ES2255121T3 - Procedimiento para la determinacion del potencial anticoagulante de una muestra y procedimiento para la determinacion de la glicosilacion de trombomodulina. - Google Patents
Procedimiento para la determinacion del potencial anticoagulante de una muestra y procedimiento para la determinacion de la glicosilacion de trombomodulina.Info
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Abstract
LA SOLICITUD TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTICOAGULANTE DE UNA MUESTRA MEDIANTE LA ADICION DE TROMBOMODULINA Y TROMBOPLASTINA EN UN ENSAYO DE COAGULACION.
Description
Procedimiento para la determinación del potencial
anticoagulante de una muestra y procedimiento para la determinación
de la glicosilación de trombomodulina.
La solicitud se refiere a un procedimiento para
la determinación del potencial anticoagulante de una muestra por
adición de una trombomodulina y una tromboplastina en un ensayo de
coagulación.
La activación de la coagulación desemboca en la
conversión de la proenzima protrombina en la proteasa activa
trombina. La trombina acelera su formación por sí misma, activando a
los cofactores factor V y factor VIII por disociación proteolítica.
Estos cofactores activados forman con las proteasas factor Xa y
respectivamente IXa unos complejos activos de enzima y cofactor
sobre superficies de fosfolípidos, cuya actividad es más alta en un
factor de 10.000 que la de las proteasas singulares. Por medio de
este retroacoplamiento positivo se llega casi de un modo explosivo
a la formación de grandes cantidades de trombina. La trombina
convierte al fibrinógeno en fibrina, que en un caso normal conduce
a la oclusión de una herida y a la curación de una herida. A fin de
impedir una propagación, amenazadora de la vida, de la coagulación,
que conduciría a una oclusión del sistema vascular en el cuerpo, y
por lo tanto, a trombosis, se deben de reprimir tanto la proteasa
activa como también el suministro posterior de la proteasa. Las
proteasas activas son neutralizadas en el cuerpo por agentes
inhibidores de proteasas mediante la formación de complejos
covalentes. El más importante agente inhibidor de proteasas es la
antitrombina III, cuyo efecto anticoagulante es acelerado por
sulfatos de heparina. La formación continuada de proteasas activas
de la coagulación es interrumpida retroacoplando por la propia
trombina. La trombina se fija a la proteína membranal trombomodulina
y pierde de esta manera sus propiedades promotoras de la
coagulación (procoagulantes), tales como la activación de plaquetas
o la conversión de fibrinógeno. El complejo entre trombina y
trombomodulina convierte a la proenzima proteína C, en presencia de
iones de calcio, en la proteasa activa proteína Ca (APC) (efecto
A). Junto a esto, la trombomodulina, que es un sulfato de heparano,
actúa por sí misma oponiéndose a la coagulación por medio de su
glicosilación. La formación de un complejo inactivo entre trombina
y antitrombina III se acelera de esta manera (Dittman WA, Majerus
PW, Blood 1990; 75: 329-336; Bourin
M-C, Lindahl U, Biochem. J 1990: 270:
419-425). La APC resultante forma con su cofactor,
la proteína S, un complejo, que disocia proteolíticamente a los
cofactores activos factor VIIIa y factor Va, y los desactiva de
esta manera. La APC interrumpe, por consiguiente, la fuerte
estimulación mediante estos cofactores y la formación ulterior de
los factores Xa y respectivamente trombina. Otra proteína membranal,
el receptor endotelial de la proteína C, parece estimular a la
actividad activadora de la proteína C del complejo entre trombina y
trombomodulina.
Este sistema de proteína C, que antes se ha
descrito, constituye un importante mecanismo anticoagulante. Esto
es confirmado por el hecho de que personas con deficiencias o
defectos de carácter hereditario o adquirido en la proteína C o la
proteína S padecen con una alta probabilidad de trombosis, en
particular de trombosis venosas recidivantes. Junto a la proteína C
y la proteína S, pueden influir sobre la actividad del sistema
otros factores, a saber el factor de von Willebrand y el factor IXa,
que pueden proteger al factor VIIIa con respecto de una
descomposición proteolítica. Los trastornos adquiridos pueden
retroceder también a la formación de anticoagulantes de lupus.
Éstos son anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos, que perturban a
la fijación a superficies de fosfolípidos, que es necesaria para la
función, de los complejos entre una proteasa y un cofactor. Además,
se describió una mutación del factor V, que ya no puede ser
desactivada por la APC, o por lo menos puede serlo solamente muy
mal. Además, se conocen mutaciones de los factores que participan en
el complejo entre trombina y una trombomodulina, que conducen a una
formación disminuida de proteína C activada, tales como mutaciones
de la propia trombomodulina, de la proteína C y de la trombina.
Defectos o deficiencias de la antitrombina III
son una causa adicional de la formación de trombosis. La
determinación de la antitrombina III se efectúa, por regla general,
mediante adición de trombina y heparina a una muestra altamente
diluida y mediante determinación de la trombina residual por adición
de un substrato cromógeno o de fibrinógeno, y mediante la
determinación de la velocidad de conversión y respectivamente la
formación de un coágulo de fibrina.
A causa de los muchos trastornos posibles del
sistema de proteína C, importante por su efecto antitrombótico, es
conveniente en el diagnóstico clínico utilizar un ensayo de
escrutinio, que indique de una manera general un trastorno en este
sistema, es decir de su potencial anticoagulante. Esto es válido en
particular cuando determinados trastornos, tales como en este caso
los causados por el factor de von Willebrand, el factor IXa, el
anticoagulante de lupus o una mutación del factor V, se pueden
analizar solamente con un gran gasto en laboratorios experimentados
especialmente en esto. Además de esto, un ensayo de escrutinio para
la determinación del potencial del sistema de proteína C puede
mostrar también trastornos, cuyas causas se pueden esclarecer en
particular solo difícilmente, tales como por ejemplo la influencia
de reacciones en fase aguda o inflamaciones, puesto que no se puede
esclarecer de un modo concluyente la cooperación de diferentes
factores a partir de una suma de determinaciones de factores únicos.
Además, en un ensayo tal de escrutinio se pueden determinar al
mismo tiempo trastornos, cuya causa no se conozca todavía en el
momento actual. Un ensayo tal sirve, por consiguiente, para la
búsqueda de trastornos de factores únicos o múltiples de un
paciente, que pueden conducir a un riesgo aumentado de
trombosis.
La utilización de un ensayo que determina el
potencial anticoagulante de una muestra, es decir del sistema de
proteína C y/o de la antitrombina III, va más allá de la
determinación de una causa individual, y adquiere una validez
propia, que sirve en la práctica clínica para reconocer una
tendencia aumentada a la trombosis (trombofilia) y, por
consiguiente, muestra consecuencias para la terapia, tales como, por
ejemplo, la terapia anticoagulante con derivados de cumarina o con
heparinas. Una aplicación adicional de este ensayo es por
consiguiente el control de la terapia anticoagulante.
Hasta ahora, la proteína C o la proteína S se
investigaron como factores individuales en cuanto a su
funcionalidad. Para esto, la muestra, o la proteína C aislada a
partir de la muestra, se añade primeramente en un defecto a un
plasma deficiente en proteína C. La activación de la proteína C se
efectúa a continuación o bien mediante la adición de trombina o de
una combinación de trombina y una trombomodulina, o por adición de
un veneno de serpiente de Agkistrodon contortrix, que es
conocido bajo su nombre comercial Protac® (de la entidad
Pentapharm, Basilea, Suiza). La detección de la proteína C presente
en la muestra se efectúa o bien con ayuda de la prolongación del
tiempo de coagulación mediante el efecto anticoagulante de la
proteína C presente en la muestra, o mediante conversión de un
substrato específico para trombina. Alternativamente, mediante la
utilización de un substrato específico para la APC, la actividad de
la proteína C, después de una activación con trombina o Protac®, se
puede determinar también directamente de una manera cromógena.
Las determinaciones de la proteína S (PS) se
efectúan mediante mezcladura de la muestra con un plasma deficiente
en cuanto a PS. La determinación del efecto anticoagulante de la APC
se efectúa mediante determinación de la prolongación de la
coagulación. O bien se añade la APC requerida para esto, o mediante
Protac® se activa la proteína C en el plasma deficiente en PS
(Bertina, RM, Res. Clin. Lab. 1990; 20: 127-138).
