BR112014031509B1 - Para a determinação simultânea in vitro em tempo real do curso da atividade da enzima proteolítica e da resistência do coágulo de fibrina, reômetro rotativo e uso de um reômetro rotativo - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA IN VITRO EM TEMPO REAL DO CURSO DA ATIVIDADE DA ENZIMA PROTEOLÍTICA E DA RESISTÊNCIA DO COÁGULO DE FIBRINA, REÔMETRO ROTATIVO E USO DE UM REÔMETRO ROTATIVO. A presente invenção se refere à medição simultânea da geração da enzima proteolítica e da resistência do coágulo no plasma ou sangue total ou de qualquer amostra biológica adequada derivada do sangue. O método de medição abrange a utilização de um substrato detectável, que compreende uma porção que pode ser liberada mediante reação com a enzima proteolítica alvo, e os meios para medição de um aumento na viscosidade da resistência do coágulo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere à medição simultânea da geração da enzima proteolílica e da resistência do coágulo no plasma ou sangue total ou de qualquer amostra biológica adequada derivada do sangue. O método de medição abrange a utilização de um substrato detectável, que compreende uma porção que pode ser liberada mediante reação com a enzima proteolítica alvo, e os meios para medição de um aumento na viscosidade da resistência do coágulo.

[002]A presente invenção em particular se refere a um método para a medição simultânea da geração da trombina e da resistência do coágulo no sangue ou em uma amostra ou em uma amostra biológica derivada do sangue. A geração da trombina é detectada através de um substrato que emite um sinal devido à clivagem pela trombina. A resistência do coágulo é detectada com base no aumento da viscosidade durante a formação do coágulo.

[003] No contexto da presente invenção, foi projetado um reômetro especial em forma de placa e cone, que é capaz de medir a geração da trombina e a resistência do coágulo. O suporte de amostras do reômetro possui uma parte inferior transparente para permitir a transferência da luz fluorescente emitida através de um substrato sensível à trombina. Para a detecção da geração da trombina, um detector fluorescente é utilizado, de maneira vantajosa, quando o substrato para a trombina compreende uma porção fluorescente e é colocada sob a amostra.

[004] Consequentemente, a presente invenção se refere ao campo da hemostase (ou haemóstase) e trombose, que conduz à coagulação na configuração fisiológica ou patológica, respectivamente.

[005] Consequentemente, a presente invenção se refere aos meios e aos métodos adequados para a pesquisa da hemostase e coagulação. Consequentemente, a presente invenção fornece os meios, em particular os compostos, aparelhos, métodos e kits para a detecção da hemostase, coagulação ou distúrbios de coagulação nas amostras biológicas que compreende o sangue ou os produtos sanguíneos, tal como o plasma.

[006]A presente invenção em particular se refere ao campo do diagnóstico e, consequentemente, fornece os meios que são adequados para serem englobados nos testes de varredura para a detecção de uma condição clínica de um paciente, e em especial para o diagnóstico de uma condição patológica em um paciente, tal como o risco da trombose ou de hemorragia. A presente invenção também fornece os meios que podem ser englobados dentro dos testes de varredura com o objetivo de fornecer os dados relevantes para o planejamento da terapia.

[007]A presente invenção ainda se refere à monitoração terapêutica de um paciente, especialmente quando dito paciente está sob tratamento medicamentoso.

[008]A presente invenção também pode ser utilizada para a determinação da atividade dos agentes farmacêuticos ou medicamentos em relação ao processo de coagulação e formação de coágulos de fibrina, ou para a avaliação da atividade de candidatos para o medicamento de tal processo.

[009]A hemostase é um equilíbrio entre o estado pró-trombótico e a hemorragia. Os componentes da hemostase podem ser divididos em uma parte do plasma que é uma solução derivada do sangue que contém as proteínas de coagulação, e uma parte celular do sangue que contém as células sanguíneas tais como as plaquetas, eritrócitos e leucócitos. A interação in vivo do recipiente com o sistema hemostático impede a perda de sangue excessiva quando ocorre o dano a um vaso. Uma das proteínas de coagulação centrais no sistema hemostático é a trombina. A trombina é formada no término da cascata de coagulação e provoca que o fibrinogênio seja convertido em fibrina. A fibrina formada forma uma malha apertada de captura de plaquetas e eritrócitos, por conseguinte, originando um obturador que veda o vaso. A medição da geração da trombina é conhecida como sendo indicativa de um trombótico ou um fenótipo de hemorragia e a formação de fibrina mostrou ser indicativa de um fenótipo de hemorragia relacionado com o ponto de dispositivos de cuidados durante a cirurgia. A firmeza dos coágulos de sangue é um parâmetro funcional importante para a hemostase in vivo, à medida que um coágulo deve resistir à pressão do sangue e à tensão do cisalhamento no local da lesão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[010] O mundo da medicina é capaz de medir a evolução do sistema hemostático em relação à fisiopatologia durante décadas. No início dos anos 50, foi descoberto que a trombina possui um papel central na hemostase e que a medição da geração da trombina fornece uma boa indicação do estado do sistema de coagulação global. O grupo do professor Hemker (NL) coloca muito esforço para projetar uma análise para a medição da geração da trombina no momento, na presença de um calibrador. Eles conseguiram projetar e fabricar um método utilizado como tal no sangue total, plasma e plasma rico em plaquetas, que é conhecido como Calibrated Automated Thrombography (publicação WO 2003/093831). Atualmente, este método é utilizado em muitos laboratórios de pesquisas. Diversos métodos podem ser utilizados para a medição da geração da trombina no plasma e sangue total. Hemker et al., mostraram o princípio de uma fina camada que reduz o efeito dos eritrócitos em combinação com um substrato insensível à base de rodamina para o resfriamento brusco dos eritrócitos (publicação WO 2006/117246). A combinação provou ser uma ferramenta poderosa para a medição da geração da trombina no sangue total.

[011] No momento atual, todos os métodos para a medição da geração da trombina são com base na detecção única de trombina, principalmente através da conversão de um substrato fluorescente / cromogênico sensível à trombina. A trombina é a enzima principal para a conversão do fibrinogênio em fibrina. Além disso, foi demonstrada uma relação entre a taxa de conversão da trombina e da espessura da fibrina e da ramificação. Apesar da importância da trombina e da sua associação com o fenótipo protrombótico ou da hemorragia existem diversas condições em que a fibrina e, por conseguinte, a resistência do coágulo, pode ser influenciada de forma independente a partir da trombina. O grupo de Konings et al., mostrou que o fator de coagulação XIIa reforça a rede de fibrina independentemente da trombina [1]. Por conseguinte, existe uma necessidade para a medição simultânea da geração da trombina e da resistência de um coágulo. Além disso, através da medição simultânea da geração da trombina e da resistência do coágulo, a quantidade mínima de trombina necessária para a iniciação de coágulo pode ser facilmente determinada.

[012]A presente invenção fornece os métodos, dispositivos e kits que permitem satisfazer esta necessidade, o que significa que podem ser adaptados para a medição simultânea de diversas atividades de enzimas proteolíticas envolvidas na hemostase ou trombose, juntamente com a resistência de coágulo.

PRINCÍPIOS DA HEMOSTASE E DA COAGULAÇÃO RELACIONADOS COM A PRESENTE INVENÇÃO MECANISMO DA GERAÇÃO DA TROMBINA

[013] O mecanismo de geração da trombina no plasma sanguíneo pode ser exemplificado como a seguir. O fator tecidual (TF) é abundante, mas não exclusivamente presente na parede do vaso. Quando um vaso sanguíneo é danificado, o sangue entra nos tecidos e o fator VIIa da proteína do plasma (VIIa) pode interagir com o TF. Isso desencadeia um conjunto complexo de interações entre as proteínas e plaquetas do plasma, resultando em uma explosão transitória da trombina, que continua a ser limitada no tempo e no espaço. Por conseguinte, um ferimento interrompe a hemorragias, mas a coagulação não é propagada para o resto do corpo.

[014] Pode ser demonstrado que este mecanismo é tão complexo, repleto de reações de retornos positivos e negativos, que a sua ação não pode ser prevista a partir do conhecimento de suas partes (complexidade irredutível). Por conseguinte, se a avaliação da função do sistema hemostático for desejada, a geração da trombina precisa ser pesquisada, uma vez que ocorre no corpo ou em uma parte isolada do corpo, isto é, uma amostra de sangue ou plasma rico em plaquetas. A interação entre as plaquetas do sangue e o fator do plasma é de particular importância, a informação a ser obtida a partir de plasma pobre em plaquetas é essencialmente deficiente [3-5].

[015] Uma fração importante (de cerca de 30%) de toda a trombina formada na coagulação do plasma está ligada ao coágulo de fibrina. A trombina ligada ao coágulo retém as suas propriedades trombóticas, pode coagular o fibrinogênio, ativar os fatores V, VIII e XI, assim como as plaquetas [3-5]. No entanto é apenas parcialmente inibida pela antitrombina. Por conseguinte, é essencial que a fibrina esteja presente na pesquisa da função do sistema de coagulação.

[016] Conforme afirmado acima, a atividade da trombina que gera no local de uma lesão é um determinante importante da extensão da reação hemostática-trombótica que se segue. A maior parte da trombina (superior a 95%) é obtida após o momento de coagulação, por conseguinte, o tempo de coagulação não é automaticamente um bom indicador da atividade da trombina. A atividade da trombina na coagulação do sangue é um fenômeno transitório e, por conseguinte, deve ser medida durante o processo de coagulação.

