ES2329672T3 - Ensayo hematologico y kit. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para evaluar el potencial de coagulación de una muestra de sangre o plasma que comprende: a) Mezclar una muestra de sangre o plasma con por lo menos un activador del sistema de coagulación sanguínea, un sustrato de la trombina y una sustancia que interfiere con la gelatinización de la fibrina, habiendo sido incubada la mezcla de activador y muestra si fuese necesario. b) Determinar incrementalmente o continuamente la liberación del producto de conversión del sustrato de la trombina, y c) Calcular por lo menos un valor indicativo del potencial de coagulación. en la que: i) la cantidad de sustrato es suficientemente pequeña para ser consumida completamente por una cantidad especificada de sangre o plasma normales, la cantidad y las propiedades cinéticas del sustrato se seleccionan de manera que dicha consumición tiene lugar en un intervalo comprendido entre 5 y 600 segundos, dicho valor calculado es dependiente de la velocidad de consumo del sustrato.
Description
Ensayo hematológico y kit.
La presente invención se refiere a un
procedimiento destinado a evaluar el potencial de coagulación, o el
potencial de generación de trombina de una muestra de sangre o
plasma.
Rijkers et al., ["Design and synthesis
of thrombin substrates with modified kinetic parameters",
Thrombosis Research 79(5/6): 491-499
(1995)] describe un estudio de investigación de una multiplicidad
de sustratos cromógenos de la trombina.
Lottemberg et al., ["The action of
thrombin on peptide P-Nitroanilide substrates:
Hydrolysis of
Tos-Gly-Pro-Arg-Pna
and
D-Phe-pip-Arg-Pna
by human alpha and gamma and bovine alpha and
beta-thrombins", Trombosis Research
28(1):313-332 (1982)] describen un
estudio de la actividad de multiples disoluciones de trombina en
multiples sustratos cromógenos.
Baughman et al., ["Thrombin activation
rate constant 1 stage chromogenic assay for the extrinsic system"
Thrombosis Research 26(1):1-12
(1982)] describen un ensayo cromógeno utilizando tromboplastina
tisular como activador y un sustrato de trombina como
indicador.
De Peuriot et al., ["Electorchemical
activity determination of trypsin-like enzymes 4.
Coupled electrochemical and espectrophotometric assay of thrombin
using the same D phenylalanyl pipecolil arginine 4
methoxy-beta naphtylamide dihydro chloride
S-2421 substrates", Thrombosis Research
22(3):303-308 (1981)] describe un
estudio utilizando detección amperométrica de una especie
electroactiva liberada de un sustrato electrogénico mediante la
digestión con trombina.
Gradipore (WO 99 39212) describe un ensayo de
coagulación que compara las velocidades de coagulación contra
estándares, utilizando venenos de serpiente.
Hemker et al.,
(EP-A-O 420 332) describe el
procedimiento de potencial endógeno de la trombina (ETP) en el que
el sustrato de trombina no se consume y en el que es opcional la
adición de un inhibidor de la polimerización del fibrinógeno.
HaemoSys
(DE-A-19904674) describe un
procedimiento destinado a la cuantificación de hirudina y otros
inhibidores directos de la trombina. La activación de la
protrombina se realiza utilizando la propia trombina como activador
y se utiliza un sustrato cromógeno de trombina con el fin de medir
la inhibición.
Boehringer Mannheim GMBH
(EP-A-0229234) describe un
procedimiento que primero produce una fracción de plasma rica en
Proteína C y a continuación mezcla esta fracción del plasma con un
conjunto de plasmas normales y realiza un ensayo parcial de tiempo
de tromboplastina (aPTT) con el fin de detectar la inhibición de la
coagulación por la proteína C de la muestra.
Es esencial para la supervivencia que las
heridas dejen de sangrar y que el parto sea compatible con la
supervivencia de la madre, es decir, que el cuerpo disponga de un
mecanismo adecuado de hemostasis. Si, sin embargo, se detiene el
flujo sanguíneo en los vasos intactos, la circulación normal queda
impedida, lo que es deletéreo para un funcionamiento normal. Los
tejidos y los órganos pueden morir cuando se detiene el suministro
de sangre durante un período de tiempo demasiado largo. La
naturaleza ha proporcionado un mecanismo admirablemente eficaz y
extraordinariamente complejo, el sistema hemostático, con el fin de
asegurar las funciones aparentemente contradictorias: el flujo
adecuado de sangre en los vasos normales y la rápida detención de
las hemorragias en los dañados. No es sorprendente que el mecanismo
hemostático sea muy complejo y esté finamente sintonizado, repleto
de comprobaciones y equilibrios (Hemker H C, Beguin S., Phenotyping
the clotting system. [Trombosis Haemostasis
84:747-51 (2000)].
La hemostasis se produce mediante la
interrelación entre pequeñas células sanguíneas, las plaquetas, y un
conjunto de proteínas del plasma sanguíneo, el sistema de
coagulación. Habiendo pasado por una sección de pared vascular
dañada, las plaquetas se pegan al tejido desnudo en la herida y
generan un escenario en el que la sangre se puede coagular sin que
el coágulo sea arrastrado por el flujo sanguíneo. La interacción
entre la herida y el coágulo conduce a la formación de trombina. La
trombina es responsable de un concierto de reacciones, de entre las
cuales la coagulación, es decir, la solidificación de la sangre es
solamente una de ellas: La trombina es activa las plaquetas y actúa
sobre las células de la pared vascular. Las plaquetas activadas,
por su parte, promueven la formación de trombina. La trombina
participa en un conjunto de reacciones retroalimentadas positivas y
negativas. (Hemker et al., US 5.192.689).
El concepto de conversión de proenzima en enzima
es esencial para la comprensión. Una enzima es una proteína capaz
de amplificar una reacción química muy específica. Las enzimas
proteolíticas son proteínas que pueden cortar a otras proteínas en
pedazos. Estas pueden, por consiguiente, ser extraordinariamente
peligrosas y generalmente se forman y transportan por el cuerpo en
forma de proenzimas. Las proenzimas generalmente son más grandes que
las enzimas y no pueden, como tales, producir daño alguno.
Solamente cuando se cortan en lugares
específicos puede aparecer el carácter enzimático. Por ejemplo, las
enzimas que digieren las proteínas de nuestros alimentos se producen
como proenzimas en el páncreas y solamente se activan cuando se
segregan en el intestino. El mecanismo de coagulación se basa en una
serie ordenada de conversiones proenzima-enzima. La
primera de esta serie se transforma en una enzima activa que activa
a la segunda, que activa a la tercera. De este modo unas pocas
moléculas al principio de la serie crean una explosión de la enzima
activa final: trombina. Este mecanismo se refiere generalmente como
la cascada de coagulación.
La trombina, en la sangre, no vive durante mucho
tiempo: de otro modo la más mínima herida podría hacer coagular
toda la sangre: su tiempo de supervivencia en el plasma es de
solamente unos pocos minutos, debido al hecho de que se une a las
antitrombinas, proteínas suicidas del plasma que inactivan la
trombina uniéndose a ella de modo irreversible. Las antitrombinas
también actúan como proteínas reguladoras que pueden inactivar las
primeras trazas de trombina antes de que puedan aumentar la
generación de trombina mediante las reacciones de retroalimentación
positiva.
La secuencia de cascada solamente explica la
formación explosiva de trombina, sin embargo, la coagulación no es
así de simple, el producto está finamente sintonizado mediante una
delicada red de reacciones de retroalimentación positiva y
negativa. La coagulación comienza cuando se daña un vaso. Los las
vasos están envueltos en una capa llena de células con Factor
Tisular (TF) (Mann KG: Biochemistry and physiology of blood
coagulation. Thromb. Haemost.,
82(agosto):165-174 (1999)]. Después de
una herida este TF queda expuesto a la sangre, se une al factor
VIIa para formar la primera enzima: TF:VIIa. Esta activa al Factor X
a Xa, que a su vez genera trombina. Todas las proteínas plasmáticas
implicadas en la coagulación indicadas son factores coagulantes,
designados con números romanos. Cuando se activa una proenzima a
enzima, se añade una "a" al número. El Factor Xa no es una
enzima muy eficaz; necesita la ayuda de factor V activado (una
proteína auxiliar o cofactor) que ayuda a acelerar la activación de
la trombina mil veces. Los dos factores se unen a una superficie
fosfolipídica que también se une a la protrombina y de este modo
favorece el encuentro de sustrato y enzima. [XiM, Beguin S, Hemker
HC. The relative importance of factors II, VII, IX and X for the
prothrombinase activity in plasma of orally anticoagulated
patients. (Thromb. Haemost. 62:788-91
(1989)].
Esto ofrece la posibilidad de regular la función
del factor Xa, y por consiguiente la producción de trombina en el
espacio y el tiempo. El factor V es activado por la trombina al
factor Va. Xa y Va se unen a una superficies de fosfolípido y
forman el complejo de protrombinasa que convierte más protrombina en
trombina muy eficazmente. La trombina se une también a la
trombomodulina. Este complejo convierte a la proteína C (de nuevo
una proenzima) en su forma activada (enzima) APC. APC a su vez ataca
al factor Va y lo inactiva (convirtiéndolo en factor VI). [Rosing
J, Hemker HC, Tans G., Molecular biology and pathophysiology of APC
resistance: current insights and clinical applications. Semin.
Thromb. Haemost., 24(4):329-35
(1998)].
VIIa:TF no solamente active al factor X sino
también al factor IX (nueve). La trombina también activa la factor
VIII que, justo como el factor V, es una proteína auxiliar. El
factor VIIIa y el IXa forman un complejo denominado tenasa, que
produce más X. Tal como el factor Va, el factor VIIIa es degradado
por la proteína C activada. Tal como el complejo
Xa-Va, el complejo IXa-VIIIa solo
funciona bien cuando está absorbido en una superficie de
fosfolípido.