Un procedimiento para la determinación de la proteína S mediando
utilización de una trombomodulina fue descrito por Matschiner
(véase el documento de patente de los EE.UU. US 5.525.478) (véase
más adelante).
Ciertos procedimientos conocidos para la
determinación de la proteína C mediando utilización de una
trombomodulina se basan en el aislamiento de la proteína C a partir
de la muestra mediante adsorción. Esta proteína C aislada a partir
de la muestra es activada a continuación mediante un complejo entre
trombina y una trombomodulina, y la proteína C activa producida se
detecta en un ensayo cromógeno (Thiel, W. y colaboradores, Blut
1986; 52: 169-177). Este procedimiento es complicado
y no determina el potencial total del sistema de proteína C. Además
de esto, la utilización está limitada a procedimientos cromógenos,
es decir que no se puede determinar de esta manera la repercusión
fisiológica sobre la formación de un coágulo de fibrina.
En el documento de patente europea EP 0.711.838
se describe un procedimiento para la determinación funcional de
variantes del factor V, cuya forma activada se caracteriza, en
comparación con el factor Va normal, por una disminuida
desactivación mediante la APC. Para esto, la muestra se mezcla con
un plasma deficiente en cuanto a factor V a fin de excluir
influencias perturbadoras, por ejemplo una deficiencia de factores,
anticoagulantes de lupus o influencias terapéuticas (antagonismo
oral de la coagulación (anticoagulación), heparina), y a
continuación, se lleva a cabo un ensayo de coagulación en presencia
de la proteína C activada.
También se describió ya que, a fin de detectar
mutantes de la trombina, se emplea un procedimiento para la
detección de una trombomodulina, que está caracterizado porque éstos
no forman ningún complejo activo con trombomodulina. Para esto se
diluye la muestra, de tal manera que después de una activación de la
protrombina para dar trombina por enzimas procedentes de venenos de
serpiente, conocidas de por sí para un experto en la especialidad,
no resulta ningún coágulo, que perturbe a la subsiguiente
determinación. Después de haber añadido trombomodulina y la
proteína C, se vigila la formación de proteína C activada mediante
conversión de un substrato cromógeno para la proteína C. Este
procedimiento ya se utilizó también a fin de ensayar la actividad
de diferentes variantes naturales de la protrombina y
respectivamente de la trombina, con una trombomodulina.
Los métodos expuestos hasta ahora son apropiados
solamente para detectar trastornos del sistema de proteína C
mediante el factor investigado singularmente en cada caso. Debido a
las consideraciones expuestas más adelante, éstos no son apropiados
como ensayos de escrutinio. A una amplia introducción como ensayos
de escrutinio se oponía hasta ahora también la insuficiente
practicabilidad del procedimiento de determinación.
Para la determinación de trastornos del FV, Amer
y colaboradores (Thromb. Res. 1990; 57: 247-258)
modificaron el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT). El
APTT es un procedimiento clásico para la detección de trastornos de
la coagulación, es decir sirve para el reconocimiento de tendencias
a hemorragias. Después de una activación del plasma de muestra
mediante una superficie activadora, la coagulación no se inicia,
como es usual en el caso del APTT, mediante adición de una solución
de cloruro de calcio, sino que se añade la APC simultáneamente con
los iones de calcio. Los tiempos de coagulación se prolongan por
medio del efecto anticoagulante de la APC añadida exógenamente.
Este ensayo reconoce, por consiguiente, ya muchas trastornos del
sistema de proteína C, con la excepción de defectos o deficiencias
de la proteína C en la muestra, puesto que la APC se añade
exógenamente, y tampoco se presenta ningún trastorno que concierna,
por ejemplo, a la interacción de la proteína C y/o trombina con una
trombomodulina.
En el documento DE 44.27.785 se describe un
procedimiento para la determinación de trastornos del sistema de
proteína C, en el que la proteína C de la muestra (endógena) que se
ha de investigar se activa previamente en primer lugar con un
activador de la proteína C. A continuación, se comprueba en un
ensayo de coagulación el efecto de la APC resultante sobre el
retraso de la formación de trombina. Como activadores de la
proteína C pasan a utilizarse activadores conocidos, tales como
enzimas procedentes de venenos de serpiente (por ejemplo, de
Agkistrodon contortrix, nombre comercial Protac®) o complejos
entre trombina y trombomodulina. La detección de la formación de
trombina se puede efectuar a través de la formación de coágulos
(procedimiento clásico) o mediante un substrato cromógeno. Los
ensayos de coagulación como fundamento para el reconocimiento del
efecto anticoagulante del sistema de proteína C abarcan todos los
procedimientos de por sí conocidos para un experto en la
especialidad, tales como el del APTT, el del tiempo de
tromboplastina (PT), el del tiempo del veneno de la víbora de
Russell (RVVT de Russell’s Viper Venom Time), el de la adición de
factores activados de coagulación o de venenos de serpiente, o de
enzimas procedentes de éstos, que conducen en última instancia a la
formación de trombina, y por consiguiente, de un factor V activado.
En este procedimiento, a diferencia de los procedimientos actuales,
se determinan todos los trastornos del sistema de proteína C, con la
excepción de variantes de la trombina así como también de la
trombomodulina. Otras variantes de la proteína C se pueden detectar
en este procedimiento, en el que se utilizan complejos, formados
previamente, entre trombina y una trombomodulina.
Basándose en el tiempo de tromboplastina, un
procedimiento clásico en el diagnóstico de la coagulación, se
describe en el documento de patente francesa FR 2.689.640 un
procedimiento, en el que en una muestra, mediante adición de una
tromboplastina y calcio, se activa la coagulación. La trombina
resultante de este modo activa, en el caso de una adición
simultánea de una trombomodulina a la proteína C en la muestra
(endógena). En dependencia de la aptitud funcional del sistema de
proteína C, la APC actúa oponiéndose a la formación de trombina.
Después de 15 minutos, mediante conversión de los iones de calcio
en complejos, se interrumpe la actividad ulterior de coagulación y
la trombina resultante se determina por conversión de un substrato
cromógeno específico. La cantidad resultante de trombina es
indirectamente proporcional a la capacidad funcional del sistema de
proteína C. Se pueden reconocer todos los trastornos del sistema de
proteína C de la muestra, puesto que se activan tanto la proteína C
endógena, como también la protrombina endógena. El ensayo tiene, no
obstante, algunas desventajas. Por una parte, mediante largo tiempo
total de medición, de 16 minutos, este procedimiento es inapropiado
para un empleo rutinario como ensayo de escrutinio. En segundo
lugar, en la muestra se produce un coágulo antes de la formación
propiamente dicha de proteína C activada, de tal manera que este
procedimiento es posible solamente en combinación con métodos
cromógenos de medición, que determinan la conversión de la trombina
producida. Por consiguiente, ya no es posible la metodología
tradicional de medición, que determina la formación del coágulo de
fibrina. A fin de impedir interferencias con el coágulo resultante,
en el procedimiento según Duchemin y colaboradores, por lo tanto,
antes de la investigación se elimina el fibrinógeno de la muestra,
por ejemplo mediante adición de enzimas que disocian a la
fibrina.
Procedimientos similares son descritos por
Rijkers y colaboradores (Rijkers DTS y colaboradores, Thromb.
Haemost. 1997; Suplemento; 550 resumen PS-2251) y en
el documento US 5.051.357.
Estos procedimientos descritos hasta ahora, para
la activación de la proteína C de la muestra mediando utilización
de la protrombina endógena de la muestra, y de una trombomodulina
añadida exógenamente, están caracterizados porque
- 1.
- se necesita una incubación previa para la formación de la proteína C activada;
- 2.
- la activación de la trombina endógena conduce a una formación prematura de un coágulo de fibrina, por lo que, antes del análisis, se tiene que destruir el fibrinógeno en la muestra y, por lo tanto,
- 3.
- son posibles solamente procedimientos cromógenos de detección;
- 4.
- condicionado por los tiempos de incubación y/o por el tratamiento previo de la muestra, resulta en total un largo período de tiempo de medición (mayor que10 minutos).
