ES2636318T3

ES2636318T3 - Procedimiento para la monitorización de una terapia anticoagulante

Info

Publication number: ES2636318T3
Application number: ES12748059.8T
Authority: ES
Inventors: Pall Torfi ONUNDARSON; Brynja R. GUDMUNDSDOTTIR
Original assignee: FLIX DIAGNOSTICS
Current assignee: FLIX DIAGNOSTICS
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2017-10-05
Anticipated expiration: 2032-03-08
Also published as: US20160108457A1; IN2013MN01890A; WO2012120546A2; DK2684056T3; WO2012120546A3; EP2684056A2; US20120231485A1; US9234902B2; CN103534595A; RU2607658C2; CN103534595B; RU2013144950A; EP2684056B1; IS2809B

Abstract

Procedimiento para medir la actividad de un fármaco anticoagulante antagonista de la vitamina K en un paciente, que se basa en la medición en una muestra de plasma de prueba de dicho paciente de la actividad combinada de dos y únicamente los factores de coagulación II y X, comprendiendo el procedimiento: - mezclar dicha muestra de plasma de prueba con plasma deficiente sólo en el factor II y el factor X, en el que la proporción de dicha muestra de plasma de prueba y dicho plasma deficiente está en el intervalo de 1:1 a 1:20, - añadir a dicha muestra de plasma de prueba uno o más reactivos de coagulación y calcio, y - determinar la capacidad de coagulación de la sangre mediante la medición del tiempo de coagulación de la sangre o la generación de trombina.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la monitorizacion de una terapia anticoagulante CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La presente invencion esta dentro del campo del diagnostico medico y la monitorizacion de farmacos, especlficamente el campo de la medicion de la coagulacion sangulnea en pacientes que toman compuestos farmaceuticos para la terapia de anticoagulacion.

ANTECEDENTES TECNICOS Y TECNICA ANTERIOR

[0002] La coagulacion de la sangre es el mecanismo que impide continuar la perdida de sangre cuando cualquier parte del sistema de circulacion de la sangre esta lesionada. Implica la formation de una masa semisolida de material sangulneo, que actua para tapar heridas de los vasos. El sistema comprende una serie de componentes que interactuan en la sangre y en la pared del vaso que deben permanecer en equilibrio; un sistema inactivo provoca el riesgo de hemorragia severa y fatal, mientras que la actividad excesiva del sistema de coagulacion de la sangre provoca el riesgo de formacion de coagulos de sangre (trombosis y tromboembolia) dentro del sistema circulatorio, obstruction de arterias, con consecuencias potencialmente mortales debido a la necrosis de los tejidos (muerte celular).

[0003] Los anticoagulantes o "diluyentes de la sangre" estan entre las clases de farmacos mas administrados con frecuencia y dentro de esta clase, los antagonistas de la vitamina K (AVK, cumarinas) han sido hasta hace poco los unicos agentes orales disponibles. Debido al delicado equilibrio del sistema de coagulacion de la sangre y mucha variation en la sensibilidad del paciente y la capacidad de respuesta a la terapia, las dosis de AVK tienen que ajustarse cuidadosamente y monitorizarse de forma continua, ya que la respuesta del paciente y la dosis adecuada cambia con frecuencia con el tiempo. Se estima que se realizan anualmente 800 millones de pruebas en todo el mundo para monitorizar la coagulacion de la sangre en los pacientes sobre los AVK.

[0004] El sistema de coagulacion de la sangre comprende un sistema complejo de proenzimas, enzimas y cofactores interrelacionados, que realizan su papel en la superficie de las plaquetas activadas y las celulas endoteliales y en los vasos rotos en el cuerpo humano. Cuando se activa el sistema, por lo general en la herida de un vaso, el resultado final es la formacion de un coagulo de sangre que contiene una malla de fibrina insoluble. En el cuerpo, el proceso de coagulacion se controla cuidadosamente sobre la superficie de las plaquetas activadas y las celulas endoteliales, pero en el laboratorio de pruebas, la superficie de las plaquetas se suele sustituir por fosfollpidos adecuados. Las proenzimas, enzimas y cofactores se denominan tradicionalmente factores de coagulacion (F), la mayorla de los cuales se forman en el hlgado.

[0005] Los factores de coagulacion dependientes de la vitamina K y los antagonistas de la vitamina K: Cuatro factores de coagulacion, es decir, FII, FVII, FIX y FX, que se forman en el hlgado, son inactivos a menos que despues de la slntesis se carboxilen ademas por un proceso de enzima dependiente de la vitamina K en el hlgado. En pacientes con deficiencia de vitamina K o en pacientes tratados con un antagonista de la vitamina K (AVK), la cantidad de factores dependientes de la vitamina K (VKD) carboxilados se reduce y, por lo tanto, tambien la capacidad de coagulacion (coagulabilidad) de la sangre del paciente correspondiente. A menos que el efecto de los AVK este controlado, esto puede conducir a una hemorragia interna grave e incluso mortal. Pero mediante la reduction de los niveles de factores VKD de una manera controlada, la coagulacion anormal de la sangre dentro de los vasos (trombosis) se puede prevenir y reducir al mlnimo el riesgo de sangrado. Por tanto, es imperativo que el efecto de los AVK este controlado con pruebas de coagulacion adecuadas. Basandose en los resultados de pruebas, la dosis se puede ajustar maximizando el efecto antitrombotico y, al mismo tiempo, minimizando el riesgo de sangrado anormal causado por la sobreanticoagulacion.

[0006] La monitorizacion de la actividad de coagulacion de la sangre en pacientes tratados con AVK durante sesenta anos se ha basado en la medicion del tiempo de protrombina (PT), bien como el PT Quick original (PT) (Quick, A., J Bio Chem 1935 (109): pag. 73-4) o como su modification, PT de Owren (tambien conocido como PP, prueba P & P o prueba de complejo de protrombina) (Owren y Aas Scand J Clin Lab Invest, 1951. 3 (3): pag. 201-8). La prueba de PT mide la actividad de coagulacion de tres de los cuatro factores de coagulacion dependientes de la vitamina K (es decir, FII, FVII, y FX), as! como del fibrinogeno (factor I) y el factor V, en una muestra de plasma sangulneo que se agotado en calcio, mediante la adicion de un reactivo de coagulacion (tromboplastina, factor tisular) y calcio, y posteriormente la medicion del tiempo que tarda la sangre en coagular. La ultima prueba (P & P) es una modificacion de PT, donde el plasma adsorbido (totalmente deficiente en factores dependientes de vitamina K) se mezcla en el plasma de prueba, corrigiendo cualquier posible deficiencia de factor V o fibrinogeno y dejando la prueba P & P solo sensible a los factores II, VII y X. Por lo tanto, la prueba de PT tambien es sensible a la deficiencia de los factores V y el fibrinogeno, que no son dependientes de la vitamina K y si la deficiencia puede causar confusion en los resultados en pacientes que toman AVK. Con ambas pruebas, sin embargo, el tiempo de coagulacion medido es igualmente sensible a una reduccion de cualquiera de los tres factores dependientes de la vitamina K que la prueba mide, es decir, FII, FVII y FX. La actividad coagulante de FIX no se mide mediante estas pruebas. Los tiempos de

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coagulacion obtenidos con las pruebas basadas en PT se han supuesto en la practica que reflejan directamente el efecto antitrombotico de AVK en pacientes, excepto durante la iniciacion de la terapia con AVK. Sin embargo, este no siempre puede ser el caso.