La sangre comprende plaquetas (trombocitos). En
cuanto encuentran una herida se unen a tejido expuesto (colágeno)
y, mediante esta unión y el contacto con la trombina, se activan.
Ello resulta en un cambio en la superficie de las plaquetas que
ahora son capaces de unirse a los factores de coagulación tales como
los complejo Xa-Va y IXa-VIIIa.
Esta unión es esencial para su funcionamiento adecuado. La
superficie de las plaquetas sirva como un espacio bidimensional en
el que los factores de coagulación se encuentran entre si y realizan
con mayor facilidad sus reacciones. De nuevo, esta adsorción
incrementa la formación de trombina por un factor de mil veces.
Así, sin tal superficie la coagulación no ocurriría. Esto
proporciona la Dimensión de Lugar: la coagulación solo tiene lugar
donde se necesita y permanece contenida en dicha zona [Beguin S,
Keularts I, On the coagulation of platelet rich plasma.
Physiological mechanism and pharmacological consequences.
Haemostasis 29:50-57 (1999)].
El resultado de todo esto es que la producción
de trombina está gobernada por una compleja maraña de bucles de
retroactivación positivos y negativos. Estos mecanismos son tan
complejos que imposibilitan su descripción (incluso teóricamente)
describirlos en un modelo matemático. Por consiguiente es
extraordinariamente difícil predecir con precisión como responderá
cuantitativamente el sistema a los cambios en uno o más de sus
reactantes.
Los fármacos que se diseñan con el fin de
inhibir la trombosis mediante el ataque selectivo a solamente una
de las enzimas pueden, en la práctica, actuar de modo completamente
opuesto a lo esperado. La consecuencia es que el potencial
coagulador de la sangre se debe medir en lugar de tratar de
predecirlo.
El procedimiento convencional de evaluar el
sistema hemostático es activar la hemostasis (utilizando diferentes
activadores) y evaluar el tiempo necesario para detectar la
coagulación del plasma o la sangre ("tiempo de coagulación").
Por el contrario, se determina la concentración de ciertos
componentes o se ensaya la actividad de ciertos componentes en
sistemas artificiales (actividades de factores individuales).
Mediante todas estas estrategias no se ensaya directamente la
dinámica de la activación de la trombina. Los tiempos de coagulación
solamente representan la fase de retraso antes de que empiece la
generación de trombina y por consiguiente solamente muestran una
parte de la historia. La extensión de la reacción
hemostática-trombótica también se determina
críticamente mediante la dinámica de la formación de trombina.
En el pasado se han desarrollado múltiples
estrategias destinadas a la cuantificación de la dinámica de la
formación de combina. Los mejor conocidos son los procedimientos
desarrollados por Hemker y Beguin et al., (patente US nº
5.192.689) y las modificaciones de estos procedimientos por otros
autores.
El procedimiento de Hemker depende de la
determinación del denominado "potencial endógeno de trombina"
(ETP) en la muestra de la sangre o plasma coagulantes.
Se añade un activador de la formación de
trombina a la muestra junto con un sustrato de la trombina, en el
que la cantidad y las propiedades cinéticas de dicho sustrato de
trombina se seleccionan de tal modo que la cantidad de trombina
generada en la muestra no puede consumir completamente dicho
sustrato de trombina. La trombina formada durante la reacción de
coagulación consume dicho sustrato, produciendo un producto de
conversión. La cantidad de producto de conversión se determina y a
partir de este se calcula el potencial endógeno de trombina en la
muestra [Hemker HC, Wielders S, kessels H, Beguin S., Continuos
registration of thrombin generation in plasma, its use for the
determination of the thrombin potencial. Thromb. Haemost.
70:617-24 (1993)].
Típicamente, el ETP se calcula con base en el
área bajo la curva de actividad de la trombina (Fig. 2). La
actividad de trombina se calcula con base en la primera derivada de
la producción del producto de conversión del sustrato de la
trombina.
El procedimiento ETP de Hemker depende de la
continua evaluación de trombina formada in vitro, a partir
de su formación hasta que es inhibida por las sustancias inhibidoras
endógenas en la sangre o por los inhibidores añadidos en el
reactivo (Fig. 2). El procedimiento ETP se base en el concepto de
que la actividad hemostática que se desarrolla en una herida o
trombo es esencialmente dependiente del número de
"horas-persona" de trombina que se pueden
desarrollar en la sangre. De acuerdo con este concepto cuenta tanto
la cantidad de trombina que se puede generar así como también el
tiempo durante el cual está activa. La cantidad de trabajo que
potencialmente puede hacer la trombina se refleja en el área bajo
la curva que describe la concentración de trombina en el tiempo
durante la coagulación, es decir, el ETP. Otra propiedad importante
es el tiempo transcurrido hasta que comienza la formación de
trombina, es decir, el período de retraso. Esto le ocurre también al
tiempo de coagulación, debido a que el coágulo aparece cuando
aproximadamente se ha formado aproximadamente el 1% de la trombina.
Se pierde mucha información si solamente se observa el tiempo de
coagulación tal como se determina por la coagulabilidad: después de
la formación del coágulo la mayor parte de la acción de la trombina
aún está por ocurrir [Hemker HC, Beguin S. Thrombin generation in
plasma: its assesment via the endogenous thrombin potencial.
Thromb. Haemost. 74:134-8 (1995)].
Las siguientes estrategias se utilizan
comúnmente en hematología, por ejemplo, para evaluar el ETP:
Los sustratos cromógenos son péptidos acoplados
a grupos cromóforos. Generalmente se aplican en disolución acuosa.
Cuando estos grupos cromóforos se separan del péptido mediante la
acción enzimática aumenta la densidad óptica de la disolución y
esto se puede detectar fotométricamente. Los sustratos cromógenos se
utilizan en muchos procedimientos diagnósticos para determinar la
actividad de ciertas enzimas. Los sustratos cromógenos utilizados
comúnmente para la trombina se separan fácilmente mediante la acción
de la trombina y por ello se consumen rápidamente por su acción.
Para la utilización en el procedimiento ETP se han aplicado
sustratos cromógenos que se convierten lentamente por la trombina.
Estos son sustratos que originalmente se han, o bien, se habían
desarrollado para otras enzimas (p.ej., el sustrato
S-2222, que se desarrolló para determinar actividad
FXa) o son sustratos desarrollados especialmente para determinar ETP
[Rijkers DT, Hemker HC, Tesseer GI. Sinthesis of peptide
p-nitroanilides mimicking fibrinogen- and
hirudin-binding to thrombin. Design of slow reacting
thrombin substrates. Int. J. Pept. Protein Res.,
48:182-93 (1996)].
Los cromóforos (p.ej.,
p-nitro-anilina
[p-NA] utilizados en los sustratos cromógenos se
evalúan típicamente utilizando luz con una longitud de onda de 405
nm. Tanto la fibrina como las plaquetas en disolución acuosa
interfieren con la evaluación de la liberación de cromóforos del
sustrato cromógeno a 405 nm. Cuando se forma la trombina, ésta
separa dos partes de la molécula de fibrinógeno (los referidos como
fibrinopéptidos A y B). La molécula resultante se refiere como
fibrina. Se polimeriza espontáneamente para formar polímeros de
fibrina (cadenas de fibrina) que son entrelazadas covalentemente por
el factor XIIIa (un factor de coagulación también activado por la
trombina). Este mecanismo (formación de fibrina y polimerización)
es una parte integral del proceso hemostático en el cuerpo.
Con el fin de evaluar el ETP utilizando sustrato
cromógenos la muestra debe estar agotada de fibrinógeno
(desfibrinación) antes del análisis o se deben añadir sustancias
que interfieran con la polimerización de la fibrina (Wielders S,
Mukherjee M, Michiels J, Rijkers DT, Cambur JP, Knebel RW, Kakkar V,
Hemker HC, Beguin S. The routine determinatio of the endogenous
thrombin potencial, first results in different forms of hyper- and
hypocoagulability. Thromb. Haemost. 77:629-36
(1997)]. La desfibrinación de la muestra se puede realizar
utilizando venenos de serpiente que parten al fibrinógeno. El
coágulo de fibrina resultante se puede eliminar del plasma mediante
centrifugación o se puede eliminar manualmente. Sin embargo esto
requiere una etapa adicional en la preparación de la muestra, que
no se puede realizar mediante los analizadores de laboratorio
estándar. Como etapa aparte que debe ser realizada por los operarios
del laboratorio en lugar de por el equipo automático, incrementa
considerablemente el precio de dichos análisis. La muestra
desfibrinada no se puede utilizar en el análisis estándar del
sistema de coagulación, solo se puede utilizar para el
procedimiento ETP. Además también está poco claro si la eliminación
del coágulo de fibrina producido artificialmente elimina también
sustancias relevantes de la muestra de plasma que podrían ser
relevantes para la función de la cascada de coagulación [Kumar R,
Beguin S, Hemker HC. The influence of fibrinogen and fibrin on
thrombin generation is an evindence for feedback activation of the
clotting system by clot bound thrombin. Thromb. Haemost.
72:713-21 (1994)].
Se conocen sustancias que inhiben la
polimerización de la fibrina. La sustancia más comúnmente utilizada
es el péptido
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH. La utilización de este péptido en el procedimiento ETP fue
introducida por Stuerzebecher et al., y tiene la principal
ventaja de no tener que desfibrinar la muestra antes del análisis
[Prasa D, Svendsen L, Sturzebecher J. Inhibition of thrombin
generation in plasma by inhibitors of factor Xa. Thromb Haemost.
Oct; 78(4):1215-20 (1997); Prasa D,
Svendsen L, Sturzebecher J. The ability of thrombin inhibitors to
reduce the thrombin activity generated in plasma on extrinsic and
intrinsic activation. Thromb. Haemost.
Mar;77(3):498-503 (1997)].