[017] Um processo típico da formação de trombina na coagulação do sangue ou do plasma, também designado como a curva de geração da trombina, é mostrado na Figura 1 (linha sólida). Após um período em que nenhuma trombina observável é formada, a concentração acentuada aumenta, alcança um pico e, em seguida, reduz novamente. Os parâmetros típicos da formação da trombina são o tempo de espera, a área sob a curva (AUC), também designada como a trombina endógena potencial (ETP; vide abaixo), a altura do pico, e o tempo necessário para alcançar o pico.

RESISTÊNCIA DA COAGULAÇÃO

[018]A formação dos coágulos de fibrina que são relativamente resistentes à lise representa a etapa final da coagulação do sangue, conduzindo à reparação da lesão do tecido. O processo do complexo da formação do coágulo é iniciado através da clivagem de peptídeos N-terminais, conhecidos como fibrinopeptídeos A e B, a partir do fibrinogênio. Estas moléculas de fibrinogênio ativadas podem formar os complexos solúveis com as moléculas da fibrina e do fibrinogênio (monômeros de fibrina). No caso da atividade persistente da trombina, a concentração das fibrinas solúveis aumenta e forma as protofibrilas de cadeia dupla de comprimento. Posteriormente, estas protofibrilas podem ser lateralmente combinadas para formar as fibras de fibrina de diâmetros diferentes, resultando na polimerização da fibrina solúvel em fibrina insolúvel polimerizado covalentemente ligada.

[019]A estrutura do coágulo de fibrina pode ser influenciada por um determinado número de variáveis, incluindo o local do pH, resistências iônicas, e as concentrações de cálcio e fibrinogênio. É importante observar que a concentração de trombina presente no local apresenta o efeito fisiológico mais profundo na estrutura dos coágulos da fibrina. Baixas concentrações de trombina produzem os coágulos de fibrina altamente permeáveis, muito turvos compostos de fios de fibrina frouxamente tecidos, espessos. As concentrações mais elevadas de trombina produzem os coágulos relativamente não turvos, menos permeáveis compostos de uma rede densa de fios de fibrina relativamente finos. Através da ativação dependente de trombina de fator XIII, são formadas as ligações covalentes entre diferentes cadeias de fibrina, que reforça os contatos da fibrina dentro do coágulo de fibrina, por conseguinte, aumentando as propriedades viscoelásticas do coágulo de fibrina. A estrutura da fibrina fortemente determina a estabilidade mecânica e fibrinolítica do coágulo, e pode apresentar implicações fisiológicas significativas. Os coágulos firmes que são resistentes à fibrinólise são propensos à trombose enquanto que os coágulos frágeis, altamente susceptíveis à fibrinólise, resultam na lise prematura e hemorragias.

[020]A maioria dos estudos de formação de coágulos foi realizada através da adição de uma quantidade fixa de trombina para o fibrinogênio purificado. No entanto, a formação de coágulos in vivo ocorre na presença de concentrações dinâmicas e contínuas de trombina. Estas cinéticas complexas conduzem à arquitetura de fibrina relativamente heterogênea nos coágulos formados durante a geração in situ da trombina, versus a arquitetura da fibra homogênea presente nos coágulos produzidos através da adição da trombina exógena. Além disso, o possível envolvimento de outros componentes do sistema de coagulação, tais como o FXIIa, independentemente da geração da trombina pode apresentar impacto na estrutura dos coágulos de fibrina. Tomados em conjunto, existe uma necessidade para a medição simultânea da geração da trombina e da formação de fibrina / resistência do coágulo.

MÉTODOS DA TÉCNICA ANTERIOR DETERMINAÇÃO DA GERAÇÃO DA TROMBINA NA TÉCNICA ANTERIOR

[021] Uma curva da geração da trombina foi classicamente obtida por meio da determinação do teor de trombina em pequenas subamostras coletadas em intervalos curtos a partir da coagulação do sangue ou do plasma [6, 7]. Este método, em geral, necessita de análise separada das subamostras e permite a determinação de apenas de 3 a 5 curvas simultaneamente pela ocupação contínua de um técnico de laboratório especializado. É tão trabalhoso quanto afastar a sua aplicação na rotina clínica ou farmacêutica.

[022]A patente EP-A-0.420.332 (ou patente US 5.192.689) descreve um método para determinar a quantidade de trombina, que está presente em uma amostra de coagulação do sangue ou do plasma através da medição da quantidade do produto que é produzido a partir de um substrato artificial durante a coagulação. Esta quantidade é proporcional à área sob a curva de geração da trombina, designado como o Potencial Endógeno da Trombina, ETP. O método compreende a adição de um ativador de formação de trombina a uma amostra de coagulação do sangue ou do plasma em conjunto com um substrato de trombina, em que a quantidade e também as propriedades cinéticas do substrato da trombina são selecionadas de tal maneira que a quantidade de trombina gerada na amostra não pode completamente consumir dito substrato de trombina, por conseguinte, produzindo um produto de conversão, medindo a quantidade de dito produto de conversão produzido desta maneira e, a partir deste, determinando o potencial de trombina endógena na amostra. Este método ETP pode ser ilustrado pelas seguintes reações: (1) Fatores de coagulação (de V a XII) ^ protrombinase, através do ativador (2) Protrombina ^ trombina, através da protrombinase (3) Trombina + antitrombóticos ^ os complexos inativos (4) Substrato ^ sinal da molécula, através da trombina

[023]Todas as reações são irreversíveis e, por conseguinte, a trombina apenas está temporariamente presente na mistura de reação. Enquanto a trombina está presente, ela participa na reação 4, com o resultado que o grau de conversão do substrato indica o tempo durante o qual, e o tempo para o qual, a trombina catalisou esta reação.

[024] É essencial que a quantidade de substrato não seja esgotada antes da trombina desaparecer. Para a quantidade de substrato convertido ser uma representação exata da quantidade total de atividade de trombina que foi desenvolvida, a taxa de reação deverá ser proporcional à concentração de trombina em qualquer instante no tempo. A essência deste método ETP é que o potencial de trombina é determinado como um método de ponto terminal sem a determinação da curva de trombina / hora como tal. No caso do substrato ser de medida curta, o ponto terminal simplesmente seria a quantidade máxima do produto formado, e tal figura não possui nenhum significado.

[025]Além disso, o método ETP é realizado na prática com um substrato cromogênico, isto é, os substratos com um grupo de saída cromofórico que é detectado por meio da medição da densidade ótica. O fibrinogênio e, consequentemente, as plaquetas do sangue, precisam ser removidos do plasma uma vez que a turbidez resultante da conversão do fibrinogênio-fibrina pela trombina torna impossível a medição adicional. O fibrinogênio e as plaquetas, no entanto, são componentes essenciais do sistema de coagulação que influenciam o curso de formação da trombina. Isso coloca um limite sério sobre a aplicabilidade da densidade ótica como método de detecção. Consequentemente, a avaliação do ETP no plasma que contém as plaquetas e/ou o fibrinogênio não seria possível.

[026] O monitoramento contínuo da concentração de trombina foi tentado através da adição de um substrato adequado de trombina para a amostra de coagulação e do monitoramento do curso de tempo do aparecimento do produto de separação amidolítico. Por exemplo, um substrato cromogênico é utilizado e a densidade ótica é medida, para monitorar o desenvolvimento de p-nitro-anilina [8, 9]. Se a taxa de reação em tal teste for dependente apenas da concentração de trombina e se o sinal for proporcional à quantidade de produto, por conseguinte, a inclinação da curva do produto seria proporcional à quantidade de trombina presente, de maneira que a curva da geração da trombina possa ser obtida a partir da primeira derivada da curva do produto, se a constante de proporcionalidade (Kc) for conhecida.

[027] Na prática, no entanto, a taxa de reação não é apenas dependente da concentração de trombina, o sinal não é necessariamente proporcional à quantidade do produto e a Kc é desconhecida. As razões são as seguintes:

[028]A: Consumo de substrato: O sinal não é apenas dependente da atividade de trombina na amostra, mas também da quantidade do substrato que, através da atividade da própria enzima, reduz com o tempo. O efeito pode ser atenuado através da adição de um excesso de substrato, mas apenas até um determinado limite. O substrato se liga, de forma reversível, para o centro ativo da trombina e, por conseguinte, protege a inativação da trombina através das antitrombinas naturais. Abolir o efeito do consumo de substrato para um grau aceitável é recompensado por prolongar a experiência para durar cerca de duas horas. (Quanto mais substrato for adicionado, mais moléculas de enzima são ocupadas e não está disponível para os processos da inativação natural. Isso prolonga a duração da experiência. A 1 x Km, a experiência é concluída em 30 minutos, a 5 km, a independência prática do consumo de substrato é obtida, mas a experiência dura 90 min). Além disso, em tais concentrações de substrato, a inibição da trombina interfere com reações de retorno e já não é garantido que o processo natural seja medido. Esta também é a razão pela qual, em um método destinado a avaliar a área sob a curva da quantidade total de substrato convertido, um excesso de substrato precisa ser adicionado de maneira que a antitrombina adicional precisa ser adicionada para tornar a experiência praticamente possível (vide patente EP-A-0.420.332, discutida acima). B: As alterações na densidade ótica ocorrem por meio da coagulação da amostra de plasma: a utilização dos substratos cromogênicos implica na remoção do fibrinogênio e, consequentemente, das plaquetas do sangue, que provoca um aumento espúrio do OD por meio do espalhamento da luz, no momento da coagulação. O fibrinogênio e as plaquetas, no entanto, são componentes essenciais do sistema de coagulação que influenciam o curso de formação da trombina (vide acima). Isso coloca um limite sério em relação à aplicabilidade da densidade ótica como método de detecção. Este problema pode ser contornado através da utilização de um substrato que produz um produto fluorescente [10]. Isto, no entanto, apresenta o seguinte problema: C: Nas medições de fluorescência, o sinal não está linearmente relacionado com a quantidade de produto. Nomeadamente, o sinal fluorescente não é linearmente dependente da concentração do produto fluorescente uma vez que as moléculas fluorescentes absorvem a luz a partir de outras moléculas do produto, o denominado “efeito de filtro interno”. Com os produtos fluorescentes, aumentando as concentrações de substrato para diversas vezes Km, conforme exigido para limitar o efeito do consumo de substrato, automaticamente também aumenta o efeito de filtro interno.