[0007] Costa et al. (Costa I.M., et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 64 (2010) 130-132) investigaron la utilidad del factor II y el factor X como marcadores terapeuticos en pacientes en tratamiento con warfarina. En el estudio, se ensayo la actividad de FII o FX mediante la mezcla de las muestras de pacientes con plasma deficiente en FII (o FX), seguido de la adicion de tromboplastina y registro del tiempo de coagulacion. Los autores utilizaron los valores de INR (de la prueba PT) como referencia y sus resultados indican una relacion no proporcional entre los valores de INR y una actividad baja de FIIy FX, concluyeron que en estas circunstancias, "la capacidad de prediction y el interes de FII y FX como marcadores de respuesta a la warfarina es insignificante".

[0008] El documento WO 93/07491 describe un prueba que utiliza trombomodulina soluble para determinar el estado funcional en plasma de las protelnas inhibidoras de la coagulacion dependientes de vitamina K, la protelna C y la protelna S. El procedimiento comprende la combination de una muestra de prueba de plasma de sangre y una sustancia activadora de la coagulacion en una solution libre de calcio, a continuation, la adicion de trombomodulina y de iones de calcio solubles para iniciar una reaction de coagulacion, la medicion del tiempo requerido para la coagulacion de la muestra de plasma de prueba, la comparacion del tiempo de coagulacion medido con el de las muestras de plasma de control estandar, incluyendo los controles de plasma deficiente en protelna C y protelna S, y a continuacion la utilization de los valores de tiempo de coagulacion comparados para determinar el estado funcional de la protelna C y la protelna S en el individuo.

[0009] El documento WO 2004/102202 describe una mezcla de activation que comprende plasma de sustrato con deficit de factores, un activador y un fosfollpido. Esta mezcla de activacion se utiliza en lugar de los componentes individuales en un procedimiento de prueba de una etapa. El activador es preferentemente sllice micronizada y el fosfollpido es preferiblemente fosfollpido sintetico.

[0010] El tiempo de coagulacion medido real medido en un individuo normal variara dependiendo del procedimiento aplicado y tambien del sistema de analisis y los reactivos especlficos utilizados. Diferentes reactivos de coagulacion e incluso diferentes lotes de factores tisulares (tromboplastina) y protelnas del fabricante utilizados causan la variabilidad en el tiempo de coagulacion obtenido con PT o P & P. Por lo tanto, se ha ideado un protocolo para procedimientos de calibration. Cada fabricante asigna un valor de ISI (Indice Internacional de Sensibilidad) para el factor tisular proporcionado. (Ver WHO Guidelines for Thromboplastins and Plasma Used to Control Anticoagulant Therapy, TRS, No. 889, Anexo 3). El valor de ISI indica como un lote particular de factor tisular se compara con una muestra estandarizada a nivel internacional. El valor de ISI es por lo general entre 1,0 y 2,0. De este modo, se puede calcular un valor de "relacion normalizada internacional" (INR), que es la relacion del tiempo de protrombina de un paciente con respecto a la PT de poblacion normal media, elevado a la potencia del valor de iSi para el sistema analltico utilizado. El valor INR en consecuencia puede describirse con la ecuacion:

INR (PT/MNPT)ISI

donde MNPT se refiere a "tiempo de protrombina normal media". Para propositos practicos, el MNPT se obtiene generalmente como un valor medio de los tiempos de protrombina de al menos 20 muestras frescas de individuos sanos. Un nivel alto de INR, como una INR de mas de 5, indica que hay una alta probabilidad de hemorragia, mientras que si la INR es de 1,3 o menos, no hay protection contra tener tromboembolismo. Un intervalo de INR normal para una persona sana es 0,8-1,3 y para las personas en tratamiento con cumarina (por ejemplo, warfarina), el intervalo terapeutico mas comunmente recomendado es de 2,0-3,0.

[0011] La INR objetivo puede ser mayor en determinadas situaciones, tales como para los individuos con valvulas cardlacas mecanicas.

[0012] Las pruebas modificadas para evaluar con precision la capacidad de coagulacion de la sangre que podrla superar las desventajas de los procedimientos actuales en la tecnica, y hacer posible un ajuste de dosis mas preciso y preferiblemente una monitorizacion menos frecuente de la actividad anticoagulante en pacientes anticoagulados, serla muy apreciada.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

[0013] La presente invention se refiere a un nuevo procedimiento de monitorizacion de la terapia anticoagulante y kits para el uso del procedimiento. Se basa en los experimentos de los inventores que indican que la medicion de solamente la actividad de los factores II y X (FII y FX) refleja con mayor precision la capacidad de coagulacion que los actuales procedimientos convencionales (PT, P & P) y, por lo tanto, probablemente que el efecto antitrombotico de los anticoagulantes AVK en pacientes esta mejor indicado por el nuevo procedimiento de prueba. La presente invencion se basa en la determination de la actividad combinada de solo los factores de coagulacion II y X y la exclusion de la influencia de todos los otros factores de coagulacion en los resultados de la prueba. El procedimiento implica mezclar plasma de prueba de un ser humano a ensayar con plasma deficiente en dos y unicamente factores

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de coagulacion II y X, pero con niveles normales de otros factores (en lo sucesivo denominado plasma deficiente en Fiix), a fin de corregir cualquier posible deficiencia en factores de coagulacion distintos de FII y FX en la muestra de prueba, que de otro modo podrlan influir en el resultado de la prueba. Mediante la adicion de un reactivo de coagulacion y de calcio, se puede medir la generacion de trombina o fibrina. De esta manera, la actividad de factores II y X y su actividad combinada se pueden evaluar con precision sin un efecto de confusion de otras deficiencias de factores. De este modo, la presente invention proporciona una evaluation de la capacidad de coagulacion de la sangre, que los inventores creen que con mayor precision que los procedimientos actuales, refleja el efecto antitrombotico de los agentes anticoagulantes AVK administrados al sujeto que esta siendo analizado.

[0014] La presente invencion proporciona ademas kits que son adecuados para realizar el procedimiento de la presente invencion, que comprenden un reactivo de coagulacion y plasma deficiente en dos y unicamente los factores II y X.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0015]

Figura 1: tiempo de protrombina Quick (PT, panel A) o tiempo de protrombina de Owren (P & P, panel B) en relation con la reduction selectiva en la actividad de factores dependientes de la vitamina K individuales.

Figura 2: Parametros ROTEM en relacion con el porcentaje de P & P en 65 muestras de pacientes sobre la anticoagulacion estable con warfarina.

Figura 3: Parametros ROTEM (CT, MaxVel, MCF) en relacion con la reduccion selectiva de la actividad de factores de coagulacion dependientes de la vitamina K individuales en plasma pobre en plaquetas.

