ES2639445T3 - Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro - Google Patents

Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro Download PDF

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Abstract

Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro, comprendiendo dicha composición: plasma humano, solución tamponada isotónica al plasma normal y ácido ferúlico, caracterizada por que dicho plasma humano se ha obtenido mediante métodos conocidos de extracción de plasma humano y por que dicha solución isotónica tamponada tiene un pH entre 6,5 y 8,5, en la que la concentración de plasma humano está en el intervalo de 15% (v/v) a 75% (v/v), la cantidad de dicha solución isotónica tamponada está en el intervalo de 40% (v/v) a 70% (v/v); y en la que la cantidad de ácido ferúlico está en el intervalo de 0,01% (p/v) a 1% (p/v).

Description

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DESCRIPCION
Composicion para su utilizacion como plasma de control anormal de la coagulacion en ensayos in vitro
La presente invencion se refiere al sector del analisis clinico de la sangre y, mas en particular, se refiere a una composicion que comprende plasma humano, solucion isotonica tamponada y acido ferulico para utilizar en el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia, coagulacion y fibrinolisis. Ademas, la presente invencion se refiere a la utilizacion de acido ferulico en la preparacion de un control anormal de plasma en ensayos de hemostasia.
La hemostasia es el conjunto de mecanismos a traves de los cuales los animales con un sistema vascular evitan desangrarse tras una herida. El mecanismo de la hemostasia tiene distintas funciones importantes: (a) mantener la sangre en estado fluido cuando circula dentro del sistema vascular, (b) detener la hemorragia en el lugar donde se ha producido una herida o haya perdida de sangre a traves de la formacion de un coagulo, y (c) asegurar la eliminacion del coagulo cuando la herida se ha curado. Habitualmente, en la hemostasia intervienen cinco elementos, a saber: los vasos sanguineos, las plaquetas (componente celular), los factores de la coagulacion, los inhibidores de la coagulacion y el sistema fibrinolitico. La hemostasia, pues, involucra un grupo de fuerzas que deben interactuar en un perfecto equilibrio, las fuerzas procoagulantes y anticoagulantes. Este equilibrio esta controlado por varias proteinas, algunas de ellas conocidas como factores de coagulacion. Es un equilibrio muy delicado y en caso de desequilibrio, podria generar un estado protrombotico o un trastorno hemorragico.
Es muy importante medir de forma precisa el funcionamiento de la coagulacion, porque si existen deficiencias, pudieran amenazar la vida. Este hecho adquiere especial interes en el caso de pacientes sometidos a terapia de coagulacion en condiciones tromboemboliticas.
El papel del laboratorio de hemostasia es detectar y conocer las alteraciones fisiologicas en enfermedades hemorragicas y tromboticas. Para ello se utilizan diferentes ensayos tales como ensayos de hemostasia primaria, coagulometricos e inmunologicos, que permiten obtener informacion util para guiar a los profesionales de la salud hacia un diagnostico preciso y su tratamiento adecuado.
Los ensayos de hemostasia se pueden dividir en dos grupos diferentes: evaluacion inicial de la hemostasia, en el que se pueden incluir el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), la determinacion de la concentracion de fibrinogeno y tiempo de trombina (TT); en el otro grupo se pueden incluir ensayos especiales tales como el tiempo de reptilasa (RT), el tiempo de coagulacion activada (ACT), la determinacion de la concentracion de antitrombina (AT), de Proteina C, de Proteina S, de factor de von Willebrand, de plasminogeno y de a2-antiplasmina (inhibidor de plasmina).
En los laboratorios de hemostasia, muestras de pacientes son analizadas para una gran variedad de cribados de hemostasia y ensayos especiales durante toda la jornada de trabajo. En estos ensayos, el control metodologico de las variables que intervienen en la eficiencia y eficacia de los ensayos de hemostasia son esenciales para un diagnostico correcto. Dentro de estos controles de calidad internos seguidos por los laboratorios, el uso de plasmas de control juega un papel muy importante.
