PT947585E - Metodo in vitro melhorado, kits e reagentes para a peaquisa de defeitos de coagulacao sanguinea - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODO IN VITRO MELHORADO, KITS E REAGENTES PARA A PESQUISA DE DEFEITOS DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA" Âmbito da invenção A presente invenção refere-se a métodos fotométricos in vitro, kits e reagentes para a pesquisa qualitativa e determinação quantitativa da actividade funcional de componentes da via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea, que compreendem a medição da taxa de conversão de um substrato exógeno, por uma enzima cuja actividade está relacionada com a actividade anticoagulante de proteína C, numa amostra de sangue de um humano, compreendendo factores de coagulação e o referido substrato exógeno, após activação, pelo menos parcial, da coagulação, através da via intrínseca, extrínseca, ou comum e desencadeamento da coagulação por adição de iões cálcio, e comparação da referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.

Antecedentes da invenção A manutenção de uma hemostase adequada é o resultado de um balanço cuidadoso entre as actividade pro e anticoagulantes. Após um trauma, a coagulação é desencadeada primeiramente através da activação dos factores de coagulação IX e X (FIX, FX) pelo factor tecidular (também designado por tromboplastina tecidular) e factor VII (FVII), seguido de produção de trombina, que por sua vez cliva o fibrinogénio, para formar fibrina solúvel. Após reticulação pelo factor XIII, obtém-se um coágulo de gel insolúvel, tridimensional, que impede novas nprHfls Ho sangue. A regulação deste sistema altamente potente - apresentada esquematicamente na Figura 1 - é conseguida através de uma relação balanceada entre fenómenos procoagulantes (apresentados com setas de linhas a cheio) e fenómenos anticoagulantes (apresentados com setas a tracejado). Os fenómenos anticoagulantes compreendem 1) inibição da trombina já formada, por antitrombina (AT) e ct2-macroglobulina e 2) prevenção de nova formação de trombina, pela via anticoagulante da proteína C. Aqui, a proteína C(APC) activada inactiva as proteínas de coagulação, o factor VIII e factor V, nas suas formas activadas (FVIIIa, FVa) através de clivagem proteolítica. Além disso, a inibição do factor Xa produzido é também conseguida pela antitrombina e pelo inibidor da via do factor tecidular (TFPI), em que este último inibe também o complexo factor tecidular/factor Vila. 0 factor VlIIa e factor Va actuam como cofactores na activação de factor X e protrombina, respectivamente, e aumentam as velocidades de reacção destes processos em cerca de 1000 vezes cada. Assim, estes cofactores actuam como estimuladores potentes da coagulação. A sua inactivação pelo APC para, portanto, essencialmente, uma nova produção de trombina, proporcionando assim um forte efeito anticoagulante. A proteína S e também o factor V actuam como cofactores da proteína C activada (APC).

Como se pode ver pela Figura 1, a activação da coagulação através dos sistemas intrínsecos ou extrínsecos, resulta na activação do factor X, um componente chave na via comum final. No sistema intrínseco, o fenómeno inicial é a activação de factores de contacto (Factor XII, pré-calicreina) seguido da - 2 -

activação do factor XI, que por sua vez activa o factor IX. No sistema extrínseco, o factor IX e o factor X são activados pdo COITip Ι^λΟ Lav^tOi XUU Idl / J_ ci (J L O £ V J. _L â .

Tal como se mostra, também, na figura 1, é necessária a presença de iões cálcio em várias destas reaeçoes. A activação do factor X pelo factor IXa e da protrombina pelo factor Xa requer fosfolípidos procoagulantes. In vivo, estes são fornecidos pela superfície de membrana das plaquetas activadas; in vitro, por extractos de plaquetas, fosfolípidos purificados, ou extractos brutos de fosfolípidos de fontes adequadas. A concentração de ião cálcio, total e livre no plasma nativo é de cerca de 2,4 e 1,2 mmol/1, respectivamente. Tipicamente, a concentração de ião cálcio utilizada em métodos analíticos para a determinação de factores de coagulação ou anticoagulação são na gama de 1,5-10 mmol/1. As concentrações doutros iões metálicos no plasma são baixas, sendo os valores típicos para a concentração total de 1 mmol/1 para Mg2+ e 5 -40 μιηοΐ/ΐ para Zn2+, Cu2+ e Mn2+.

Os defeitos na via anticoagulante de proteína C podem originar um risco de trombose, devido a uma menor capacidade de prevenir a formação de trombina. Estes defeitos podem ser devidos a deficiências na actividade de proteína C e/ou do seu cofactor, a proteína S. Outro defeito, recentemente detectado, é uma mutação pontual no gene do factor V (G -► A) no nucleótido 1691, resultando na substituição de aminoácidos Arg (R) -► Glc (Q) , na posição 506 no factor V/factor Va, designada por FV:Q506 ou Factor V Leiden. A heterozigoticidade e homozigoticidade para esta mutação são muitas vezes designadas por FV:R506Q e FV:Q506Q, respectivamente. Esta mutação ocorre num dos três locais de clivagem de APC (aminoácidos 306, 506, 679) no factor Va, o que confere uma falha na sua degradação - 3 -

pela proteína C activada (APC), designada por resistência a APC. A resistência a APC é considerada uma desordem da coagulação sanguínea, reconhecida por uma resposta anticoagulante anormalmente baixa à proteína C activada (APC) e a determinação da referida resistência a APC pode ser utilizada para pesquisar e diagnosticar doenças tromboembólicas, tais como a trombofilia hereditária, ou para determinar o risco de um humano adquirir uma manifestação desta desordem da coagulação sanguínea (Dahlback B., EP-608 235) .

Assim, há uma necessidade de investigar estes componentes da via anticoagulante de proteína C na avaliação de pacientes trombóticos e também, potencialmente, para pesquisar anomalias na actividade anticoagulante de proteína C, proteína S e factor V, em situações ligadas a um aumento do risco de trombose, tais como antes de uma cirurgia, durante o trauma e durante a gravidez, ou ligada à utilização de pílulas contraceptivas orais, ou terapia de substituição hormonal. Actualmente, estão disponíveis testes de coagulação e/ou cromogénicos para análise da actividade de proteína C e proteína S, bem como para a detecção de resistência a APC, que é devida, pelo menos em 90%, a uma mutação do factor V na posição 506. A actividade de proteína C é tipicamente medida após activação da proteína C endógena, contida numa amostra de plasma, pela trombina, ou por uma enzima de veneno de cobra da Agkistrodon contortrix contortrix (Stocker K., EP 203 509), disponível no mercado como reagente Protac®C (Pentapharm AG, 4

Basel, Suiça). A concentração de Protac®C na mistura de activação é tipicamente de cerca de 0,1 U/ml ou superior, uma vez que de outra torma poderia resultar numa activação insuficiente de proteína C (Martinoli J. , Stocker K. Thromb Res 43, 253-264 (1986) ; Mc Call F. et al Thromb Res 45, 681-685 (1987)).

Após a activação pelo Protac®C, a actividade de proteína C é determinada por um teste de coagulação ou cromogénico (Bertina R. Res Clin Lab, 20, 127-138 (1990); Marlar R. Adcock DM. Hum Pathol 20, 1040-1047 (1989), Rosén S., EP 486 515). Nos métodos de coagulação, a coagulação é desencadeada através da via intrínseca, utilizando reagentes APTT ou através da via extrínseca, utilizando o factor tecidular. Em ambos os casos, adicionam-se iões cálcio a uma concentração final normalmente de 5 -10 mmol/1. Estão disponíveis kits e reagentes comerciais para a determinação da actividade de proteína C, tais como Acticlot™ C (American Diagnostica) , Stachrom Protein C (Diagnostica Stago) , Staclot Protein C (Diagnostica Stago) Coamatic® Protein C (Chromogenix AB) e Activador de proteína C (Behring Diagnostica). A activação de proteína C pela trombina é estimulada cerca de 1000 vezes pela trombomodulina, uma proteína da membrana de células endoteliais (Esmon CT e Owen WG, Proc Natl Acad Sei 78, 2249-2252 (1981)). A utilização de trombina/trombomodulina como activador da proteína C, para análise da actividade de proteína C e/ou proteína S em amostras de plasma, utilizando um método fotométrico, é também conhecida (Pittet J-L e Aiach M., FR Pat Appl. 2689 640-A1). 5 A actividade de proteína S é determinada a partir da sua estimulação da actividade da APC na sua degradação do factor Ya e/cu Factor VlIIa. Tipi^auienLt;, nestes restes, adiciona-se uma quantidade padrão de APC a uma amostra de plasma, ou efectua-se a activação de proteína C endógena, sendo em seguida determinado o tempo de coagulação, após uma activação da coagulação, simultânea ou separada, através do sistema intrínseco, utilizando um reagente APTT, através do sistema extrínseco, utilizando factor tecidular ou factor Xa (Bertina R. , loc cit; Preda L. et al., Thromb Res 60, 19-32 (1990); D'Angelo S. et al, Thromb Res 77, 375-378 (1995)). Também já foram publicados testes de actividade cromogénica para a proteína S, utilizando factor IXa como activador e monitorizando a produção de factor Xa (van de Waart P., Woodhams BJ EP 567 636) ou a produção de trombina (Rosén S., EP 486 515). Em todos estes métodos, adicionam-se iões cálcio como acima referido. A mutação de factor V (FV:Q506) na molécula de factor V pode ser detectada por métodos de biologia molecular, baseados na utilização da técnica de reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Bertina RM et al, Nature 369, 64-67 (1994)), ou por métodos em que se determina a actividade funcional da APC. Estes métodos de actividade podem ser baseados na coagulação (Dahlbãck B, EP 608 235; Rosén et al., Thromb Haemost 72, 255-260 (1994)) e incluem a utilização de pré-diluição de plasma amostra, com um plasma sem, ou com pouca actividade de factor V (Dahlbãck B, EP-A-94 905 908.3; Jorquera JI et al., Lancet 344, 1162-1163 (1994); Svensson PJ et al, Thromb Haemost 77, 332-335 (1997)). O último princípio de teste, i.e. um teste baseado na coagulação utilizando pré-diluição do plasma amostra, é também utilizado num produto comercial, Coatest® APC Resistance V (Chromogenix AB) . Alternativamente, podem-se - 6 -

utilizar métodos cromogénicos (Dahlbâck B, EP 608 235; Rosén et al., Thromb Haemost 73, 1364, Resumo 1778 (1995), Nicolaes GAF et al, Thromb Haemost 76, ^04-410 {1905)).