Para el análisis del potencial del sistema de
proteína C serían ventajosos, no obstante, aquellos métodos que
permitan una determinación rutinaria en coagulómetros habituales, es
decir que permitan unos cortos tiempos de medición (menores que 10
minutos) y la determinación tradicional de un coágulo de
fibrina.
Una misión del invento fue, por lo tanto,
encontrar un procedimiento que permita determinar el potencial del
sistema de proteína C también en procedimientos clásicos y con
cortos tiempos de medición. Una misión adicional consistió en que
tal ensayo también ha de determinar conjuntamente también unas
cantidades deficitarias (déficits) de la antitrombina III.
Un procedimiento para la determinación del
potencial de la proteína C ha sido descrito por Matschiner en el
documento US 5.525.478, en este caso la muestra se incuba con un
activador de fases de contacto y, a continuación, la coagulación se
activa con una mezcla de cloruro de calcio y una trombomodulina, en
lugar de con cloruro de calcio,. Matschiner expone que en el caso
de añadirse 1 U/ml de una trombomodulina (de conejo) se prolonga el
tiempo de coagulación en el APTT desde 36 hasta 156 s. Él describe
además procedimientos derivados de éste para la determinación de la
proteína C y la proteína S, mezclando la muestra con un plasma
deficiente en proteína C y respectivamente en proteína S, antes de
su utilización en este ensayo. Ensayos propios (véase el Ejemplo 3)
pudieron confirmar que una adición de 5 \mug/ml (referida a la
tanda total de ensayo) de una trombomodulina (de conejo) es
necesaria para prolongar el tiempo de coagulación en el APTT desde
aproximadamente 30 hasta aproximadamente 160 s.
Determinaciones análogas fueron llevadas a cabo
también con una trombomodulina recombinante; como era de esperar,
se encontró una prolongación del tiempo de coagulación (Ohishi y
colaboradores, Thromb. Haemostas. 1993; 70:
423-426). De manera interesante, este efecto sólo es
muy débilmente pronunciado (aproximadamente 150 s (segundos) con
aproximadamente 1 \mug/ml de trombomodulina en el plasma;
aproximadamente 1 U/ml de trombomodulina). Éste, no obstante, es
visible solamente cuando, como en este caso, el tiempo de
coagulación sin la adición de trombomodulina es muy largo (450 s).
En el caso de estos largos tiempos de coagulación, los retrasos de
la formación de trombina repercuten en un grado superior al
proporcional sobre la formación de coágulos, por lo que esta
prolongación en 150 s no se puede comparar con la prolongación,
descrita por Matschiner, en el caso de un tiempo de coagulación de
base sin trombomodulina, que es muchísimo más corto. Este largo
tiempo de coagulación se había obtenido mediante el recurso de que
se utilizó un reactivo de tromboplastina muy fuertemente diluido
con cloruro de calcio. Estos largos tiempos de coagulación (mayores
que 300 s) son vistos muy críticamente por un experto en la
especialidad, puesto que la precisión de la determinación es muy
inexacta. Unas pequeñas oscilaciones en ciertos factores de
coagulación, en particular de los cofactores V y VIII, conducen a
unas prolongaciones grandes en grado superior al proporcional de
los tiempos de coagulación. Además, estos largos tiempos de
medición son impracticables para determinaciones rutinarias, puesto
que con ellos se disminuye en la rutina el caudal de paso de las
muestras.
Si, en lugar de un PT muy diluido, se utiliza un
PT normal, el efecto anticoagulante de una trombomodulina se puede
mostrar solamente mediante el empleo de unas cantidades muy altas.
Esto es observable a partir de las investigaciones de Takahashi y
colaboradores (Thromb. Haemostas. 1995; 73:
805-811). Los autores añadieron una trombomodulina
enriquecida procedente de orina a un plasma normal y llevaron a cabo
un PT normal con unos tiempos de coagulación sin trombomodulina de
aproximadamente 13 s. Por adición de unas concentraciones muy altas
se prolongó el tiempo de coagulación, pero incluso con 1.000 U/ml la
prolongación del tiempo de coagulación fue sólo de aproximadamente
17 s. Esto es insuficiente para una discriminación entre personas
normales y pacientes con estados de deficiencia del sistema de
proteína C.
Sorprendentemente, se encontró que una
trombomodulina, de la que se había eliminado la glicosilación
similar a heparina mediante la condroitinasa ABC, no presenta en el
procedimiento descrito por Matschiner ninguna prolongación tan
pronunciada del tiempo de coagulación.
A una trombomodulina preparada por vía
recombinante le falta asimismo la glicosilación apropiada a fin de
acelerar la desactivación de la trombina mediante antitrombina III
(efecto B), es decir que sólo presenta la propiedad de la
activación de la proteína C como cofactor para trombina (efecto
A).
El presente invento se basó, por lo tanto, en la
misión de poner a disposición un procedimiento de escrutinio para
la determinación del potencial anticoagulante. Por el concepto de
potencial anticoagulante se entiende la propiedad que posee el
plasma de producir, sobre la base de la inhibición directa de
trombina y/o del retraso de la formación de trombina, una
prolongación del tiempo de coagulación en un ensayo de coagulación
que se basa en la formación de trombina.
Los procedimientos de escrutinio plantean unos
requisitos especiales. Puesto que están pensados para elaborar un
alto número de muestras en un corto tiempo y, a pesar de todo, de
una manera muy fiable, no deberían sobrepasar un tiempo de medición
de 5 min, y ventajosamente se pueden llevar a cabo como un ensayo
de 1 etapa. Por el concepto de ensayo de 1 etapa se entiende un
ensayo, en el que entre las adiciones de reactivos no se necesita
ningún tiempo de incubación previa. Para el escrutinio de mayores
grupos de personas, es ventajosa la utilización de reactivos que se
puedan producir del modo más constante que sea posible, tal como p.
ej. la utilización de proteínas recombinantes, aquí p. ej. de una
trombomodulina recombinante. Un procedimiento de escrutinio tiene,
por lo tanto, que ser apto para funcionar también con una
trombomodulina recombinante tal, independientemente de cuál sea su
origen. El problema planteado por esta misión se resolvió mediante
las formas de realización puestas a disposición en las
reivindicaciones.
Es objeto del invento un procedimiento de
escrutinio para la determinación y el diagnóstico del potencial
anticoagulante de una muestra en presencia de una trombomodulina
añadida exógenamente, de origen humano o recombinante, que junto a
su actividad activadora de la proteína C presenta también la
propiedad de acelerar la inhibición de trombina mediante
antitrombina III, realizándose, en el caso de una trombomodulina
preparada por vía recombinante, que la propiedad desactivadora de la
trombina se restablece mediante unión con, o adición de, un
glicosaminoglicano, cuyo procedimiento incluye las siguiente
etapas:
- a)
- a la muestra, preferiblemente a una muestra de plasma, se le añaden los siguientes reactivos:
- i)
- una trombomodulina exógena, de origen humano o recombinante, que puede formar un complejo con trombina, pudiendo este complejo activar a la proteína C en la muestra, pudiendo la proteína C ser una proteína C endógena o añadida exógenamente,
- ii)
- un activador que, sin ninguna incubación intermedia, conduce a la activación de protrombina para dar trombina, pudiendo la protrombina ser una protrombina endógena o añadida exógenamente,
- iii)
- fosfolípidos,
- iv)
- iones de calcio,
- v)
- así como otros reactivos adicionales, que se utilizan generalmente para optimizar los ensayos de coagulación,
- b)
- la reacción se inicia mediante la adición del reactivo que contiene el activador de protrombina, y
- c)
- la formación de trombina se determina mediante medición de la velocidad de conversión de un substrato para trombina, determinándose esta velocidad de conversión por medio del tiempo de medición que transcurre hasta la formación de un coágulo de fibrina o por medio de la velocidad de conversión de un substrato marcado para trombina.
Como muestra se puede utilizar una sangre entera
procedente de venas o capilares, y un plasma, preferiblemente un
plasma al citrato.