Sin embargo, se deben aplicar concentraciones
bastante elevadas de
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH y la inhibición de la polimerización de la fibrina es
frecuentemente incompleta, especialmente en muestras con elevadas
concentraciones de fibrinógeno. Debido a que el fibrinógeno es, tal
como se lo denomina, una proteína de fase aguda, puede llegar a
alcanzar concentraciones muy elevadas en el plasma de pacientes
(hasta 10 g/l). Así, muchos pacientes cuyo ETP podría ser relevante
tienen concentraciones elevadas de fibrinógeno que pueden perturbar
la evaluación del ETP utilizando inhibidores de la polimerización
de la fibrina.
Otra estrategia para evaluar el ETP, que es hoy
en día más popular que el procedimiento de los sustratos cromógenos,
es la utilización de sustratos fluorógenos [Hemker HC, Guesen PL,
Ramjee M, Wagenwoord R, Beguin S. The thrombogram: monitoring
thrombin generation in platelet-rich plasma.
(Thromb. Haemost. 83:589-91 2000). Los
sustratos fluorógenos son análogos a los sustratos cromógenos. La
diferencia consiste en que los sustratos liberan con la acción
enzimática un grupo que se puede determinar utilizando un
fluorómetro. Los fluorómetros tienen una elevada sensibilidad para
la detección de pequeñas cantidades de sustancias con propiedades
fluorescentes. La evaluación fluorométrica del ETP tiene además la
ventaja de que la fibrina o las plaquetas no interfieren con el
análisis. Es decir, no se han de tomar medidas para desfibrinar las
muestras o para inhibir la polimerización de la fibrina. Además, el
plasma rico en plaquetas se puede utilizar para el análisis, lo que
permite la evaluación de la interacción de los factores plasmáticos
(enzimas) y plaquetas durante la formación de trombina [Keularts
IM, Hamulyak K, Hemker HC, Beguin S. The effect of DDAVP infusión on
thrombin generation in platelet-rich plasma of von
Willebrand type 1 and in mild haemophilia A patients. Thormb.
Haemost 84:638-42 (2000)].
Sin embargo, la utilización de sustratos
fluorógenos también tiene desventajas significativas: El equipo de
laboratorio estándar utilizado para el análisis del sistema de
coagulación no prevé el análisis fluorométrico. Así, el análisis
requiere instrumentación adicional cara (fluorómetro). Ello genera
costos adicionales significativos y es un obstáculo importante para
la introducción de este procedimiento. Además, la tendencia de la
década pasada ha sido implementar todos los ensayos de coagulación
siempre que sea posible en un analizador con el fin de simplificar
el procedimiento de ensayo y minimizar los costes laborales. La
utilización de un instrumento diferente para el procedimiento ETP
reduce significativamente su aplicabilidad como procedimiento de
rutina.
Los fluorómetros que se utilizan en la
actualidad para el procedimiento ETP no proporcionan el pipeteo
automatizado del procedimiento ETP, así, para realizar el
procedimiento se requieren múltiples etapas de pipeteo manual, lo
que a su vez incrementa el coste del procedimiento y complica la
introducción del procedimiento en los laboratorios de rutina.
Tal como se mencionó el procedimiento ETP de
Hemker y Beguin (patente US nº 5.192.689) requiere la utilización
de un sustrato lento para la trombina, es decir, un sustrato que
tenga una elevada K_{M} y por consiguiente, la trombina formada
por la cascada de coagulación lo convierte lentamente. Hemker
explica que es necesario un sustrato de trombina con una elevada
K_{M} con el fin de minimizar los efectos del sustrato sobre la
cascada de coagulación. La mayoría de los factores de coagulación
son, como a la trombina, serina-proteasas y tienen
homologáis con la trombina. Según Hemker, con el fin de evaluar la
formación de trombina de un modo válido, uno debe utilizar un
sustrato con una elevada K_{M} que así no producirá una
interferencia importante con la cascada de coagulación.
Sin embargo, la utilización de un sustrato lento
de trombina produce una señal relativamente débil. Esto complica la
evaluación precisa de la "fase de retraso", es decir, el tiempo
desde el comienzo del análisis hasta la detección de trombina libre
en la mezcla de muestra-reactivo.
La utilización de un sustrato lento junto con la
necesidad de evaluar la activación e inactivación de la trombina
condujo a tiempos de medición muy largos (típicamente de 30 minutos)
y a la necesidad de concentraciones superiores de sustrato, ambas
cosas incrementan el coste de los análisis. En un análisis en
condiciones de rutina, tiempos de medición de 30 minutos tienen dos
efectos negativos: se incrementa el tiempo retorno
significativamente, limitando así la utilidad del ensayo en
decisiones terapéuticas inmediatas. El analizador queda bloqueado
durante un período de tiempo significativo.
El procedimiento ETP de Hemker se basa en la
determinación del área bajo la curva (AUC) de actividad de trombina,
es decir, en las "horas persona" que realizan las moléculas de
trombina desde su activación hasta su inactivación. Una
multiplicidad de substancias inhibidoras inactivan la trombina in
vitro. Una de ellas es la antitrombina, un inhibidor que forma
complejos irreversibles con la trombina y otras
serina-proteasas y cuya acción es amplificada por
las heparinas. Otra es el cofactor II de la heparina, un inhibidor
más específico, cuya acción antitrombina también es amplificada por
las heparinas. La trombina también es inhibida por inhibidores menos
específicos en el plasma. Uno de los más importantes es la
alfa-2-macroglobulina
(alfa-2-m).
Alfa-2-m no se une al centro activo
de la trombina (como lo hacen la mayoría de los demás inhibidores),
sino que incorpora a la trombina como una jaula. La trombina unida
a la alfa-2-m pierde sus actividades
biológicas: no activa las plaquetas y no parte el fibrinógeno,
factor V, factor VIII, factor XI o factor XIII. Sin embargo todavía
puede romper sustratos cromógenos o fluorógenos (pequeños) y así
imita la actividad de la trombina activa. Esto perturba la
evaluación correcta del ETP según Hemker [Rijkers DT, Wieldeers SJ,
Beguin S, Hemker HC. Prevention of the influence of fibrin and
alpha-2-macroglobulin in the
continuous measurement of the thrombin potential: implications for
an endpoint determination of the optical density. Thromb. Res.
Feb 15;89(4):161-9 (1998)]. A medida que
la concentración de alfa-2-m en las
muestras oscila de individuo a individuo y está también afectada
por el estado de enfermedad, se necesitan algoritmos complejos con
el fin de sustraer la actividad de la trombina unida a
alfa-2-m de la actividad total de
trombina determinada [Kessels H, Willems G, Hekmer HC. Analysis of
thrombin generation in plasma. Comput. Biol. Med. Jul;
24(4):277-88 (1994)].
En muchos estudios científicos se aplican
procedimientos que evalúan la generación de trombina del proceso
hemostático utilizando un procedimiento referido como
"submuestreo". Los ejemplos que se proporcionan en: Beguin S,
Lindhout T, Hemker HC. The effect of trace amounts of tissue factor
on thrombin generation in platelet rich plasma, its inhibition by
heparin. Thromb. Haemos.
Feb28:61(1):25-9 (1989). Kessels H, Beuin
S, Andree H, Hemker HC. Measurement of thrombin generation in whole
blood-the effect of heparin and aspirin. Thormb.
Haemost. Jul; 72(1):78-83 (1994).
Reverter JC, Beguin S, Kessels H, Kumar R, Hemker HC, Coller BS.
Inhibition of platelet-mediated, tissue factor
induced thrombin generation by the mouse/human chimeric 7E3
antibody. Potential implications for the effect of c7E3 Fab
treatment on acute thrombosis and "clinical restenosis". J.
Clin Invest. Aug 1;98(3):863-74 (1996);
Butenas S, van't Veer C, Mann KG. "Normal" thrombin generation.
Blood Oct 1;94(7):2169-78 (1999).
van't Veer C, Golden NJ, Kalafatis M, Siminoni P, Bertina RM, Mann
KG. An in vitro analysis of the combination of haemophilia A
and factor V (LEIDEN). Blood Oct
15;90(8):3067-72 (1997)].
En estos y muchos otros estudios una muestras de
sangre o plasma se hace reaccionar con un activador de la
hemostasis.
Durante la activación de la coagulación se
extraen repetidamente pequeñas alícuotas de la muestra y se disponen
en una disolución tampón que comprende un sustrato cromógeno de la
trombina (este procedimiento se refiere como
"sub-muestreo"). En cada una de las alícuotas
se ensaya por separado la actividad de trombina. Este procedimiento
genera un esfuerzo significativo ya que se analizan hasta 80
muestras para cada experimento y por consiguiente no es de
aplicación para la utilización de rutina.
Los sustratos de trombina se utilizan también en
otra multiplicidad de procedimientos de laboratorio, por ejemplo,
se utilizan sustratos sintéticos de trombina en diferentes
aplicaciones para el análisis de la hemostasis [Fareed J, Messmore
HL, Walenga JM, Bermes EW Jr. Synthetic peptide substrates in
hemostatic testing. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.
19(2):71-134 (1983)]. Entre estas
aplicaciones se encuentran procedimientos para evaluar la actividad
de antitrombina [Blomback M, Blomback B, Olsson P, Svendsen L., The
assay of antithrombin using a synthetic chormogenic substrate for
thrombin. Thromb. Res. Nov;5(5):621-32
(1974)], la concentración de heparina [Choo IH, Didisheim P, Doerge
ML, Johnson ML, Bach ML, Melchert LM, Hohnson WJ, Taylor WF.
Evaluation of a heparin assay method using a fluorogenic synthetic
peptide substrate for thrombin. Thromb. Res. Suppl. Jan
1-15,25(1-2):115-23
(1982), la actividad de trombina o protrombina [Hitomi Y, Kanda T,
Niinobe M, Fujii S.; A sensitive colorimetric assay for thormbin,
prothrombin and antithrombin III in human plasma using a new
synthetic substrate. Clin. Chim. Acta., Mar
12;119(3):157-64 (1982)] y procedimientos
para evaluar el fármaco anticoagulante hirudina y otros inhibidores
directos de la trombina [Griessbach U, Sturzebecher J, Markwardt
F., Assay of hirudin in plasma using a chromogenic thrombin
substrate. Thromb. Res. Suppl. Jan
15;37(2):347-50 (1985)]. Utilizando estos
procedimientos la actividad de la trombina o la protrombina en la
muestra se ensaya específicamente o se determina la inhibición de la
trombina añadida mediante anticoagulantes endógenos o exógenos.