Uma vez que os defeitos genéticos na via anticoagulante de proteína C são encontrados em cerca de 25% de pacientes não seleccionados com tromboembolismo venoso (VTE) e em cerca de 50% de pacientes com trombofilia, i.e. pacientes de famílias com uma tendência aumentada para VTE, há uma necessidade de um teste único que detecte todas estas anomalias, com uma sensibilidade e especificidade elevadas, i.e. um teste global (total). Um conceito para um teste global baseia-se na activação de proteína C no plasma com Protac® e activação da coagulação pela via intrínseca ou extrínseca (Bartl et al, USP 5,001,069, Kraus Μ, AP-A-696 642). Os resultados obtidos com a aplicação de um kit comercial deste teste, ProC Global (Behring Diagnostica, Marburg, Alemanha), em que a activação intrínseca da coagulação é conseguida através da adição de um reagente APTT, mostra uma sensibilidade para a deficiência de proteína C, deficiência de proteína S e para FV:Q506, respectivamente de cerca de 90%, 50-80% e mais de 90%, na análise de indivíduos saudáveis e pacientes trombóticos (Dati F et al., Clin Chem 43, 1719-1723 (1997); Ruzicka K et al, Thromb Res 87, 501-510 (1997)). A especificidade é de cerca de 50% em grupos de trombóticos (Dati F et al., loc cit), i.e. obtém-se uma proporção substancial de resultados positivos, que não podem ser ligados a defeitos conhecidos em componentes da via anticoagulante de proteína C, tais como na proteína C, proteína S e factor V. Assim, este teste não possui especificidade suficiente.

Além disso, os resultados da análise de mulheres grávidas sem qualquer dos defeitos conhecidos na via anticoagulante de - 7 -

proteína C são claramente diferentes da análise de indivíduos saudáveis, normais (Rangard B, Wagner C, Armais Hematol 74: Suplemento tt. Resumo 74, Λ77 (1597); Giegemunu h et ai Armais Hematol 74: Suplemento II, Resumo 188, A105 (1997)), que necessita de gamas separadas para estes grupos. Esta interferência, até agora não caracterizada, limita a aplicabilidade geral do teste. Um método global alternativo para a detecção de defeitos na via anticoagulante de proteína C, baseado na activação da proteína C de plasma endógena prlo Protac C, utiliza o factor tecidular como desencadeador da coagulação (Preda L et al, Blood Coag Fibrinol 7, 465-469 (1996)). Também aqui, a sensibilidade do método é limitada, especialmente para a proteína S. Além disso, diferentes categorias de amostra, e.g. mulheres grávidas e mulheres não grávidas, poderão necessitar de diferentes aproximações para avaliação dos resultados, devido a interferências não apenas relacionadas com componentes na via anticoagulante de proteína C.

Para um teste global ser útil como teste de pesquisa de defeitos hereditários, conhecidos, na via anticoagulante de proteína C, i.e. deficiência na proteína C, deficiência na proteína S e mutação FV:Q506, a sensibilidade deverá ser elevada, pelo menos de 90%, para todos os defeitos. Além disso, a especificidade deverá ser elevada, acima de 60%, adequadamente acima de 70% e de preferência acima de 80%, de modo a reduzir consideravelmente o número de resultados falso positivos. Os métodos actuais na arte não proporcionam uma solução satisfatória para estes requisitos. Para o desenvolvimento de métodos melhorados para a determinação específica da actividade de proteína C e proteína S e para a determinação de mutações no factor V que afectam a sua 8 actividade anticoagulante, é também desejável melhorar a rfisolucão e especificidade destes métodos. Há também uma necessidade de melhorar a estabilidade de diferentes componentes utilizados como reagentes separados, ou como reagentes em kits compreendendo estes métodos.

Assim, o problema técnico que está na base da presente invenção é proporcionar métodos in vitro com uma sensibilidade e especificidade melhoradas para a pesquisa e detecção especifica de defeitos na via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea num humano. Um outro problema reconhecido é melhorar a estabilidade dos componentes nestes métodos.

Descrição sumária da invenção

Verificou-se agora, de forma inesperada, que os problemas técnicos acima referidos podem ser resolvidos com base na descoberta, surpreendente, de que a adição de níveis baixos de iões de metais divalentes, como os iões Mg2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, Sr2+, Cu2+ ou o ião monovalente Cu+, na presença de iões cálcio aumenta a actividade anticoagulante da via anticoagulante de proteína C e proporciona uma resolução elevada entre níveis diferentes de actividade de proteína C e actividade de proteína S, respectivamente e uma discriminação elevada para a presença da mutação FV:Q506, resultando numa sensibilidade e especificidade melhoradas para a detecção de defeitos em componentes da via anticoagulante de proteína C, com métodos fotométricos e/ou de coagulação. Assim, a invenção constitui também um novo método global, excelente, para a via anticoagulante de proteína C. Além disso, os iões de metais divalentes proporcionam uma melhoria inesperada da estabilidade dos reagentes utilizados, quer quando utilizados - 9 -

separadamente, quer quando utilizados em kits de testes para determinar a actividade anticoagulante de componentes da via anticoagulante de proteína C, em amostras de sangue, com métodos fotométricos e/ou de coagulação.

Assim, os problemas acima mencionados são resolvidos pelas características das reivindicações. O objecto da presente invenção é, assim, um método fotométrico in vitro para a pesquisa qualitativa e determinação quantitativa da actividade funcional de componentes da via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea, compreendendo a medição da taxa de conversão de um substrato exógeno, por uma enzima cuja actividade está relacionada com a actividade anticoagulante de proteína C, numa amostra de sangue de um humano, que compreende factores de coagulação e o referido substrato exógeno após activação, pelo menos parcial, da coagulação, através da via intrínseca, extrínseca, ou comum e desencadeamento da coagulação por adição de iões cálcio, e comparação da referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo, sendo o referido método caracterizado pela adição de mais iões de um metal(ais) à referida amostra. A presente invenção refere-se assim a um novo método in vitro para a pesquisa, num humano, de defeitos na via anticoagulante de proteína C, devido, e.g. a deficiências na proteína C, deficiência na proteína S e mutações no factor V, tais como a mutação FV:Q506, ou outros defeitos no factor V, relacionados com a resistência a APC e/ou actividade de cofactor APC. Este método pode ser concebido para a detecção específica, quer de deficiência de proteína C, quer - 10 -

deficiência de proteína S, quer de mutações no factor V/factor Va, que afectam a taxa de clivagem pela APC. Uma forma de ccncrstizaçao picicj. j.ud ud presente invenção compreende um teste global para a via anticoagulante de proteína C. 0 termo "iões de um metal(ais)" refere-se ao facto de poderem estar presentes iões de um ou mais dos referidos metais. Os iões preferidos dos referidos outros metais são iões de metais divalentes, ou iões de cobre monovalentes, como Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Sr2+ e/ou iões Cu+. 0 termo "amostra de sangue" é definido de modo a abranger uma amostra de sangue, tal como sangue total, ou uma amostra derivada de sangue, como uma amostra de plasma sanguíneo, ou uma amostra de soro sanguíneo. 0 termo "teste fotométrico" é definido de modo a abranger métodos de teste colorimétrico, fluorimétrico e luminométrico. 0 termo "factores de coagulação" refere-se a factores que compreendem componentes nas vias intrínseca, extrínseca e comum (fenómenos procoagulantes, veja-se figura 1) e na via anticoagulante de proteína C (fenómenos anticoagulantes, veja-se figura 1), sendo ou apenas endógenos, i.e. inerentes à amostra de sangue, ou compreendendo também a adição de factores exógenos. Além disso, podem-se adicionar fosfolípidos no método, quando se utiliza qualquer das vias, intrínseca, extrínseca, ou comum, para a activação da coagulação. 0 referido novo método irá assim permitir uma melhor pesquisa e diagnóstico de defeitos na via anticoagulante de proteína C, na investigação de pacientes com doenças tromboembólicas, tais como trombose venosa profunda e/ou - 11 -

embolismo pulmonar. No caso de um paciente pertencer a uma família com trombofilia hereditária, o referido novo método é i-*mhém adequado para a investigavSu de membros aa tamilia do paciente, de modo a determinar a possível hereditariedade de defeitos na referida via. 0 referido novo método é também adequado para o diagnóstico de defeitos na via anticoagulante de proteína C, na investigação de pacientes antes de cirurgia, pacientes com trauma, ou de mulheres grávidas, ou de mulheres que estão a tomar pílulas contraceptivas orais, ou terapia de substituição hormonal, tal como a terapia de estrogénios. Além disso, podem-se conceber métodos globais para permitir a detecção de defeitos conhecidos e de defeitos até agora não reconhecidos na via anticoagulante de proteína C. A invenção pode também permitir a concepção de métodos fotométricos e/ou de coagulação específica, para defeitos ainda não reconhecidos na referida via.

Qualquer dos métodos acima mencionados, compreende a monitorização da conversão de um substrato exógeno, fotométrico, quer pelo factor Xa, quer pela trombina, contendo um cromóforo, fluoróforo ou luminóforo como grupo rejeitado. Exemplos destes grupos rejeitados, mensuráveis fotometricamente, são a p-nitroanilina (pNA, cromóforo) para utilização em métodos colorimétricos, e.g. derivados de naftilamina e cumarina, tais como a metilcumarina, ácido aminoisoftálico e seus derivados (fluoróforos) para utilização em métodos fluorimétricos e e.g. isoluminolamida (luminóforo) para utilização em métodos luminométricos. A invenção é bastante inesperada, atendendo ao conhecimento actual na área, que, de facto, estabelece que vários iões divalentes aumentam a actividade procoagulante de alguns factores de coagulação dependentes de vitamina K, na - 12 -

presença de iões cálcio (veja-se fenómenos procoagulantes na figura 1), de modo que não se poderia esperar que a adição destes outros ί õps de metal(ais) pudessem melhorar os testes em relação à actividade anticoagulante, especificamente na via anticoagulante de proteína C.