Como activadores, que sin ninguna incubación
intermedia adicional conducen a la activación de protrombina para
dar trombina, se pueden utilizar preferiblemente: el factor Xa o Va,
o complejos entre los factores Xa y Va, o activadores de
protrombina de por sí conocidos para un experto en la especialidad,
procedentes de venenos de serpiente, p. ej. ecarina o textarina
(Rosing J, Tans G, Thromb. Haemostas.1991; 65:
627-630) o bien activadores del factor X, tales
como los factores IXa, VIIIa o complejos entre los factores IXa y
VIIIa, o activadores del factor X y/o del factor V de por sí
conocidos para un experto en la especialidad, procedentes de
venenos de serpiente, p. ej. del veneno de la víbora de Russell,
pero preferentemente por adición de un reactivo que contiene
tromboplastina, tal como p. ej. procedente del cerebro o pulmón de
un conejo o de la placenta de un ser humano, tal como p. ej.
Thromborel S (de la entidad Behring Diagnostics), o de origen
recombinante, tal como p. ej. Innovin (de la entidad Dade) o
Thromborel R (de la entidad Behring Diagnostics).
Los fosfolípidos añadidos pueden ser de origen
natural o sintético, preferiblemente proceden de extractos de
tejidos de placenta, pulmón, cerebro o trombocitos de origen humano
o animal, se prefieren también extractos de plantas tales como por
ejemplo habas de soja. Ventajosamente, los fosfolípidos se añaden en
una cantidad tal, que en la tanda de ensayo se obtiene una
concentración de 0,001% a 1,0% (p/v = peso/volumen), de manera
preferida de 0,005% a 0,5%, de manera especialmente preferida de
0,015% a 0,15%.
El procedimiento conforme al invento se puede
utilizar también para determinar selectivamente defectos de
factores especiales de coagulación. Para esto, la muestra utilizada,
preferiblemente antes de su utilización en el ensayo, se mezcla con
una solución, que contiene los factores de coagulación, que no
deben de determinarse conjuntamente en el ensayo.
Factores de coagulación, que presentan un interés
especial, son p. ej. la ATIII, la proteína S, la proteína C, el
factor V y la protrombina, o bien sus variedades.
Para la eliminación de trastornos causados por
heparina, o bien se puede descomponer o neutralizar la heparina que
se encuentra en la muestra, p. ej. mediante la heparinasa o aminas,
tales como una poli-lisina, hexadimetrina,
espermina, espermidina o sulfato de protamina, o se puede añadir un
exceso lo más grande que sea posible con respecto a las
concentraciones de heparina que se han de esperar, de manera
preferida de 0,1 a 10 U/ml de una tanda de ensayo, de manera
especialmente preferida 0,3 - 3 U/ml, de manera muy especialmente
preferida 0,7 U/ml.
A partir de investigaciones del efecto de
diferentes trombomodulinas, se sacó la conclusión de que la
inhibición de la trombina no sólo es una de varias propiedades de la
trombomodulina, sino que constituye una premisa para la actividad
anticoagulante a través del sistema de proteína C. Este
reconocimiento es nuevo. Además, se encontró que la glicosilación
de la trombomodulina es responsable de la aceleración del efecto
anticoagulante de la antitrombina III y, por lo tanto, mediante el
procedimiento conforme al invento, junto al sistema de proteína C,
se determina otro importante mecanismo anticoagulante, el de la
antitrombina III propiamente dicha. De esta manera, se describe
aquí por primera vez un procedimiento, con el que se determinan
ambos importantes mecanismos de control de la coagulación.
La causa original de este sorprendente efecto es
posiblemente menos la inhibición de la disociación de fibrinógeno,
que está vinculada con la inhibición de la trombina, sino
probablemente más bien la inhibición de la activación del factor V,
esta activación no frenada conduciría a un suministro posterior,
aumentado en un factor de aproximadamente 10.000, de trombina, que
entonces ya no puede ser captada tan eficazmente por una
trombomodulina.
Debido a estos nuevos reconocimientos, en el caso
de una deficiencia de antitrombina III, al contrario que un plasma
normal, se ha contar con un tiempo de coagulación acortado en
presencia de una trombomodulina, puesto que la antitrombina III ya
no puede neutralizar las actividades procoagulantes de la trombina
en el complejo con una trombomodulina. También en el caso de un
defecto o de un trastorno del sistema de proteína C se llega, en
comparación con un plasma normal, a una prolongación menos
pronunciada del tiempo de coagulación. Unos defectos en ambos
sistemas actúan por consiguiente en el mismo sentido. Esto se pudo
mostrar por primera vez en el Ejemplo 6.
Para representar la función fisiológica del
sistema de proteína C y de la antitrombina III, se tiene que
utilizar por lo tanto una trombomodulina con glicosilación intacta,
es decir que la trombomodulina utilizada debe de presentar tanto la
actividad inhibidora de trombina (actividad B) como también la
actividad activadora de la proteína C (actividad A). Debido a este
reconocimiento, es posible determinar la actividad procoagulante
por medio de un reactivo que contiene tromboplastina, puesto que
esto representa la vía de coagulación extrínseca, fisiológicamente
relevante, y se suprime una incubación previa de la muestra para la
activación de la fase de contacto (Ejemplo 3).
Para la realización de un procedimiento que se
basa en una tromboplastina, se debe de escoger la concentración de
la tromboplastina de tal manera que la formación de trombina se
desarrolle tan lentamente que durante este período de tiempo
resulte una cantidad suficiente de proteína C activada, como para
retrasar la formación de trombina, que es necesaria para la
formación de coágulos. Para esto, un experto en la especialidad
ajusta la concentración de una tromboplastina en un reactivo de tal
manera que el tiempo de coagulación de un plasma normal en ausencia
de trombomodulina sea por lo menos de 20 s y como máximo de 300 s;
preferiblemente éste se sitúa en el intervalo de 40 a 150 s. Esto
se puede conseguir, p. ej., diluyendo reactivos comerciales de
tromboplastina. Para la dilución se utiliza preferiblemente una
solución, que contiene los iones de calcio necesarios para la
actividad de
coagulación.
coagulación.
Además, también se deberían sustituir
fosfolípidos en una cantidad apropiada (de 0,001 a 1% p/v) y en un
modo apropiado (preferiblemente de extractos de tejidos, tales como
trombocitos, un pulmón, una placenta o un cerebro o de fuentes
vegetales) en el caso de la dilución del reactivo. Estas fuentes
contienen en la mayoría de los casos unas proporciones
suficientemente altas de fosfatidil-etanolamina, que
es un fosfolípido que es importante para la actividad de la
proteína C activada. No obstante, ésta se puede también añadir
dosificadamente, según las necesidades, a fin de estimular el
efecto A de la trombomodulina y del sistema de proteína C.
Para determinar la combinación óptima de la
concentración de tromboplastina y la concentración de
trombomodulina se establece un haz de curvas, en el que el tiempo de
coagulación se determina con y sin una determinada concentración de
trombomodulina, en dependencia de la dilución de la tromboplastina,
y esto se repite en el caso de diferentes concentraciones de
trombomodulina (véase el Ejemplo 4).
Preferiblemente, se emplean unas concentraciones
de trombomodulina situadas entre 0,5 y 50 \mug/ml, referidas al
volumen final de la tanda de ensayo, de manera especialmente
preferida unas concentraciones comprendidas entre 1 y 10 \mug/ml.
A partir de este haz de curvas se manifiestan como apropiadas las
siguientes combinaciones, que en presencia de trombomodulina tienen
unos tiempos de coagulación con un plasma normal menores que 300 s,
de manera especialmente preferida menores que 150 s, y en las que la
diferencia con respecto al tiempo de coagulación sin trombomodulina
es por lo menos de 50%, preferiblemente de 100 - 300% de este tiempo
de coagulación sin trombomodulina.
La tromboplastina puede proceder de fuentes
naturales, tales como una placenta, un pulmón o un cerebro de
origen humano, así como también se puede haber producido con medios
de tecnología genética.
La trombomodulina se aísla preferiblemente a
partir de fuentes naturales, tales como una placenta, un pulmón o
un cerebro de origen humano, con procedimientos de por sí conocidos
para un experto en la especialidad. Ésta se caracteriza porque las
fracciones que contienen trombomodulina presentan, junto a la
activación de la proteína C, también un efecto
anti-trombina aumentado por la antitrombina III.