[029] O Problema A é comum a todos os métodos contínuos. O Problema B pode ser contornado utilizando um substrato fluorogênico, mas isso introduz o problema C. D: Mesmo se os problemas de A, B e C não existissem, permanece a questão de estabelecer uma relação relevante entre a taxa de reação para a concentração de trombina, isto é, a determinação da calibração constante Kc. Essa relação varia de configuração experimental para configuração experimental (por exemplo, é diferente em diferentes fluorômetros) e de amostra para amostra (por exemplo, devido às variações da cor do plasma). A adição de uma quantidade padrão conhecida de trombina para a amostra é impossível uma vez que a enzima adicionada vai perturbar as reações fisiológicas. Também é possível adicionar a trombina a uma amostra de não coagulação paralela, uma vez que vai ser inativada no plasma.

[030] Estas desvantagens foram convenientemente evitadas através da medição da concentração de trombina no plasma de coagulação, com ou sem as plaquetas, através do monitoramento da separação de um substrato adequado de sinal e comparando com uma atividade de trombina conhecida constante em uma amostra paralela, conforme descrito no pedido de patente WO 2003/093831. O método se baseia na constatação de que determinadas substâncias exibem uma atividade similar à trombina constante, que pode ser adequadamente utilizado para atribuir valores absolutos (nM) para os primeiros derivados dos sinais obtidos a partir das moléculas que são separadas pela trombina, uma vez que se desenvolve para dentro e desaparece a partir da coagulação do plasma. Um calibrador adequado e particularmente preferido é o complexo irreversível de α2-macroglobulina (também designado no presente como α2M) e a trombina. A ligação da trombina para o α2M torna a trombina imune aos inativadores naturais presentes no plasma, mas deixa intacta a sua capacidade de separar pequenos substratos que após a clivagem liberam uma molécula com propriedades absorção de luz, fluorescência, ou outras propriedades de suporte de sinal.

[031] Mais particularmente, em uma parte da amostra, a geração da trombina (isto é, a coagulação) é desencadeada através de um método conhecido no estado da técnica. Para a outra parte, uma preparação com uma atividade de trombina determinada de forma independente e invariável, de preferência, o complexo α2M-trombina, conforme mencionado acima, é adicionado. A formação de produto é medida nas duas amostras, de preferência, ao mesmo tempo. A quantidade molar exata da trombina presente em qualquer momento na amostra de coagulação é obtida através da comparação do sinal da amostra para o sinal medido a partir da amostra ao qual foi adicionada a preparação, com a atividade da trombina conhecida e invariável, mas em que a formação de trombina não foi desencadeada. As curvas resultantes produzidos através deste método são caracterizadas por parâmetros como o tempo de espera, a área sob a curva, a altura do pico, o declive de inclinação ascendente, o tempo para o pico e ainda todos os parâmetros de uma curva que se assemelha à função matemática T = a.t b.exp-ct (iniciando após um tempo de espera). A concentração de trombina normalmente inicia em zero, aumenta a uma altura de pico normalmente em um valor entre 50 e 500 nanomolar e novamente regressa a zero. O tempo de espera normalmente é um valor entre zero e 20 minutos e é terminado assim que a concentração da trombina é de cerca de acima de 10 nanomolar. Neste momento, também a formação de um coágulo aparece, aa etapa que o pico ocorre alguns minutos mais tarde. Os parâmetros da curva de geração da trombina, também designados como Thrombogram®, uma marca registrada da Synapse BV, são os parâmetros compósitos que são influenciados por um grande conjunto de concentrações e constantes de reação dos fatores de coagulação que interagem. Eles refletem todas as variações dessas variáveis que influenciam a função do sistema hemostático trombótico, uma vez que ocorrem em uma configuração clínica, terapêutica ou outra. Todos os antitrombóticos e todas as doenças relacionadas ao sistema hemostático trombótico medido até o momento possuem a sua influência sobre esses parâmetros. Durante o tratamento antitrombótico ou dos distúrbios da coagulação hemostática de qualquer tipo de tempos de espera e do tempo para o pico, os valores, em geral, são aumentados, a altura e a área sob a curva de pico, em geral, são reduzidas. Por outro lado, sob estados de hipercoagulabilidade estes parâmetros se movem em sentido oposto. Desta maneira, o Trombograma verdadeiramente reflete a capacidade de coagulação de sangue e fornece uma indicação para qualquer risco trombótico ou hemostático.

[032] Utilizando esta análise automatizada trombograma calibrada (CAT) desenvolvida por Hemker e colegas de trabalho, a geração da trombina no plasma é medida com mais precisão. No entanto, o brusco resfriamento variável do sinal fluorescente através da hemoglobina e glóbulos vermelhos das células que sedimentam, agrupam e retraem com o coágulo, pode conduzir a sinais altamente irregulares. Posteriormente, foi demonstrado (publicações WO 2006/117246 e WO 2009/098313), que os problemas ocasionados pelos glóbulos vermelhos do sangue podem ser superados através da dispersão do sangue no suporte de amostras, por conseguinte, criando uma fina camada de sangue. Utilizando a rodamina-110 como um produto de sinalização, um substrato fluorogênico com elevado rendimento quântico, comprimentos de onda de excitação e emissão que possui menos sobreposição com o espectro de absorção da hemoglobina e que não é significativamente consumido ao longo do tempo (submetido para publicação) também aprimorou o sistema.

[033]A Figura 1 mostra a conversão dos dados de fluorescência em bruto (linha pontilhada) para a atividade da trombina para o sangue total CAT. O aumento da intensidade de fluorescência devido à formação de atividade da α2M- trombina foi subtraído a partir da intensidade de fluorescência total (linha tracejada). A primeira derivada desta curva corrigida do tempo de fluorescência e da conversão da intensidade de fluorescência com o calibrador produz uma trombograma com a atividade da trombina, expressa em nM (linha sólida). A partir deste trombograma, os seguintes parâmetros podem ser calculados: potencial de trombina endógena (ETP, área sob a curva; nM.min), tempo de espera (min), pico de trombina (nM) e pico para o tempo de trombina (min).

[034] O pedido de patente WO 2011/094185 se refere ao método básico descrito acima na patente EP-A-0.420.332 e descreve um método para a medição da geração da trombina, em uma amostra de sangue como uma função do tempo, utilizando um fluorômetro aprimorado. Um substrato fluorogênico e um ativador de trombina são adicionados à amostra de sangue para formar uma amostra ativada. A fluorescência é medida com a utilização de um fluorômetro e geração da trombina, assim como uma função do tempo é calculada a partir da fluorescência medida.

[035]A publicação WO 2008/099179 descreve um método para medir as propriedades reológicas da coagulação do sangue, utilizando um reômetro oscilante que compreende uma superfície base e uma superfície oscilante que contém uma abertura para a introdução de uma amostra de sangue. As desvantagens principais do modo de oscilação em comparação ao modo rotativo são: (1) as taxas de cisalhamento extremamente baixas no modo de oscilação, que são mais comparáveis para a medição estática; (2) a duração do teste é de 2 a 3 vezes mais longa que no modo de rotação; no modo de rotação o teste principalmente ocorre em fluxo laminar tal como no corpo humano.

[036]A patente US 6.571.610 descreve um reômetro rotativo que possui um elemento de base com a forma de uma placa e um elemento rotativo com a forma de um cone. Uma abertura para a introdução de uma amostra a ser testada é formado entre o elemento de base e o elemento rotativo. Uma característica importante da geometria de cone e de placa é a taxa de cisalhamento homogênea ou perfil de velocidade linear ao longo da abertura permitindo características de fluxo homogênea no meio e nas bordas da amostra.

DETERMINAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE UM COÁGULO NO ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR

[037]A formação de fibrina pode ser monitorada através da detecção do aumento da viscosidade. Neste método de “detecção de viscosidade”, um elemento magnético é colocado no plasma. Devido à iniciação da reação de coagulação, isto é a formação de fibrina, o movimento do elemento magnético se torna mais lento e a velocidade deste movimento pode ser detectada. As desvantagens deste sistema incluem a produção de resultados variáveis, dependendo do formato dos aglomerados formados de fibrina. Além disso, a coagulação apenas pode ser medida quando a viscosidade alcança um nível específico. Por exemplo, os analisadores de rotina da hemostase determinam a formação de coágulos através da medição das variações de uma amplitude de oscilação da esfera magnética por meio dos sensores indutivos. O movimento da esfera é obtido através de um campo eletromagnético alternado criado por duas bobinas independentes. A amplitude da oscilação continua constante, desde que a viscosidade do fluido circundante seja constante, mas reduz quando a viscosidade do ambiente aumenta. A posição da esfera na cuvete determina o sinal recebido pela bobina receptora. Estas variações do campo magnético determinam a amplitude de oscilação e o tempo de coagulação.