Assim, sabe-se que o Mg2+ estimula a actividade do factor IXa (Byrne et al, J Biol Chem 1980; 255:1430-1435; Sekiya F et al, J Biol Chem 1995; 270:14325-14331; Sekiya F et al, J Biol Chem 1996; 271:8541-8544; Morita T et al. Thromb Haemost 1997; 78, Suplemento: 430, Resumo PS-1755) e também aumenta a taxa de activação do factor IX pelo factor FXIa e factor tecidular (Sekiya F et al, loc sit 1995, loc cit 1996; Morita T et al., loc cit) . Também se verificou que nem a proteína C, nem a trombina, factor VII e factor X respondem a Mg2+ (Sekiya F et al, loc cit 1995). Verificou-se que o Mg2+ também estimula a activação de protrombina pelo factor Xa, fosfolípidos e iões cálcio (Prendergast FG e Mann KG, J Biol Chem 1977; 252:840-850) , um efeito que , no entanto, pode não ser pronunciado a concentrações de ião cálcio acima de 1 mmol/1 (Sekiya F et al, loc cit 1995). Além disso, verificou-se que o factor IX tem um único local de ligação para o Mn2+ (Amphlett GW et al., J Biol Chem 1978; 253:6774-6779) o qual foi sugerido ser igual ao local de ligação de Mg2+ (Sekiya F et al., loc cit 1995).

Também se verificou que os iões Mn2+ aumentam a ligação do factor IX a fosfolípidos coagulantes, na presença de iões cálcio ou Sr2+, tendo este último, também, portanto, um efeito procoagulante (Liebman et al, J Biol Chem 1987; 262, 7605- 7612) .

Além disso, verificou-se que os iões Mgz+ e Mn2+ aumentam a actividade amidolítica do factor Vila, i.e. a taxa de clivagem - 13 -

de substratos de péptidos sintéticos de baixo peso molecular (Butenas S et al, Biochemistry 1994; 33: 3449-3456; Persson E.

Petersen LC. ~F.nr .j Bicchsm 1995; 234:293-300), enquanto que foi referido que os iões Zn2+ têm um efeito inibitório na actividade amidolítica do factor Vila, mas nenhum efeito na actividade amidolítica do factor Xa, trombina ou proteína C activada (Pedersen AH et al, Thromb Haemost 1991; 65:528-534). Também se verificou que os iões Mn2+ substituem os iões cálcio na activação do factor X pela enzima do veneno da víbora

Russell, apesar de proporcionar uma taxa de activação baixa (Bajaj P et al, J Biol Chem 1977; 252:4758-4761). O conhecimento na área também estabelece que os iões metálicos divalentes, como o Zn2+ e Cu2+, estimulam a auto- activação de factor XII, um factor de coagulação não dependente de vitamina K (Shore et al, Biochemistry 1987; 26:2250-2258; Bernardo MM et al, J Biol Chem 1993; 268: 12468-12476).

Uma outra ilustração de como a presente invenção era inesperada, é o conhecimento que estabelece que o Mg2+ e o Mn2+ estimulam a inibição da APC pelos dois inibidores de protease do plasma, inibidor de a2-macriglobulina e inibidor de plasmina (Heeb MJ et al, J Biol Chem 1991; 266: 17606-17612).

Assim, a adição de Mg2+ e Mn2+, nas condições utilizadas resulta numa menor actividade anticoagulante da APC.

Deste modo, a presente invenção, que proporciona uma actividade anticoagulante maior da via anticoagulante da proteína C através da utilização de iões de metal(ais), tais como, e.g. iões metálicos divalentes, ou Cu+, para além dos iões cálcio, não poderia ser derivada ou esperada a partir do estado da arte. 14

Descrição sumária das figuras e descrição pormenorizada da invenção A seguir descreve-se a invenção em maior pormenor, fazendo referência às figuras, em gue: A Figura 1 mostra uma representação esquemática do sistema de coagulação sanguínea e sua regulação; A Figura 2 mostra uma representação gráfica dos resultados obtidos no exemplo 2, i.e. os efeitos dos iões metálicos num teste de proteína C cromogénico; A Figura 3 mostra uma representação gráfica dos efeitos obtidos de acordo com o Exemplo 5, nomeadamente o efeito de Mg2+ e Mn2+ num teste de proteína S cromogénico; e A Figura 4 reúne, numa representação gráfica, os resultados obtidos de acordo com o método descrito no Exemplo 8, i.e. o efeito de iões metálicos na discriminação da deficiência de proteína S e para FV:Q506 num teste global de via de proteína C, utilizando o Factor Xa como activador.

Uma forma de concretização da presente invenção preferida, cobre assim um método para a pesquisa global de defeitos na via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea, compreendendo A) incubação de uma amostra de sangue do referido humano compreendendo factores de coagulação, com: 1) um activador para a proteína C na referida amostra, 2) um activador de coagulação adequado, 15

3) um substrato sintético exógeno quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mpnsiirável fotcmstricamcnto, 4) iões cálcio e 5) outros iões de metal(ais) referido B) determinação da taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparação da referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.

Outra forma de concretização da presente invenção refere-se a um método para a determinação da actividade de proteína S livre, que compreende: A) incubação da referida amostra de sangue compreendendo factores de coagulação, com: 1) proteína C activada exogenamente, ou proteína C exógena, juntamente com um activador de proteína C, 2) um activador de coagulação adequado, 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para trombina, que compreende um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) outros iões de metal(ais) referidos; B) determinação da referida taxa de conversão do referido substrato exógeno; e 16

C) comparação da referida taxa de conversão, com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada

Ho meemn moHo

Outra forma de concretização da presente invenção refere-se a um método para a determinação da actividade de proteína C livre, que compreende: A) incubação da referida amostra de sangue compreendendo factores de coagulação com: 1) um activador de proteína C na referida amostra, 2) um activador de coagulação adequado, 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, que compreende um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, e 4) iões cálcio, e 5) outros iões de metal(ais) referidos; B) determinação da taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparação da referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.

Uma quarta forma de concretização da presente invenção, preferida, refere-se a um método para pesquisar uma mutação (ões) de factor V numa amostra de sangue do referido humano, compreendendo: A) incubação de uma amostra de sangue do referido humano, compreendendo factores de coagulação com: 17

__f* (—y7 1) proteína C activada exógena, ou proteína C exógena juntamente com um activador de proteína C, ou um activador para proteína C endógena 2) um activador de coagulação adequado, 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, que compreende um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) outros iões de metal(ais) referidos; B) determinação da taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparação da referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.

Nos métodos preferidos acima mencionados para a pesquisa global de defeitos na via anticoagulante de proteína C, para a determinação de actividade de proteína S livre, ou actividade de proteína C, ou para a pesquisa de uma mutação (ões) do factor V, tal como a mutação FV-.Q506, numa amostra de sangue, o passo A) compreende a incubação da amostra de sangue do referido humano compreendendo factores de coagulação, na presença dos outros iões de metal(ais) adicionados, utilizados de acordo com a presente invenção, com 1) um activador de proteína C na referida amostra, para proporcionar a activação de proteína C endógena, ou proteína C activada exógena, ou proteína C exógena, juntamente com um activador de proteína C, 18

2) um activador de coagulação adequado para proporcionar pelo menos a activação parcial da coagulação, *) um substrato sintético exógeno, para o factor xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, para proporcionar a monitorização do factor Xa, ou actividade de trombina e 4) iões cálcio para desencadear a coagulação.

Estes passos 1) a 4) podem ser realizados separadamente e/ou em simultâneo, i.e. em diferentes combinações sequenciais, proporcionando os referidos métodos de uma fase" a "quatro fases", como se segue:

Nos métodos de uma fase, todos os componentes necessários para a realização dos passos 1) a 4) são adicionados em simultâneo.

No método de duas fases a) os componentes para os passos 1) e 2) podem ser primeiro combinados seguido da adição simultânea de substrato exógeno com iões cálcio (3) e 4)) ou b) todos os componentes, excepto os iões cálcio, (1)-3)) podem ser adicionados em simultâneo, em que a adição dos iões cálcio (4) compreende então o segundo passo, ou c) os componentes para o passo 1), 2) e 4) podem ser incluídos em simultâneo e o passo 3) realizado como um passo separado.

Nos métodos de três fases a) os passos 1) e 2) são combinados e os passos 3) e 4) realizados como passos separados, ou b) os passos 1) e 2) são realizados como passos separados e os passos 3) e 4) são realizados em simultâneo, ou c) os passos 2) e 3) são realizados como passos separados e os passos 1) e 4) são realizados em simultâneo, ou d) o passo 1) 19

é realizado como um passo separado, os passos 2) e 4) são realizados em simultâneo, seguido do passo 3).

Nos métodos de quatro fases, os passos 1) a 4) são realizados como passos separados, na ordem descrita, ou por qualquer outra ordem.

Todos os métodos de uma, duas, três ou quatro fases podem ser utilizados em métodos cromogénicos, fluorimétricos ou luminométricos.

Outras formas de concretização da invenção compreendem métodos de coagulação, utilizando activação através da via intrínseca, extrínseca ou comum.

Para qualquer dos métodos, os referidos outros iões de metal (ais), utilizados de acordo com a presente invenção, podem ser adicionados, quer inicialmente, quer numa fase mais tardia a qualquer dos referidos reagentes. Nas aplicações em que a proteína C endógena é activada por um activador de proteína C, tal como nos métodos para a actividade de proteína C e métodos globais para a via anticoagulante de proteína C, um modo preferido da invenção é incluir os referidos outros iões de metal (ais) no passo de activação da proteína C, especialmente quando se utiliza Protac®C como activador da proteína C.