También es conocido preparar una trombomodulina
por vía recombinante. A la trombomodulina recombinante no
glicosilada se le debe de añadir la actividad B posteriormente a la
traducción mediante un acoplamiento bioquímico o químico con un
sulfato de heparina. Esto se puede efectuar mediante una expresión
en células glicosilantes, p. ej. de origen humano.
Sorprendentemente, se encontró que la adición de un sulfato de
heparina no fijado a una trombomodulina consigue ya el efecto
necesario (Ejemplo 7).
A fin de evitar una formación prematura de
coágulos, al reactivo se le pueden añadir conocidos agentes
inhibidores de la agregación, tales como productos de disociación de
fibrina, obtenidos por disociación de fibrinógeno mediante bromuro
de cianógeno, plasmina, elastasa u otras enzimas conocidas, por
ejemplo procedentes de venenos de serpiente (véase, por ejemplo, la
cita de Markland FS Jr, Thromb. Haemostas. 1991; 65:
438-443), o péptidos sintéticos, que tienen la
secuencia RGD, tales como los que se han descrito, por ejemplo, en
el documento de solicitud de patente europea
EP-A-0.456.152.
A fin de excluir una oxidación de la
trombomodulina o de los fosfolípidos en el reactivo, se pueden
utilizar, como protección contra la oxidación, sustancias de por sí
conocidas para un experto en la especialidad, tales como
hexacianoferrato de potasio, vitamina C, glutatión, ácido úrico,
hidroquinona, tocoferoles,
butil-hidroxi-tolueno (BHT),
butil-hidroxi-anilina, ubiquinona o
enzimas tales como la superóxido dismutasa y una catalasa.
Sobre la base de este nuevo procedimiento,
mediante adición a los reactivos o a las muestras se pueden hacer
visibles partes individuales del sistema anticoagulante. Así, se
puede añadir, por ejemplo, antitrombina III, a fin de reconocer
solamente trastornos del sistema de proteína C. A la inversa, la
muestra se puede mezclar, por ejemplo, con un plasma deficiente en
antitrombina III, a fin de excluir trastornos del sistema de
proteína C. Además, unos plasmas, que no contienen uno o varios
factores del sistema de proteína C, bien sea porque se trata de
plasmas deficientes naturales, por ejemplo congénitos, o puesto que
estos factores se habían eliminado técnicamente, por ejemplo, por
inmunoadsorción, se utilizan para mezclar con ellos el plasma de la
muestra, de tal manera que sólo sean manifiestos trastornos de
factores, que faltan en el plasma que se utilizó para la
mezcladura. Para la neutralización de anticuerpos
anti-fosfolípidos, por ejemplo de anticoagulantes
de lupus, se pueden añadir también fosfolípidos, por ejemplo de
trombocitos, a reactivos o directamente a la muestra y/o plasmas
deficientes.
La observación de que, para un retraso manifiesto
de la actividad de coagulación a través del sistema de proteína C
es necesario el efecto anticoagulante (actividad B) que presenta la
trombomodulina, conduce a una nueva interpretación en lo que se
refiere a la importancia biológica de la porción de hidratos de
carbono y a la aplicación en diagnósticos. Hasta ahora, es
desconocida la importancia biológica propiamente dicha de la
porción de hidratos de carbono de las glicoproteínas. Por regla
general, se discute solamente una influencia sobre el tiempo de
semidesintegración en la circulación sanguínea (Paulson JC, TIBS
1989; 14; 272-275). Ahora bien, es conocido que los
diabéticos tienen una incidencia más alta de trombosis, en
particular en el sistema vascular arterial. Puesto que, a causa de
las conclusiones aquí expuestas, el efecto anticoagulante sobre la
trombina es la premisa para la actividad anticoagulante de la
proteína C, y, por otra parte, en el caso de enfermos diabéticos
puede aparecer un trastorno de la síntesis correcta de la porción de
hidratos de carbono, se supone que la pérdida de la actividad
anti-trombina que presenta la trombomodulina en el
caso de enfermos diabéticos constituye una parte importante del
mecanismo patológico, que conduce a un riesgo aumentado de
trombosis.
Esto significa que la detección de la
glicosilación y respectivamente de la actividad B (efecto
anti-trombina) que presenta la trombomodulina en
relación con la actividad A (activación de la proteína C),
constituye un marcador de diagnóstico importante para el potencial
anticoagulante de la proteína C sobre la superficie vascular y, por
lo tanto, se puede aprovechar para estimar el riesgo de una amenaza
de trombosis, en particular para las trombosis arteriales.
Preferiblemente, este análisis tiene lugar en el caso de enfermos
diabéticos o de personas con un metabolismo perturbado de metionina
(hiper-homocisteinemia) a fin de determinar el
progreso del deterioro del endotelio. También para otras
enfermedades, que están asociadas con un trastorno del metabolismo
del endotelio, tales como, por ejemplo, tumores, aterosclerosis,
enfermedades autoinmunológicas u otras enfermedades inflamatorias,
este análisis puede aportar un importante indicio para el pronóstico
o terapéuticamente conveniente.
La detección de la relación de ambas actividades
se puede efectuar con productos de disociación de la
trombomodulina, que se presentan de un modo natural en el plasma,
así como también mediante un análisis de un tejido natural de
pacientes. La determinación de ambas actividades se efectúa en
ensayos cromógenos, tales como los que se describen, por ejemplo,
en la cita de Preissner y colaboradores (J. Biol. Chem. 1990; 265:
4.915-4.922; véase también el Ejemplo 1).
Preferiblemente, antes de la determinación, la trombomodulina se
separa de la matriz restante (por ejemplo, componentes de un
plasma). Para esto es apropiado un estuche de ensayo que consiste
en una fase sólida revestida con anticuerpos dirigidos contra
trombomodulina, por ejemplo, una placa de microtitulación, tiras de
ensayo o un módulo de ensayo. En una primera etapa de incubación, la
trombomodulina se fija a la fase sólida y a continuación se separa
por lavado la matriz perturbadora. A continuación, se determinan
las proporciones de ambas actividades en tandas de ensayo separadas
en procedimientos cromógenos.
Además, se puede determinar directamente el grado
de glicosilación de la trombomodulina aislada a partir de la sangre
o de tejidos de pacientes, a través de procedimientos de por sí
conocidos para un experto en la especialidad. Los resultados, por
ejemplo, la relación de la actividad A a la actividad B o viceversa,
sirven como medida del grado de gravedad de la perturbación de la
síntesis o bien como indicador de un riesgo aumentado de
trombosis.
Los siguientes Ejemplos, mediando utilización de
una trombomodulina de conejo, deben solamente ilustrar el invento.
Siempre y cuando que no se señale lo contrario, se utilizaron
reactivos y aparatos de la entidad Behring Diagnostics GmbH.
La determinación cromógena de la actividad de una
trombomodulina se efectúa apoyándose en la cita de Salem y
colaboradores, Journal of Biological Chemistry, volumen 259, nº19,
páginas 12.246-12.251 (1984). La realización del
ensayo se efectuó en un Behring Coagulation Timer (Medidor del
tiempo de coagulación de Behring) (Behring Diagnostics):
50 \mul de una muestra se mezclaron con 50
\mul del reactivo 1, que comprende 50 \mug/ml de la proteína C,
6 \mug/ml de trombina en Tris-HCl 50 mM, NaCl
200 mM, MnCl_{2} 5 mM, albúmina de suero bovino al 1%, de pH 7,3,
y se incubó durante 5 minutos. Durante este período de tiempo, la
trombina, en cooperación con la trombomodulina contenida en la
muestra, activa a la proteína C para dar la proteína C activada.
Esta activación se interrumpe por adición de un cóctel de agentes
inhibidores (50 U/ml de antitrombina III, 5 unidades de
anti-trombina/ml de hirudina, 1 U/ml de heparina no
fraccionada en Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5
mM, de pH 7,4) y, después de 30 segundos se añaden 50 \mul de un
substrato cromógeno para la proteína C (procedente de Berichrom
Protein C; de la entidad Behring Diagnostics). El desarrollo del
color se vigila durante 30 segundos a 405 nm y a partir de esto se
calcula la modificación de la extinción por minuto (delta U/min).