Figura 4: Desarrollo del tiempo de Fiix-protrombina; tiempos de coagulacion obtenidos en plasmas de prueba con actividad de FX y FII combinada oscilando del 1,6% al 100%. Las curvas describen resultados obtenidos con diferentes condiciones experimentales, es decir, diferente proportion de plasma de prueba con respecto a plasma deficiente en Fiix, as! como diferentes prediluciones del plasma de prueba. Los experimentos representativos muestran una proporcion del plasma de prueba con respecto al plasma total (volumen de plasma de prueba +

volumen de plasma Fiix): W 0,09 (1 + 10); I. * * * V 0,17 (1 + 5); ^ 0,25 (1 + 3); ° 0,28 (1 + 2,5); TO,31 (1 + 2,2); * 0,40 (1 + 1,5).

Figura 5. Correlation de Fiix-INR con INR (PP-INR) en 38 muestras seleccionadas al azar de pacientes estables con warfarina.

Figura 6. Una secuencia de mediciones de FII, FVII y FX en un unico individuo empezando con warfarina en relacion con respecto a INR (PP-INR, curva de negro) y Fiix-INR (curva roja). Los tiempos de coagulacion (INR) cambian en relacion con los cambios en las concentraciones de los factores vKd.

DESCRIPCION DETALLADA

[0016] La presente invencion implica un procedimiento nuevo y proporciona kits basados en el procedimiento, para determinar capacidad de coagulacion de la sangre de muestras de plasma humano, en particular para medir la actividad de un farmaco anticoagulante en pacientes que toman estos farmacos. La influencia de otros factores de coagulacion distintos de FII y FX se elimina mediante este procedimiento. El procedimiento puede mejorar, en particular, el tratamiento anticoagulante con cumarinas (antagonistas de la vitamina K, AVK), tales como la warfarina, que reducen la concentration de los factores de coagulacion activos (gamma-carboxilados) II, VII, IX y X. El nuevo procedimiento tambien puede tener aplicacion para monitorizar otros anticoagulantes que inhiben FII o Fx o ambos.

[0017] El fundamento subyacente de la presente invencion se basa en los resultados experimentales que sugieren que la inclusion de la influencia de FVII de coagulacion en el tiempo de coagulacion en pacientes tratados con AVK, tal como se hace en los pruebas basados en el tiempo de protrombina convencionales, PT (Quick) y P & P (Owren), para la determination de la capacidad de coagulacion de la sangre, puede provocar una fluctuation en los resultados del tiempo de coagulacion determinado que puede ser terapeuticamente irrelevante. Tales resultados confusos de la prueba, posiblemente, pueden inducir a error al medico cuando se ajusta la dosis de estos medicamentos potencialmente peligrosos. Esta nueva hipotesis ha conducido a una nueva invencion, que se basa en las siguientes consideraciones y resultados experimentales:

I. Durante la iniciacion de la anticoagulacion oral (OA) con AVK y despues de los cambios de dosis, la concentracion

de cada uno de los factores de coagulacion (F) gamma carboxilados dependientes de la vitamina K (VKD) fisiologicamente activos se ve afectada en un grado diferente y a una velocidad diferente debido a sus vidas medias significativamente diferentes, es decir, aproximadamente 3,5 horas para el FVII (proconvertina), 52 horas para FX

(factor Stuart) y 72 horas para FII (protrombina) (Roberts, H.R., Escobar M.A., Other coagulation factor deficiencies,

3a edition. Thrombosis and Hemorrhage, ed S.A.I. Loscalzo J. Vol 1. 2003, Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 575-598.). En consecuencia, la concentracion de FVII cambia mas rapidamente que los otros factores y esto

puede tener una influencia importante en los valores medidos de PT/P&P, incluso cuando FII y FX no han cambiado significativamente.

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II. Algunos estudios anteriores han indicado que la influencia antitrombotica de FVII durante la terapia con cumarinas puede ser menos importante que la de la protrombina (FII) o FX (Zivelin et al, J Clin Invest, 1993. 92 (5): pag. 213140; Xi et al, Thromb Haemost, 1989. 62 (2): pag. 788-91). Xi et al. mostro que la actividad de protrombinasa (la generacion de trombina) en muestras anticoaguladas de pacientes tratados con cumarinas era dependiente de la concentracion de FX y, en particular, de la concentracion de FII, pero menos dependiente de la actividad de FVII, lo que demostro una primera relacion umbral evidente a concentraciones muy bajas de FVII. Zivelin et al. encontraron que el efecto antitrombotico de los factores VKD en conejos depende de la concentracion de FX y en particular de la concentracion de FII, pero no de la concentracion de FVII. Ademas, se demostro en estudios cllnicos, que la monitorizacion de AVK midiendo el antlgeno de protrombina nativa (NPA) por ELISA parecla ser mas predictivo de eventos adversos que la monitorizacion con la Pt, lo que sugiere una cierta inexactitud de las mediciones de PT (Furie et al., Blood, 1984. 64 (2): pag. 445-51; Furie et al, Blood, 1990. 75 (2): pag. 344-9; Kornberg et al, Circulation, 1993. 88 (2): pag. 454-60). Finalmente, el estudio de Brummel et al. usando plasma anticoagulado de pacientes tratados con warfarina demostro que existla una escasa relacion entre los tiempos de coagulacion basados en PT (INR) y la generacion de trombina en respuesta a factor tisular diluido (Brummel et al, Circulation, 2001, 104 (19): pag. 2311-7). Estos hallazgos utilizando tromboelastometrla de rotacion (ROTEM) y factor tisular diluido confirman esta observacion, indicando la inexactitud de los procedimientos de monitorizacion basados en PT o P & P.

[0018] El termino "plasma de prueba" o "muestra de plasma de prueba" se refiere en este contexto a plasma de un paciente o sujeto para el cual se desea una prueba de coagulacion de la sangre.

[0019] "Plasma normal" se refiere a plasma adecuado para uso como control, de individuos sanos normales, preferentemente y tlpicamente agrupados a partir de varios individuos para normalizar cualquier variacion interindividual en la concentracion de los factores pertinentes.

[0020] "Reactivo de coagulacion" se refiere a un reactivo que activa la via de coagulacion en una muestra de sangre o plasma, que conduce a la conversion de protrombina en trombina y fibrinogeno en fibrina.

[0021] El procedimiento de la invencion se basa en la medicion de la actividad combinada de dos y unicamente los factores de coagulacion II y X, lo que significa que el efecto de otros factores que puede ser variable en la muestra de prueba (por ejemplo, FI, FV, FVII y FIX) es eliminado. "Actividad combinada" en el presente documento se refiere a efectos medidos debido a la actividad tanto de FII como de FX, pero el efecto de uno no se diferencia del otro.

[0022] En el procedimiento de la invencion, la muestra de plasma de prueba se mezcla con plasma deficiente en Fiix, como se menciona anteriormente, la proporcion del plasma de prueba con respecto al plasma deficiente esta en el intervalo de 1:1 a 1:20, preferiblemente en el intervalo de 1:4 a 1:10, tal como en el intervalo de 1:5 a 1:8, tal como, pero no limitado a 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 o 1:10. Tal como se usa en el presente documento, la notacion 1:4 significa una parte de plasma de prueba contra cuatro partes de plasma deficiente, es decir cinco partes de plasma en total (es decir, 20% de plasma de prueba y 80% de plasma deficiente).