Especificamente, a invenção refere-se à adição de iões de metais divalentes ou do ião monovalente Cu+, com vista a aumentar a resolução entre diferentes níveis de, respectivamente, actividade de proteína C e actividade de proteína S, bem como proporcionar uma discriminação elevada para a presença da mutação FV:Q506, resultando numa - 20 -

sensibilidade e especificidade melhoradas para a detecção de defeitos em componentes da via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea. A yaxua de concentrações de iões metálicos dentro da qual a actividade anticoagulante do sistema de proteína C é estimulada, varia em relação ao ião metálico efectivo. A concentração óptima de iões Mg2+ é consideravelmente maior do que a de outros iões metálicos. A gama de concentrações para iões metálicos, que não o Mg2+, compreende 1 μπκ>1/1-2 mmol/1, adequadamente 5-400 μιηοΙ/L e preferencialmente 10-80 μιηοΐ/l. Para os iões Mg2+, a gama de concentrações compreende 20 μιηοΐ/lj - 10 mmol/1, adequadamente 100 μπιοΙ/L - 2 mmol/L e preferencialmente 200 μιηοΙ/L - 1 mmol/L. 0 contra-ião deverá ser seleccionado de modo a permitir as concentrações de iões metálicos disponíveis acima descritas. Os contra-iões adequados são aniões mono-, di- e trivalentes, de preferência aniões mono- e divalentes, tais como aniões cloro, sulfato e nitrato. Também se podem proporcionar iões metálicos na forma de um complexo de ião metálico com proteína(s), tais como proteínas sanguíneas, ou uma superfície sólida, tal como uma parede de um vaso reaccional revestida com um ião metálico.

Para qualquer aplicação da invenção, utilizam-se métodos fotométricos e de coagulação, para monitorizar a actividade anticoagulante de componentes na via anticoagulante de proteína C.

Nos métodos fotométricos, utilizam-se substratos sintéticos cora grupos rejeitados colorimétricos, fluorimétricos ou luminoméricos, os quais deverão ser 21

preferencialmente selectivos para o factor Xa ou para a trombina. Uma vez que a produção de factor Xa e de trombina de acordo com a -invenção 6 influenciada pela actividade anticoagulante de proteína C na mistura reaccional, que contém uma amostra teste de um indivíduo, a medição da taxa de conversão dos referidos substratos pelas referidas enzimas é adequadamente realizada, para a determinação da referida actividade anticoagulante de proteína C. A medição da referida taxa de conversão é adequadamente comparada com a taxa de conversão correspondente, obtida quando se utiliza um conjunto de plasma humano normal como amostra teste. A taxa de conversão pode ser medida cineticamente, i.e. monitorizando a alteração na densidade óptica (DO) versus tempo, expressa como e.g. ADO/min, ou medida após um tempo de incubação fixo, expressa como DO. A determinação da taxa de conversão de substratos sintéticos é realizada com instrumentos disponíveis para a monitorização da libertação do grupo rejeitado do substrato efectivo, escolhido. Quando a taxa de conversão é determinada num leitor de microplacas, é adequado realizar as leituras no designado modo de comprimento de onda duplo, de modo a eliminar possíveis diferenças entre os poços da microplaca. Nestas leituras, selecciona-se um comprimento de onda para a detecção da libertação do grupo rejeitado, enquanto que o outro comprimento de onda é seleccionado numa gama de comprimentos de onda em que o grupo rejeitado libertado não tem nenhuma absorvência apreciável. Quando se escolhe um grupo rejeitado colorimétrico como a paranitroanilina (pNA), faz-se uma leitura adequada a comprimento de onda duplo a 405 e 490 nanometros, expressa como DO405-409nin· 22

-~7

Um outro aspecto da invenção é a utilização de amostras de sangue diluído nos referidos métodos fotométricos, de modo a evitar a interferência de componentes dc amostras de sangue na amostra teste, tais como, e.g., anticorpos contra complexos fosfolípido-proteína (presentes em e.g., pacientes com anticoagulante de Lupus). A concentração final, i.e. a concentração na amostra, cuja densidade óptica é determinada, pode variar, dependendo do método utilizado. Para os métodos colorimétricos, a referida concentração de amostra de sangue pode ser inferior a 10% e de preferência inferior a 5%.

Pode-se utilizar qualquer activador de proteína C endógena, tal como a trombina, com ou sem trombomodulina, ambos de fontes humanas ou não-humanas, ou produzidos por tecnologia recombinante, como proteínas do tipo selvagem, ou como polipéptidos modificados, para proporcionar uma propriedade funcional adequada ou alternativamente, uma enzima de veneno de cobra que activa a proteína C. As enzimas de veneno de cobra adequadas são preferencialmente seleccionadas da família da cobra Agkistrodon e podem ser adicionados como veneno bruto, ou num estado purificado, como o produto Protac®C. As enzimas de veneno de cobra adequadas podem também ser produzidas por tecnologia recombinante, como proteínas do tipo selvagem, ou como polipéptidos modificados, para proporcionar a propriedade funcional adequada. A concentração de activador de proteína C pode variar, dependendo das condições utilizadas. Assim, para o activador Protac®C, a concentração pode variar entre 1 x 10~3 e 1 U/ml, de preferência 2 x 10“3 e 0,3 U/ml durante a activação da proteína C num método global para a via anticoagulante de proteína C, ou em métodos específicos para actividade de proteína C e proteína S livre, ou para um método para a detecção de 23

mutações no factor V/factor Va, sem afectar a taxa de clivagem pela APC.

De acordo com outra forma de concretização preferida da presente invenção, a activação de proteína C na amostra de sangue precede, ou ocorre em simultâneo, com a activação da coagulação.

Nos métodos da presente invenção, utiliza-se um activador de coagulação adequado. Estes activadores podem ser seleccionados para activar a designada via intrínseca, extrínseca, ou comum. A activação através do sistema intrínseco pode ser realizada com um reagente APTT que contém um activador de contacto adequado ou com a adição separada de um activador de contacto. Como activadores da via intrínseca, podem-se utilizar composições adequadas de fosfolípdos e activadores de contacto. Os fosfolípidos podem ser adicionados como uma mistura de fosfolípidos purificados, ou como extractos brutos de fontes biológicas, como, e.g. cérebro, placenta, clara de ovo e soja. Como activadores de contacto, podem-se utilizar ácido elágico, colagénio, ou substâncias relacionadas com o colagénio, ou várias formas de sílica (caolino, sílica micronizada, sílica coloidal). Alternativamente, podem-se utilizar o factor Xlla, factor Xla ou factor IXa em combinação com fosfolípidos, como activadores da via intrínseca, em vez de utilizar um activador de contacto. Opcionalmente, podem-se adicionar componentes como a protrombina, factor VlII/factor VlIIa e factor X. Utilizam-se substratos fotométricos selectivos para o factor Xa, ou trombina. 24

A activação pelo sistema extrínseco pode ser realizada pelo factor tecidular de tecidos humanos ou não-humanos, ou produzido por tecnologia recoriibiiicmLe, uomo uma proteína ao tipo selvagem, ou como um polipéptido modificado de forma adequada, com ou sem a adição de factor Vll/factor Vila. Alternativamente, a activação pode ser realizada pelo factor Vila, em combinação com os referidos fosfolípidos.

Opcionalmente, podem-se adicionar reagentes como a protrombina, factor V/Va, factor IX e factor X. Utilizam-se substratos fotométricos selectivos para FXa ou trombina. A activação da via comum pode ser realizada por adição de factor Xa exógeno, ou por factor X exógeno em combinação com um activador exógeno do factor X, tal como uma enzima de veneno de cobra, e.g. uma enzima de veneno de cobra de Russeli Viperi. Alternativamente, o referido activador exógeno do factor X pode ser adicionado, para activação de factor X endógeno. Opcionalmente, podem-se adicionar a protrombina e/ou factor V/Va. Utilizam-se substratos fotométricos selectivos para a trombina.

Geralmente, as interferências devidas a e.g. níveis funcionais variáveis de componentes, na amostra podem ser minimizados, incluindo uma quantidade adequada de plasma deficiente no componente da via anticoagulante de proteína C a ser determinado. Este plasma pode ser deficiente em e.g. proteína C, proteína S ou factor V. No caso de um método global para a via anticoagulante de proteína C, pode-se adicionar um plasma deficiente em proteína C, proteína S e factor V.

No caso de um método para a actividade de proteína S, ou um método para a detecção de uma mutação do factor V que - 25 -

afecta a degradação do factor V/Va pela APC, pode-se adicionar proteína C exógena como um plasma deficiente para a proteína S e factor V. rp.snerl- ΐ vamonta ,

Pode-se adicionar proteína S nos métodos para actividade de proteína C ou para a detecção da(s) referida mutação no factor V.

No caso de métodos para a proteína C e proteína S, pode-se adicionar também factor V/factor Va para minimizar a interferência do factor V mutado, presente na amostra, vz mutações que afectam a degradação do factor V/Va pela APC.

Os factores de coagulação e componentes da via anticoagulante de proteína C, acima mencionados, vz factor Xlla, factor Xla, factor IX/IXa, factor VlII/VIIIa, factor VlI/VIIa, factor X/Xa, factor V/Va, protrombina, proteína C/APC e proteína S são de origem humana ou não-humana, adequadamente de origem bovina ou humana. Os referidos factores de coagulação podem ser também produzidos por tecnologia recombinante como tipo-selvagem, ou como polipéptidos modificados, com actividade biológica adequada.

De modo a impedir a formação de gel de fibrina, pode-se adicionar um inibidor da polimerização de fibrina à mistura reaccional, tal como Gly-Pro-Arg-Pro.

Em métodos cromogénicos, pode-se utilizar qualquer substrato cromogénico para o factor Xa, tal como e.g. benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (S-2222, Chromogenix AB, Mõlndal, Suécia), Ν-α-Ζ-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765, Chromogenix AB) , CH3SC>2-D-Leu-Gly-Arg-pNA (CBS 31,39, Stago Diagnostica) e MeO-CO-D-CHG-Gly-

Arg-pNA (Spectrozyme XA, American Diagnostica, Greenwich, - 26 - ‘7 USA). Correspondentemente, pode-se utilizar qualquer substrato cromogénico para a trombina, e.g. H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238, Chromogenix AB), piroGlu-Pro-Ara-PNA (S-23££, Chiumogenix AB), D-Ala-Pro-Arg-pNA (S-2846, Chromogenix AB) , Z-D-Arg-Sarc-Arg-pNA (S-2796, Chromogenix AB) , AcOH*H-D-CHG-But-Arg-pNA (CBS 34,47, Stago) e H-D-HHT-Ala-Arg-pNA (Spectrozyme TH, American Diagnostica).