Esta modificación es proporcional a la cantidad de trombomodulina
en la muestra. Los valores expuestos en la Tabla 1 se obtuvieron
con una trombomodulina de conejo (de la entidad American
Diagnostica; 1.000 U/mg de proteína).
Determinación de la actividad de
una trombomodulina en el ensayo cromógeno.(TM deglyc =
trombomodulina tratada con condroitinasa; véase el Ejemplo
2)
| Trombomodulina | Delta U/min * 10^{-3} |
| (\mug/ml) | |
| 0 | 20,0 |
| 0,2 | 53,9 |
| 0,4 | 81,0 |
| 0,6 | 106,0 |
| 0,8 | 155,1 |
| 1,0 | 169,0 |
| 1,5 | 210,7 |
| 2,0 | 247,3 |
| TM decgly. | Delta U/min * 10^{-3} |
| (\mug/ml) | |
| 0,5 | 113,4 |
A fin de eliminar la porción de heparina de la
trombomodulina, se mezcló 1 ml con 30 \mug/ml de una
trombomodulina de conejo (de la entidad American Diagnostica) en
Tris-HCl 50 mM, de pH 8,0, con 30 \mul de una
solución de condroitinasa ABC (10 U/ml; de la entidad Sigma) y se
incubó a +37ºC durante una noche.
La trombomodulina tratada se diluyó a 0,5
\mug/ml en el tampón de reactivo 1 del Ejemplo 1 y se ensayó. La
trombomodulina tratada previamente mostró a 0,5 \mug/ml una
actividad, que corresponde a la de 0,6 \mug/ml de la
trombomodulina no tratada.
Por consiguiente, la actividad activadora de la
proteína C no sólo no se redujo, sino que más bien se aumentó
ligeramente.
Como se ha indicado en la cita de Matschiner
(documento US 5.525.478), se mezclaron 50 \mul de un plasma
agrupado de donantes normales con 50 \mul de un reactivo de APTT
(actina; de la entidad Dade), y se incubaron durante 120 s a +37ºC
para la activación de la fase de contacto. En lugar del cloruro de
calcio añadido de lo contrario en el caso de un APTT, se añadieron
50 \mul de una trombomodulina (de conejo; 15 \mug/ml en una
solución fisiológica de cloruro de sodio), y tan sólo a
continuación se provocó la coagulación con cloruro de calcio (25
mmol/l). Los resultados se exponen en la Tabla 2. Ellos muestran
primeramente, que en presencia de una trombomodulina los tiempos de
coagulación se prolongan con respecto a los de una muestra normal.
Esto corresponde a los datos de
Matschiner.
Matschiner.
No obstante, una prolongación tal, si bien menor,
aparece también en el caso de un plasma deficiente en proteína C.
En este caso, se supone que esto no se puede atribuir a la
desactivación de los cofactores procoagulantes VIIIa y Va
(actividad A), sino al efecto inhibidor (actividad B) que presenta
la trombomodulina frente a trombina. Esto se pone de manifiesto
cuando se emplea, como en este ejemplo, una trombomodulina, cuya
glicosilación se había eliminado. Sorprendentemente, entonces no
sólo se suprime la prolongación de la coagulación debida a la
actividad B, sino también (aproximadamente 20 s; = diferencia del
plasma deficiente en proteína C con y sin trombomodulina) también
casi totalmente la prolongación de la coagulación debida a la
actividad A.
Esto no se había mostrado hasta ahora. A partir
de esto se saca la conclusión de que la actividad B es una premisa
para la actividad A en condiciones fisiológicas (formación de
fibrina) y, por consiguiente, en el ensayo de coagulación se puede
emplear sólo una trombomodulina con una glicosilación intacta.
| Adición de TM | Plasma normal | Plasma deficiente en proteína C |
| Sin | 28,2 | 32,7 |
| TM intacta | 166,4 | 63,2 |
| TM deglyc | 40,4 | 44,6 |
En el procedimiento se debe de buscar para una
concentración dada de una trombomodulina una concentración
apropiada de un reactivo para PT que contiene tromboplastina, a fin
de conseguir para un ensayo de escrutinio una prolongación del
tiempo de coagulación (20 -300 s), que sea apropiada para el sistema
de proteína C.
Para esto se mezcló 1 parte de una muestra con 1
parte de un reactivo que contiene trombomodulina (trombomodulina de
conejo en Tris-HCl 50 mM, sin y respectivamente con
0,025% de un fosfolípido procedente de habas de soja, pH 7,4), y se
provocó la reacción de coagulación con un reactivo de PT en
diferentes diluciones (aquí, por ejemplo, Thromborel S, de Behring
Diagnostics; dilución con una solución 25 mM de cloruro de
calcio).
Como comparación se determinó el tiempo de
coagulación sin la adición de una trombomodulina.
El ejemplo expuesto en la Tabla 3 muestra que en
el caso de una baja concentración de trombomodulina con respecto a
un PT sin trombomodulina con una dilución creciente de la
tromboplastina, los tiempos de coagulación permanecen en primer
término iguales y tan sólo con una alta dilución (aquí: a 1:1.000)
se consigue una diferenciación. Si, por el contrario, se escoge más
alta la concentración de trombomodulina, entonces es reconocible una
diferenciación ya en el caso de una dilución más baja. En este
ensayo se escogería una combinación óptima en el caso de una
dilución a 1:100 de la tromboplastina en presencia de 1,7 \mug/ml
de trombomodulina (en la tanda de ensayo) (véase también el Ejemplo
5), puesto que las diferencias son demasiado bajas en el caso de
diluciones menores de tromboplastina. En el caso de una dilución a
1:100, la diferencia es, con 1,4 \mug/ml, algo baja, y con 2,0
\mug/ml, algo alta. Por consiguiente, este procedimiento requiere
manifiestamente menos cantidad de trombomodulina en la tanda de
ensayo que el procedimiento de acuerdo con Matschiner, y, por lo
tanto, es superior a éste.
Sin ninguna sustitución con fosfolípidos, en el
caso de una dilución más alta, se obtienen unos tiempos más largos
de coagulación sin y con TM, que en el caso de una sustitución con
fosfolípidos (véase la Tabla 4). La diferenciación entre el ensayo
testigo sin trombomodulina y el ensayo de escrutinio con
trombomodulina, propiamente dicho, es algo peor sin ninguna
sustitución con fosfolípidos. En el caso de la sustitución con
fosfolípidos, se debe prestar atención a que la sensibilidad para
anticoagulantes de lupus disminuya por consiguiente en el
procedimiento.
| Dilución | 0 \mug/ml | 0,7 \mug/ml | Dif. | 1,4 \mug/ml | Dif. | 2,0 \mug/ml | Dif. |
| 1:10 | 22,9 | 24,0 | 1,1 | 24,6 | 1,7 | 25,7 | 2,8 |
| 1:30 | 31,5 | 35,2 | 3,7 | 35,6 | 4,1 | 41,9 | 10,4 |
| 1:100 | 44,7 | 53,9 | 9,2 | 83,9 | 39,2 | 231,8 | 187,1 |
| 1:300 | 62,7 | 101 | 38,3 | >300 | >300 | ||
| 1:100 | 103,9 | >300 | >300 | >300 |
| Dilución | sin TM | con TM | Diferencia | sin TM | con TM | Diferencia |
| con PL | con PL | con PL | sin PL | sin PL | sin PL | |
| 1:10 | 22,9 | 24,0 | 1,1 | 22,5 | 23,7 | 1,2 |
| 1:30 | 31,5 | 35,2 | 3,7 | 33,5 | 37,8 | 4,3 |
| 1:100 | 44,7 | 53,9 | 9,2 | 54,8 | 65,4 | 10,6 |
| 1:300 | 62,7 | 101 | 38,3 | 84,9 | 109,6 | 24,7 |
| 1:1.000 | 103,9 | >300 | >200 | 154,2 | 281,9 | 127,7 |
A partir de haces de curvas determinados según el
Ejemplo 4, se determinó una combinación óptima del reactivo
activador (aquí: una tromboplastina) y de una trombomodulina. En la
Tabla 5 se muestra la reacción de diferentes plasmas con defectos
en el sistema de proteína C para tal combinación. Como en el Ejemplo
4, el Thromborel S se diluyó a 1:100 con cloruro de calcio. El
reactivo de trombomodulina contenía 5,0 \mug/ml de una
trombomodulina (que corresponden a 1,7 \mug/ml en la tanda de
ensayo), así como fosfolípidos (0,025%). Se ensayaron los siguientes
plasmas: un plasma agrupado normal, un plasma deficiente en la
proteína C, un plasma deficiente en la proteína S, así como un
plasma de factor V Leiden. Los resultados expuestos en la Tabla 5
confirman que en estas condiciones se acortaron los tiempos de
coagulación de las muestras patológicas en comparación con los del
plasma normal en presencia de una trombomodulina.