Es extremadamente recomendable utilizar un control en el rango de tiempo de coagulacion normal y otro en el rango anormal, en intervalos regulares para asegurar el funcionamiento correcto de los reactivos y dispositivos utilizados en el laboratorio de hemostasia. Existen recomendaciones publicadas en relacion con la frecuencia de ensayo de los materiales de control para algunos ensayos de coagulacion. Por ejemplo, el CLSI (siglas en ingles del Instituto de Estandares de Laboratorios Clinicos) ha publicado documentos de guia en relacion con los ensayos PT y aPTT. En dicho documento, se recomienda ensayar, como minimo, dos niveles de materiales de control cada 8 horas, o mas frecuentemente si ocurre un procesado de muestras de forma continua, tal como ocurre en muchos laboratorios. Este documento de CLSI tambien indica que el primer ensayo realizado despues de cambios o incorporacion de nuevos reactivos o de un cambio importante de instrumentos debe ser con la muestra de control. Los controles permiten evaluar la precision y la desviacion analitica de los ensayos de coagulacion en el sistema empleado de coagulometro y reactivos utilizados.
Existe literatura publicada en relacion con la preparacion de plasma de control de la coagulacion y actualmente estan comercialmente disponibles algunos de ellos. Sin embargo, la mayoria de los metodos descritos requieren mucho tiempo e incluyen etapas costosas para absorber factores proteicos criticos del plasma para obtener las propiedades de coagulacion anormales. Un metodo para preparar plasma de control anormal de coagulacion comprende la incubacion de plasma normal con hidroxido de aluminio y su posterior centrifugacion. El sedimento contiene varios factores de coagulacion y el sobrenadante resultante se puede emplear como plasma de control patologico. Los tiempos de coagulacion anormales se consiguen mediante la eliminacion de los factores de coagulacion del plasma. Sin embargo, el plasma de control de la coagulacion obtenido de esta manera no es completamente satisfactorio, porque se obtienen resultados anormales en algunos ensayos, pero en otros la actividad esta en el rango normal, por ejemplo, factor VIII, XI y XII, asi como en otros ensayos de hemostasia tales como TT y RT.
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Otro metodo para generar un control anormal de la coagulacion es diluir el plasma normal. Dicho metodo se describe en una gufa internacional (NCCLS H30-A2), en la que se menciona como preparar un plasma de control anormal para la determinacion de fibrinogeno segun el metodo Clauss. Ademas, se describe que se puede diluir un conjunto de plasmas normales con tampon barbital para obtener plasma con un resultado anormal (bajo contenido en fibrinogeno). El resultado final de la dilucion de un conjunto de plasmas normales resulta anormal para la mayona de los ensayos de hemostasia. Sin embargo, este plasma de control de la coagulacion no es anormal, por ejemplo, para TT y RT. El mismo resultado se obtiene mediante la dilucion de plasma normal con otras soluciones tal como una solucion de albumina al 4%.
Song Wang y otros: “The anticoagulant ability of ferulic acid and its applications for improving the blood compatibility of silk fibroin, BIOMEDICAL MATERIALS, INSTITUTE OF PHYSICS PUBLISHING, BRISTOL, GB, vol. 3, ne 4, 1 Diciembre 2008 (2008-12-01), pag. 44106; da a conocer que el acido felurico tiene actividad anticoagulante.
Wee Jae Joon y otros: “Identification of Anticoagulant Components in Korean Red Ginseng”, JOURNAL OF GINSENG RESEARCH, vol 34, n° 4, Diciembre 2010 (2010-12), pag. 355-362, da a conocer que los compuestos feluricos, que comprenden acido ferulico, en el ginseng rojo coreano, tienen actividad anticoagulante que contribuye al efecto cardiovascular del ginseng rojo coreano.