Se han descrito procedimientos adicionales que
aplican substratos de trombina con el fin de ensayar el tiempo de
protrombina: (patente US nº 4.784.944 (Kolde): Prothrombine time
determining reagent and methods of using and preparing the same)
(Ohki M, Tanak S, Uchida K, Yamaguchi T, Kato H., A basic study on a
higly sensitive automated method for hypercoagulable state in
plasma, fluorogenic Prothrombin Time method. Rinsho Byori, Oct;
41(10):1153-8 (1993) (patente US 4289498
(Baughman): One-stage prothrombin assay and
compositions useful therein).
\newpage
En la patente US nº 4.784.944 y en el
procedimiento descrito por Ohki et al [Ohki M, Tanaka S,
Uchida K, Yamaguchi T, Kato H. Rinsho Byori;
Octo;41(10):1153-8 (1993)] se aplica un
sustrato de trombina para ensayar el comienzo de la generación de
trombina después de la activación de la coagulación por el Factor
Tisular. Estos procedimientos no se desarrollaron para ensayar la
cantidad y velocidad de la trombina generada durante la reacción
(tal como en el ensayo de la invención), sino solamente con el fin
de ensayar el punto temporal de la generación de trombina libre.
En la patente US nº 4.289.498 se describe un
procedimiento para determinar el Tiempo de Protrombina, que se basa
en la determinación de la velocidad exponencial de generación de
trombina en un plasma recalcificado tratado con tromboplastina.
Para la determinación de la velocidad de generación de trombina se
aplica un sustrato de trombina. En esta fuente el sustrato de
trombina no se utiliza con el fin de cuantificar la formación de
trombina en si, sino como una medida indirecta del Tiempo de
Protrombina en un ensayo muy diluido. Utilizando el ensayo diluido
y la adición del denominado "reactivo de suero", que comprende
múltiples factores de coagulación activados, se modifica la
generación de trombina en la muestra del paciente cuando se comprar
con la situación fisiológica. Por el contrario, el ensayo de la
invención evalúa la generación de trombina utilizando una
situación mucho menos artificial. La fuente de Baughman no describe
la utilización de una cantidad relativamente pequeña de un sustrato
cromógeno rápido para evaluar la generación inicial de trombina
mediante los mecanismos hemostáticos en la muestra. Por el
contrario, en la página 12 líneas 59-69 Baughman
afirma que el sustrato de trombina se aplica preferentemente en un
exceso estoiquiométrico en comparación a la cantidad de plasma y
que el límite superior de la concentración del sustrato cromógeno
es simplemente la solubilidad del sustrato en la mezcla, lo que
demuestra que la ventaja del procedimiento de la presente invención
no había sido reconocida. En la forma de realización preferida de
la fuente Baughman el sustrato cromógeno se utiliza a una
concentración 11,85 mM en relación con el volumen de plasma
añadido. En el procedimiento de la invención el sustrato cromógeno
se utiliza preferentemente a una concentración de 250 \muM en
relación al mismo volumen de plasma. Tal como se muestra a
continuación en las Figuras 15 y 16 el ensayo de la presente
invención no ensaya simplemente el Tiempo de Protrombina, ya que
existe considerable oscilación entre el ensayo de la invención y
este procedimiento de rutina.
Tal como se mencionó anteriormente el
procedimiento convencional de evaluar el sistema hemostático es, por
ejemplo, activar la hemostasis y evaluar el "tiempo de
coagulación". Por el contrario, se determina la concentración de
ciertos componentes o la actividad de ciertos componentes se evalúa
en sistemas aislados artificiales (actividades de factores
individuales). Mediante todas estas estrategias no se ensaya
directamente la dinámica de la activación de la trombina. "El
tiempo de coagulación" solamente representa la fase de retraso
antes de que comience la generación de trombina.
Además, la utilización de sustratos cromógenos
para evaluar el "potencial endógeno de trombina" (ETP) de una
muestra desfibrinada requiere una etapa aparte para la preparación
de la muestra, que no se puede realizar mediante los analizadores
de laboratorio estándar. Además la muestra desfibrinada no se puede
utilizar para el análisis estándar del sistema de coagulación, sino
que solamente se puede utilizar para el sistema ETP. Además,
tampoco está claro si la eliminación del coágulo de fibrina generado
artificialmente extrae también substancias relevantes de la muestra
de plasma que podrían ser relevantes para la función de la cascada
de coagulación. El péptido
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH que inhibe la polimerización de la fibrina se puede utilizar
en el procedimiento ETP. Sin embargo, se deben aplicar
concentraciones bastante elevadas de
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH y la inhibición de la polimerización de la fibrina es
frecuentemente incompleta, especialmente en muestras con
concentraciones elevadas de fibrinógeno.
La utilización de sustratos fluorógenos también
tiene desventajas significativas: El equipo de laboratorio estándar
utilizado para el análisis del sistema de coagulación no prevé el
análisis fluorométrico. Así, el análisis requiere instrumentación
adicional cara. Además, la realización de un ensayo con sustratos
fluorógenos requiere la múltiples etapas manuales de pipeteo lo que
encarece el coste del procedimiento y complica la introducción del
procedimiento en los laboratorios de rutina.
La utilización de sustratos de trombina lentos
según el procedimiento de Hemker produce una señal relativamente
débil. Esto complica la evaluación sensible de la "fase de
retraso".
La utilización de sustratos lentos junto con la
necesidad de evaluar la activación e inactivación de la trombina
conduce a tiempos de medida muy largos y a la necesidad de
concentraciones elevadas de sustrato, incrementando ambas cosas el
coste del análisis.
En resumen, todos los procedimientos actuales
disponibles para cuantificar la generación de trombina durante el
proceso de coagulación tienen múltiples desventajas, que han
limitado su utilización hasta ahora a aplicaciones de investigación
no rutinarias.
Así, el gran reto de la presente invención es
superar los problemas y desventajas asociadas con la utilización de
rutina de los procedimientos de la técnica anterior y proporcionar
un procedimiento rápido y preciso para evaluar el potencial de
coagulación de una muestra de sangre o plasma. Esto se logra
observando la dinámica inicial de la generación de trombina en una
muestra.
Tal como se utilizan en la presente memoria los
siguientes términos tendrán los significados indicados:
Las antitrombinas son proteínas suicidas del
plasma que inactivan la trombina uniéndose a ella irreversiblemente.
Funcionan como proteínas reguladoras que pueden inactivar las
primeras trazas de trombina antes de que aumente la generación de
trombina por las reacciones retroalimentadas positivas. La heparina
amplifica la función de algunas antitrombinas.
Tiempo de coagulación es el tiempo necesario
para detectar la coagulación de la sangre o plasma después de la
inducción de la hemostasis.
Los sustratos cromógenos son péptidos acoplados
a grupos cromóforos. Cuando estos grupos cromóforos se separan del
péptido por acción enzimática la densidad óptica de la disolución
aumenta y ello se puede detectar fotométricamente.
El sustrato fluorógeno se puede utilizar de modo
semejante a sustrato cromógeno. La diferencia está en que el
sustrato libera, por la acción enzimática, un grupo que se puede
determinar utilizando un fluorómetro.
Activador del sistema de coagulación: Se conoce
una multiplicidad de sustancias que pueden activar la hemostasis.
Los activadores del sistema plasmático de coagulación inducen la
ruptura de los factores de coagulación a sus formas activas. Por
ejemplo, el Factor Tisular forma un complejo con el factor VII
activado. Este complejo activa al factor X y al factor IX. Otras
sustancias (p.ej., colágeno) activan las plaquetas de la sangre. Una
vez activadas las plaquetas segregan sustancias que activan la
coagulación y presentan receptores adhesivos en su superficie.
Además, la composición de la superficie de las plaquetas cambia con
el fin de permitir la unión de los factores de coagulación.
Sustratos de trombina: son sustancias que son
separadas por la acción de la trombina y liberan grupos que se
pueden detectar cuantitativamente. Los ejemplos son sustratos
cromógenos de la trombina (el producto de conversión se detecta
fotométricamente) o sustratos fluorógenos de la trombina (el
producto de conversión se detecta utilizando análisis
fluorométrico).
El acelerador de la coagulación es un material o
sustancia o mezcla de los mismos que acelera considerablemente la
velocidad de generación de trombina. Los fosfolípidos y los iones de
calcio son aceleradores de la coagulación ya que promocionan la
formación de complejos de los factores de coagulación. En estos
complejos (por ejemplo, el complejo de protrombinasa) se acelera
significativamente la activación de los factores de coagulación.
La primera derivada de una curva refleja el
gradiente de la curva durante la reacción, la velocidad de reacción.
La primera derivada de la curva de densidad óptica de la mezcla de
muestra y reactivo durante el análisis de coagulación utilizando un
sustrato de trombina refleja la actividad de trombina durante el
tiempo.
K_{M}: Abreviación de la constante de
Michaelis que se puede definir como la concentración de sustrato a
la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.
Es una propiedad intrínseca de la enzima relacionada con la
constante de unión para formar el complejo enzima sustrato
particular. En el presente contexto la enzima es trombina.