[038] Outra técnica, a tromboelastografia (TEG), mecanicamente pesquisa a formação do coágulo (ou dissolução) em um sistema oscilante [11]. Na TEG convencional, uma taça está em movimento de oscilação em torno de um pino de medição, enquanto que em ROTEM (tromboelastometria de rotação) a taça é fixa e o pino é colocado em movimento de rotação de oscilação. Após o início da formação dos coágulos, os fios de fibrina são formados, resultando em um aumento de torque entre o pino e a taça. Esta mudança de torque pode ser eletronicamente (TEG) ou oticamente (ROTEM) detectada. A mudança viscoelástica após a indução da coagulação, em parte, decorre da malha de fibrina que, em parte, é formada a partir da agregação das plaquetas ativadas, Fator de von Willebrand (VWF) e fibrina. Por conseguinte, é sensível aos níveis de plaquetas e fibrinogênio de coagulação do sangue total. É importante observar que em contraste com muitos dos testes de coagulação convencionais que terminam com a formação dos primeiros fios de fibrina, a TEG continua gerando dados até a eventual lise / retração de coágulos. Por conseguinte, a TEG fornece informações em relação à atividade fibrinolítica e função plaquetária o que, em geral, não está disponível a partir dos testes de coagulação de rotina. Por exemplo, a determinação da alteração na viscoelasticidade pode ser utilizada para avaliar as anomalias qualitativas / quantitativas do Fator de von Willebrand e os defeitos na função das plaquetas resultantes na interação reduzida de VWF com as plaquetas, conforme descrito na patente US 2010/0.273.206 A1. Uma possível desvantagem de TEG é que ela é realizada sob condições de cisalhamento baixo (0,1 por segundo), o que resulta na retenção da massa de glóbulos vermelhos na rede de fibrina, possivelmente interferindo com a difusão dos fios de fibrina ou com interação da fibrina com as plaquetas. Por conseguinte, a TEG deve ser interpretada juntamente com os valores hematócritos da amostra de sangue. Assim como outros métodos in vitro, não pode refletir a contribuição in vivo das células endoteliais ou as forças de cisalhamento do fluxo de sangue no local da formação do coágulo e da fibrinólise [11]. A utilização da fibrina como um indicador para a geração da trombina no sangue total, tal como na TEG, não reflete a capacidade de geração total da trombina nos pacientes, devido ao fato de que o fibrinogênio como um substrato se esgota rapidamente e, por conseguinte, a fibrina medida em TEG apenas informa sobre a geração da trombina em uma fase inicial do processo de coagulação. O tratamento matemático do sinal de TEG com o objetivo de se assemelhar a uma curva de geração da trombina não contribui exceto para a confusão [12, 13].

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[039]A presente invenção se refere a um método que supera as desvantagens do estado da técnica anterior, pelo menos em parte, e que se baseia na medição simultânea da geração da trombina e da formação da fibrina / resistência do coágulo, em uma amostra biológica analisada in vitro. A presente invenção ainda se refere a um método que pode ser aplicado para a medição da geração de outras enzimas ativas proteolíticas em hemostase ou trombose, tal como a plasmina, por conseguinte, permitindo, a medição simultânea da atividade da enzima proteolítica e formação de fibrina / resistência do coágulo.

[040] Esse método em particular fornece um sistema de medição refletindo a atividade enzimática, em particular a atividade da trombina, que ocorre in vivo.

[041]Apesar da forte relação entre a taxa de conversão da trombina e a espessura da fibrina, existem diversas condições em que a fibrina pode ser influenciada de forma independente a partir de trombina, que suportam a necessidade para a detecção simultânea da geração da trombina e formação de fibrina. A presente invenção se refere a um método que permite a medição simultânea de uma atividade proteolítica, em particular a geração da trombina, e a resistência do coágulo em tempo real.

[042]A presente invenção se refere à medição simultânea da geração da trombina e da resistência de um coágulo. A geração da trombina pode ser medida através de um método, de preferência, o método CAT, conforme descrito por Hemker et al., [2] e ilustrado nas páginas e exemplos seguintes. A resistência da coagulação é medida através da detecção da viscosidade aumentada / reduzida utilizando um reômetro especialmente projetado.

[043]A geração da trombina, de preferência, é medida através da detecção da luz fluorescente emitida através de um substrato sensível à trombina. Da mesma maneira como para a detecção da resistência do coágulo, a amostra biológica (de sangue ou de plasma) é aplicada sobre um reômetro que está projetado para ser suficientemente sensível para detectar um aumento da viscosidade devido à formação de fibrina. É importante observar que a utilização deste reômetro especialmente projetado permite a aplicação de diferentes taxas de cisalhamento para a reação de coagulação. Por conseguinte, a presente invenção descreve um método para o estudo da geração da trombina in vitro e resistência do coágulo em condições que se assemelham às taxas de cisalhamento in vivo do fluxo do sangue venoso e arterial, fornecendo informação relevante em relação à função das plaquetas e fibrinólise. A medição simultânea da geração da trombina e da resistência do coágulo possui a vantagem adicional de facilmente determinar a quantidade mínima de trombina necessária para a iniciação de coágulo.

[044]A presente invenção também se refere a um reômetro rotativo para a medição das propriedades, em particular da resistência do coágulo de uma amostra biológica, que compreende um elemento de base e um elemento rotativo que definem entre si uma abertura de medição para a introdução de uma amostra a ser testada, os meios para a medição da velocidade de rotação do elemento rotativo e/ou o torque aplicado ao elemento rotativo, em que dito reômetro compreende um fluorômetro para a quantificação do sinal de fluorescência emitido pela amostra biológica.

[045] Em uma realização particular do reômetro, o elemento rotativo compreende um cone e o elemento de base compreende uma placa, a abertura de medição a ser formada entre a ponta de dito cone e de dita placa. Uma abertura de medição adequada para realizar o método da presente invenção é, por exemplo, entre 10 μm e 2 μm, de preferência, não superior a 100 μm, determinada entre o sistema reômetro de medição (por exemplo, entre a ponta do cone do reômetro) e a placa superior da parte da base do reômetro, ou a superfície da parte inferior de um detentor de amostra.

[046] De preferência, o elemento de base e o suporte da amostra compreendem uma superfície transparente, permitindo a detecção e a quantificação do sinal de fluorescência emitido pela amostra por meio de dita superfície através do fluorômetro. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS - A Figura 1 mostra uma curva típica de geração da trombina no sangue total gerado através da análise à base de CAT de sangue total. - A Figura 2 ilustra uma vista esquemática de um reômetro, de acordo com a presente invenção, que permite a medição simultânea da geração da trombina e da resistência do coágulo. A Figura 3 ilustra uma vista em seção transversal de uma parte de dito reômetro. - A Figura 4 mostra a curva de geração de medição simultânea da trombina e o gráfico da viscosidade obtidos em uma amostra de sangue através de um reômetro especialmente projetado (com o fluorômetro integrado) em modo de oscilação. - A Figura 5 mostra a curva de geração de medição simultânea da trombina e gráfico da viscosidade obtidos em uma amostra plasma pobre em plaquetas (a) e sangue total (b), através de um reômetro especialmente projetado da presente invenção com o fluorômetro integrado. Diferentes taxas de cisalhamento foram utilizadas para simular o fluxo venoso e arterial. - A Figura 6 mostra o efeito do peptídeo de Doolittle na curva de geração de trombina e gráfico da viscosidade no plasma pobre em plaquetas conforme medido por um reômetro especialmente projetado. - A Figura 7 mostra os resultados da geração da trombina de medição simultânea (valores de ETP) e gráfico de viscosidade no defibrinilatado versus o controle de plasma pobre em plaquetas por um reômetro especialmente projetado. - A Figura 8 mostra os dados de fluorescência em bruto da geração de plasmina no plasma pobre em plaquetas, em conjunto com o gráfico da viscosidade de medição simultânea.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[047]A seguir, é fornecida uma descrição típica do sistema hemostático e trombótico para a presente invenção, com ênfase na sua enzima mais importante, a trombina. No entanto, deve ser observado que a presente invenção também se refere a outras enzimas e a outros sistemas fisiológicos, tais como outras enzimas proteolíticas ativadas (fatores) do sistema de coagulação de sangue e plasma incluindo, a plasmina e outros componentes ativados do sistema fibrinolítico no sangue e plasma, e fatores do complemento ativado no sangue e no plasma.

[048] Para a medição simultânea, a geração das enzimas proteolíticas, em particular a geração da trombina, e a resistência do coágulo, a amostra biológica analisada é aplicada sobre um reômetro projetado para permitir a detecção de um aumento da viscosidade devido à formação da fibrina em diversas condições de tensão de cisalhamento, simulando in vivo as condições fisiológicas. O reômetro suportado em ar é suficientemente sensível para detectar um aumento da viscosidade devido à formação de fibrina. A parte inferior transparente do suporte da amostra permite a transferência de luz fluorescente emitida através de um substrato sensível de trombina, facilmente detectável com um fluorômetro embutido.

[049] O método da presente invenção, para a determinação simultânea in vitro, em tempo real do curso da atividade da enzima proteolítica determinada e da resistência do coágulo de fibrina formado em uma amostra biológica, enquanto simula as condições de fluxo de sangue in vivo, compreende as seguintes etapas: (a) desencadear a geração da enzima proteolítica na amostra biológica, para permitir a coagulação em dita amostra biológica e o contato de dita amostra biológica com um substrato de sinal ocasionando um sinal detectável em relação com o produto liberado mediante reação de conversão de dito substrato de sinal com a enzima proteolítica gerada, (b) dispor a mistura da amostra obtida em (a) como uma camada fina e configurar uma abertura de medição, em particular, uma abertura zero, entre o sistema de medição e a mistura obtida em (a) mantida em um recipiente adequado para a medição do sinal detectável obtido mediante reação do substrato de sinal com a enzima proteolítica, (c) aplicar uma força de rotação para a mistura da amostra obtida em (b), por conseguinte, simulando o fluxo do sangue venoso ou arterial de uma condição fisiológica ou clínica determinada in vivo, (d) determinar o curso do tempo do desenvolvimento de sinal detectável na amostra biológica para fornecer os resultados da atividade da enzima proteolítica ao longo do tempo, especialmente como uma curva, (e) em dita amostra biológica desencadeada, monitorar simultaneamente o aumento da viscosidade ao longo do tempo com um reômetro rotativo, como uma medida da formação de fibrina na amostra biológica.