Um outro assunto objecto da presente invenção é um kit para utilização nos métodos acima descritos, que compreende os seguintes componentes: a) um activador para a proteína C, ou proteína C activada exogenamente ou proteína C exógena, juntamente com um activador de proteína C; b) um activador de coagulação adequado; c) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, que compreende um grupo rejeitado mensurável fotometricamente; d) iões cálcio; e e) outros iões de metal(ais) referidos; em recipientes separados e/ou em recipientes compreendendo misturas de pelo menos dois dos referidos componentes, em solução aquosa, ou na forma liofilizada.

Uma outra forma de concretização preferida da presente invenção refere-se a um kit para utilização nos métodos acima, que compreende os seguintes componentes: 27

(ΛΛλΑκϊρ'

(=h a) um activador de proteína C ou proteína C exógena activada ou proteína C exógena, juntamente com um activador de proteína C; b) um activador de coagulação adequado; c) um substrato sintético exógeno quer para o factor Xa quer para a trombina, que compreende um grupo rejeitado mensurável fotometricamente; d) iões cálcio; e) os referidos outros iões de metal(ais) f) factores de coagulação; e em recipientes separados e/ou recipientes compreendendo misturas de pelo menos dois dos referidos componentes em solução aquosa, ou na forma liofilizada.

Uma outra forma de concretização da presente invenção compreende um reagente para utilização nos métodos acima, compreendendo pelo menos dois dos componentes seguintes a) a f) : a) um activador de proteína C; ou proteína C activada exógena, ou proteína C exógena, juntamente com um activador de proteína C; b) um activador de coagulação adequado; - 28 -

c) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa quer para trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurávpl fntO!r.etric2™cr.tc ; d) iões cálcio; e) o referido ião de metal(ais); e f) factores de coagulação; num recipiente em solução aquosa ou na forma liofilizada.

Uma forma de concretização preferida do referido reagente compreende proteína C activada, com ou sem iões cálcio e os referidos outros iões de metal(ais). Uma outra forma de concretização preferida do referido reagente, compreende factores de coagulação e activadores de proteína C e os referidos outros iões de metal(ais), se desejável, em combinação com fosfolípido(s). Outra forma de concretização compreende factor IX/IXa, factor X/Xa e/ou iões cálcio e os referidos outros iões de metal(ais), ou os referidos outros iões de metal(ais) em combinação com factor V/Va, proteína C e protrombina. Opcionalmente, podem-se combinar o factor

VlII/VIIIa) e/ou trombina com os referidos outros iões de metal(ais). Numa outra forma de concretização, os referidos outros iões de metal(ais) são combinados com um activador de proteína C, tal como Protac®C ou trombina/trombomodulina. As referidas formas de concretização de reagente são adequadamente contidas num recipiente, numa solução aquosa, ou na forma liofilizada.

Pode-se utilizar uma grande gama de concentrações de reagentes nos métodos da presente invenção. A tabela 1 - 29 -

seguinte apresenta gamas adequadas e preferidas para os vários componentes utilizados no método e contidos nos kits e rpanpnfp? de acorde com a presente invenção.

Tabela 1

Concentração final no meio reaccional final

Parâmetro

Amostra de sangue 0, 02 ! - 10%, de preferência 0,1 - 5% FIX/FIXa 1 X 10'15 - 1 x IO-6 mol/1 FX/FXa 1 X 10'15 - 5 x 10-7 mol/1 FV/FVa 1 X 10'12 - 10"7 mol/1, de preferência 2 X 10_1° - 5 x 10"8 mol/1 FVII/FVIIa 1 X 10'15 - 2 x 10"8 mol/1 FVIII/FVIIIa 1 X 10"4 - 5 x 10'1 IU/ml Protrombina 1 X 10'9 - 5 x 10'7 mol/1 Trombina 1 X IO'15 - 1 x IO-8 mol/1 iões Ca2+ 0, 5 - 20 mmol/1, de preferência 1 - 10 mmol/1 iões Mg2+ 20 μιηοΐ/ΐ - 10 mmol/1, adequadamente μπιοΐ/ΐ - 2 mmol/1 e de preferência 200 μπκ>1/1 - 1 mmol/1 iões Mn2+, Zn2+, Cu2+

Ni2+, Sr2+ e/ou

Cu+ Proteína C/APC Protac®C Proteína S Factor tecidular 1 μιηοΐ/ΐ - 2 mmol/1, adequadamente 5 - 400 μιηοΐ/ΐ e de preferência 10 - 80 μιηοΐ/ΐ 1 x 10-10 - 1 x 10"7 mol/1, de preferência 5 x IO"10 - 1 x 10"8 mol/1 1 x 10'3 - 1 U/ml, de preferência 2 x 10-3 -0,3 U/ml 10‘9 - 5 x 10“7 mol/1 10‘8 - IO"5 g/1, de preferência 5 x 10-8 -10"6 g/1 30

Trombina/ trombomodulina

Fosfolí niHn

Inibidor de polimerização de fibrina

Gama dependente da substância utilizada

Substrato cromo- génico PH Força iónica 10'5 - 5 x 10'3 mol/1 6,5 - 9,5, de preferência 7-8,5 0 - 0,6, de preferência 0,01 - 0,25

As formas de concretização adequadas incluem preparação em solução aquosa ou liofilização num recipiente, de um ou mais componentes apresentados na tabela 1 acima, tal como uma proteína com, ou sem iões de metal(ais), opcionalmente na presença de fosfolípido, para proporcionar reagentes adequados para utilização no método de acordo com a invenção. As referidas formas de concretização podem compreender, e.g. proteína C ou APC e os referidos iões de metal (ais) e com ião cálcio e com ou sem uma enzima activa, tal como factor IXa ou factor Xa. Outras formas de concretização podem compreender iões de metal (ais) com qualquer um, ou uma combinação de factor V/Va, proteína S, protrombina, factor X, factor VlII/IIIa, trombina. Outra forma de concretização pode compreender um activador de proteína C como o Protac®C ou trombina/trombomodulina com iões de metal(ais).

Os métodos da presente invenção permitem tempos de reacção convenientes tais como 1- 10 min, de preferência 2-5 min, para proporcionar facilidade de aplicação a aparelhos de coagulação automáticos. 31

7 A invenção refere-se também a kits e reagentes para utilização nos métodos in vitro acima descritos, para a pesquisa e diagnóstico de deficiênr.-i λ em proteína C e pxoceina S e para mutações no factor V que afectam a actividade anticoagulante de APC. A invenção refere-se ainda a um kit para um método in vitro para a pesquisa e diagnóstico de defeitos na via de proteína C, causados por e.g., deficiência de proteína C, deficiência de proteína S e mutações de factor V. Os referidos kits compreendem uma selecção adequada de componentes enumerados na tabela 1, de preferência presentes como reagentes num ou mais recipientes, compreendendo os referidos componentes em solução aquosa ou na forma liofilizada. A invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes que, no entanto, não restringem de modo algum o âmbito das reivindicações.

Exemplo 1

Efeito de iões de manganésio e magnésio na determinação da actividade de proteína C num teste de produção de trombina, cromogénico, de três fases, utilizando o activador de proteína C Protac®C.

Amostras: Plasma deficiente em proteína C (Biopool, Umeâ,

Suécia) com e sem adição de proteína C humana purificada (Chromogenix AB) , para se obter 0, 0,1, 0,5, e 1,0 IU/ml de proteína C.

Diluição da amostra: 1:41 em Tris-HCl 25 mmol/1 pH 7,6, NaCl 6,20 mmol/1, albumina de soro bovino a 0,2%. 32

Activador de proteína C: Utilizou-se Protac®C como solução mãe contendo 10 U/ml. A concentração final durante a activação de proteína C = 0,17 U/ml. Ad.i rd nn?ra”-cc iões Hy’-" e Mn2, para se obterem concentrações finais durante a activação de proteína C, de 0,4 e 0,04 mmol/1, respectivamente.

Reagente 1: Factor IXa de bovino (Enzyme Research, South Bend 33 ‘^7

a hidrólise de substrato, por adição de 50 μΐ do substrato de trombina cromogénico, S-2796 e incubando durante 4 minutos a 37 °C. A reacção é então terminaH; bailando u pn através da adição de 50 μΐ de ácido acético a 20%. Em seguida, a densidade óptica (DO) das amostras nos micropoços é registada a 405 e 490 nm e a diferença entre a densidade óptica a 405 e 490 nm, DO405-4901111U é calculada. Esta reacção de três fases é representada esquematicamente como se segue:

Activaçao de proteína C:

Activação de coagulação

Hidrólise do substrato

Diluição do plasma 50 μΐ Activador de proteína C 50 μΐ 3 min, 37 °C

Reagente 1 50 μΐ Reagente 2 50 μΐ 5 min, 37 °C S-2796 50 μΐ

4 min, 37 °C HOAc, 20% 50 μΐ

RegistO da DO405-490nin

Resultados:

Proteína C, IU/ml 0 0,1 0,5 1,0 Ca2+, 6 mmol/1 0,542 0,515 0,503 0,467 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,04 mmol/1 0,564 0,441 0,231 0,076 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mg2+, 0,4 mmol/1 0,541 0,441 0,230 0,069 34

Os resultados demonstram que incluindo iões de manganésio e magnésio num sistema reaccional que contém iões cálcio, se obtém um grande aumento da arfividadc antiuuaguiante, manifestado pelo facto de concentrações crescentes de proteína C nas amostras resultarem numa absorvência muito menor, i.e. uma produção de trombina muito menor. Pelo contrário, na presença de apenas iões cálcio, há uma resolução muito menor na absorvência, i.e. na produção de trombina, a concentrações crescentes de proteína C. Assim, a adição de outros iões metálicos constitui um método melhorado para a determinação da actividade de proteína C.