[0023] Generalmente, la muestra de prueba de plasma se trata como para las pruebas de coagulacion convencionales, es decir, una muestra de sangre fresca extralda del paciente es tratada con citrato para el agotamiento del calcio, y los globulos rojos de la sangre se separan del plasma por centrifugacion. La muestra de plasma de prueba preparada se puede entonces convenientemente mezclarse con plasma deficiente en Fiix, adecuadamente justo antes del analisis.

[0024] Se anade un reactivo de coagulacion al plasma de prueba, y calcio, para desencadenar la coagulacion. El reactivo de coagulacion y el calcio pueden premezclarse entre si o cada uno se anade por separado a la muestra de plasma de prueba. Alternativamente, cualquiera o ambos reactivos pueden premezclarse con el plasma deficiente. Por consiguiente, las etapas del procedimiento reivindicado que implican la mezcla de muestra de plasma de prueba con plasma deficiente y la adicion del reactivo de coagulacion y el calcio pueden llevarse a cabo en una, dos o tres etapas.

[0025] El reactivo de coagulacion puede ser cualquiera de los reactivos usados comunmente en pruebas convencionales como los descritos anteriormente, tales como, pero no limitado a, tromboplastina (incluyendo factor tisular recombinante), fosfollpidos, el factor IXa, el factor XIa, el factor XIIa, calicrelna, el factor VIIa, el factor VIIa y activador exogeno, tal como el veneno de serpiente que activa el factor X.

[0026] El presente procedimiento funciona con la activacion de la coagulacion a traves de la via intrlnseca o la via extrlnseca. Los reactivos de coagulacion tromboplastina y el factor VIIa activaran la via extrlnseca, mientras que los siguientes reactivos de coagulacion activan la via intrlnseca: fosfollpidos, el factor IXa, el factor XIa, el factor XIIa, calicrelna, o el complejo de factores IXa/VIIIa.

[0027] Los activadores exogenos, tales como venenos de serpiente, se pueden utilizar en el procedimiento de la invencion. Estos incluyen veneno de vlbora de Russel (veneno de serpiente de Daboi russelii) que puede obtenerse de una fuente natural o producirse recombinantemente. Tambien se pueden usar otros venenos de serpiente que activan el factor X directamente a traves de la via comun.

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[0028] La tromboplastina no es una protelna pura, sino un complejo de protelnas del factor tisular y fosfollpidos. El factor tisular (tambien conocido como factor tisular de plaquetas, factor III, tromboquinasa o CD142) es una protelna transmembrana integral que es un receptor de superficie celular para el factor Vila, que funciona como un cofactor obligatorio para la actividad proteolltica del factor Vila hacia el factor X que convierte el fator X en el factor de proteasa activa Xa. El factor tisular necesita asociarse con fosfollpidos coagulantes para la expresion completa de su funcion cofactor.

[0029] La tromboplastina utilizada en el procedimiento y kits de la invention se puede obtener de fuentes animales como son conocidas para el experto, incluyendo, pero no limitado a, cerebro de conejo, placenta humana, cerebro humano, cerebro bovino, pulmon bovino, u otras fuentes adecuadas. La tromboplastina tambien puede ser tromboplastina producida de forma recombinante que es preferiblemente tromboplastina humana recombinante. La tromboplastina recombinante se puede producir mediante la expresion del componente de factor tisular en cultivo celular adecuado, por ejemplo de cultivo de celulas de raton de la placenta, celulas de ovario de hamster (celulas CHO); celulas de hongos, organismos procariotas, por ejemplo, en cultivos de E. coli; plantas transgenicas u otro vehlculo de expresion adecuado, y, posteriormente, el factor tisular se lipida in vitro.

[0030] En algunas realizaciones de la invencion, el reactivo de coagulation comprende fosfollpidos, estos pueden derivarse de varias fuentes naturales o sintetizarse y/o modificarse qulmicamente. Los fosfollpidos utilizados en las pruebas de coagulacion tambien se denominan como tromboplastina parcial, aunque habitualmente la tromboplastina parcial se refiere a extractos de fosfollpidos separados de diversos tejidos. Cuando se utilizan fosfollpidos como reactivo de coagulacion, estos pueden ser, preferentemente, de una composition adecuada, enriquecida en fosfollpidos que tienen una buena actividad procoagulante, tal como, pero no limitado a, fosfatidil serina. El reactivo de coagulacion puede, en ciertas realizaciones, utilizarse con un activador, en particular, cuando los fosfollpidos se utilizan como reactivo de coagulacion. Dicho activador puede seleccionarse adecuadamente a partir de, pero no esta limitado a, partlculas de caolln, celite, partlculas de vidrio, partlculas de sllice, que pueden o no ser sllice micronizada, o acido elagico. En esta realization, el procedimiento corresponde a lo que se conoce como la prueba APTT (tiempo de tromboplastina parcial activada), excepto que, de acuerdo con la invencion, se anade plasma deficiente en Fiix, haciendo que los resultados de la prueba Fiix-APTT solo reflejen la actividad de Fll y/o FX. Cuando se utilizan fosfollpidos sin activador como reactivo de prueba, la prueba se puede comparar con lo que se conoce como la prueba de PTT, es decir, Fiix-PTT.

[0031] Las combinaciones de mas de un reactivo de coagulacion se utilizan en ciertas realizaciones, tales combinaciones incluyen el uso de tromboplastina y factor Vila, y una combination de los factores IXa y Villa.

[0032] La fuente de calcio es generalmente, pero no necesariamente cloruro de calcio.

[0033] La cantidad/concentracion de reactivo de coagulacion en el procedimiento es generalmente similar a la de los procedimientos actuales para medir la coagulacion. Cuando se utiliza tromboplastina, los resultados pueden normalizarse basandose en el valor de ISI, realizado adecuadamente como en la normalization de las pruebas PT Quick y PT Owren.

[0034] El reactivo de coagulacion y/o plasma deficiente preferiblemente se liofilizan y en tal caso se reconstituyen antes de su uso en agua o tampon adecuado.

[0035] El calcio se utiliza en la concentration convencional, tal como en el intervalo 1,0-4,0 mM, preferiblemente 2,5 mM.

Determination del punto final:

[0036] La determinacion del punto final en el procedimiento de la invencion puede ser de cualquier tipo utilizado actualmente de forma convencional, incluyendo, pero no limitado a, la determinacion manual (visual) mediante la tecnica de inclinacion del tubo, la deteccion mecanica usando procedimientos de deteccion de coagulos, tales como "bola rodante" o tecnica de sonda vibrante (detectando cuando la sonda es estatica debido a la mayor viscosidad), procedimientos de detection optica utilizando detection optica de la formation de fibrina, y tambien tecnicas cromogenicas basadas en el uso de sustratos cromogenicos, incluyendo sustratos para la trombina (por ejemplo sustrato S2238 (Chromogenix-lnstrumentation Laboratory SpA, Milan, Italia) y sustratos para FXa, tales como BIOPHEN CS-11 (22) (Aniara, Mason OH, EE.UU.).