Esto pone de manifiesto que un ensayo que se basa
en un PT diluido en presencia de una trombomodulina indica
trastornos del sistema de proteína C por una prolongación menos
pronunciada del tiempo de coagulación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Sin TM | Con TM | Diferencia | Cociente |
| (con - sin TM) | (con/sin) TM | |||
| Plasma normal | 34,3 | 125,6 | 91,3 | 3,7 |
| PD en la proteína C | 37,4 | 62,9 | 25,5 | 1,7 |
| PD en la proteína S | 41,3 | 68,4 | 27,1 | 1,7 |
| Factor V Leiden | 39,8 | 103,6 | 63,8 | 2,6 |
| (defecto heterocigótico) |
Un plasma con un defecto congénito de
antitrombina III (< 0,01 U/ml de ATIII; de la entidad Milan
Analytica AG, Suiza) pero con los otros factores de coagulación en
el intervalo normal, se empleó en el procedimiento como se ha
descrito en el Ejemplo 5. El reactivo de trombomodulina contenía,
diferenciándose del Ejemplo 5, 7,0 \mug/ml de trombomodulina (que
corresponden a 2,3 \mug/ml en la tanda de ensayo) a fin de
conseguir una reacción óptima, tal como se ha mostrado en el
Ejemplo 4. Como comparación, se utilizó el mismo plasma agrupado
normal que en el Ejemplo 5.
Los resultados en la Tabla 6 confirman que el
tiempo de coagulación del plasma deficiente en antitrombina frente
al plasma normal se había acortado en presencia de trombomodulina.
Este acortamiento apunta a un potencial anticoagulante incompleto
con respecto a un plasma normal. Por consiguiente, el procedimiento
permite por primera vez la detección de defectos en cuanto a ambos
sistemas anticoagulantes importantes: el sistema de proteína C así
como el de la antitrombina III:
| Muestra | sin TM | con TM | Diferencia | Cociente |
| (con - sin TM) | (con/sin) TM | |||
| Plasma normal | 37,4 | 128,5 | 91,1 | 3,4 |
| PD de proteína C | 42,7 | 79,9 | 37,2 | 1,9 |
Como se ha descrito en el Ejemplo 2, se
desglicosiló la trombomodulina de conejo mediante utilización de
crondroitinasa (TM deglyc)
Como en el Ejemplo 4, el Thromborel S se diluyó a
1:100 con cloruro de calcio 25 mmol/l. El reactivo de trombomodulina
contenía 10 \mug/ml de trombomodulina (lo que corresponde a 3,3
\mug/ml en la tanda de ensayo), así como fosfolípidos de habas de
soja (0,05%). Por causa de la desglicosilación, en el procedimiento
se consigue sólo una prolongación muy pequeña del tiempo de
coagulación, tal como se muestra en la Tabla 7 para una agrupación
de plasmas normales. En el caso de una adición de heparina al
reactivo que contiene trombomodulina (1 U/ml; que corresponde a 0,33
U/ml en la tanda de ensayo; Liquemin, de la entidad
Hoffmann-La Roche, Suiza) por medio de la inhibición
de la reacción procoagulante se prolonga también el tiempo de
coagulación en ausencia de trombomodulina; en presencia de
trombomodulina, por el contrario, el tiempo de coagulación se ha
prolongado en un múltiplo. Esto se ha de atribuir a la propiedad
anticoagulante restaurada de la trombomodulina por medio de la
adición de heparina, puesto que con un plasma con un defecto en el
sistema de proteína C (plasma deficiente en el factor V Leiden
heterocigótico) la diferencia o bien la relación entre estos dos
tiempos de coagulación está pronunciada de manera manifiestamente
más débil.
El procedimiento conforme al invento se puede
llevar a cabo, por lo tanto, también con una trombomodulina no
glicosilada, por ejemplo una trombomodulina preparada por vía
recombinante, en la que se aporta heparina a la tanda de
ensayo.
| Muestra | TM/heparina | sin TM | con TM | Diferencia | Cociente |
| Plasma normal | gly | 32,3 | 106,8 | 74,5 | 3,3 |
| degly/- | 35,0 | 45,7 | 10,7 | 1,3 | |
| degly/hep | 65,9 | 189,5 | 123,6 | 2,9 | |
| Factor V Leiden | degly/hep | 61,9 | 99,3 | 37,4 | 1,6 |
Claims (36)
1. Procedimiento de escrutinio para la
determinación del potencial anticoagulante de una muestra en
presencia de una trombomodulina añadida exógenamente, de origen
humano o recombinante, que junto a su actividad activadora de la
proteína C presenta también la propiedad de acelerar la inhibición
de trombina mediante antitrombina III, realizándose, en el caso de
una trombomodulina preparada por vía recombinante, que la propiedad
desactivadora de la trombina se restablece mediante unión con, o
adición de, un glicosaminoglicano, cuyo procedimiento incluye las
siguiente etapas:
- a)
- a la muestra, preferiblemente a una muestra de plasma, se le añaden los siguientes reactivos:
- i)
- una trombomodulina exógena, de origen humano o recombinante, que puede formar un complejo con trombina, pudiendo este complejo activar a la proteína C en la muestra, pudiendo la proteína C ser una proteína C endógena o añadida exógenamente,
- ii)
- un activador que, sin ninguna incubación intermedia, conduce a la activación de protrombina para dar trombina, pudiendo la protrombina ser una protrombina endógena o añadida exógenamente,
- iii)
- fosfolípidos,
- iv)
- iones de calcio,
- v)
- así como otros reactivos adicionales, que se utilizan generalmente para optimizar los ensayos de coagulación,
- b)
- la reacción se inicia mediante la adición del reactivo que contiene el activador de protrombina, y
- c)
- la formación de trombina se determina mediante medición de la velocidad de conversión de un substrato para trombina, determinándose esta velocidad de conversión por medio del tiempo de medición que transcurre hasta la formación de un coágulo de fibrina o por medio de la velocidad de conversión de un substrato marcado para trombina.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la velocidad de conversión medida se
pone en relación con la velocidad de conversión en una tanda de
ensayo para la determinación del tiempo de coagulación, en el que
no resulta, o no se añade, ninguna proteína C activada.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la velocidad de conversión medida se
pone en relación con la velocidad de conversión en una tanda de
ensayo análoga a la del procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que, sin embargo, no se añade ninguna
trombomodulina.
4. Procedimiento de acuerdo con por lo
menos una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque la concentración del activador en la etapa a) ii) se escoge
de tal manera que el tiempo de coagulación de un plasma normal en
ausencia de trombomodulina es por lo menos de 20 s y a lo sumo de
300 s, preferiblemente de 30 a 150 s.
5. Procedimiento de acuerdo con por lo
menos una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque en la etapa a) ii) se utilizan como activadores unos
reactivos de tromboplastina de por sí conocidos para un experto en
la especialidad, que son de origen humano o animal, tal como los
procedentes de una placenta, un pulmón o un cerebro, o que se
producen con medios de tecnología genética.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la trombomodulina se
añade a la muestra de modo separado con respecto del reactivo que
contiene un activador en un reactivo dispuesto por separado.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la trombomodulina
utilizada es de origen humano.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado porque, en el caso de una
trombomodulina producida por vía recombinante, la propiedad
desactivadora de la trombina se restablece por unión con sulfato de
heparina.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado porque en el caso de una
trombomodulina preparada por vía recombinante, la propiedad
desactivadora de la trombina se restablece por adición de sulfato
de heparina.