Según un aspecto la presente invención
proporciona un procedimiento destinado a ensayar el potencial de
coagulación de una muestra de sangre o plasma que comprende:
- a)
- mezclar una muestra de sangre o plasma con por lo menos un activador del sistema de coagulación de la sangre y un sustrato de trombina, y si es necesario incubar la mezcla,
- b)
- determinar incrementalmente o continuamente la liberación del producto de conversión del sustrato de trombina y
- c)
- calcular por lo menos un valor indicativo del potencial de coagulación.
en el que:
- i)
- la cantidad de sustrato es suficientemente pequeña para ser completamente consumida por una cantidad específica de sangre o plasma normales,
- ii)
- la cantidad y propiedades cinéticas del sustrato se seleccionan de tal modo que dicha consumición tiene lugar en un intervalo comprendido entre 5 y 600 segundos,
- iii)
- dicho valor calculado es dependiente de la velocidad de consumición del sustrato.
\newpage
Preferentemente el valor determinado es la
velocidad máxima de consumición del sustrato, que es dependiente
del potencial de generación de trombina de la muestra.
Así, en términos generales, se selecciona un
sustrato de acción rápida y se utiliza a una concentración baja en
relación con la muestra, por el contrario al procedimiento de Hemker
descrito anteriormente. El sustrato se puede seleccionar
convenientemente por la constante de Michaelis (K_{M}) para la
reacción sustrato-trombina que es una propiedad
generalmente conocida, y la selección de la invención [ii) anterior]
se podría, si fuese necesario, expresar alternativamente en
relación a esta constante. Preferentemente, el sustrato de trombina
tiene una K_{M} de 200 \muM o inferior, más preferentemente de
100 \muM o inferior, y la más preferida 50 \muM o inferior.
El sustrato de trombina puede ser un sustrato
cromógeno, fluorógeno o amperógeno de la trombina u otro sustrato
para la detección de la actividad de trombina. En una forma de
realización preferida el sustrato cromógeno se selecciona de entre
el grupo que comprende:
- H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH,
- H-D-Phe-Pip-Arg-pNA\cdot2HCl,
- Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-NH-Mec,
- pyroGlu-Pro-Arg-pNA\cdotHCl y Bz-Phe-Val-Arg-pNA.
El procedimiento puede además comprender o
utilizar un sustrato que interfiere con la gelatinización de la
fibrina, preferentemente un inhibidor de la polimerización de la
fibrina, tal como
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH, por ejemplo, en una concentración comprendida entre 0,1 y 20
mg/ml, preferentemente de 5 mg/ml.
Además, el procedimiento puede comprender o
utilizar un inhibidor de la coagulación. Los ejemplos de inhibidores
de la coagulación adecuados son los activadores de la Proteína C
(p.ej., Protac), inhibidores de la senda del Factor Tisular (o
sustancias equivalentes), factor VIIa inactivado (o sustancias
equivalentes), Proteína C activada (o sustancias equivalentes),
inhibidores de las plaquetas (por ejemplo, prostaciclina), inhibidor
FVIII (o sustancias equivalentes), inhibidor FIX (o sustancia
equivalente), heparina y/o heparinoides, inhibidores directos de la
trombina, inhibidores directos del Facto Xa e inhibidores de las
serina-proteasas (por ejemplo, aprotinina).
El procedimiento puede comprender también o
utilizar un acelerador de la coagulación. Los aceleradores de la
coagulación adecuados son los fosfolípidos de origen natural o
sintético o las sustancias semejantes y el cloruro de calcio u
otras fuentes de cationes divalentes. Los activadores del sistema de
coagulación que se pueden utilizar según la presente invención son
el Factor Tisular o sustancias semejantes, activadores del factor X
(por ejemplo, venenos de serpiente), activadores del factor V (por
ejemplo, venenos de serpientes), activadores de la protrombina (por
ejemplo, venenos de serpientes), activadores de la fase de contacto
(por ejemplo, kaolin), factores de la coagulación activados o
sustancias semejantes y activadores de las plaquetas (por ejemplo,
colágeno). Un activador preferido del sistema de coagulación es el
Factor Tisular recombinante que se puede utilizar a una
concentración comprendida entre 2 y 200 ng/ml. Otro activador
preferido del sistema de coagulación, el silicato de aluminio, se
puede utilizar a una concentración comprendida entre 0,5 y 10
g/l.
Además, el producto de conversión del sustrato
se puede detectar convenientemente óptimamente a 405 nm adecuada
para la mayoría de los instrumentos en uso.
Otras características preferidas de la presente
invención se encuentran descritas en las reivindicaciones.
La Fig. 1 es un esquema diagramático que
representa las complejas interacciones en el ensayo de la presente
invención.
La Fig. 2 (técnica anterior) es un diagrama que
representa el ensayo de Hemker para determinar el potencial
endógeno de trombina (ETP).
La Fig. 3 (técnica anterior) es una gráfica que
representa el incremento en la densidad óptica mediante la
conversión de un sustrato cromógeno de la trombina según la técnica
anterior a diferentes concentraciones de sustrato.
La Fig. 4 (técnica anterior) es una gráfica que
representa la primera derivada de las curvas de reacción de la Fig.
3.
La Fig. 5 es una gráfica que representa el
incremento de la densidad óptica y la fuerte señal que se obtiene
mediante la conversión de un sustrato cromógeno rápido de la
trombina según el ensayo de la invención a diferentes
concentraciones de sustrato.
La Fig. 6 es una gráfica que representa la
primera derivada de las curvas de reacción de la Figura 5.
La figura 7 es una gráfica que representa el
efecto de la activación sobre el ensayo de la invención de
diferente concentraciones de Factor Tisular recombinante (la
concentración mostrada en la figura es en ng/ml).
La Fig 8 es una gráfica que representa la
primera derivada de las curvas de reacción representadas en la Fig.
7.
La Fig. 9 (técnica anterior) es una gráfica que
ilustra el efecto de las anomalías ópticas debidas al fenómeno de
gelatinización de la fibrina.
La Fig. 10 (técnica anterior) es una gráfica que
representa la primera derivada de la curva de reacción representada
en la Fig. 9.
La Fig. 11 es una gráfica que representa la
correlación entre el inicio de la coagulación (detectada por la
generación de fibrina) y el comienzo de la generación de trombina
detectada mediante el ensayo de la presente invención.
La Fig. 12 es una gráfica que representa el
efecto de disminuir la actividad del factor de coagulación FVIII
(actividades mostradas en la figura) sobre el ensayo de la presente
invención.
La Fig. 13 es una gráfica que representa la
correlación entre la actividad del factor VIII y la generación
inicial de trombina (ensayada según el ensayo de la presente
invención) en pacientes de hemofilia A y en voluntarios sanos.
La Fig. 14 es una gráfica que representa el
efecto de la adición de FVIII a pacientes hemofílicos en la
generación inicial de trombina (ensayada utilizando el
procedimiento de la presente invención).
La Fig. 15 es una gráfica que representa la
correlación de la generación inicial de trombina (ensayada según el
procedimiento de la presente invención) y mediante el procedimiento
de Tiempo de Protrombina.
La Fig. 16 es una gráfica que representa la
correlación entre la generación inicial de trombina (ensayada según
el procedimiento de la presente invención), expresada contra el
Tiempo de Protrombina.
Inesperadamente se descubrió que un sistema de
ensayo que utiliza en combinación un activador del sistema de
coagulación plasmático, una muestra de sangre o plasma y un sustrato
rápido de la trombina a una concentración relativamente baja (la
cinética y la cantidad de sustrato de trombina se seleccionan de tal
modo que típicamente se consuma en entre 5 y 600 segundos después
de la activación de la trombina) permite una ruta mucho más precisa,
barata y rápida para evaluar la coagulación o el potencial de
generación de trombina de una muestra de ensayo de sangre o plasma
que los procedimientos previamente aplicados.
El sistema de ensayo es menos dependiente de la
fase inhibidora de la trombina, que los procedimientos anteriores
para la evaluación de la activación de la trombina, lo que tiene
múltiples ventajas e incrementa la relevancia fisiológica del
ensayo.
Cuando se aplica un sustrato cromógeno de la
trombina, se aplica normalmente un inhibidor (o sustancia semejante)
de la polimerización de la fibrina con el fin de suprimir la
gelatinización de la fibrina que interferiría con la conversión del
sustrato cromógeno. Sin embargo, si se aplica un sustrato fluorógeno
(u otro procedimiento de detección que no es perturbado por la
gelatinización de la fibrina) este componente no es necesario en el
ensayo de la presente invención.
Para realizar el ensayo según la presente
invención se utilizan preferentemente los siguientes reactivos:
- un activador del sistema de coagulación plasmático (por ejemplo, Factor Tisular recombinante a una concentración de 200 ng/ml de muestra).
- un sustrato cromógeno con una K_{M} comprendida entre 200 \muM o inferior (p.ej., H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH a una concentración de 250 \muM/ml de muestra).
- opcionalmente un acelerador de la coagulación (p.ej., fosfolípidos a una concentración de 50 \mug/ml de muestra, y CaCl_{2} a una concentración de 25 mM/ml muestra).
- opcionalmente un inhibidor de la coagulación (por ejemplo, proteína C activada a una concentración de 1 U/ml).
- opcionalmente un inhibidor de la polimerización de la fibrina (p.ej., H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH a una concentración de 5 mg/ml de muestra).
Dos o más (o todos) estos reactivos se pueden
combinar en un reactivo con el fin de reducir el número de etapas
de pipeteo necesarias. Cuando se combinan múltiples componentes en
un solo reactivo se debe evaluar si las disoluciones son
compatibles.
Con el fin de realizar el procedimiento de
ensayo se mezcla una muestra de sangre o plasma con el reactivo y
se determina la generación del producto de conversión. Si se aplica
un sustrato cromógeno la reacción se puede detectar óptimamente a
405 nm (en este caso solamente se puede analizar plasma
normalmente). Si se aplica un sustrato fluorógeno se puede analizar
plasma rico o pobre en plaquetas. Si se utiliza un sustrato
amperógeno o equivalente (es decir, cuando no se genera un señal
óptica) entonces se puede analizar sangre o plasma.