[0037] Otras realizaciones incluyen el uso de sustratos fluorogenicos, que tras la escision por una enzima amidolltica (por ejemplo, trombina, o factor Xa) liberan un marcador fluorogenico. Estos incluyen, pero no se limitan, a peptido- amidas de 4-metil-cumarina (MCA), por ejemplo Pefafluor FXa (PEFA-5534) (Pentapharm Ltd. Basilea, Suiza) que es un sustrato sensible para el factor Xa. En otras realizaciones, se utilizan sustratos luminogenos, estos incluyen el sustrato S-2613 (t-butiloxicarbonil-isoleucil-glutamil-gamma-piperidil-glicil-arginil-isoluminol), para otros sustratos, vease, por ejemplo Hemker HC, Handbook of synthetic substrates for the coagulation and fibrinolytic system, Martinus Nijhoff Publishers, Boston (1983).

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Kits de la invencion:

[0038] En otro aspecto, la presente invencion proporciona kits que son adecuados para el funcionamiento del procedimiento de la invencion en los laboratorios cllnicos de todo el mundo. Por consiguiente, los kits estan configurados para proporcionar en recipientes con una cantidad adecuada y listos para el uso los reactivos necesarios para la ejecucion de pruebas de acuerdo con la invencion. El kit de prueba de la presente invencion comprende un reactivo de coagulacion, tal como uno o mas de los anteriores mencionados en la descripcion de los procedimientos de la invencion, y plasma normal que es deficiente solo en el factor II y el factor X (plasma deficiente en Fiix).

[0039] El plasma deficiente es plasma que es deficiente solo en el factor II y el factor X, de tal manera que todavla contiene otros factores de coagulacion, tales como el factor VII y el factor IX. El plasma deficiente se produce adecuadamente como se ha descrito anteriormente, es decir, plasma normal como se define anteriormente que se hace deficiente en FII y FX, preferiblemente con procedimientos de inmunoagotamiento.

[0040] En algunas realizaciones, los kits de la invencion comprenden ademas una fuente de iones de calcio, que puede ser proporcionada en su propio contenedor designado o incluirse con el reactivo de coagulacion o el plasma deficiente. En otras realizaciones, el calcio no se proporciona como parte del kit, ya que muchos laboratorios y aparatos de coagulacion tienen fuentes adecuadas de reactivo de calcio.

[0041] El reactivo de coagulacion y dicho plasma deficiente pueden proporcionarse en ciertas realizaciones ser proporcionado en un unico recipiente, que ademas se puede proporcionar con o sin iones de calcio. En otras realizaciones, el reactivo de coagulacion y el plasma deficiente se proporcionan en recipientes separados.

[0042] El reactivo de coagulacion y el plasma deficiente se proporcionan preferiblemente en forma de polvo liofilizado, ya sea o no proporcionados separados o combinados en el mismo vial. Dicho uno o mas recipientes se configuran adecuadamente de manera que el material liofilizado puede ser reconstituido en el recipiente original.

EJEMPLOS - PARTE EXPERIMENTAL

[0043] Los inventores estaban interesados en estudiar la contribucion de cada factor de coagulacion VKD sobre la coagulacion, medido por tromboelastometria de rotacion (ROTEM). Los resultados de estos experimentos llevo a creer que la influencia de la FII y FX llevaba sustancialmente mas peso en la formacion de coagulos que FVII y FX a concentraciones cllnicamente relevantes de estos factores. Sin embargo, no se pudo discernir la diferencia entre el efecto de FII y FX. Esta observacion dio lugar a la presente invencion, tal como se describe a continuacion.

[0044] No se tenia conocimiento de un estudio previo usando ROTEM activado con tromboplastina altamente diluida para evaluar sistematicamente la contribucion de cada uno de los factores de coagulacion dependientes de la vitamina K en la formacion de coagulos. ROTEM es una prueba de coagulacion global realizada habitualmente en sangre entera. El procedimiento ROTEM, ademas de medir el tiempo de iniciacion de la polimerizacion de la fibrina, es decir, el tiempo de coagulacion (ROTEM CT, fase de iniciacion) tambien mide los aspectos consiguientes de la coagulacion (Rand et al, Blood, 1996. 88 (9): pag. 3432-45), incluyendo la velocidad de la fase de propagacion posterior de la formacion del coagulo mayor (medida como angulo alfa o velocidad maxima ROTEM, "MaxVel") y, finalmente, la maxima firmeza del coagulo (MCF), que refleja la fase de estabilizacion final (Sorensen et al., J Thromb Haemost, 2003. 1 (3): pag 551-8). Los resultados ROTEM realizados sobre sangre entera son una funcion no solo de factores de coagulacion, sino tambien de la funcion plaquetaria, proteasas, inhibidores y el sistema fibrinolltico. ROTEM, en opinion de algunos investigadores, describe mejor la formacion de coagulos que las pruebas de coagulacion tradicionales realizadas sobre PPP, ya que las pruebas de coagulacion tradicionales solo miden la fase de iniciacion (Ganter et al, J Cardiothorac Vasc Anesth, 2008. 22 (5): pag. 675 -80). Dado que no se pudieron realizar experimentos sobre la sangre entera se compararon experimentos realizados sobre PPP con experimentos con fosfollpido de plaquetas anadidos o plaquetas de bancos de sangre. La mayorla de los resultados fueron similares, a menos que se indique lo contrario. En nuestros experimentos ROTEM se utilizo una tromboplastina altamente diluida (1:17.000) (Brummel et al, supra) que puede reflejar mas estrechamente la concentracion fisiologica del factor tisular que la alta concentracion de tromboplastina utilizada en las pruebas de TP.

Reactivos y las condiciones experimentales:

Preparacion de plasma y plaquetas

[0045] Se extrajo sangre de los pacientes en tratamiento con anticoagulacion con warfarina para la fabricacion de muestras de prueba de PPP. La sangre tambien se extrajo de veinte donantes sanos (10 hombres, 10 mujeres) para producir plasma normal mezclado (PNP), para las pruebas de coagulacion y analisis ROTEM. Usando una tecnica de mlnimo estasis, se extrajo sangre a traves de una aguja 21G en tubos Vacuette@ de citrato de sodio tamponado al 1/10 vol/vol 3,2% (0,109 mol/l) (Greiner, Kremsmunster, Austria). El plasma pobre en plaquetas (PPP) se preparo por centrifugacion de la sangre a 4°C durante 15 minutos a 2500 g, la eliminacion del sobrenadante y nueva

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centrifugacion durante 15 minutos a 2500 g. El PNP se prepare combinando el plasma normal recentrifugado y el material final se almaceno en alicuotas de 0,5 ml a -80°C. Los plasmas con deficit de factores inmunoagotados se obtuvieron de Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, Vermont, EE.UU.). Los plasmas inmunoagotados se agotaron selectivamente en los factores de coagulacion II, VII, IX o X y no hubo actividad inhibidora residual en los plasmas.