Exemplo 2

Efeito de diferentes iões metálicos na determinação da actividade de proteína C, num teste de produção de trombina de três fases, utilizando uma concentração de activador de proteína C quatro vezes menor.

As condições experimentais foram como no exemplo 1, excepto para a utilização de uma concentração final de activador de proteína C (Protac®C) de 0,043 U/ml. Adicionaram-se iões Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Ni2+ para se obterem concentrações finais durante a activação de proteína C, de 0,4 mmol/1 (Mg2+) ou 0,04 mmol/1. Também se adicionaram iões Mn2+ e Cu2+ para se obter uma concentração final de 0,08 mmol/1. Também se utilizou Ca2+ a concentrações finais de 1,5 mmol/1 e 6,6 mmol/1, na ausência de outros iões metálicos.

Resultados: Os resultados são apresentados na tabela a seguir com todos os dados primários, que também incluem uma comparação entre as concentrações finais de 0,04 e 0,08 mmol/1 para Mn2+ e Zn2+ 35

Proteína c, IU/ml 0 0,1 0.5 1 r\ Ca2+, 6 mmol/L 1 D, 652 0,633 0,559 0,505 Ca2+, 1,5 mmol/1 0,640 0,585 0,504 0,438 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,04 mmol/L 0,725 0,689 0,503 0,237 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2\ 0,08 mmol/L 0, 627 0,469 0,145 0,056 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,4 mmol/L 0, 627 0,583 0,361 0,123 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Zn2+, 0,04 mmol/L 0,513 0,446 0,334 0,129 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Zn2+, 0,08 mmol/L 0,421 - 0,189 0,051 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Ni2+, 0,04 mmol/L 0,594 0,437 0,173 0, 047 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Cu2+, 0,08 mmol/L 0,487 0,425 0,348 0,099 Os resultados acima, mostrados também graficamente

Figura 2, demonstram que muitos iões metálicos diferentes proporcionam uma melhoria da actividade anticoagulante e também que a concentração de cálcio de 1,5 mmol/1, na ausência de quaisquer outros iões metálicos adicionais não possui actividade potenciadora de anticoagulação. Além disso, a concentração de Protac®C não é critica, uma vez que a utilização de uma concentração quatro vezes menor deste componente ainda resulta numa actividade anticoagulante pronunciada, na presença de iões metálicos adicionados. - 36 -

Exemplo 3

Efeito de iões metálicos na def prmiriaçãc da actividade de proteína C num teste de produção de trombina de duas fases.

Os pormenores experimentais são como descrito no exemplo 1, com as seguintes excepções: - a concentração final de activador de proteína C (Protac®C) era 0,043 U/ml durante a activação de proteína C. - 0 substrato de trombina cromogénico utilizado, era S-2846 (Chromogenix AB). - o substrato cromogénico foi incluído no reagente 1 adicionou-se proteína C humana purificada ao plasma deficiente em proteína C para se obter 0, 0,1 e 0,5 IU/ml, - iões metálicos testados: Mn2+ e Mg2+

Resultados, expressos como DO405-490nm a) iões Mn2+ Proteína C, IU/ml 0 0,1 0, 5 Ca2+, 6 mmol/1 1,18 1,07 0, 669 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,04 mmol/L 1,36 1,17 0,258 a) iões Mg2+ Proteína C, IU/ml 0 0,1 0,5 Ca2+, 6 mmol/1 1,24 1,05 0,554 - 37 -

Ca2+, 1,5 mmol/1 +

Mg2+, 0,4 mmol/L 1,45 1, 15 0,215

Estes resultados mostram que se obtém uma resolução significativamente maior para as diferentes actividades de proteína C, quando se adicionam iões Mn2+ e Mg2+ a uma concentração final de 0,04 mmol/1 e 0,4 mmol/1, respectivamente, constituindo assim um método de duas fases melhorado para a determinação da actividade de proteína C.

Exemplo 4

Efeito dos iões manganésio na determinação da actividade de proteína C num teste de produção de trombina de duas fases, utilizando uma emulsão de fosfolípidos de cérebro de bovino.

Fonte de fosfolípidos: Cefoteste (Nycomed, Oslo, Noruega)

Os pormenores experimentais são como no exemplo 3. A concentração final de Cefoteste era de 3% (v/v) Resultados, expressos como DO405- -490nm Proteína C, IU/ml 0 0,1 0,5 Ca2+, 6 mmol/1 1,09 0,813 0,375 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,04 mmol/L 1,366 0, 996 0,163

Os resultados mostram que se obtém o mesmo efeito potenciador na actividade anticoagulante de proteína C com um 38

extracto bruto de fosfolípidos de uma fonte de tecido animal. Assim, a fonte de fosfolípidos não é crítica.

Exemplo 5

Efeito de iões manganésio e magnésio na determinação de actividade de proteína S livre, num teste cromogénico de produção de factor Xa.

Amostra: plasma deficiente em proteína S (Biopool), com ou sem adição de proteína S humana purificada, para se obter 0%, 25% e 100% de proteína S.

Diluição da amostra: 1:61 em tampão Tris 50 mmol/1, pH 8,2, NaCl 0,15 mmol/1, BSA a 0,2%

Factor reagente (concentração no teste antes da adição de substrato): FIXa de bovino (4 mU/ml) FX de bovino (0,3 U/ml) FVIII humano (0,02 U/ml) FV humano (0,02 U/ml)

Protrombina humana (0,01 U/ml)

Fosfolípidos (21 μιηοΐ/ΐ)

Mg2+ (0,4 mmol/1) ou Mn2+ (0,04 mmol/1) ou nenhuma adição Meio: 10 mmol/1 MES pH 6,0, NaCl 0,15 mol/1, BSA a 0,2%

Reagente de partida APC humana (0,35 μg/ml)

CaCl2 (1/5 mmol/1) 39

Substrato de factor Xa Chromoqenix: S-2765 (Chromogenix AB), 1,8 mmol/1

Para realizar o teste, misturaram-se 50 μΐ da amostra de plasma diluído com 50 μΐ do factor reagente acima referido, e a mistura foi em seguida incubada durante três minutos a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de reagente de partida compreendendo APC humana e cloreto de cálcio e a mistura foi incubada durante quatro minutos a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de substrato cromogénico S-2765 e incubou-se a mistura reaccional durante dois minutos a 37 °C, adicionando-se em seguida 50 μΐ de ácido acético, para terminar a reacção. A absorvência da amostra foi então determinada de acordo com o Exemplo 1 e expressa como DC>405-490nm·

Factor reagente 50 μι Diluição da amostra 50 μΐ Incubação 3 minr 37 °C APC/CaCl2 50 μΐ 4 min, 37 °C S-2765, 1,8 mmol/1 50 μΐ 2 min, 37 °C HOAc, 20% 50 μΐ

Resultados: Todos os dados primários estão enumerados na tabela a seguir e são também ilustrados na figura 3

Proteína S livre, % 0 25 100

Ca2+, 1,5 mmol/1 0,857 0, 642 0, 364 40

[I

[I

Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mn2+, 0,04 mmol/L 1,53 1,34 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mg2\ 0,4 mmol/L 1,053 0,851 0,745 0,378 A figura 3 mostra que a adição de iões Mg2+ ou Mn2+ resulta numa maior resolução (i.e. num declive maior da curva) bem como numa dose-resposta mais linear, quando comparado com a utilização de apenas Ca2+, constituindo assim um método melhorado para a determinação da actividade de proteína S.

Exemplo 6

Efeito de iões estrôncio na determinação da actividade de proteína S livre, num teste cromogénico de produção de factor Xa.

Os pormenores experimentais são como descrito no Exemplo 5, mas com o factor reagente armazenado durante uma hora antes do teste.

Resultados: Absorvências expressas como DO405-490nm

Proteína S livre, % 0 25 100 Ca2+, 1,5 mmol/1 0,673 0, 488 0,258 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Sr2+, 0,4 mmol/L 0,848 0,611 0,276

Os resultados mostram que se obtém uma maior resolução para vários níveis de actividade de proteína S com a adição de 41

ΙλΛ

iões Sr2+f suportando o efeito potenciador dos iões Sr2+ na actividade da via anticoagulante de proteína C

Exemplo 7

Efeito de iões metálicos na detecção da deficiência de proteína S num método cromogénico global para a via anticoagulante de proteína C, utilizando factor tecidular como activador da coagulação e monitorizando a produção de trombina.

Amostra: conjunto de plasma humano normal e plasma deficiente em proteína S (Biopol, Umeâ, Suécia)

Diluição da amostra: 1:21 em Tris-HCl 25 mmol/1 pH 7,6, NaCl 20 mmol/1, albumina de soro bovino a 0,2%.

Activador de proteína C: O activador de proteína C (Protac®C) da Coamatic Protein C foi reconstituído em 7,2 ml, de acordo com o folheto informativo do kit e em seguida diluído em Tris-HCl 25 mmol/1 pH 7,6, NaCl 20 mmol/1, albumina de soro bovino a 0,2%, para se obter uma concentração durante a activação de proteína C, de 0,02 U/ml. A protrombina humana (Chromogenix AB) foi adicionada para se obter uma concentração final após adição de factor tecidular de 1,5 μg/ml. A análise foi realizada com ou sem iões Mg2+, adicionados à solução de Protac®C.

Reagente:

Factor tecidular: Thromborel (Behringwerke, Marburg, Alemanha) reconstituído em 2 ml de água de acordo com o fabricante, 42

diluído em seguida em Tris-HCl 25 mmol/1, pH 7,6, NaCl 20 mmol albumina de soro bovino a 0,2% para se obter uma concentração final durante a activação da coagulação dc C,C33% iv/v).

Fosfolípidos (fosfatidilcolina a 43%, fosfatidilserina a 27% e esfingomielina a 30%): concentração final durante a activação da coagulação de 16,7 μπιοΐ/ΐ.