Para analizar la reacción se registra la
conversión del sustrato de trombina y por lo menos un parámetro que
depende de la velocidad de conversión del sustrato de trombina. Esto
se representa en la Fig. 1 que representa las complejas
interacciones enzimáticas que conducen a la formación de trombina
libre. La generación inicial de trombina se detecta utilizando un
sustrato rápido de trombina. La conversión de sustrato de trombina
se detecta utilizando los procedimientos adecuados y se calcula la
primera derivada.
La densidad óptica (OD) de la mezcla de
reactivo-muestra se registra típicamente cada 0,5 a
2 segundos. En los experimentos que siguen se midió en un
analizador de cromógeno cada 2 segundos. Los valores se pueden
representar gráficamente manualmente o mediante un ordenador con el
fin de obtener curvas como las que se muestran en la Fig. 5. A
continuación se registran gráficamente los cambios en densidad
óptica entre mediciones sucesivas. Aunque esto se puede realizar
manualmente, resulta preferido utilizar un programa de ordenador.
Con el fin de calcular los valores de la pendiente de la curva (la
primera derivada) se realizó el siguiente cálculo en Microsoft®
Excel®.
Pendiente de la
curva en el punto de tiempo X = [(OD en el punto de tiempo
X + 2 segundos) - (OD en el punto de tiempo X - 2
segundos)]/4
En la que X representa cada uno de los puntos
temporales durante el análisis (excepto los dos primeros segundos y
los dos últimos segundos).
Los valores obtenidos se representaron
gráficamente con el fin de obtener curvas de la primera derivada
tal como se muestra en la Fig. 6. Los valores más altos de las
curvas (la máxima de la primera derivada) se toman como una
medición dependiente de la coagulación o del potencial de generación
de trombina de la muestra en cuestión.
Si se desea, se puede utilizar un programa de
ordenador con el fin de seleccionar más precisamente los puntos de
inflexión positiva de las curvas primarias de la Figura 5 (que
corresponden a los valores más altos en la Figura 6). Se puede
obtener un valor absoluto para una muestra relativo a la actividad
de trombina de la sangre normal mediante la comparación de los
picos de la curva de la muestra con los del plasma de sangre normal
medido en las mismas condiciones, tal como se describe en relación
con la Fig.12 más adelante.
Además, se puede disponer un instrumento con los
programas necesarios para permitir mediciones en los dispensarios
(por ejemplo, amperométricos) calibrados para indicar el potencial
de generación de trombina de una muestra de sangre utilizando tales
valores máximos de la primera derivada. Tales instrumentos existen
para ensayos convencionales.
La primera derivada de la curva de reacción
refleja la conversión del sustrato de trombina durante el ensayo.
La velocidad de conversión del sustrato de trombina depende de si la
trombina se produce rápidamente o lentamente durante la reacción.
Se define el máximo de la primera derivada como la "generación
inicial de trombina" (2af). Utilizando plasma de calibración
comercialmente disponible se puede convertir a una escala porcentual
% la formación inicial de trombina (2af), en la que el 100%
corresponde a una muestra de sangre normal y el 0% refleja la
ausencia absoluta de activación de trombina.
Utilizando los procedimientos según la presente
invención la activación de la trombina se puede determinar
utilizando un procedimiento rápido y barato, que utiliza
instrumentación estándar. Comparado con los procedimientos
anteriores el ensayo consume mucho menos tiempo (entre 5 y 10
minutos, en comparación con 30 minutos de los procedimientos
anteriores), requiere cantidades muy inferiores de sustrato de
trombina (12,5 nmol sustrato, en comparación con los 450 nmol
requeridos en los procedimientos anteriormente aplicados) y se puede
automatizar por completo en equipo estándar.
La mayoría de los ejemplos para la aplicación
del ensayo de la presente invención utilizan sustratos cromógenos
para la determinación de la actividad de trombina. Sin embargo,
también se pueden utilizar sustratos fluorógenos, amperógenos u
otros sustratos con el fin de detectar la actividad de trombina.
Aunque en los ejemplos los reactivos se aplican en disolución
acuosa, se pueden aplica modificaciones del ensayo de la presente
invención que utilizan reactivos secos. La muestra de sangre o
plasma disuelve el reactivo seco y la reacción se realiza en fase
líquida.
Para esta aplicación el reactivo se puede
inmovilizar en superficies sólidas (p.ej, cuentas de látex).
El procedimiento según la presente invención se
puede adaptar a la aplicación deseada mediante la selección del
sustrato (cromógeno/fluorógeno/amperógeno), mediante la
concentración del sustrato, mediante la adición de activadores
(Factor Tisular, activador de contacto) o inhibidor (proteína C
activada, inhibidor de la senda del Factor Tisular). Genera una
fuerte señal óptica y se puede analizar utilizando algoritmos
simples (primera derivada). Mediante la utilización de un sustrato
cromógeno rápido el ensayo se enfoca en la fase inicial de
activación de trombina. Por el contrario con los procedimientos
anteriormente utilizados, en especial el ensayo ETP de Hemker et
al., determina la fase de activación y de inhibición de la
trombina. Según Hemker et al., las "horas persona" de
trombina son los factores determinantes de la hemostasis, hemorragia
o trombosis. Por consiguiente en el procedimiento ETP el área bajo
la curva de actividad de trombina se calcula tal como se ilustra en
la Figura 2. Esta curva, desde el punto de vista fisiológico, tiene
dos partes: la fase de generación de trombina y la fase de
inhibición de la trombina. La velocidad de generación de la trombina
en la primera parte de la curva proporciona información sobre si la
trombina se forma rápidamente (a veces denominada "cinética de
explosión") o lentamente. Esta información, que no proporciona el
ensayo estándar de coagulación, proporciona información adicional
valiosa para la evaluación de la hemostasis. La fase de inhibición
de la trombina tal como se ensaya mediante el ETP in vitro se
determina principalmente por la actividad de antitrombina y por
otros anticoagulantes endógenos y exógenos en la muestra. Sin
embargo en el cuerpo la regulación negativa de la generación de
trombina y sus inhibición está fuertemente influenciada por las
estructuras endoteliales (trombomodulina) y las sustancias liberadas
por, o unidas al endotelio (por ejemplo, glicosaminoglicanos). Así,
la fase de inhibición de la trombina tal como se ensaya in
vitro es de relevancia clínica baja y oscurece la predictividad
clínica del procedimiento ETP. Contrariamente a esto, el ensayo de
la presente invención, al enfocarse en la fase inicial de activación
de la trombina proporciona más información clínicamente relevante
sobre la activación de la trombina que los procedimientos
anteriores.
La Figura 3 muestra el desarrollo de la densidad
óptica utilizando procedimientos descritos con anterioridad. La
formación de trombina se detectó utilizando el sustrato cromógeno
lento
H-\beta-Ala-Gly-Arg-pNA\cdot2AcOH
(K_{M} = 2000 \muM). La polimerización de la fibrina se inhibió
utilizando el péptido sintético
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH. La formación de la trombina comienza después de
aproximadamente 80 segundos. La Figura 4 muestra la primera derivada
de la curva de reacción para los mismos períodos de tiempo. Las
diferentes curvas muestran el efecto de múltiples concentraciones
de sustrato cromógeno. El incremento en densidad óptica no se
detiene durante la reacción, ya que el sustrato cromógeno no se
consume durante la reacción. El sustrato cromógeno y el inhibidor
de la polimerización de la fibrina se encuentran comercialmente
disponibles de Pentapharm Ltd., Basle.
Se prepararon las siguientes disoluciones con el
fin de evaluar el ensayo de la invención:
- Disolución 1, una disolución acuosa de CaCl_{2} (25 mM), un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH, Pentapharm, Basle) e inhibidor de la polimerización de la fibrina (5 mg/ml H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH, Pentapharm, Basle).
- Disolución 2, una disolución acuosa comprendiendo un activador de contacto (silicato de aluminio 5 g/l, sigma, St. Luis, USA) y fosfolípidos (derivados de cefalina de cerebro de conejo, 50 \mug/ml, Pentapharm, Basle).
Se preparó plasma pobre en plaquetas a partir de
sangre venosa tratada con citrato mediante centrifugación
(20 min. a 1500 g).
(20 min. a 1500 g).
El procedimiento se realizó como sigue:
Se mezcló 50 \mul de plasma pobre en plaquetas
con 50 \mul de disolución 2 y se incubó durante 180 segundos. Se
añadió a continuación 50 \mul de la disolución 1 y se realizó la
detección de la densidad óptica a 405 nm durante 400 segundos.
Este procedimiento generalmente se sigue con
modificaciones específicas en los ejemplos (invención)
siguientes.
Se repitió el procedimiento con diferentes
concentraciones de sustrato del sustrato
H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH
(K_{M} 15,9 \muM), Pentapharm, Basle) con el fin de la gráfica
de la Figura 5.
A partir de las curvas de reacción se calculó la
primera derivada mediante la determinación del incremento en
densidad óptica cada 4 segundos tal como ya se ha descrito. La
primera derivada se registra gráficamente en la Figura 6.
La Figura 5 demuestra que la formación de
trombina en la misma muestra de plasma que en las Figuras 3 y 4
detectada mediante el procedimiento según la presente invención.
Utilizando el procedimiento de la presente invención se genera una
señal óptima mucho más fuerte (20 veces más fuerte). La elevación
en densidad óptica se detiene cuando se consume el sustrato,
típicamente ente 1 y 2 minutos después del inicio de la generación
de trombina. La Figura 5 y la Figura 6 muestran el efecto de elevar
la concentración del sustrato sobre las propiedades de detección.
La elevación de la concentración de sustrato conduce a la elevación
de la señal óptica. Sin embargo, ya las concentraciones más bajas
ensayadas son suficientes para generar una señal más fuerte que
utilizando los procedimientos anteriores. Mediante la utilización de
la misma concentración de sustrato se puede generar una señal más
de 100 veces más fuerte que la generada cuando se compara con la de
la técnica anterior. Según el ensayo de la presente invención la
señal óptica se puede amplificar dependiendo de la concentración de
sustrato de fibrina que se aplique.