[0046] Se produjeron plaquetas congeladas-descongeladas (rafaga) (fosfolipidos de las plaquetas) y plaquetas lavadas a partir de un concentrado de plaquetas de un banco de sangre donado recientemente en dextrosa, acido y citrato (ACD). Para ambas, las plaquetas se lavaron de la siguiente manera: el plasma rico en plaquetas (PRP) se centrifugo durante 15 minutos a 2500 g y a continuacion se resuspendieron 1:1 vol/vol en tampon TBS (6,055 g de base Trizma (Sigma, Seetze, Alemania), 8,766 g de NaCl, pH 7,4, 1000 ml H2O). Despues de la resuspension, los tubos se llenaron con tampon TBS y se volvieron a centrifugar durante 10 min a 2500 g. El sobrenadante se elimino y el sedimento se resuspendio dos veces. La suspension final se conto automaticamente usando Sysmex 4000 (Sysmex Corp., Kobe, Japon) y la solucion final se ajusto a un recuento de plaquetas de 100x109/l. La solucion final fue congelada a -80°C, se descongelo de nuevo y a continuacion se volvieron a tomar alicuotas en tubos pequenos y se congelaron de nuevo para producir fosfolipidos plaquetarios, o alternativamente, las plaquetas lavadas se almacenaron a temperatura ambiente y se utilizaron en dos dias.

Reactivos

[0047] Los plasmas con deficit de factores utilizados para analizar los factores de coagulacion se obtuvieron de Diagnostica Stago (Asnieres, Francia). El tampon Hepes (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, con y sin CaCl2 200 mM, pH 7,4) se obtuvo de Bie y Berntsen Inc. (Herlev, Dinamarca). La tromboplastina recombinante (TF) (Innovin®) se obtuvo de Dade Behring (Marburg, Alemania). Innovin se reconstituyo y se almaceno en alicuotas de 100 ml a 80°C en tubos Eppendorf. Un tubo de Innovin se reconstituyo para cada experimento y se mezclaron 10 ml de Innovin en 990 ml de Hepes CaCl2 para producir una dilucion 1:100 que se diluyo aun mas mediante la mezcla de 100 ml de la dilucion 1:100 con 500 ml de Hepes CaCl2 para producir una solucion de trabajo 1:600.

[0048] El PPP inmunoagotado de los factores de coagulacion FII o FVII o FIX o FX o de FII y FX se obtuvieron de Haemotologic Technologies Inc. (Essex Junction, Vermont, EE.UU.). El plasma agotado se mezclo en plasma normal combinado en diferentes proporciones tal como se describe con cada experimento a continuacion. Se anadio tromboplastina y calcio y se midieron los tiempos de coagulacion en diluciones progresivamente crecientes de plasma normal con tampon de Owren.

Experimentos ROTEM

[0049] Los perfiles de formacion dinamica de coagulos de sangre fueron registrados por un Analizador de Coagulacion por Tromboelastometna ROTEM (Pentapharm, Munich, Alemania) tal como se describe en detalle en otras partes [Sorensen, B., et al, J Thromb Haemost, 2003. 1 (3): pag. 551-8. Ingerslev, J., et al. Haemophilia, 2003. 9 (4): pag. 348-52. Fenger-Eriksen, C., et al. Br J Anaesth, 2005. 94 (3): pag. 324-9], pero difiere en que en vez de sangre entera, se utilizo PPP citrado. En resumen, la mezcla de reaccion contenia 270 ml de plasma citrado + 30 ml de tampon + 20 ml de TF diluido y CaCl2. Todos los resultados mostrados son las medias de cuatro experimentos. La medicion por tromboelastometna (ROTEM) se baso en la activacion de la coagulacion con tromboplastina altamente diluida (dilucion final de la mezcla de reaccion de TF 1:17.000). La evaluacion de la formacion de coagulos de plasma se baso en parametros de tromboelastometna estandar, tales como el tiempo de coagulacion (TC), la velocidad maxima (MaxVel) y la firmeza maxima del coagulo (MCF). El CT caracteriza la fase de iniciacion de la formacion de coagulos. La MaxVel representa la fase de propagacion de la coagulacion y la MCF indica la fase de estabilizacion. 9999

[0050] Lo experimentos ROTEM se realizaron en diluciones de PNP realizadas con el plasma con deficit de factores pertinentes (FII, FVII, FIX o FX) mezclado gradualmente con el aumento de la proporcion de plasma normal con el fin de producir concentraciones finales de los factores de coagulacion de 1, 2, 4 , 8, 16, 32 y 50%. Las mezclas se diluyeron 1:600 en dos etapas con tampon HEPES CaCl2. Los experimentos se realizaron sin y con fosfolipido de plaquetas anadido o plaquetas del banco de sangre lavadas. Las cubetas experimentales se montaron en un soporte de copa de aluminio que fue controlado termostaticamente a 37°C. La mezcla de 270 ml de cada dilucion de plasma y 30 ml de plaquetas lavadas se colocaron en las copas de medicion. La medicion se inicio mediante la adicion de 20 ml de la dilucion 1:600 de TF recombinante y la colocacion de la copa en un pin de 6 mm de diametro que esta unido al extremo inferior de un eje vertical. Cada experimento se realizo por cuadruplicado.

Tiempo de protrombina

[0051] Tanto el tiempo de protrombina Quick (PT) como el tiempo de protrombina de Owren (tiempo de proconversion de protrombina, prueba P & P) se midieron en muestras de pacientes. Se utilizo el analizador de coagulacion STA-R (Diagnostika Stago, Asnieres, Francia). El PT se realizo utilizando STA-Neoplastine® CI plus como reactivo de coagulacion, con un valor de ISI de 1,3 y el P & P se realizo utilizando el reactivo STA-SPA 50 con

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ISI de 1,01 (ambos de Diagnostika Stago). El reactivo de P & P es similar al reactivo de PT, pero tambien consiste en plasma bovino absorbido anadido como fuente del factor V de coagulacion y fibrinogeno y, por tanto, solo es sensible a la actividad de FII, FVII y FX. Los porcentajes de P & P se calcularon a partir de una curva estandar basandose en plasma combinado diluido en serie en tampon de Owren. La INR se calcula tal como se describe anteriormente.

Analisis estadlstico

[0052] Se utilizo el software estadlstico GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc. CA, EE.UU.) para la representation grafica y calculos estadlsticos, incluyendo y analisis de regresion lineal y no lineal. Todos los datos se muestran como media ± 1 error estandar de la media (SEM).

RESULTADOS

Ejemplo 1: PT y P & P en relation con la reduction selectiva de los factores VKD individuales.

[0053] La relacion entre PT y la concentration reducida de los factores de coagulacion VKD seleccionados FII, FVII, FIX o FX en PPP se muestra en la Figura 1. El tiempo de protrombina Quick se muestra en el panel A y el tiempo de protrombina de Owren (P & P) en el panel B. Los experimentos se realizaron mediante el agotamiento gradual de plasma completamente immunoagotado de un solo factor mediante la mezcla gradual en plasma normal. Tal como se esperaba, ambos tipos de mediciones de PT (Quick y Owren) eran igualmente sensibles a la concentracion de FII, FVII y FX a lo largo de las concentraciones probadas, mientras que ninguna medicion fue sensible a la actividad de FIX.