La solicitud de Patente en Estados Unidos N° US 2001/004641 da a conocer ensayos de tiempo de protombina (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPPT) con una composicion de control de la coagulacion que comprende plasma humano y un anticoagulante.
La presente invencion da a conocer un plasma de control anormal de la coagulacion que supera todos los inconvenientes mencionados anteriormente. El plasma de control anormal de la presente invencion garantiza resultados en el rango anormal en un gran numero de ensayos de hemostasia, incluyendo TT, RT y la determinacion de actividad de los factores especfficos de la coagulacion. Los presentes inventores han descubierto, sorprendentemente, que mediante la adicion de acido ferulico en una solucion isotonica a un plasma normal se puede obtener un plasma de control anormal que puede ser utilizado de forma eficaz en la mayona de los ensayos de hemostasia.
Sin estar asociados a ninguna teorfa en particular, es posible que esta propiedad del acido ferulico se obtenga por una propiedad caracterfstica anticoagulante de dicha sustancia. No obstante, el hecho de que una sustancia posea propiedades anticoagulantes, no indica que sea apropiada para generar un plasma anormal. Por ejemplo, la warfarina es uno de los anticoagulantes mas utilizados en sanidad para tratar los pacientes con riesgo trombotico y lleva mas de 50 anos utilizandose como medicamento. Sin embargo, este compuesto no es util para ser anadido en un plasma y generar un control anormal de la coagulacion, ya que su mecanismo de accion se basa en la inhibicion de la smtesis de los factores de coagulacion dependientes de la vitamina K. Como anticoagulante requiere de un sistema in vivo completo.
Otros compuestos con actividad anticoagulante, como la heparina o el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sf que pueden ser anadidos a plasma normal y generar tiempos anormales en los ensayos de hemostasia. Sin embargo, los presentes inventores no han obtenido resultados similares con los anticoagulantes heparina o EDTA. Ambos anticoagulantes no son idoneos para generar un plasma anormal, ya que presentan un efecto desigual sobre los ensayos de hemostasia. Es decir, la concentracion optima para obtener un tiempo anormal en un ensayo es insuficiente o excesiva para otro ensayo. Por ejemplo, en el caso de la heparina, provoca un alargamiento del ensayo aPTT pero no afecta al ensayo PT o lo hace en menor medida. Ademas, la heparina no provoca el alargamiento del ensayo RT, o sea no genera un plasma anormal para RT. Un caso similar ocurre con el EDTA, a una concentracion determinada, puede provocar un alargamiento en el ensayo de RT pero no afectar, o hacerlo de una manera muy suave, a los resultados de los ensayos de PT, aPTT y TT.
Por lo tanto, la presente invencion da a conocer una composicion para su utilizacion como control anormal de la coagulacion en ensayos in vitro, que comprende plasma humano, solucion tamponada isotonica al plasma normal y acido ferulico, caracterizada por que dicho plasma humano ha sido obtenido mediante metodos conocidos de extraccion de plasma humano y por que dicha solucion tamponada isotonica tiene un pH entre 6,5 y 8,5, en la que la concentracion de plasma humano esta en el intervalo de 15% (v/v) a 75% (v/v), la cantidad de dicha solucion isotonica esta en el intervalo de 40% (v/v) a 70% (v/v); y en la que la concentracion de acido ferulico esta en el intervalo de 0,01% (p/v) a 1% (p/v).
En la composicion de la presente invencion, el termino plasma humano se refiere a la parte lfquida de la sangre a la que se le han extrafdo los hematfes, los globulos blancos y las plaquetas. Ademas, el plasma humano que se utiliza en la composicion de la presente invencion es un plasma que tiene un tiempo normal de coagulacion en los distintos ensayos y, por tanto, es posible su utilizacion como control normal en ensayos de coagulacion. Dicho plasma se puede obtener por cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante plasmaferesis.
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Una ventaja adicional de la composicion para el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia de la presente invencion es que dicha composicion se puede congelar o liofilizar, y permanece estable despues que se descongela o reconstituye.