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió
utilizando diferentes concentraciones del activador del sistema
plasmático de la coagulación en la evaluación de la generación de
trombina utilizando el ensayo de la presente invención. Se diluyó
en serie Factor Tisular recombinante (Instrumentation Laboratory,
Kirchheim, Germany) y se utilizó como el activador en la disolución
2. Los resultados de densidad óptica y las primeras derivadas se
muestran respectivamente en las Figuras 7 y 8. Los números en los
diagramas muestran las concentraciones de Factor Tisular
recombinante (ng/ml muestra). Así el ensayo se puede adaptar tal
como se necesite dependiendo del procedimiento de activación
aplicado.
(Comparativo)
Las Figuras 9 y 10 demuestran una de las
limitaciones de la técnica anterior. La generación de trombina se
valoró utilizando el sustrato de trombina lento
H-\beta-Ala-Gly-Arg-pNA\cdot2AcOH
(2,5 mM) y el inhibidor de la polimerización de la fibrina
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH (5 mg/ml). A 400 segundos después del inicio de la generación
de trombina se detectan anormalidades ópticas, que son todavía más
evidentes en la primera derivada (Fig. 10). Lo más probable éstas
son debidas a un fenómeno de gelatinización tardía de la fibrina,
que tiene lugar a pesar de la utilización de un inhibidor de la
polimerización de la fibrina. El fibrinógeno es una proteína de
fase aguda y aumenta significativamente en muchos estados de
enfermedad. Aparentemente la utilización de inhibidores de la
polimerización de la fibrina no elimina por completo la
gelatinización en muestras con una concentración de fibrina
aumentada.
En el procedimiento de la presente invención la
señal óptica es mucho más fuerte, de modo que las anomalías ópticas
perturban la reacción en mucho menor grado. Además, mediante la
utilización del procedimiento de la presente invención la detección
de la generación de trombina termina típicamente entre 1 y 2 minutos
(cuando se ha consumido el sustrato de trombina), de modo que el
fenómeno de gelatinización tardía de la fibrina (tal como se
observa en las Figuras 9 y 10) no afecta a las mediciones.
La Figura 11 compara la detección del inicio de
la coagulación mediante el procedimiento de formación de fibrina y
mediante el procedimiento de la presente invención. Para este
experimento se coagularon 80 muestras de voluntarios sano y
pacientes de hemofilia A, mediante la adición de un activador de
fase de contacto (silicato de aluminio, Sigma, St. Louis, USA),
fosfolípidos (cefalina de cerebro de conejo, Pentapharm, Basle) y
CaCl_{2} (Sigma, St. Louis, USA). Se hace referencia a este
procedimiento como "tiempo de tromboplastina parcial activada"
(aPTT). El tiempo desde el inicio del proceso hasta que se detecta
coagulación es el aPTT. El ensayo de la presente invención se
realizó utilizando un proceso de activación idéntico al aPTT. La
diferencia entre los dos procesos fue la adición del sustrato
cromógeno rápido
(H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH,
250 \muM/l, Pentapharm) y el inhibidor de la polimerización de la
fibrina
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH (5 mg/ml, Pentapharm) en el ensayo de la presente
invención.
La Figura 11 muestra que la adición del sustrato
cromógeno retardó el inicio de la generación de trombina (tal como
propuso Hemker). Sin embargo, inesperadamente (y en contraste con lo
publicado por Hemker et al.) la inhibición de la coagulación
mediante la adición del sustrato cromógeno rápido produjo un efecto
altamente sistemático, que no interfiere con la correcta evaluación
de la hemostasis. La correlación de los dos procedimientos fue
excelente (coeficiente de correlación 0,95).
La Figura 12 muestra el efecto de disminuir la
actividad del factor de coagulación FVIII sobre el ensayo de la
presente invención. Se utilizó un plasma de calibración
comercializado (producido utilizando un conjunto de plasmas de
voluntarios sanos, Instrumentation Laboratory, Kirchheim, Germany)
con el fin de calibrar los resultados. La primera derivada como
porcentaje de lo "normal" se define como la generación inicial
de trombina (2af), que se establece para el plasma de calibración
como el 100%.
Las muestras de plasma se prepararon mediante
diluciones seriadas del plasma de calibración utilizando plasma
deficiente en FVIII (un plasma que había sido agotado de factor
VIII, comercialmente disponible de Dade-Behring,
Marburg, Germany). La Figura 12 muestra que la formación de trombina
tal como se evalúa mediante el ensayo de la presente invención es
muy dependiente de la actividad de FVIII en la muestra. FVIII es el
factor de coagulación cuya concentración o actividad se encuentra
disminuida en los pacientes de hemofilia A. Esta deficiencia
resulta en una disminución de la generación de trombina y por
consiguiente en una grave tendencia a la hemorragia en estos
pacientes.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Con el fin de evaluar el efecto de proporcionar
factor VIII sobre la generación inicial de trombina se prepararon
las disoluciones siguientes:
- disolución 1, una disolución acuosa comprendiendo CaCl_{2} (25 mM), un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH, Pentapharm, Basle) y un inhibidor de la polimerización de la fibrina (5 mg H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH/ml, Pentapharm, Basle).
- disolución 2, una disolución acuosa que comprende un activador por contacto (silicato de aluminio 5 g/l, Sigma, St. Louis, USA) y fosfolípidos (derivados de cefalina de cerebro de conejo, 50 \mug/ml, Pentapharm, Basle).
- disolución 3, una disolución acuosa que comprende Factor Tisular recombinante (Baxter, Viena, Austria) a una concentración de 1 U/ml.
El plasma pobre en plaquetas se prepara a partir
de sangre venosa citrada, por centrifugación (20 min. a 1.500
g).
El proceso se realiza como sigue:
- se mezcló 50 \mul de sangre pobre en plaquetas con 50 \mul de disolución 2 y 50 \mul de disolución 3 y se incubó durante 600 segundos. Se añadió 50 \mul de disolución 1 y se determinó la densidad óptica a 405 nm durante 400.
Durante el período de incubación el FVIII
añadido con la disolución 3 puede ser inhibido por los anticuerpos
antiFVIII en la sangre del paciente. El efecto del FVIII añadido y
de la inhibición del FVIII sobre la generación de trombina se
evalúa mediante este procedimiento.
La Figura 13 muestra la correlación entre la
actividad de factor VIII y la generación inicial de trombina (2af)
en los pacientes de hemofilia A y en voluntarios sanos. La
generación inicial de trombina (2af) se muestra como el % de la
normalidad utilizando una calibración de un conjunto de plasmas
normales (que se estableció como el 100%).
Los resultados muestran una correlación muy
buena, no lineal de los dos parámetros. Para las muestras de plasma
con una actividad de factor VIII inferior al 20% (de lo normal) se
produce una disminución de la generación de trombina dependiente de
FVIII tal como se evalúa mediante el ensayo de la presente
invención.
La Figura 14 demuestra el efecto de la adición
de FVIII (recombinante, Baxter, Vienna, Austria) a pacientes de
hemofilia A, sobre la generación inicial de trombina. La generación
inicial de trombina fue, otra vez, indicada como el % de la
normalidad utilizando una calibración con un conjunto de plasmas
normales (que se estableció como el 100%).
La adición de FVIII corrigió la deficiencia de
FVIII en las muestras y produjo un incremento significativo de la
generación inicial de trombina determinada mediante el ensayo de la
presente invención.
Ejemplos
8A-C
Las Figuras 15 y 16 muestran diferentes
experimentos que demuestran la correlación entre la generación
inicial de trombina por el procedimiento de la presente invención y
por el procedimiento de Tiempo de Trombina.
Para la evaluación del ensayo de la presente
invención se prepararon las siguientes disoluciones acuosas:
- disolución 1a, una disolución acuosa preparada combinando CaCl_{2} (25 mM), un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH, Pentapharm, Basle), un inhibidor de la polimerización de la fibrina (5 mg/ml H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH\cdotAcOH, Pentapharm, Basle) y Factor Tisular recombinante (200 ng/ml, Instrumentation Laboratory, Kirchheim, Germany).
- disolución 1b (contenido reducido de Factor Tisular) y disolución acuosa preparada mediante la combinación de CaCl_{2} (25 mM), un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa-2AcOH) un inhibidor de la polimerización de la fibrina (5 mg H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH/ml) y Factor Tisular recombinante (20 ng/ml) en disolución acuosa.
- disolución 1c (Contenido reducido en Factor Tisular) una disolución acuosa preparada mediante la combinación de CaCl_{2} (25 mM), un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH), un inhibidor de la polimerización de la fibrina (5 mg, H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH/ml) y Factor Tisular recombinante (2 ng/ml) en disolución acuosa.
- disolución 2, una disolución acuosa preparada mediante la combinación de fosfolípidos (derivados de encefalina de cerebro de conejo, 50 \mug/ml, Pentapharm, Basle) y tampón HEPES (pH 7,4, 50 mM, Sigma, St. Louis) en disolución acuosa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se preparó plasma pobre en plaquetas a partir de
sangre venosa citrada (20 min. a 1500 g).
El proceso se realizó tal como sigue:
Ejemplo
8A
Se mezclaron 50 \mul de plasma pobre en
plaquetas con 50 \mul de disolución 2 y se incubó durante 180
segundos. Se añadieron 50 \mul de disolución 1a y se detectó la
densidad óptica a 405 nm durante 400 segundos.
Ejemplo
8B
Se mezcló 50 \mul de plasma pobre en plaquetas
con 50 \mul de disolución 2 y se incubó durante 180 segundos. Se
añadieron 50 \mul de disolución 1b y se detectó la densidad óptica
a 405 nm durante 400 segundos.