Ejemplo 2: Correlation de parametros ROTEM con PT de Owren en muestras de pacientes tratados con warfarina

[0054] Se compararon los parametros de ROTEM y los resultados de pruebas de P & P en muestras de PPP obtenidas de 65 pacientes consecutivos tratados con warfarina que asistieron a la cllnica de anticoagulacion (Figura 2). Solo hubo una correlacion moderada entre la actividad coagulante en porcentaje de la prueba P & P y el CT de ROTEM (R2 = 0,27, p <0,0001) con una marcada variation en el CT de ROTEM en un porcentaje similar de P & P. Hubo una mala correlacion entre la MaxVel de P & P y ROTEM (R2 = 0,08, p <0,0001) y la MCF de ROTEM (R2 = 0,11, p = 0,0014). Se observan resultados similares si la INR se representa frente a los parametros de ROTEM (no mostrados). Los parametros de ROTEM tambien se midieron en PPP adsorbido igualmente agotado de todos los factores VKD. Mediante la mezcla en concentraciones progresivamente aumentadas de PPP normal combinado, el plasma adsorbido se agoto gradualmente con concentraciones iguales de factores VKD. Con todas las concentraciones de factores VKD igualmente reducidas, se encontro una buena correlacion, es decir, R2 por regresion no lineal fue de 0,79 para el CT de ROTEM, 0,64 para la MaxVel de ROTEM y 0,77 para la MCF de ROTEM (curvas no mostradas).

Ejemplo 3: Parametros de ROTEM en relacion con la reduccion selectiva de factores VKD individuales

[0055] Con el fin de evaluar por separado la influencia de cada factor VKD en parametros de ROTEM, se ha probado la coagulacion con ROTEM en PPP selectivamente inmunoagotado en un solo factor VKD individual y a continuation se agoto gradualmente en el factor deficiente relevante mediante la mezcla en el plasma normal. Los datos mostrados en la figura 3 se refieren a experimentos en PPP sin fosfollpido de plaquetas anadido o plaquetas lavadas. El CT de ROTEM (fase de initiation) (Figura 3A) se prolongo marcadamente mas mediante la reduccion selectiva gradual en FII o FX a niveles leves y moderadamente bajos (similares a los deseados durante la anticoagulacion) que mediante reducciones similares en FVII o FIX. Los resultados fueron similares en PPP con fosfollpido de plaquetas anadido y en PPP con plaquetas lavadas anadidas (datos no mostrados). La MaxVel de ROTEM (Figura 3B) que representa la fase de propagation de la formation de coagulos de ROTEM tambien fue mas dependiente de la concentracion de FII y FX que de la concentracion de FVII o FIX en PPP y tambien en PPP enriquecido con fosfollpidos de plaquetas (datos no mostrados), pero posiblemente mas dependiente de la concentracion de II que de la concentracion de X con plaquetas lavadas anadidas (datos no mostrados). Por ultimo, la fase de estabilizacion o MCF de ROTEM en PPP (Figura 3C) fue mas dependiente de FII y FX que de FIX o FVII.

[0056] En base a estos experimentos de ROTEM, se concluyo que FII o FX tienen mas peso en la formacion de fibrina que los factores de FVII y FIX a concentraciones de factor redcidas levemente y moderadamente, similares a las presentes y deseadas durante la terapia con cumarina. FII y FX tenlan mas influencia en todas las fases de la formacion de coagulos (iniciacion, propagacion y estabilizacion) que FVII y FIX. La mala correlacion de los parametros de ROTEM con el PT de Owren (INR) descrita anteriormente en muestras de plasma de pacientes posiblemente refleja esta discrepancia entre FVII por un lado y FII y FX por otro en la formacion de coagulos en pruebas de PT y ROTEM.

[0057] Tambien se concluyo que el efecto combinado de FII y FX puede tener considerablemente mas peso en la formacion de coagulos que FVII o FIX a concentraciones de factores relevantes para la terapia anticoagulante. Sin embargo, dado que FVII tiene una vida media mucho mas corta que FII y FX, las fluctuaciones en los tiempos de

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protrombina (PT o P & P) puede estar a veces relacionada principalmente con el cambio de concentracion de FVII y no puede predecir un verdadero cambio en la potencial formation de coagulos o en el efecto antitrombotico. El efecto confuso de FVII que causa la fluctuation de PT podrla conducir potencialmente a la dosificacion erronea de AVK y pruebas de monitorizacion innecesariamente frecuentes. Por lo tanto, la inclusion de sensibilidad a FVII en las pruebas de monitorizacion actuales, posiblemente puede reducir la eficacia y la seguridad y aumentar el costo de la terapia con cumarinas. Se contempla que la fluctuacion en el efecto anticoagulante de AVK podrla reducirse mediante la elimination de la influencia de FVII en las pruebas de monitorizacion.

Ejemplo 4: Procedimiento de Fiix aplicado en plasma de muestra

Prueba basada en el procedimiento de Fiix

[0058] La presente invention se basa en la idea de que mediante la mezcla de una muestra de plasma a analizar con plasma que es deficiente (totalmente agotado) en los factores FII y FX (aqul referido como plasma deficiente en Fiix), corrigiendo as! todas las demas deficiencias de factores de coagulation posibles en la muestra, y posteriormente midiendo el tiempo de coagulacion despues de la activation de la coagulacion con un reactivo de coagulacion, los resultados de la prueba solo reflejaran la actividad de la coagulacion de FII y FX.

[0059] Los resultados de la prueba se pueden obtener como tiempo de coagulacion, la relation del tiempo de coagulacion o cualquier otro punto final que mide la generation de trombina o la formacion de fibrina. Los resultados experimentales mostrados en los ejemplos del presente documento se basan en la medicion de los tiempos de coagulacion con tromboplastina (STA® - Neoplastine® CI plus de Diagnostica Stago) como reactivo de coagulacion en el instrumento STA-R (Diagnostica Stago). Dado que esta es una variante del tiempo de protrombina, se le denomina "tiempo de protrombina de Fiix" o PT de Fiix.

[0060] En el nuevo procedimiento, que se le denomina procedimiento de Fiix, se mezcla una muestra de plasma de prueba (el plasma del paciente) se mezcla con plasma normal que ha sido immunoagotado en FII y FX (plasma deficiente en Fiix). Utilizando dicha mezcla, mediante la adicion de tromboplastina y calcio, se puede medir una variante del tiempo de protrombina que solo es sensible a FII y FX, es decir PT de Fiix. En el PT de Fiix, las proporciones de plasma de prueba con respecto a plasma deficiente en Fiix pueden estar en el intervalo de 1:1 a 1:20 partes, preferiblemente en el intervalo de 1:2 a 1:10 (ver a continuation).

[0061] Los resultados demostrativos de los experimentos de los presentes inventores utilizando tromboplastina como reactivo de coagulacion (es decir PT de Fiix) se muestran en la figura 4. Los resultados muestran los tiempos de coagulacion obtenidos en relacion con el "porcentaje de Fiix", es decir, la concentracion en porcentaje de FII y FX combinados. Las diferentes curvas representan diferentes diluciones de plasma normal, as! como diferentes relaciones de plasma muestra normal con respecto a plasma deficiente en Fiix en la mezcla.

[0062] La relacion de plasma de prueba y el plasma deficiente en Fiix en las muestras mostradas en la figura 4 es la siguiente: v 0,09 (1 + 10); V 0,17 (1 + 5); ^ 0,25 (1 + 3); ° 0,28 (1 + 2,5); TO,31 (1 + 2,2); + 0,40 (1 + 1,5).