Para lograr una composicion para el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia, es preferible que se utilice un conjunto (“pool”) de plasma normal que contiene plasma de 2 o mas donantes humanos sanos. Dicho conjunto de plasma se puede preparar mediante mezclado suave en un recipiente adecuado.
La solucion isotonica de la presente invencion puede ser cualquier solucion isotonica conocida en la tecnica anterior. Preferentemente, la solucion isotonica de la presente invencion es un tampon que mantiene un pH alrededor del valor fisiologico entre 6,5 y 8,5 (por ejemplo, Tris, HEPES, MOPS o CHAPS).
Ademas, opcionalmente la composicion para el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia de la presente invencion puede comprender un agente estabilizador de factores de coagulacion. Un estabilizador de factores de coagulacion puede proporcionar una estabilidad adicional a dicha composicion. Preferentemente, dicho estabilizador de factores de coagulacion es glicina, y mas preferentemente, dicha glicina esta presente en la composicion para el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia de la presente invencion en una cantidad de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 4% (p/v).
La composicion para el control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia de la presente invencion tambien puede comprender opcionalmente un agente estabilizante de proteinas o aditivo proteico y/o agente de carga, y un conservante. Dicho agente estabilizante tiene como funcion principal conservar la funcionalidad de las proteinas una vez liofilizadas las mismas. Dicho agente estabilizante puede ser cualquier agente estabilizante conocido por un experto en la materia.
Por ultimo, la presente invencion da a conocer el uso de acido ferulico en la preparacion de un control anormal de la coagulacion en ensayos de hemostasia.
A continuacion, se describe en mas detalle la presente invencion en referencia a ejemplos ilustrativos, que no constituyen una limitacion de la presente invencion, y en referencia a las figuras en las que:
La figura 1 muestra el efecto del acido ferulico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT.
La figura 2 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT.
La figura 3 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT.
La figura 4 muestra el efecto del acido ferulico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT.
La figura 5 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT.
La figura 6 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT.
La figura 7 muestra el efecto del acido ferulico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT.
La figura 8 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT.
La figura 9 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT.
La figura 10 muestra el efecto del acido ferulico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT. La figura 11 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT.
La figura 12 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. Preparacion de las composiciones control anormal de plasma para los ensayos de hemostasia
Para evaluar el efecto de diferentes anticoagulantes en diferentes ensayos de hemostasia, se prepararon diferentes composiciones de plasma. Se utilizo plasma normal humano citratado (16 mM de citrato) conservado a una temperatura inferior a -70 °C y se descongelo en bano a 37 °C. A continuacion, se anadio HEPES hasta una concentracion final de 40 mM y el pH fue ajustado hasta 7,4 - 7,6 con NaOH 1N. Se prepararon diferentes composiciones de plasma. A la primera no se anadio ningun anticoagulante y se utilizo como control. En las otras, se anadieron concentraciones crecientes de los anticoagulantes analizados: acido ferulico (0,5% 1% y 1,5%), heparina (0,1 UI/mL, 0,5 UI/mL y 1 UI/mL) y EDTA (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 1,5 mg/mL). Cada composicion de plasma fue analizada para los ensayos PT, aPTT, TT y RT mencionados anteriormente en Q Haemostasis Analyzer (Diagnostic Grifols, Espana) usando los reactivos DG-PT, DG-APTT Synth, DG-TT L Human y DG-Fibroclotin de Diagnostic Grifols.
EJEMPLO 2. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de PT.
En las figuras 1-3 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de PT con los diferentes anticoagulantes, en las que se relaciona el tiempo obtenido en el ensayo de PT, segun la concentracion de anticoagulante presente en el plasma. En triangulos se representa el control (plasma sin anticoagulante) y en cuadrados las composiciones que tienen acido ferulico, heparina y EDTA. Se puede observar que el acido ferulico (figura 1) y el EDTA (figura 3)
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generan una disminucion en el % de actividad de PT de manera proporcional a la cantidad de anticoagulante presente en el plasma. En cambio, la heparina (figura 2) no provoca un resultado diferente al del plasma sin anticoagulante. Es decir, en las concentraciones ensayadas, la heparina no afecta el ensayo PT. En cambio, el acido ferulico y el EDTA anadidos en un plasma normal, si que generan una disminucion en el % de actividad de PT.