10. Procedimiento de acuerdo con por lo
menos una de las reivindicaciones 1 8, caracterizado porque
la unión se efectúa por vía recombinante o sintética.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de
trombomodulina en el reactivo se escoge de tal manera que, en
presencia de trombomodulina, los tiempos de coagulación con un
plasma normal son menores que 300 s, de manera especialmente
preferida menores que 150 s, y porque la diferencia con el tiempo
de coagulación sin trombomodulina es de por lo menos de 40%,
preferiblemente de 100 a 300%, de este tiempo de coagulación sin
trombomodulina.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
concentración de trombomodulina es de 0,5 a 50 \mug/ml,
preferiblemente de 1 a 10 \mug/ml, referida al volumen final de
la tanda de ensayo.
13. Procedimiento de acuerdo con por lo
menos una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado
porque para retrasar la formación de coágulos se añaden conocidos
agentes inhibidores de la agregación en el procedimiento de
ensayo.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se sustituye
con factores purificados de coagulación, que no participan en la
función del sistema de proteína C o de la antitrombina III, por
adición al reactivo o a los reactivos.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque se añaden
fibrinógeno, el factor VII, el factor IX, el factor X y/o
protrombina (el factor II), al reactivo o a los reactivos.
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque se añade antitrombina
III a fin de reconocer solamente trastornos del sistema de proteína
C.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque para la determinación
selectiva de trastornos únicos o múltiples, la muestra de plasma,
antes de su utilización en el procedimiento, se mezcla con una
solución, que contiene factores de coagulación que no se deben de
determinar conjuntamente en el ensayo.
18. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, caracterizado porque para el diagnóstico
selectivo del defecto o la deficiencia de una proteína, la muestra,
antes de su utilización en el procedimiento, se diluye previamente
con un plasma, que contiene menos que 5% de esta proteína, en la
relación de 1:2 a 1:20, de manera preferida de 1:3 a 1:5, y de
manera especialmente preferida de 1:4.
19. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, caracterizado porque para el diagnóstico
selectivo de un defecto o una deficiencia de múltiples proteínas, la
muestra, antes de su utilización en el procedimiento, se diluye
previamente con un plasma, que contiene menos que 5% de esta
proteína, en la relación de 1:2 a 1:20, de manera preferida de 1:3
a 1:5, y de manera especialmente preferida de 1:4.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, caracterizado porque para el diagnóstico
selectivo de anticuerpos anti-fosfolípidos, la
muestra, antes de su utilización en el procedimiento, se diluye
previamente con una solución acuosa, que contiene fosfolípidos y/o
trombocitos en una concentración de 0,01 a 1% (p/v), en la relación
de 1:2 a 1:20, de manera preferida de 1:3 a 1:5, y de manera
especialmente preferida de 1:4.
21. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, caracterizado porque para la determinación
de la actividad anticoagulante de la antitrombina III, la muestra
se diluye previamente con un plasma deficiente en antitrombina III
en una relación de 1:2 a 1:10, preferiblemente de 1:4.
22. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la velocidad de
conversión del substrato por la muestra se determina en presencia de
trombomodulina y en ausencia de trombomodulina, y esta diferencia,
o el cociente de ambas se pone en relación con la diferencia o el
cociente de la que se obtiene con un plasma normal o con una
agrupación de plasmas.
23. Utilización del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 1 para el reconocimiento de pacientes
que tienen un riesgo aumentado de trombosis.
24. Utilización del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 1 para la vigilancia de una terapia
anticoagulante.
25. Procedimiento para la detección y la
cuantificación de la glicosilación de la trombomodulina de un
paciente por determinación de la relación entre la actividad
activadora de la proteína C, y la actividad que produce la
aceleración de la inhibición de trombina por antitrombina III, que
presenta la trombomodulina de una muestra de un paciente.
26. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque la determinación de
ambas actividades de la trombomodulina se efectúa directamente en la
muestra.
27. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque la trombomodulina
endógena se aísla a partir de la muestra antes de la determinación
de ambas actividades.
28. Un estuche de ensayo para su
utilización en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación
25, que contiene
\newpage
- a)
- una tira de ensayo revestida con anticuerpos contra una trombomodulina, que se pone en contacto con la muestra,
- b)
- una solución de lavado, en la que se lava la tira de ensayo incubada,
- c)
- reactivos para la determinación de la activación de la proteína C,
- d)
- reactivos para la determinación de la desactivación de la trombina.
29. Estuche de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 28, que contiene reactivos para la determinación de
la activación de la proteína C, realizándose que un reactivo
contiene trombina, la proteína C y cloruro de calcio, en el que la
tira de ensayo se incuba primeramente para la activación de la
proteína C, y un segundo reactivo contiene antitrombina III,
heparina y/o hirudina, y un substrato cromógeno para la proteína C,
para la desactivación de la trombina y la determinación de la
cantidad formada de proteína C mediante determinación de la
intensidad de color de la tira de ensayo.
30. Estuche de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 28, que contiene reactivos para la determinación de
la desactivación de la trombina, realizándose que un reactivo
contiene antitrombina III, en el que se introduce la tira de
ensayo, y un reactivo contiene trombina, que se añade a
continuación, y un reactivo contiene un substrato cromógeno para
trombina que, después de un tiempo de incubación, se añade para la
determinación de la actividad remanente de trombina a través de la
determinación de la intensidad del color de la tira de ensayo.
31. Un estuche de ensayo de acuerdo con por
lo menos una de las reivindicaciones 28 a 30, realizándose que en
lugar de la tira de ensayo se utiliza una placa de microtitulación
revestida con anticuerpos contra trombomodulina.
32. Utilización del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 25 para la determinación del grado de
glicosilación de una trombomodulina en la sangre, el plasma o
tejidos de pacientes con diabetes u homocisteinemia.
33. Utilización del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 25 para la determinación del grado de
glicosilación de una trombomodulina en la sangre, el plasma o
tejidos de pacientes con aterosclerosis.
34. Procedimiento de escrutinio para la
determinación de la actividad de AT III y de la actividad del
sistema de proteína C de una muestra en presencia de una
trombomodulina añadida exógenamente, de origen humano o
recombinante, que junto a su actividad activadora de la proteína C,
tiene también la propiedad de acelerar la inhibición de trombina
por antitrombina III, realizándose, en el caso de una trombomodulina
producida por vía recombinante, que la propiedad desactivadora de
la trombina se restablece mediante unión con, o adición de, un
glicosaminoglicano, cuyo procedimiento incluye las siguientes
etapas:
- a)
- a la muestra, preferiblemente a una muestra de plasma, se le añaden los siguientes reactivos:
- i)
- una trombomodulina exógena, de origen humano o recombinante, que junto a su actividad activadora de la proteína C tiene también la propiedad de acelerar la inhibición de trombina por antitrombina III (BITA), o bien a que se añade heparina para la reconstitución de la propiedad BITA,
- ii)
- por lo menos un activador que, sin ninguna incubación intermedia, conduce a la activación de protrombina para dar trombina, pudiendo la protrombina ser una protrombina endógena o añadida exógenamente,
- iii)
- fosfolípidos,
- iv)
- cloruro de calcio,
- v)
- así como otros reactivos adicionales, que se utilizan generalmente para la optimización de ensayos de coagulación,
- b)
- la formación de trombina se determina por medición de la velocidad de conversión de un substrato para trombina, realizándose que esta velocidad de conversión se determina por medio del tiempo de medición que transcurre hasta la formación de un coágulo de fibrina o por medio de la velocidad de conversión de un substrato marcado para trombina.
35. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 34, para la determinación selectiva de la actividad
de AT III, caracterizado porque la muestra se diluye con un
plasma que contiene menos que 5% de la actividad normal de AT III,
en la relación de 1:2 a 1:20, de manera preferida de 1:3 a 1:5, de
manera especialmente preferida de 1:4.
36. Procedimiento para la estimación del
riesgo de una amenaza de trombosis en el caso de diabéticos,
caracterizado porque se determina la glicosilación de la
trombomodulina o la relación del efecto
anti-trombina de la trombomodulina a la actividad
activadora de la proteína C que presenta la trombomodulina, siendo
la pérdida del efecto anti-trombina un indicador de
un riesgo aumentado de trombosis.
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| ATE315233T1 (de) | 2006-02-15 |
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