[0063] Se utilizaron diferentes relaciones, pero el objetivo era ser capaz de medir de forma fiable concentraciones de FII y Fx < 2 u/dl (u se refiere a unidades equivalentes de plasma). Con el fin de medir con precision concentraciones de FII y FX tan bajas como < 2 u/dl, los resultados experimentales sugieren que una relacion preferible de plasma de prueba con respecto al plasma deficiente en Fiix esta en el intervalo de 1:2-1:10.

[0064] En base de los experimentos mostrados en la figura 4 se decidio medir el PT de Fiix mediante la mezcla de 80 ml de una dilucion 1:7 de plasma de prueba con 25 ml de plasma deficiente en Fiix (es decir, proportion final de 1 parte de plasma de prueba a 2,2 partes de plasma deficiente en Fiix). A continuacion, se midio el "PT de Fiix" en muestras de 38 pacientes en tratamiento estable con warfarina y se calculo la relacion normalizada internacional ("INR de Fiix" o “Fiix-INR”). Tal como se muestra en la figura 5, la INR de Fiix se correlaciona bien con los valores de INR basados en PT de Owren (INR de PP; R2 = 0,87, p <0,0001). Los resultados correspondientes se encontraron cuando INR de Fiix se correlaciono con INR basado en PT Quick (INR de PT, datos no mostrados).

[0065] En la figura 6, se muestran mediciones secuenciales de INR de Fiix, INR de PP, FII, FVII y FX durante 49 dlas en un unico paciente empezando con warfarina. La cantidad de factores de coagulacion (porcentaje) se muestra en el eje Y izquierdo y el valor de INR en el eje Y derecho. El cambio en la INR en relacion con cambios en las concentraciones de los factores VKD se puede derivar de la grafica. En resumen, la INR de PT muestra mas que la fluctuacion que la INR de Fiix, siendo la razon que la INR de PT responde a los rapidos cambios que se producen en FVII, pero la INR de Fiix no. Sin embargo, dado que, en base a los experimentos previamente discutidos y la hipotesis basados en los mismos, de que la concentracion de FII y FX es el principal responsable del efecto antitrombotico de la warfarina, se presenta que la INR de Fiix describe con mas precision el efecto antitrombotico presente en el paciente.

[0066] En particular, se puede observar que el valor de INR de PT se eleva mucho mas rapido que la INR de Fiix los

primeros dlas de la administracion, esto se puede atribuir a la reduccion rapida de FVII, lo que tiene un efecto en el valor de INR de PT medido, pero no en el valor de INR de Fiix. El valor INR de PT indica que ya en el dla 3, el paciente ha alcanzado un rango anticoagulado aceptable (zona gris) y la inmersion despues del dla 4 indica que la dosis de warfarina probablemente se ha reducido. La curva de Fiix, por otro lado, indico que el paciente alcanza un 5 valor de INR aceptable (anticoagulacion aceptable) en el dla 5. El valor de Fiix permanece en la zona de INR adecuada en los siguientes dlas 6 y 7, mientras que los valores de INR de PT erroneamente indican que el paciente esta recibiendo una dosis demasiado alta de warfarina.

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para medir la actividad de un farmaco anticoagulante antagonista de la vitamina K en un paciente, que se basa en la medicion en una muestra de plasma de prueba de dicho paciente de la actividad combinada de dos y unicamente los factores de coagulacion II y X, comprendiendo el procedimiento:

- mezclar dicha muestra de plasma de prueba con plasma deficiente solo en el factor II y el factor X, en el que la proporcion de dicha muestra de plasma de prueba y dicho plasma deficiente esta en el intervalo de 1:1 a 1:20,

- anadir a dicha muestra de plasma de prueba uno o mas reactivos de coagulacion y calcio, y

- determinar la capacidad de coagulacion de la sangre mediante la medicion del tiempo de coagulacion de la sangre o la generation de trombina.
2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que dicho uno o mas reactivos de coagulacion se seleccionan del grupo que consiste en:

i) tromboplastina,

ii) fosfollpidos,

iii) factor IXa,

iv) factor XIa,

v) factor XIIa,

vi) calicrelna,

vii) activador exogeno, incluyendo venenos de serpiente que activan el factor X, y

viii) factor VII a
3. Procedimiento, segun la reivindicacion 2, que comprende anadir un activador de contacto seleccionado del grupo que consiste en:

i) partlculas de caolln,

ii) celite,

iii) partlculas de vidrio,

iv) partlculas de sllice, y

v) acido elagico.
4. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la etapa de diluir dicha muestra de plasma de prueba con tampon o solution salina.
5. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho reactivo de coagulacion se diluye con agua, una solucion acuosa salina o una solucion acuosa tamponada.
6. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos un componente de dicho reactivo de coagulacion, plasma deficiente o fuente de calcio esta liofilizado, y en el que el procedimiento comprende ademas una etapa de reconstitution de dicho al menos un componente.
7. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa de determinar la capacidad de coagulacion de la sangre comprende un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en:

- detection manual/visual de la coagulacion,

- procedimientos mecanicos y/o electronicos para observar cambios de viscosidad,

- procedimientos opticos de deteccion de la formation de coagulos,

- deteccion cromogenica utilizando sustratos cromogenicos,

- deteccion fluorogenica utilizando sustratos fluorogenicos, y

- deteccion luminogenica.
8. Kit de prueba para medir la actividad de un farmaco anticoagulante antagonista de la vitamina K en un paciente, que comprende:

- un reactivo de coagulacion, y

- plasma normal que es deficiente solo en el factor II y el factor X y que contiene otros factores, que incluyen el factor VII y IX (plasma deficiente en Fiix), y

- opcionalmente, que comprende una fuente de iones de calcio.
9. Kit de prueba, segun la reivindicacion 8, que comprende en un recipiente dicho reactivo de coagulacion y dicho plasma deficiente en Fiix.
10. Kit de prueba, segun la reivindicacion 8 o 9, que comprende un primer recipiente que comprende dicho reactivo de coagulacion y dicho plasma deficiente en Fiix.
11. Kit de prueba, segun la reivindicacion 8, que comprende en un primer recipiente dicho reactivo de coagulacion y en un segundo recipiente dicho plasma deficiente en Fiix.
12. Kit de prueba, segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que dicho reactivo de coagulacion se

selecciona entre uno o mas de:

i) tromboplastina,

ii) fosfollpidos,

iii) factor IXa,

5 iv) factor XIa,

v) factor XIIa,

vi) calicrelna,

vii) activador exogeno, incluyendo venenos de serpiente que activan el factor X, y

viii) factor Vila

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13. Kit de prueba, segun la reivindicacion 12, en el que dicho reactivo de coagulacion comprende fosfollpidos, en el que el kit comprende en un recipiente dicho reactivo de coagulacion, un activador de contacto, tal como se describe en la reivindicacion 4, y plasma deficiente en Fiix.

15 14. Kit de prueba, segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que dicho reactivo de coagulacion y/o dicho

plasma deficiente en Fiix estan liofilizados.