EJEMPLO 3. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de aPTT.
Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de aPTT (figuras 4-6). En este ensayo, todos los anticoagulantes anadidos al plasma, a saber acido ferulico (figura 4), heparina (figura 5) y EDTA (figura 6), provocan un alargamiento del aPTT. Ademas, el alargamiento en el resultado del ensayo, es proporcional a la cantidad de anticoagulante presente en el plasma analizado.
EJEMPLO 4. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de TT.
Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de TT. En las figuras 7-9 se muestran los resultados de TT obtenidos al ensayar los plasmas preparados. De los tres anticoagulantes analizados, el EDTA (figura 9) no alarga el resultado del ensayo; es decir, no genera un TT anormal. En cambio, tanto la heparina (figura 8) como el acido ferulico (figura 7), si que generan un TT anormal.
EJEMPLO 5. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de RT.
Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de RT. En referencia a los resultados del ensayo de RT (figuras 10-12), el unico anticoagulante que no genera un resultado anormal tras ser anadido a un pool de plasma normal es la heparina (figura 11). En ninguna de las concentraciones ensayadas, la heparina provoca un alargamiento del RT. Los plasmas que contienen los anticoagulantes acido ferulico (figura 10) y EDTA (figura 12), si que generan un resultado anormal para RT.
A raiz de los resultados mostrados en los ejemplos y figuras anteriores, se puede apreciar el poder anticoagulante del acido ferulico y su capacidad, tras ser anadido a un plasma normal, de provocar resultados anormales en todos los ensayos de hemostasia. Ademas, genera un alargamiento en los tiempos de los tests de una manera equilibrada, haciendolo asi adecuado para la fabricacion de plasma de control anormal.
Si bien la invencion se ha descrito con respecto a ejemplos de realizaciones preferentes, estos no se deben considerar limitativos de la invencion, que se definira por la interpretacion mas amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

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    REIVINDICACIONES
    1. Composicion para su utilizacion como plasma de control anormal de la coagulacion en ensayos in vitro, comprendiendo dicha composicion: plasma humano, solucion tamponada isotonica al plasma normal y acido ferulico, caracterizada por que dicho plasma humano se ha obtenido mediante metodos conocidos de extraccion de plasma humano y por que dicha solucion isotonica tamponada tiene un pH entre 6,5 y 8,5, en la que la concentracion de plasma humano esta en el intervalo de 15% (v/v) a 75% (v/v), la cantidad de dicha solucion isotonica tamponada esta en el intervalo de 40% (v/v) a 70% (v/v); y en la que la cantidad de acido ferulico esta en el intervalo de 0,01% (p/v) a 1% (p/v).
  2. 2. Composicion, segun la reivindicacion 1, caracterizada por que el plasma humano es un plasma que presenta un valor de tiempo normal de coagulacion en diferentes ensayos de coagulacion.
  3. 3. Composicion, segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizada por que el plasma humano es un conjunto (“pool”) de plasma normal que contiene plasma de 2 o mas donantes humanos sanos.
  4. 4. Composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que ademas comprende un agente estabilizador de factores de coagulacion.
  5. 5. Composicion, segun la reivindicacion 4, caracterizada por que el estabilizador de factores de coagulacion es glicina.
  6. 6. Composicion, segun la reivindicacion 5, caracterizada por que la glicina esta presente en dicha composicion en una cantidad de 0,1% (p/v) a 4% (p/v).
  7. 7. Composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que ademas comprende un agente estabilizante de proteinas y un conservante.
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