[050] Os termos “geração da enzima proteolítica” e, em particular, os termos “geração da trombina” refletem o aparecimento e desaparecimento da atividade da enzima proteolítica, em particular, a atividade da trombina, ao longo do tempo na amostra biológica desencadeada. Consequentemente, os termos “geração da enzima proteolítica” e “atividade da enzima proteolítica” são utilizados alternadamente.

[051] O termo “tempo real”, conforme utilizado no presente, pretende indicar que o curso da concentração de enzima proteolítica no meio é exibido simultaneamente com a ativação e inativação biológica da amostra que está ocorrendo no vaso de reação.

[052] Conforme utilizado no presente, o termo “substrato de sinal” significa um substrato que é clivado por uma enzima proteolítica gerada na amostra biológica testada presente no meio, a partir de que um grupo de saída é separado que é detectável. Em uma realização particular da presente invenção, o substrato de sinal é um substrato fluorogênico, cujo grupo de saída é detectável através da detecção de fluorescência. Em particular, o “sinal de substrato” é um substrato que é clivado pela trombina. Os substratos fluorogênicos de sinal adequados para a trombina são bem conhecidos para o técnico do assunto e estão especialmente descritos na patente EP 0.420.332 ou na publicação WO 2003/093831.

[053] O termo “camada fina” significa uma camada da amostra analisada que possui uma espessura no intervalo de 0,05 a 5 mm e, em especial, no intervalo de 1 a 3 mm, por exemplo, de 2 mm ou inferior.

[054] De acordo com a presente invenção, a medição da viscosidade como uma determinação da formação de fibrina na amostra biológica e a determinação da geração da enzima proteolítica em dita amostra são consideradas simultâneas uma vez que são realizadas em uma única amostra ou subamostra, por exemplo, em uma recipiente ou suporte de amostra única.

[055] De maneira vantajosa, em uma realização particular da presente invenção, a medição da formação de fibrina e a determinação da geração da enzima proteolítica é realizada utilizando um único aparelho, tal como um reômetro, em particular um reômetro rotativo, de acordo com a presente invenção, que é especificamente projetado para também compreender um fluorômetro.

[056]A amostra analisada é uma amostra biológica que normalmente consiste em sangue, isto é, o sangue total ou um produto derivado do sangue, tal como o plasma, em particular o plasma rico em plaquetas (PRP), o plasma pobre em plaquetas (PPP), ou o plasma sem plaquetas (PFP). O sangue normalmente é coletado em tubos que contêm o citrato de sódio ou o EDTA, ou similar, de maneira que os íons de cálcio livres no sangue estão ligados e a formação de enzima proteolítica, a plasmina ou, em particular, a formação da trombina e da coagulação é evitada durante a coleta e armazenamento das amostras.

[057]A presente invenção fornece a possibilidade de utilizar as amostras biológicas, especialmente as amostras de sangue em um intervalo tão pequeno quanto de 20 a 60μl e até cerca de 1 mL.

[058] De acordo com a presente invenção, o desencadeamento da geração da enzima proteolítica é realizado de uma maneira conhecida, com os fatores de ativação. Os fatores de ativação, também designados ativadores da protease, para a realização do presente método, incluem os fosfolipídios, fator tecidual, em particular, o fator tecidual solúvel, ou fator tecidual humano recombinante, tromboplastina, caulim, e ácido elágico. Dependendo da amostra biológica utilizada, estes podem ser adicionados na primeira subamostra para desencadear a atividade da enzima proteolítica. Eles também, de maneira vantajosa, são adicionados à mistura provocando uma atividade constante da enzima proteolítica conhecida, em particular, a atividade da plasmina ou da trombina. Os fatores de ativação podem ser utilizados com outros componentes necessários ou vantajosos para iniciar as reações de coagulação, tais como os íons de cálcio.

[059] Na verdade, para iniciar as reações que provocam a geração da enzima proteolítica, em particular, a geração da plasmina ou da trombina, o cálcio deve ser adicionado imediatamente antes do início da medição. Em uma realização da presente invenção, conforme ilustrado nos exemplos, o cálcio é adicionado como FluCa, isto é, como uma mistura de substrato fluorogênico e CaCI2. Esta mistura FluCa pode ser preparada conforme descrito nos exemplos. No entanto, no caso do sangue não ser coletado no citrato de sódio, ou similar, esta adição de cálcio pode não ser necessária e o substrato fluorogênico, por conseguinte, é adicionado como uma solução. Este pode ser o caso quando o método é utilizado de uma maneira que torna possível iniciar a experiência dentro de minutos após a tomada de sangue.

[060] Em uma realização particular da presente invenção, o método fornece a determinação simultânea in vitro em tempo real, do curso da atividade da trombina e da resistência do coágulo de fibrina formado.

[061]Quando a enzima proteolítica é a trombina, a atividade da trombina em função do tempo pode ser apresentada como uma curva de TrombogramaTM (TG) que é caracterizada através de uma fase de iniciação que fornece quantidades diminutas de trombina, seguida por uma explosão da atividade. O sangue forma um coágulo no início da explosão e quase toda a trombina é formada após o coágulo ser formado. O TrombogramaTM, por conseguinte, mostra diversas fases, incluindo o tempo de espera, a fase de propagação, o tempo para o pico e a altura de pico e ETP.

[062] O termo “tempo de espera”, conforme utilizado no presente, pretende indicar o tempo (min) que leva antes de se iniciar a formação da trombina.

[063] Conforme utilizado no presente, o termo “altura de pico” (nM) significa a atividade máxima da trombina obtida durante a análise de uma amostra testada.

[064] O termo “tempo para o pico” (min), conforme utilizado no presente, significa o tempo entre o início da reação, e o momento em que o pico é alcançado.

[065] O termo “ETP” (Potencial Endógeno da Trombina), conforme utilizado no presente, significa o tempo integral da curva até o momento (quase) zero, a atividade da trombina é alcançada, o que corresponde à área sob a curva (nM. Min).

[066] O substrato de sinal que é utilizado no presente método, de preferência, é selecionado a partir do grupo de compostos que compreende um grupo de saída, dito grupo de saída fornece um produto de conversão detectável mediante reação de dito composto com a enzima proteolítica formada. Este produto de conversão é determinado através da espectroscopia. Em uma realização particular, o substrato de sinal é um substrato fluorogênico, e o seu grupo de saída emite a fluorescência. Consequentemente, em uma realização particular da presente invenção, dito grupo de saída é um grupo fluorescente. Em uma realização particular da presente invenção para medição da atividade da trombina, o grupo de saída, especialmente o grupo fluorescente está presente em um substrato que é sensível à trombina e é submetido a uma reação de separação do grupo de saída.

[067] Em uma realização particular, o substrato de sinal é um substrato fluorogênico seletivamente hidrolisado pela trombina, que possui uma afinidade de ligação moderada para a trombina e uma constante cinética baixa e, em particular, é um substrato sintético para a trombina, acoplado com uma molécula fluorescente.

[068] Em uma realização particular da presente invenção, o substrato fluorogênico é um oligopeptídeo que possui uma sequência de 2 a 30 resíduos de aminoácidos acoplados com uma molécula fluorescente. Como um exemplo, o oligopeptídeo possui uma lisina ou arginina terminal para acoplar com uma molécula fluorescente.

[069] Um substrato de sinal adequado e preferido para realizar o método da presente invenção, utilizando um detector de fluorescência, no sangue total ou plasma é o (Z-Gly-Gly-Arg)2Rho110, um substrato de trombina com base em rodamina. A rodamina é extremamente útil devido ao seu elevado rendimento quântico, excitação e emissão de comprimentos de onda que possuem menos sobreposição com o espectro de absorção de hemoglobina, e uma vez que não é significativamente consumida durante o tempo da análise.

[070] De maneira alternativa, para as medições de plasma, o Z- Gly-Gly-Arg-AMC (Backen, Suíça) pode ser utilizado como um substrato de trombina, que libera a AMC (7-amino-4-metilcumarina) e é medido por uma configuração de excitação de 390 nm e um filtro de emissão de 460 nm.

[071]Quando a geração da enzima proteolítica medida é a geração de plasmina, o substrato pode ser o dicloreto de bis-(amida CBZ-L- fenilalanil-L-arginina), acoplado à rodamina 110. Outro substrato fluorogênico adequado para a detecção da geração de plasmina é a H-Ala-Leu-Lys-AMC (Stago, França).

[072] Foi descrito na técnica anterior que, no caso particular da medição da geração da trombina, a trombina e o seu substrato não reagem linearmente entre si. Para compensar a não linearidade da taxa de reação da trombina com o seu substrato, dependendo da concentração de trombina na amostra biológica, a medição de uma mistura provoca uma atividade constante e conhecida de trombina é realizada em paralelo sobre uma segunda parte de não coagulação da amostra analisada (segunda subamostra). Esta etapa fornece a calibração para a medição da atividade enzima proteolítica na primeira parte da amostra. A calibração, por conseguinte, é realizada, de maneira vantajosa, quando a atividade da enzima proteolítica medida é a atividade da trombina. Em vez disso, a medição da geração de plasmina pode ser realizada sem uma etapa de calibração.