CaCl2: concentração final de 6,6 mmol/1 durante a activação da coagulação

Substrato de trombina cromogénico: S-2796 (Chromogenix AB) , 1,8 mmol/1

Para realizar o teste, misturaram-se 50 μΐ da amostra de plasma diluído com 50 μΐ de activador de proteína C, sendo a mistura a seguir incubada durante dois minutos a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de reagente, compreendendo factor tecidular e a mistura foi incubada durante quatro minutos a 37 °C. em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de substrato cromogénico S-2796 e a mistura reaccional foi incubada durante 4 minutos a 37 °C, adicionando-se em seguida 50 μΐ de solução de ácido acético, para terminara reacção. A absorvência da amostra foi então determinada de acordo com o Exemplo 1 e expressa como DO405-490nm·

Microplaca

Teste: Diluição da amostra 50 μΐ

Activador Protac C 50 μΐ

2 min, 37 °C

Reagente 50 μΐ - 43 -

Ca2+, 6, 6 mmol/1 Ca2+, 6,6 mmol/1 + Mg2+, 0,4 mmol/1

2 min, 37 °C S-2769 50 μΐ

4 τη τ n ' 27 °C HOAc, 20% 50 μΐ

Resultados

Plasma normal Plasma def. em proteína S 0,26 0,53 0,29 0,75

Os resultados mostram que a adição de iões magnésio a iões cálcio origina uma maior resolução a diferentes níveis de actividade de proteína S, melhorando portanto a detecção de deficiências de proteína S.

Exemplo 8

Efeito de iões metálicos na resolução entre diferentes níveis de proteína S livre e na detecção de FV:Q506, num método global para a via anticoagulante de proteína C, utilizando factor Xa como activador da coagulação e monitorizando a produção de trombina.

Os pormenores experimentais são como no exemplo 7, mas utilizando factor Xa de bovino (Chromogenix AB) , em vez do factor tecidular, como activador da coagulação. A concentração de factor Xa = 1,4 ng/ml durante a activação. Além disso, utilizou-se uma solução mãe de Protac®C contendo 10 U/ml, que foi diluída em Tris-HCl 25 mmol/1 pH 8,4, albumina de soro bovino a 0,2%, para se obter uma concentração durante a activação de proteína C de 0,02 U/ml. 44

Amostras 100% de proteína S = conjunto de plasma humano normal 0% de prnt-pína c - placma defiwienLe em proteína S 25% de proteína S = plasma deficiente em proteína S + 25 pg/ml de proteína S humana purificada.

Analisou-se também uma amostra de um indivíduo com heterozigoticidade para a mutação de factor V (FV.-R506Q).

Resultados: Veja-se figura 4. A tabela a seguir mostra todos os dados primários expressos como DO405-490nm-

Amostra Apenas Ca2+ Ca2+ + Mn2+ 0,04 mM Ca2+ + Mgz+ 0 100% de proteína S 0,222 0,309 0,414 25% de proteína S 0,411 0,485 0,667 0% de proteína S 0,650 0,975 1,147 FV:R506Q 0,402 0, 693 0,761

Os resultados mostram que se obtém uma maior resolução para a deficiência de proteína S na gama de 0 - 100%, bem como uma discriminação elevada para a mutação FV:Q506, quando se incluem iões Mg2+ ou Mnz+ na mistura reaccional, provando assim a utilização benéfica de adicionar iões metálicos num método cromogénico global.

Exemplo 9

Comparação entre um método cromogénico global de acordo com a invenção, utilizando factor Xa como activador da coagulação, com um método de coagulação global de acordo com a arte anterior, utilizando APTT como activador da coagulação, - 45 -

em relação à resolução entre níveis diferentes, respectivamente, de actividade de proteína C e actividade de proteína S e pm. relação ò análise ue plasma de mulheres grávidas.

Amostras: conjunto de plasma normal humano (NPL), três plasmas de indivíduos saudáveis (N1-N3), quatro plasmas de mulheres grávidas (P1-P4) e plasmas com 0% e 50% de deficiência em proteína C e proteína S, respectivamente, sendo os níveis de 50% preparados por adição de proteína C humana purificada (Chromogenix AB) ou proteína S (Chromogenix AB) a plasma deficientes, quer em proteína C, quer S (ambos de Biopool AB).

Teste cromogénico global: Para mais pormenores e teste experimentais vejam-se os Exemplos 7 e 8. Utilizou-se uma solução mãe de Protac®C contendo 10 U/ml que foi então diluída para se obter uma concentração final durante a activação de proteína C = 0,02 U/ml. O ião metálico utilizado = Mn2+ que foi adicionado à solução de Protac®C para se obter 0,04 mmol/1 no passo de activação de proteína C. A análise foi realizada numa microplaca e a DO405-490nm foi determinada como descrito no Exemplo 1. Uma DO405-490nm elevada corresponde a uma formação pronunciada de trombina e portanto a uma actividade da via anticoagulante de proteína C diminuída.

Teste de coagulação global utilizando reagente APTT: Utilizou-se o reagente APTT da Coatest® APC Resistance a uma concentração final de fosfolípido de 33 μιηοΐ/ΐ durante a activação da coagulação. Para a activação de proteína C, utilizaram-se a mesma solução mãe de Protac®C e meio de diluição, que no teste cromogénico. A concentração final durante a activação de proteína C=0,083 U/ml. A análise foi 46

realizada num analisador de coagulação ST-4 (Diagnostica Stago).

Amostra de plasma 50 μΐ Protac®C ou tampão 50 μΐ Reagente APTT 50 μΐ Activação durante 3 min, 37 °C Ca2+, 25 mmol/1 50 μΐ 0 tempo de coagulação em segundos foi determinado na presença (CT+) e ausência (CT-) de Protac®C e calculou-se uma razão do tempo de coagulação (CTR) como CTR = CT+/CT-. Um CTR baixo corresponde a uma formação pronunciada de trombina, também na presença de Protac®C e portanto a uma actividade da via anticoagulante de proteína C diminuída

Resultados Amostra Cromogénico APTT DO405-490 CTR NPL 0,202 3,77 NI 0,183 5,17 N2 0,182 0 m m N3 0,186 4,85 PI 0,221 3, 15 P2 0,298 2,21 P3 0,239 2, 60 P4 0,259 2,66 50% Pr S 0,578 3,48 0% Pr S 0,802 1,80 50% Pr C 0,456 3,86 0% Pr C 1,084 1,18 47

Os resultados demonstram que a) para amostras com 50% de deficiência, quer de proteína C, quer de proteína S, se obtém uma maior resolução em relar.ãn ã? amestras normais « b) para amostras de mulheres grávidas se obtém um desvio menor em relação às amostras normais, com o teste cromogénico, suportando a ideia de que uma sensibilidade e especificidade maiores serão obtidas com um teste cromogénico global de acordo com a invenção, quando comparado com um método de coagulação global, de acordo com a arte anterior.

Exemplo 10

Efeito de uma mistura de Mg 2+

Mn 2+ num reagente de fosfolípido, ou num reagente APC na discriminação para a mutação FV:Q506, num teste cromogénico de produção de trombina utilizando factor Xa como activador.

Amostra: Plasma com factor V normal (R506R) e com hetero (R506Q) e homozigoticidade (Q506Q) para a mutação FV:Q506.

Diluição da amostra: 1:41 em Hepes 0,05 mol/1 pH 7,7, NaCl 0,15 mol/1

Reagente A:

Reagente B:

Protrombina humana 19 μg/ml

Fosfolípidos (43% de fosfatidileolina, 27% de fosfatidilserina e 30% de esfingomielina), 50 μιηοΐ/ΐ

Factor Xa de bovino, 0,2 nmol/1 APC 6 μg/ml CaCl2, 25 mmol/1 - 48 - 7 7

50 μΐ 50 μΐ 50 μΐ 50 μΐ

FV:QR506R FV:R506Q FV:Q506Q 0,193 0, 616 0,942

Susbtrato de trombina cromoqénico: S-2796 (Chromogenix AB), 1,8 mmol/1

Mistura de i fíps metálicos: ííg2+ G,4 líuuui/i e Mn2" u,U4 mmol/1 incluídos, ou no reagente A, ou no reagente B.

Para realizar o teste, misturaram-se 50 μΐ de reagente A com 50 μΐ de reagente B, sendo a mistura em seguida incubada durante três minutos a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ da diluição de plasma e incubou-se durante dois minutos a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de substrato cromogénico S-2796 e realizou-se a leitura cinética. Determinou-se a alteração de DC>405-49o por minuto e esta foi expressa como ADO^os-490/min

Teste: Reagente A

Reagente B

Incubar a 37 °C durante 3 min Diluição de plasma 2 min, 37 °C S-2796

Leitura cinética Resultados:

Mg2+ e Mn2+ Mg2+ e Mn2+

no reagente A no reagente B 0,143 0,646 1,116 49

/

Os resultados mostram que se pode adicionar uma mistura de iões metálicos como Mg2+ e Mn2+ num reagente que contém fosfolipidos (reagente A) . nu num reagente que contém enzimas activas, como APC e factor Xa (reagente B) , originando uma discriminação elevada para a mutação FV:Q506. Assim, a adição de outros iões de metal(ais) não se restringe a nenhum reagente único.

Exemplo 11

Substituição de aniões de cloro com aniões de nitrato e sulfato, num estudo do efeito do magnésio e manganésio na determinação da actividade de proteína C, num teste de produção de trombina de três fases.

Os pormenores experimentais são como no exemplo 1

Utilizou-se nitrato de magnésio (Mg(N03)2)] e sulfato de manganésio (MnS04) em vez dos sais de cloreto correspondentes a concentrações finais no teste de 0,4 e 0,04 mmol/1, respectivamente, de acordo com as condições do Exemplo 1. As leituras de absorvência são expressas como DO405-490nm

Resultados: Proteína C, IU/ml 0 0,1 0,5 1,0 Ca2+, 1,5 mmol/L + Mn2+, 0,04 mmol/1 0,563 0,541 0,278 0,079 Ca2+, 1,5 mmol/1 + Mg2+, 0,4 mmol/L 0,603 0,554 0, 448 0,154

Os resultados mostram que se obtém uma resolução semelhante à que se obtém quando se utiliza o cloreto como 50 anião (cf. restringe a

Exemplo 1) . Assim, a escolha do anião não se iões cloreto.