Ejemplo
8C
Se mezcló 50 \mul de plasma pobre en plaquetas
con 50 \mul de disolución 2 y se incubó durante 180 segundos. Se
añadieron 50 \mul de disolución 1c y se detectó la densidad óptica
a 405 nm durante 400.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir dela curva de reacción se calculó la
primera derivada mediante la determinación de la elevación de la
densidad óptica cada 4 segundos. El máximo de la primera derivada se
definió como la actividad inicial de trombina (2af). Para calibrar
los resultados se utilizó para calibrar los resultados un plasma de
calibración comercializado (producido utilizando un conjunto de
plasmas de voluntarios sanos, comercializado por Instrumentation
Laboratory, Kirchheim, Germany). La actividad inicial de trombina
del plasma de calibración se estableció como el 100% (de lo
normal).
Se ensayó plasma citrado de 50 pacientes con
concentraciones de factores de coagulación normales o disminuidos.
Además del procedimiento de la presente invención se realizó el
ensayo estándar de Tiempo de Protrombina (utilizando el reactivo
Recombiplastin® de Instrumentation Laboratory, Kirchheim, Germany).
El Tiempo de Protrombina refleja la concentración de factor de
coagulación de la muestra y se realiza añadiendo a la muestra un
reactivo que comprende Factor Tisular a concentración muy elevada,
fosfolípidos y CaCl_{2}. El Tiempo de Protrombina se realizó como
se expone a continuación:
Se mezcló 50 \mul de plasma con 100 \mul de
Recombiplastin® y se detectó el tiempo de coagulación a 405 nm.
La Figura 15 muestra la correlación entre la
actividad inicial de trombina determinada utilizando el
procedimiento de la presente invención y el del Tiempo de
Protrombina. Utilizando el procedimiento según el Ejemplo 8a, se
detectó una generación de trombina más elevada en comparación con 8b
y 8c (el último procedimiento resulta en la generación de trombina
más débil). Esto fue debido a la cantidad disminuyente de Factor
Tisular que se utilizó en los Ejemplos. Esto también se corresponde
con los resultados del experimento mostrado en las Figuras 7 y
8.
En la Figura 16 la actividad de trombina
evaluada se transformó en % de lo normal (mediante calibración
contra un conjunto de plasmas normales) y se muestra contra el
Tiempo de Trombina (en % de lo normal). La actividad inicial de
trombina depende de la actividad de factor de coagulación en la
muestra (tal como se muestra por la significancia de la correlación
entre la generación inicial de trombina contra el Tiempo de
Protrombina). Sin embargo, se observa considerable oscilación,
especialmente cuando se aplica la activación más baja con Factor
Tisular (Ejemplo 8c).
Así, la información que no está proporcionada
por el procedimiento del Tiempo de Protrombina se determina
mediante la evaluación de la formación inicial de trombina
utilizando el procedimiento de la presente invención.
Para la evaluación de la interacción de los
componentes plasmáticos y celulares de la coagulación se prepararon
las siguientes disoluciones:
- disolución 1, una disolución acuosa que comprende CaCl_{2} (25 mM) y sustrato fluorógeno de la trombina (H-D-Cha-Ala-Arg-AMC 2 AcOH, 25 \muM, Pentapharm, Basle).
- AMC: 7-amino-4-metilcumarina
- disolución 2. Se prepara una segunda disolución mediante la combinación de un activador por contacto (silicato de aluminio 5 g/l, Sigma, St. Louis, USA) y fosfolípidos (derivados de cefalina de cerebro de conejo, 50 \mug/ml, Pentapharm, Basle) en disolución acuosa.
Se prepara plasma rico en plaquetas a partir de
sangre venosa citrada mediante centrifugación (20 min, a 500 g).
\newpage
El procedimiento se realiza tal como se expone a
continuación:
- se mezcla 50 \mul de plasma pobre en plaquetas con 50 \mul de disolución 2 y se incuba durante 180 segundos. Se añade 50 \mul de la disolución 1 y se detecta la emisión de luz a 440 nm (longitud de onda de excitación 342 nm).
Debido a la detección fluorimétrica no se
requieren medios para la inhibición la gelatinización de la fibrina.
Debido a la utilización de plasma rico en plaquetas en este
ejemplo se puede evaluar el efecto de la inhibición de las
plaquetas sobre la generación de trombina.
Con el fin de evaluar el efector de los
trastornos del sistema de la proteína C sobre la generación inicial
de trombina se produjeron las siguientes disoluciones:
- disolución 1, una disolución acuosa que comprende CaCl_{2} (25 mM) un sustrato cromógeno (250 \muM H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH, Pentapharm, Basle) y un inhibidor de la polimerización de la fibrina (5mg/ml H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH AcOH, Pentapharm, Basle).
- disolución 2. Se prepara una segunda disolución combinando un activador por contacto (silicato de aluminio 5 g/l, Sigma, St. Louis, USA) y fosfolípidos (derivados de cefalina de cerebro de conejo), 50 \mug/ml, Pentapharm, Basle) en disolución acuosa.
- disolución 3. Se prepara una tercera disolución que comprende proteína C activada (Enzyme Research, South Bend, IN, USA) a una concentración de 1 U/ml.
Se prepara plasma pobre en plaquetas a partir de
sangre venosa citrada mediante centrifugación (20 min. a
1500 g).
1500 g).
El procedimiento se realiza tal como se expone a
continuación:
- se mezcla 50 \mul de plasma pobre en plaquetas con 50 \mul de disolución 2 y 50 \mul disolución 3 y se incuba durante 180 segundos. Se añaden 50 \mul de la disolución 1 y se detecta la densidad óptica a 405 nm durante 400 segundos.
La proteína C activada presente en la disolución
3 inactiva el Fva de la muestra y reduce la generación de
trombina. En pacientes con trastornos de la activación del sistema
de la proteína C heredados (por ejemplo, portadores de la mutación
Leiden en el factor V) o adquiridas (por ejemplo, debidos a los
anticonceptivos orales) la inhibición de la activación de la
trombina disminuye cuando se compara con los sujetos normales.
Claims (21)
1. Procedimiento para evaluar el potencial de
coagulación de una muestra de sangre o plasma que comprende:
- a)
- Mezclar una muestra de sangre o plasma con por lo menos un activador del sistema de coagulación sanguínea, un sustrato de la trombina y una sustancia que interfiere con la gelatinización de la fibrina, habiendo sido incubada la mezcla de activador y muestra si fuese necesario.
- b)
- Determinar incrementalmente o continuamente la liberación del producto de conversión del sustrato de la trombina, y
- c)
- Calcular por lo menos un valor indicativo del potencial de coagulación.
en la que:
- i)
- la cantidad de sustrato es suficientemente pequeña para ser consumida completamente por una cantidad especificada de sangre o plasma normales,
- la cantidad y las propiedades cinéticas del sustrato se seleccionan de manera que dicha consumición tiene lugar en un intervalo comprendido entre 5 y 600 segundos,
- dicho valor calculado es dependiente de la velocidad de consumo del sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sustancia que interfiere con la gelatinización de la
fibrina es un inhibidor de la polimerización de la fibrina.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el inhibidor de la polimerización de la fibrina es
H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
AcOH.
4. Procedimiento según cualquiera de la
reivindicaciones anteriores, en el que dicho valor es la velocidad
máxima de consumo del sustrato, siendo dependiente de la actividad
inicial de trombina.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la velocidad máxima de
consumo de sustrato de una muestra de ensayo se compara con el
valor bajo las mismas condiciones para una muestra de sangre o
plasma estándar con el fin de proporcionar una medición de la
actividad de trombina en la muestra de ensayo.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato de trombina
presenta una K_{M} de 200 \muM o inferior.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato de trombina
presenta una K_{M} de 100 \muM o inferior.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato de trombina
presenta una K_{M} de 50 \mum o inferior.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para la evaluación del plasma, en el que
el sustrato de trombina es un sustrato cromógeno.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el sustrato cromógeno se selecciona de entre:
- H-D-CHG-Ala-Arg-pNa\cdot2AcOH,
- H-D-Phe-Pip-Arg-pNA\cdot2HCl,
- Boc-Asp(Obzl)-Pr-Arg-NH-Mec
- PyroGlu-Pro-Arg-pNA\cdotHCl y
- Bz-Phe-Val-Arg-pNA.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
en el que el producto de conversión se detecta ópticamente a
405 nm.
405 nm.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el sustrato de la trombina es un
sustrato fluorógeno o amperógeno.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza por lo menos un
inhibidor de la coagulación en la etapa (a).
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el inhibidor de la coagulación se selecciona de entre uno o
más de:
- activador de la proteína C,
- inhibidor de la vía del factor tisular (o sustancias equivalentes),
- factor VIIa inactivado (o sustancias equivalentes),
- proteína C activada (o sustancias equivalentes),
- prostaciclina u otros inhibidores de las plaquetas,
- inhibidor del factor VIII (o sustancias equivalentes),
- inhibidor del FIX (o sustancias equivalentes),
- heparinas y/o heparinoides,
- inhibidores directos de la trombina,
- inhibidores directos del Factor Xa y
- aprotinina u otros inhibidores de las serina-proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un
acelerador de la coagulación en la etapa (a).
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el acelerador de la coagulación se selecciona de entre uno o
más fosfolípidos de origen natural o sintético o sustancias
análogas, cloruro de calcio u otras fuentes de cationes
divalentes.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el activador o los
activadores de sistema de la coagulación se seleccionan de entre
uno o más de:
- factor tisular o sustancias análogas,
- activadores del factor X,
- activadores del factor V,
- activadores de la protrombina,
- caolín u otros activadores por fase de contacto,
- factores de coagulación activados o sustancias análogas y
- Colágeno u otros activadores de las plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
que comprende por lo menos un activador de veneno de serpiente.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que utiliza una disolución de dicho
sustrato a una concentración inferior o igual a 1000 \muM sobre
la base de una proporción de volumen 1:1 con el plasma.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que utiliza una disolución de dicho
sustrato a una concentración inferior o igual a 500 \muM sobre la
base de una proporción de volumen 1:1 con el plasma.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que utiliza una disolución de dicho
sustrato a una concentración inferior o igual a 250 \muM sobre la
base de una proporción de volumen 1:1 con el plasma.
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