[073] Consequentemente, em uma realização particular, com o propósito de realizar a presente invenção descrita no presente, incluindo a calibragem da atividade da enzima proteolítica, o método compreende: - uma primeira etapa para dividir a amostra biológica em, pelo menos, duas partes, designadas subamostras, incluindo uma primeira subamostra e uma segunda subamostra, - a realização das etapas de (a) a (e) do método para a detecção simultânea da geração da enzima proteolítica determinada e a formação da fibrina da presente invenção é realizada na primeira subamostra e, - a realização das seguintes etapas na segunda subamostra para a calibração dos resultados de medição da atividade da enzima proteolítica: (f) a adição para uma segunda subamostra de não coagulação, de um composto calibrador que abriga uma atividade estável constante sobre o substrato de sinal para dita enzima proteolítica determinada, dito composto calibrador, de outra maneira, sendo inerte nas reações de coagulação da subamostra (sendo inerte aos agentes fisiológicos de antitrombina no sangue), e o contato da mistura obtida de dito composto calibrador e da segunda subamostra com um substrato de sinal ocasionando um sinal detectável em relação com o produto liberado mediante reação de conversão de dito substrato de sinal com a enzima proteolítica de dita segunda subamostra, (g) a submissão de dita mistura obtida na etapa (f) com a segunda subamostra das etapas (b) e (c), do método da presente invenção, conforme definido no presente, (h) a determinação do curso de tempo do desenvolvimento do sinal detectável na segunda subamostra para fornecer os resultados da atividade da enzima proteolítica ao longo do tempo, especialmente como uma curva; (i) a comparação dos resultados obtidos na etapa (g) para os resultados da atividade da enzima proteolítica obtida na etapa (d) que permite obter os resultados calibrados da atividade da enzima proteolítica no tempo na primeira subamostra, em especial, como uma curva calibrada.

[074] O composto calibrador adequado com uma atividade proteolitica estável e constante conhecida para a realização do método da presente invenção, conforme definido acima, incluem o complexo α2M-trombina (a2-M-T), complexo de estafilocoagulase da protrombina, e trombino intervalo. De maneira alternativa, qualquer enzima proteolítica pode ser utilizada que é modificada nos seus locais de reconhecimento secundários em que o seu centro ativo para a proteólise permanece intacto, mas a sua interação funcional com as proteínas na mistura de reação é suprimida, de maneira que seja considerada como inerte nas reações de coagulação que ocorrem na mistura de reação.

[075] Os métodos e reagentes da presente invenção são adequados para a utilização na medição das propriedades do sangue para formar os coágulos de fibrina e as propriedades do sangue em relação à geração da enzima proteolítica.

[076] Um reômetro, de acordo com uma realização da presente invenção, projetado para realizar a medição da geração da enzima proteolítica e a medição simultânea da resistência do coágulo é mostrado nas Figuras 2 e 3. Dito reômetro compreende uma parte superior (1), que possui um motor (2) de condução de um eixo (3) apoiando um elemento do cone (4) na sua extremidade inferior. A ponta (5) do elemento de cone (4) está orientada para baixo e está virada para uma placa superior (6) de uma parte de base (7). O ângulo θ do cone (4), por exemplo, está entre 0,0° e 5° e, de preferência, é 0,5°.

[077]A parte superior (1) também compreende os meios (8) para a medição da velocidade de rotação do eixo (3) e/ou o torque exercido pelo motor (2) para o eixo (3). Opcionalmente, um capuz escuro (9) é montado de maneira deslizante no eixo (3). Neste caso, a posição do capuz (9) pode ser ajustada através do meio correspondente (10). a posição da parte superior (1) em relação à parte de base (7) é controlada pelos meios (11), para definir a abertura g (abertura de medição) entre a ponta (5) do cone (4) e a placa superior (6) da parte de base (7), ou entre a ponta (5) do cone (4) e a superfície inferior (14') de um suporte (14).

[078] Um fluorômetro (12) está montado na parte de base (7) para quantificar o sinal de fluorescência emitida por uma amostra (13) colocada sobre a placa superior (6). A amostra (13), por exemplo, é inserida em um suporte (14) similar a taça. O suporte (14) e a placa superior (6) são transparentes, pelo menos parcialmente, para permitir a quantificação do sinal de fluorescência emitida pela amostra (13).

[079] Durante uma análise, o suporte de amostra (14) é colocado na placa superior (6) da parte de base (7) e o cone (4) é reduzido através dos meios (11), para ajustar a abertura g. Dita abertura, por exemplo, está entre 10 μm e 2 mm, de preferência, não superior a 100 μm. O capuz (9) também é reduzido para cobrir o suporte de amostra (14), de maneira a evitar qualquer perda do sinal de fluorescência.

[080] Durante a análise, o sinal fluorescente emitido pela amostra (13) também é medido pelo fluorômetro (12), através do suporte (14) e da placa superior (6), a fim de determinar as alterações na concentração de trombina ao longo do tempo.

[081] De acordo com a presente invenção, quando se utiliza o reômetro, a força de rotação aplicada à amostra biológica é selecionada para refletir o sangue em dita configuração vascular. Consequentemente, para a configuração arterial, a taxa de cisalhamento está no intervalo de 800 a 3.000 s-1; em uma configuração venosa, a força de rotação está no intervalo de 50 a 800 s-1. Quando é aplicada uma resistência oscilatória, pode estar em um intervalo de 0,1 s-1 a 300 s-1.

[082] O método da presente invenção é realizado aplicando uma força de rotação para a mistura obtida com a amostra biológica na etapa (a). Através da rotação do sistema de medição, a taxa de cisalhamento do fluxo de sangue venoso e arterial que ocorre in vivo pode ser simulada, permitindo estudar in vitro a coagulação do sangue / lise do coágulo sob o fluxo, tornando a informação sobre a função das plaquetas e fibrinólise em condições que se aproximam mais da situação in vivo.

[083] Consequentemente, a presente invenção fornece os reagentes e os métodos para estudar a hemostase em uma configuração fisiológica para determinar a propensão de coagulação ou em uma configuração patológica, especialmente para determinar ou para monitorar uma condição clínica em um paciente, ou para realizar o planeamento da terapia ou o monitoramento da terapia. Em uma realização particular, os métodos, reagentes e kits da presente invenção são utilizados para a determinação de um risco para enfrentar a trombose ou a hemorragia em um paciente.

[084]A presente invenção, ao fornecer as condições de funcionamento simuladas in vivo no fluxo do sangue pode ser utilizada para estudar diversas configurações vasculares, em particular a arterial, venosa ou microcirculação do tumor.

[085] De acordo com um aspecto particular da presente invenção, dita primeira subamostra da amostra biológica analisada ainda compreende um medicamento ou um agente farmacêutico a ser testado, pela sua influência no sistema proteolítico em estudo, tal como o sistema hemostático-trombótico. Os agentes farmacêuticos adequados que podem ser testados no presente método são os agentes antitrombóticos, tais como os agentes antiplaquetários e agentes anticoagulantes, por exemplo, a heparina, sulfato de dermatan, um inibidor direto da trombina, por exemplo, a hirudina, argatroban, e melagatran ou um inibidor do fator Xa, por exemplo, a proteína anticoagulante de carrapato.

[086] De acordo com outro aspecto da presente invenção, o método é realizado para controlar os efeitos dos medicamentos administrados a um paciente no sistema hemostático-trombótico. Tais medicamentos incluem os medicamentos anticoagulantes, especialmente todos os tipos de heparinas, inibidores diretos da trombina ou outros agentes antitrombódicos tais como os citados acima.

[087]Ao medir a fluorescência na camada fina da amostra biológica formada entre a placa que contém a amostra biológica analisada e o sistema de medição, o efeito do efeito de filtro interno descrito acima é reduzido.

[088]A presente invenção também se refere a um método, conforme definido no presente, quando utilizado: - para detectar ou monitorar o efeito de determinadas substâncias, especialmente um medicamento ou um agente farmacêutico na atividade da trombina e resistência do coágulo em uma amostra biológica, em que dita(s) substância(s) determinada(s) é(são) adicionada(s) à amostra a ser analisada ou é(são) adicionada(s) durante a geração da trombina ou - para monitorar os efeitos dos medicamentos em uma amostra biológica de um paciente em tratamento com este medicamento ou - para rastrear as substâncias para determinar a sua capacidade de interagir com a geração da trombina ou fibrinólise ou coagulação, - para avaliar as deficiências nas moléculas no sistema trombótico ou hemostático, - para determinar a quantidade mínima de trombina necessária para iniciar a iniciação de coágulo.

[089]A presente invenção também se refere a um kit para a determinação do curso da atividade da enzima proteolítica e para a determinação simultânea da resistência do coágulo de fibrina formado em uma amostra biológica, que compreende: - em um suporte de amostras descartável que possui uma superfície da parte inferior transparente, adequado para a utilização em um reômetro rotativo, uma composição de um substrato de sinal ocasionando um sinal detectável em relação com o produto liberado mediante reação de conversão de dito substrato de sinal com a enzima proteolítica gerada na amostra desencadeada e uma composição para desencadear a atividade da enzima proteolítica na amostra, - opcionalmente, um composto composto calibrador que abriga uma atividade enzima proteolítica constante estável no substrato de sinal, - opcionalmente, uma solução tampão adequada para a adição da amostra biológica, tal como o tampão de BSA5, que compreende 20 mM de HEPES e 5 mg/mL de Albumina do Soro de Bovino, a pH = 7,35.

EXEMPLOS

[090]A presente invenção ainda será, no momento, ilustrada pelos Exemplos seguintes que não são para serem interpretados como limitando o âmbito da presente invenção em qualquer aspecto.