51

Claims (37)

1. ί

   REIVINDICAÇÕES 1. Método fotométrico in vitro para a pesquisa qualitativa e determinação quantitativa da actividade funcional de componentes da via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea, compreendendo a medição da taxa de conversão de um substrato exógeno, por uma enzima cuja actividade está relacionada com a actividade anticoagulante de proteína C, numa amostra de sangue de um humano, compreendendo factores de coagulação e o referido substrato exógeno após uma activação pelo menos parcial da coagulação, através da via intrínseca, extrínseca, ou comum e desencadeando a coagulação por adição de iões cálcio; e comparando a referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo, caracterizado pela adição de outros iões de metal(ais) à referida amostra.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem iões de um metal divalente ou iões de cobre monovalente, como os referidos outros iões de metal(ais).
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se utilizarem iões Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+ Sr2+ e/ou Cu+, como os referidos outros iões de metal(ais).
4. 4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a pesquisa global de defeitos na via anticoagulante de proteína C, da coagulação sanguínea, num humano, compreendendo: 1 / A) incubar uma amostra de sangue do referido humano compreendendo factores de coagulação com: 1) um activador de proteína C na referida srr.OoLra, 2) um activador de coagulação adequado 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) os referidos outros iões de metal(ais); B) determinar a taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparar a referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.
5. 5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a determinação da actividade de proteína S livre numa amostra de sangue do referido humano, que compreende: A) incubar a referida amostra de sangue compreendendo factores de coagulação com: 1) proteína C activada exógena, ou proteína C exógena juntamente com um activador de proteína C, 2) um activador de coagulação adequado 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) os referidos outros iões de metal(ais); 2

   \ % B) determinar a taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparar a referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.
6. 6. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3 para a determinação da actividade de proteína C numa amostra de sangue do referido humano, compreendendo: A) incubar uma amostra de sangue do referido humano compreendendo factores de coagulação com: 1) um activador de proteína C na referida amostra, 2) um activador de coagulação adequado 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) os referidos outros iões de metal(ais); B) determinar a taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparar a referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.
7. 7. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3 para a pesquisa de uma mutação(ões) no factor V, numa amostra de sangue do referido humano, compreendendo: 3

   % A) incubar uma amostra de sangue do referido humano compreendendo factores de coagulação com: 1) proteína C actiwaH? exógena, ou proteína c exógena juntamente com um activador de proteína C, um activador para proteína C endógena, 2) um activador de coagulação adequado 3) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, 4) iões cálcio, e 5) os referidos outros iões de metal(ais); B) determinar a taxa de conversão do referido substrato exógeno; e C) comparar a referida taxa de conversão com a taxa de conversão de uma amostra de sangue humano normal, determinada do mesmo modo.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a amostra de sangue ser sangue, ou uma amostra derivada de sangue, tal como uma amostra de plasma sanguíneo, ou uma amostra de soro sanguíneo.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por as referidas fases de incubação 1) a 5) do passo de incubação A, i.e. 1) adição de um activador para a proteína C endógena ou para a proteína C activada, exógena ou para proteína C exógena juntamente com um activador de proteína C, 2) adição de um activador de coagulação adequado, para proporcionar pelo menos uma activação parcial da coagulação, 3) adição de um substrato 4

   sintético, exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina 4) adição de iões cálcio e 5) adição dos referidos outros iões de metal (ais), j. especo ivamente, poderem ser realizadas separada ou simultaneamente.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se adicionarem outros iões de metal (ais) na fase de activação de proteína C.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os referidos iões cálcio serem utilizados numa concentração de 0,5 a 20 mmol/1, de preferência de 1 a 10 mmol/1 de meio final de teste.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os referidos iões Mg2+ serem utilizados numa concentração de 20 μιηοΐ/ΐ a 10 mmol/1, de preferência de 100 μιηοΐ/ΐ a 2 mmol/1 e, mais preferencialmente, de 200 μπιοΐ/ΐ a 1 mmol/1 do meio de teste final.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os referidos iões Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+ Sr2+ e/ou Cu+ serem utilizados numa concentração de 1 μιηοΐ/ΐ - 2 mmol/1, de preferência 5 a 400 μιηοΐ/l, mais preferencialmente 10 a 80 pmol/l de meio teste final.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a activação de proteína C na referida amostra preceder, ou ocorrer em simultâneo, com a activação da coagulação. 5
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar um activador de proteína C, ccleccionàuvj ΰυ yrupo que compreende enzimas de veneno de cobra activadoras de proteína C e trombina, se desejado trombina em combinação com trombomudulina.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se utilizar a enzima de veneno de cobra activadora de proteína C obtida a partir da família de cobras Agkistrodon, de preferência Agkistrodon contortrix contortrix.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se utilizar o veneno bruto ou a preparação de enzima de veneno de cobra, tal como uma enzima de veneno de cobra seleccionada de entre a família de cobras Agkistrodon (Protac®C) .
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se utilizar o activador de proteína C tal como uma enzima de veneno de cobra seleccionada da família de cobras Agkistrodon (Protac®C) numa quantidade de 1 x 10“3 a 1 U/ml, de preferência 2 x IO-3 a 0,3 U/ml no meio teste final.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizarem activadores de coagulação adequados para composições da via intrínseca, compreendendo a) fosfolípido(s) e 6

    Λ b) activadores de contacto e/ou factores IX, XII ou XI ou um reagente que produz factores IX, XII ou XI activados, ίη λΗ tΓΟ.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se utilizar como fosfolipido(s) um fosfolípido purificado ou uma mistura sua derivada, ou extractos brutos de tecidos animais, extractos de cérebro, placenta, clara de ovo ou soja.
21. 21. Método de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado por se utilizar um activador de contacto seleccionado do grupo compreendendo ácido elágico, colagénio, substâncias relacionadas com colagénio ou uma sílica, tal como sílica micronizada, sílica coloidal e caolino.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar factor tecidular (tromboplastina) nativo ou recombinante, humano, ou não-humano, de uma espécie humana, ou não humana, com, ou sem factor VlI/VIIa ou factor Vila (nativo ou recombinante, humano ou não-humano) e fosfolípidos, como activador de coagulação adequado para a via extrínseca.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar factor X activado exógeno, ou factor X exógeno e um activador exógeno para o factor X ou um activador exógeno para o factor X endógeno, como activador de coagulação adequado para a via comum. 7

    *
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se utilizar uma enzima de veneno de cobra de Russelli Viperii como snt-iwador exógeno do fa^Lor X.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os componentes da via anticoagulante de proteína C serem adicionados ao meio reaccional, para compensar níveis funcionais variáveis destes componentes na amostra.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se utilizarem componentes da via anticoagulante de proteína C, seleccionados do grupo compreendendo proteína C, proteína C activada, proteína S, factor V/factor Va, ou um plasma deficiente da via anticoagulante de proteína C efectiva a ser medido, ou um plasma deficiente de todos os referidos componentes da via anticoagulante de proteína C.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se adicionar um inibidor de polimerização de fibrina, tal como Gly-Pro-Arg-Pro, ao meio reaccional.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os factores de coagulação seleccionados do grupo compreendendo factor VlII/factor VlIIa, factor IX, factor X e protrombina, serem adicionados ao meio reaccional.
29. 29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os factores de coagulação utilizados serem seleccionados de fontes humanas e não-humanas, ou serem produzidos por tecnologia recombinante 8

    como proteínas do tipo selvagem, ou como polipéptidos modificados, para proporcionar a propriedade funcional adequada.
30. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina na mistura reaccional.
31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por se utilizar como substrato sintético exógeno quer para o factor Xa, quer para a trombina um substrato fotométrico compreendendo um cromóforo, um fluoróforo, ou um luminóforo como grupo rejeitado.
32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por um substrato fotométrico compreendendo um grupo p-nitroanilina (pNA) como grupo rejeitado cromóforo, um grupo naftilamina, ou derivado de cumarina como grupo rejeitado fluoróforo e um grupo isoluminolamida como grupo rejeitado luminóforo.
33. 33. Método de acordo com as reivindicações 30 a 32, caracterizado por se utilizar como substrato para o factor Xa, benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (S-2222), N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765) , CH3S02-D-Leu-Gly-Arg-pNA (CBS 31,39) ou MeO-CO-D-CHG-Gly-Arg-pNA (Spectrozyme Xa).
34. 34. Método de acordo com as reivindicações 30 a 32, caracterizado por se utilizar como substrato para a trombina, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238), piroGlu-Pro-Arg-pNA (S-2366), H-D-Ala-Pro-Arg-pNA (S—2846), Z-D-Arg-Sarc-Arg- 9

    pNA (S-2796), AcOH*H-D-CHG-But-Arg-pNA CBS 34,47) ou H-D-HHT-Ala-Arg-pNA (Spectrozyme TH).
35. 35. Kit para utilização nos métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo os seguintes componentes: a) um activador de proteína C, ou proteína C activada exógena, ou proteína C exógena juntamente com um activador de proteína C, b) um activador de coagulação adequado c) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, d) iões cálcio, e e) os referidos outros iões de metal(ais); em recipientes separados e/ou recipientes compreendendo misturas de pelo menos dois dos referidos componentes, em solução aquosa, ou na forma liofilizada.
36. 36. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por compreender adicíonalmente f) factores de coagulação.
37. 37. Reagente para utilização nos métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, compreendendo pelo menos dois dos seguintes componentes a) a f): a) um activador de proteína C; ou proteína C activada exógena, ou proteína C exógena juntamente com um activador de proteína C, b) um activador de coagulação adequado c) um substrato sintético exógeno, quer para o factor Xa, quer para a trombina, compreendendo um grupo rejeitado mensurável fotometricamente, d) iões cálcio, e 10

    t-

    e) os referidos outros iões de metal(ais); f) factores de coagulação caracterizado por rnmnreer.der cg referidos outros iões de metal (ais) em combinação com um activador de proteína C, tal como uma enzima de veneno de cobra seleccionada de entre a família de cobras Agkistrodon (Protac®C) , ou trombina/trombomodulina, num recipiente, em solução aquosa, ou na forma liofilizada. Lisboa, 14 de Agosto de 2001 /agente oficial da propriedade industrial 11