EXPERIMENTAL MISTURA DE REAÇÃO

[091] O sangue foi obtido através de punção venosa (1 volume de citrato de trissódio a 0,13 M para 9 volumes de sangue). O fluxo livre ou sucção mínima deve ser empregada, e os recipientes a vácuo são evitados. O plasma pobre em plaquetas (PPP) foi obtido através de duas vezes de centrifugação do sangue em 2.630 g durante 10 min.

[092] O fator de tecido relipidado recombinante (rTF) que não contém o polibreno ou Ca++ foi de Dade Behring (Marburg, Alemanha). Para cada experiência, uma mistura fresca do Fator Tecidual (TF) e as vesículas de fosfolipídios (PL) (Avanti, Alabaster, AL, EUA) foram preparadas, resultando em uma concentração final de 5 pM de TF e 4 μM de PL em tampão Hepes (20 mM, pH 7,35) que contém 5 mg/L de BSA (Sigma, A-7.030). O ativador do plasminogênio tecidual recombinante (tPA) foi obtido a partir de Boehringer Ingelheim GmbH, Alemanha como actylaseTM. O substrato fluorogênico, (Z-Gly- Gly-Arg)2Rho110, foi obtido de Diagnostica Stago (Asnières, França) e utilizado em uma concentração de 300 μM. Após a divisão pela trombina, liberta a rodamina fluorescente (Rho), que é medida por uma configuração de filtro de excitação de 470 nm e de emissão de 520. O substrato fluorogênico de plasmina, H-Ala-Leu-Lys-AMC, foi obtido de Diagnostica Stago e utilizado a uma concentração final de 200 μM. A plasmina liberada fluorescente de 7- amino-4-metilcumarina (AMC) é medida por uma configuração de filtro de excitação de 365 nm e de emissão de 430 nm. Uma mistura fresca de substrato fluorogênico e CaCl2 (FluCa) foi preparada a 37° C para cada experiência, resultando em uma concentração final de 300 μM Rho e 16,7 mM de CaCI2 em tampão Hepes (20 mM, pH 7,35) que contém 60 g/L de BSA.

[093] O calibrador, o complexo α2M-trombina (α2MT), foi preparado em casa, conforme descrito anteriormente [2]. A concentração de α2M-trombina é medida pela sua capacidade para hidrolisar o substrato cromogênico S2238. Esta atividade amidolítica da preparação foi ajustada para possuir na reação final, a mesma atividade como a 100 nM de trombina humana. Após a adição da antitrombina bovina e heparina (LEO), este material estava pronto para a utilização como um calibrador de trombina.

[094] Utilizando um substrato de sinal com um grupo de saída fluorescente, a geração da trombina foi medida por meio de um detector de fluorescência. A resistência do coágulo de fibrina formado foi monitorada através de um sistema de medição de oscilação ou de rotação de um reômetro especialmente projetado (Physica MCR 301, Anton Paar GmbH, Alemanha, Ostfildern).

[095] Um total de 700 μl (no caso do plasma) ou de 800 μl (no caso do sangue), da amostra e do substrato foi adicionado em um suporte para amostras do termostato a 37° C do reômetro. Esta mistura continha (e foi preparada através da adição na seguinte ordem) a amostra (468 μl de plasma ou 700 μl de sangue); a mistura de TF-PL (ou calibrador) (1 16 μl no caso do plasma; 50 μl no caso do sangue) e FluCa (116 μl no caso do plasma; 50 μl no caso do sangue). Imediatamente após a adição de FluCa, a viscosidade (ou o Torque no caso da oscilação do sistema de medição) e a fluorescência foram medidas a cada 10 segundos e a cada segundo a 470/520 nm, respectivamente.

EXEMPLO 1 GERAÇÃO DA TROMBINA EM RELAÇÃO À RESISTÊNCIA DO COÁGULO COM BASE NA DETECÇÃO DA VISCOSIDADE

[096]A geração da trombina foi desencadeada no sangue total, conforme indicado acima, no vidro de um reômetro MCR301 com um fluorômetro embutido. Imediatamente após a adição da solução FluCa, o sistema de medição do reômetro foi ajustado para uma posição de abertura zero e colocado em oscilação, com uma frequência de 10 Hz e um ângulo de 1°. O torque e a fluorescência foram medidos conforme indicado acima, para a amostra desencadeada (primeira parte da amostra, isto é, a primeira subamostra) e para a amostra que contém o calibrador (segunda parte da amostra, isto é, a segunda subamostra). A utilização do calibrador evita a influência dependente do doador do sinal fluorescente através da absorção de luz e resfriamento brusco da fluorescência. Com base na curva do calibrador e após a correção para a α2M-trombina presente na amostra, que ainda é capaz de converter o substrato, a curva de geração da trombina para a amostra desencadeada foi determinada, conforme descrito acima. A média das duas medições é apresentada na Figura 3 (painel superior). A iniciação do coágulo (mostrado como Torque no painel inferior) iniciou no início da geração da trombina. De maneira interessante, através da adição do ativador de plasminogênio de tecido (tPA) em uma concentração de 300 U/mL, a fibrinólise poderia ser seguida na amostra de sangue (inserida).

EXEMPLO 2 GERAÇÃO DA TROMBINA EM RELAÇÃO À FORMAÇÃO DA FIBRINA COM BASE NA DETECÇÃO DA VISCOSIDADE; SIMULAÇÃO DO FLUXO DO SANGUE

[097]A geração da trombina foi desencadeada no plasma pobre em plaquetas ou sangue total, conforme indicado acima, no vidro de um reômetro MCR301 com um fluorômetro embutido. Imediatamente após a adição da solução FluCa, o sistema de medição do reômetro foi ajustado para uma posição de abertura zero e colocado em rotação. Esta rotação do sistema de medição permitiu a simulação do fluxo do sangue, uma taxa de cisalhamento de 100 a 300 / s que corresponde ao fluxo de sangue venoso e, acima de 800 / s para o fluxo de sangue arterial. A viscosidade e a fluorescência foram medidas, conforme indicado acima, para a amostra desencadeada e para a amostra que contém o calibrador. As medições foram realizadas em triplicado e a média é mostrada na Figura 5a (plasma pobre em plaquetas) e 5b (sangue total). No plasma pobre em plaquetas, as taxas de cisalhamento mais elevadas que 100 / s resultaram em uma redução da geração da trombina e resistência do coágulo. O efeito sobre a resistência do coágulo foi repetido no sangue total, porém, o efeito sobre a geração da trombina foi diferente.

EXEMPLO 3 VISUALIZAÇÃO DO EFEITO DO PEPTÍDEO DE DOOLITTLE NA GERAÇÃO DA TROMBINA E RESISTÊNCIA DO COÁGULO

[098]A geração da trombina foi desencadeada no plasma pobre em plaquetas, conforme indicado acima, no vidro de um reômetro MCR301 com um fluorômetro embutido. As concentrações crescentes do peptídeo de Doolittle (Gli-Pro-Arg-Pro), de 0,5 mM a 2 mM, foram adicionadas para a amostra e o calibrador correspondente. O peptídeo de Doolittle se liga com uma elevada afinidade ao fibrinogênio, resultando na inibição da polimerização da fibrina. Imediatamente após a adição da solução FluCa, o sistema de medição do reômetro foi ajustado para uma posição de abertura zero e colocado em rotação, o que resulta em uma taxa de cisalhamento de 300 / s. A viscosidade e a fluorescência foram medidas conforme indicado acima, para a amostra desencadeada e a amostra que contém o calibrador. As medições foram realizadas em duplicado e a média é mostrada na Figura 6. Conforme esperado, as quantidades crescentes do peptídeo de Doolittle significativamente reduziu a viscosidade da amostra em comparação com a amostra de controle (painel superior). O efeito sobre a geração da trombina foi mínimo (painel inferior).

EXEMPLO 4 GERAÇÃO DA TROMBINA E RESISTÊNCIA DO COÁGULO NO CONTROLE VERSUS O PLASMA DEFIBRINILADO

[099]A geração da trombina foi desencadeada no controle e plasma defibrinilado, conforme indicado acima, no vidro de um reômetro MCR301 com um fluorômetro embutido. Imediatamente após a adição da solução FluCa, o sistema de medição do reômetro foi ajustado para uma posição de abertura zero e colocado em rotação, o que resulta em uma taxa de cisalhamento de 300 / s. A viscosidade e a fluorescência foram medidas conforme indicado acima. Os resultados são mostrados na Figura 7. Conforme esperado, o plasma defibrinilado resultou na abolição completa do aumento da viscosidade (painel superior) sem um efeito claro sobre a geração da trombina (descrito como ETP; painel inferior).

EXEMPLO 5 GERAÇÃO DA PLASMINA E RESISTÊNCIA DO COÁGULO NO ATIVATOR DE PLASMINOGÊNIO TECIDUAL - DESENCADEADAS NO PLASMA POBRE EM PLAQUETAS

[0100]A iniciação do coágulo foi desencadeada no plasma pobre em plaquetas, conforme indicado acima, na presença de 100 U/mL de tPA no vidro de um reômetro MCR301 com um fluorômetro embutido. Imediatamente após a adição da solução de substrato de plasmina, que contém o Ca, o sistema de medição do reômetro foi ajustado como a posição da abertura de medição e colocado em rotação (300 / s). A fluorescência e a viscosidade foram medidas conforme indicado acima, para a amostra desencadeada e para a amostra que contém o calibrador. Os dados da fluorescência em bruto e da viscosidade estão indicados no painel superior e inferior da Figura 8, respectivamente. Os resultados indicam claramente a ativação da plasmina por tPA, resultando na degradação de fibrina (redução da viscosidade).

[0101] A presente invenção deste modo oferece um método de teste conveniente para determinar simultaneamente e em tempo real, o curso de uma atividade proteolítica, em particular, a atividade da trombina, e a resistência do coágulo em uma amostra de sangue / plasma. O teste fornece um sinal contínuo, por conseguinte, fornecendo informações mais valiosas e precisas sobre parâmetros, tais como o tempo de espera, a altura de pico e o tempo para pico, em comparação com os métodos que apenas utilizam as determinações de ponto final da quantidade do produto formado. É importante observar que a presente invenção permite as pesquisas in vitro da geração da trombina e da resistência do coágulo em condições que se assemelham in vivo nas taxas de cisalhamento do fluxo venoso e arterial, permitindo as informações valiosas sobre a função das plaquetas e fibrinólise. A simulação das taxas de cisalhamento do fluxo de sangue venoso e arterial é importante, devido ao fato de que um coágulo deve resistir à tensão de cisalhamento no local da lesão.

REFERÊNCIAS

[0102] (1) Konings J, Govers-Riemslag JW, Philippou H, Mutch NJ, Borissoff Jl, Allan P, Mohan S, Tans G, Ten Cate H, Ariens RA. Factor Xlla regulates the structure of the fibrin clot independently of thrombin generation through direct interaction with fibrin. Blood. 201 1; 1 18: 3.942-51.

[0103] (2) Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R, T Lecompte, Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003; 33: 4-15.

[0104] (3) Beguin S, Kumar R. Thrombin, fibrin and platelets: a resonance loop in which von Willebrand factor is a necessary link. Thromb Haemost. 1997; 78: 590-4.

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[0107] (6) Biggs R, Macfarlane G. Human blood coagulation and its disorders. Oxford: Blackwell Scientific, 1953.

[0108] (7) Seegers WH. Prothrombin. Cambridge, Mass,: Publicado pela Commonwealth Fund pela Harvard University Press, 1962.

[0109] (8) Hemker HC, Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential. Thromb Haemost. 1995; 74: 134-8.

[0110] (9) Hemker HC, Wielders S, Kessels H, Beguin S. Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb Haemost. 1993; 70: 617-24.

[0111] (10) Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Beguin S. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb Haemost. 2000; 83: 589-91.

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[0113] (12) Rivard GE, Brummel-Ziedins KE, Mann KG, Fan L, Hofer A, Cohen E. Evaluation of the profile of thrombin generation during the process of whole blood clotting as assessed by thrombelastography. J Thromb Haemost. 2005; 3: 2.039-43.

[0114] (13) Sorensen B, Johansen P, K Christiansen, Woelke M, Ingerslev J. Whole blood coagulation thrombelastographic profiles employing minimal tissue factor activation. J Thromb Haemost. 2003; 1: 551-8.

Claims (17)

1. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA IN VITRO EM TEMPO REAL DO CURSO DA ATIVIDADE DA ENZIMA PROTEOLÍTICA E DA RESISTÊNCIA DO COÁGULO DE FIBRINA formado em uma amostra biológica, enquanto simula as condições de fluxo de sangue in vivo, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) desencadear a geração da atividade da enzima proteolítica na amostra biológica para permitir a coagulação em dita amostra biológica e o contato de dita amostra biológica com um substrato de sinal ocasionando um sinal detectável relacionado com o produto de conversão liberado mediante reação de dito substrato de sinal com a enzima proteolítica gerada, (b) dispor a mistura da amostra obtida em (a) como uma camada fina e configurar uma abertura de medição, em particular, uma abertura zero entre o sistema de medição e a mistura obtida em (a) mantida em um recipiente adequado para a medição do sinal detectável obtido mediante reação do substrato de sinal com a enzima proteolítica, (c) aplicar uma força de rotação para a mistura da amostra obtida em (b), por meio da qual simulando o fluxo do sangue venoso ou arterial in vivo de uma condição fisiológica ou clínica determinada in vivo, (d) determinar o curso do tempo do desenvolvimento de sinal detectável na amostra biológica para fornecer os resultados da atividade da enzima proteolítica ao longo do tempo, especialmente como uma curva, (e) em dita amostra biológica desencadeada, monitorar simultaneamente o aumento da viscosidade ao longo do tempo com um reômetro rotativo, como uma medida da formação de fibrina na amostra biológica.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma etapa inicial de divisão da amostra biológica em pelo menos duas partes, subamostras designadas incluindo uma primeira subamostra e uma segunda subamostra, e em que as etapas de (a) a (e), conforme definidas na reivindicação 1, são executadas na primeira subamostra e as etapas seguintes são realizadas na segunda subamostra para a calibração dos resultados de medição da atividade da enzima proteolítica determinada: (f) a adição à segunda subamostra de não coagulação, de um composto calibrador que abriga uma atividade estável constante sobre o substrato de sinal para dita enzima proteolítica determinada, dito composto calibrador, de outra maneira, sendo inerte nas reações de coagulação da subamostra, e o contato da mistura obtida de dito composto calibrador e da segunda subamostra com um substrato de sinal ocasionando um sinal detectável relacionado ao produto de conversão liberado mediante reação de dito substrato de sinal com a enzima proteolítica de dita segunda subamostra, (g) a submissão de dita mistura obtida na etapa (f) com a segunda subamostra às etapas (b) e (c) do método da presente invenção, conforme definido no presente, (h) a determinação do curso de tempo do desenvolvimento do sinal detectável na segunda subamostra para fornecer os resultados da atividade da enzima proteolítica ao longo do tempo, especialmente como uma curva; (i) a comparação dos resultados obtidos na etapa (g) aos resultados da atividade da enzima proteolítica obtida na etapa (d) para derivar os resultados calibrados da atividade da enzima proteolítica no tempo na primeira subamostra, em particular como uma curva calibrada.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por uma força de oscilação ser aplicada sobre a mistura obtida na etapa (b) em adição à força de rotação.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela amostra biológica ser selecionada a partir do grupo que consiste em sangue total, plasma rico em plaquetas, plasma pobre em plaquetas e plasma sem plaquetas.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela atividade proteolítica ser selecionada a partir do grupo que consiste em atividade de fator de coagulação ativado, atividade do fator fibrinolítico ativado e componente ativado da atividade do sistema do complemento.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela atividade da enzima proteolítica ser a atividade da trombina.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo substrato de sinal ser selecionado a partir do grupo que consiste em compostos que compreendem um grupo de saída, seletivamente liberado como um produto de conversão detectável mediante reação do substrato de sinal com a enzima proteolítica formada.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo substrato de sinal ser um substrato fluorogênico seletivamente hidrolisado pela trombina, que possui uma afinidade de ligação moderada para a trombina e uma constante cinética baixa e, especialmente, ser um substrato sintético para a trombina, acoplado com uma molécula fluorescente.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo substrato fluorogênico ser um oligopeptídeo que possui uma sequência de 2 a 30 resíduos de aminoácidos acoplados com uma molécula fluorescente.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo oligopeptídeo possuir uma lisina ou arginina terminal para o acoplamento com uma molécula fluorescente.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo substrato de sinal ser (Z-Gly-Gly-Arg)2Rho110 ou Z-Gly- Gly-Arg-AMC.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo ativador da protease que desencadeia a amostra biológica ser selecionado a partir do grupo que consiste em fosfolipídios, fator tecidual, fator de tecido solúvel, tromboplastina, caulim e ácido elágico e o reagente que provoca a reação de coagulação ser o íon de cálcio.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser utilizado para a detecção ou monitoramento da hemostase ou doença trombótica.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser quando utilizado: - para detectar ou monitorar o efeito de determinadas substâncias, especialmente um medicamento ou um agente farmacêutico na atividade da trombina e resistência do coágulo em uma amostra biológica, em que dita(s) substância(s) determinada(s) é(são) adicionada(s) à amostra a ser analisada ou é(são) adicionada(s) durante a geração da trombina ou - para monitorar os efeitos dos medicamentos em uma amostra biológica de um paciente em tratamento com este medicamento ou - para rastrear as substâncias para determinar a sua capacidade de interagir com a geração da trombina ou fibrinólise ou coagulação, - para avaliar deficiências nas moléculas no sistema trombótico-hemostático ou - para determinar a quantidade mínima de trombina necessária para iniciar a iniciação de coágulo.

15. REÔMETRO ROTATIVO para a medição de propriedades, em particular da resistência do coágulo, de uma amostra biológica, caracterizado por compreender (a) um elemento de base (6) compreendendo uma placa (14’) e (b) um elemento rotativo (4) compreendendo um cone (4), os ditos elemento de base (6) e elemento rotativo (4) definindo entre si um intervalo de medição (g) sendo formado entre a ponta (5) do dito cone (5) e dita placa (14’) para a introdução de uma amostra (13) a ser testada, meios (8) para a medição da velocidade de rotação do elemento rotativo (4) e/ou o torque aplicado ao elemento rotativo (4), em que dito reômetro compreende ainda um fluorômetro (12) para a quantificação do sinal de fluorescência emitido pela amostra biológica (13), em que o elemento de base (6) compreende uma superfície transparente (7, 14) permitindo a detecção e quantificação do sinal de fluorescência emitido pela amostra (13) por meio da dita superfície (7, 14) pelo fluorômetro (12) localizado por baixo da dita superfície (7, 14).

16. REÔMETRO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelos materiais poderem ser colocados para estudar o seu efeito sobre a coagulação do sangue para estudar a sua biocompatibilidade.

17. USO DE UM REÔMETRO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado por ser em um método para a determinação simultânea in vitro em tempo real do curso da atividade da enzima proteolítica e da resistência do coágulo de fibrina formado em uma amostra biológica, enquanto simula as condições de fluxo de sangue in vivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

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