JP2015521738A - 血漿及び全血中のトロンビン産生と血餅強度との同時測定 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血漿若しくは全血、又は血液に由来する任意の適切な生物学的試料中の、タンパク質分解酵素産生と血餅強度との同時測定に関する。この測定方法は、標的とするタンパク質分解酵素との反応時に放出され得る部分を含む検出可能な基質の使用、並びに血餅強度の粘度の増大の測定のための手段を包含する。
(トロンビン産生の機構)
血漿におけるトロンビン産生の機構は、次の通りに例示することができる。組織因子(TF)は、血管壁内に、独占的にではないが豊富に存在する。血管が損傷すると、血液が組織に入り、血漿タンパク質第VIIa(VIIa)因子が、TFと相互作用することができる。これが、血漿タンパク質と血小板との間の複雑な一連の相互作用を誘発し、時間も空間も限られたままである、トロンビンの一過性の爆発的増大をもたらす。したがって、創傷は出血を止めるが、凝血は、体の残りの部分には伝播しない。
溶解に比較的抵抗性のあるフィブリン血餅の形成は、組織損傷の修復をもたらす、血液凝固における最終ステップに相当する。血餅形成の複雑なプロセスは、フィブリノゲンからのフィブリノペプチドA及びBとして公知であるN末端ペプチドの切断によって開始される。これらの活性化されたフィブリノゲン分子は、フィブリンとフィブリノゲン分子(フィブリンモノマー)との可溶性の複合体を形成することができる。持続性のトロンビン活性の場合、可溶性のフィブリンの濃度は上昇し、長い二本鎖の原線維を形成する。その後、これらの原線維は、横方向に結びついて、様々な直径のフィブリン線維を形成し、可溶性のフィブリンが重合して、共有結合した重合した不溶性のフィブリンとなる。
(従来技術におけるトロンビン産生の決定)
トロンビン産生曲線は、伝統的に、凝血中の血液又は血漿から短い間隔で採取される少量の副次試料中のトロンビン含有量の決定を介して得られていた[6、7]。この方法は、一般に、副次試料の別々の分析を必要とし、熟練の実験室研究者の継続的従事により、わずか3〜5の曲線の決定だけが同時に可能である。非常に集約的な労働なので、臨床的又は医薬的な日常業務においては、その適用は排除される。
1)凝固因子(V〜XII)→プロトロンビナーゼ(活性化因子による)
2)プロトロンビン→トロンビン(プロトロンビナーゼによる)
3)トロンビン+抗血栓物質→不活性な複合体
4)基質→シグナル分子(トロンビンによる)。
フィブリン形成は、粘度の増大の検出によってモニタリングすることができる。この「粘度検出」方法では、磁気エレメントが、血漿内に配置される。凝血反応、すなわちフィブリン形成の開始により、磁気エレメントの動きがゆっくりになり、この動きの速度を検出することができる。このシステムの欠点としては、形成されたフィブリン塊の形状に依存する、変動する結果が生じることが挙げられる。さらに、凝血は、粘度が特定の水準に到達した時のみ測定することができる。例えば、日常の止血分析器は、誘導センサーを介する磁気球振動振幅の変動を測定することによって、血餅形成を決定する。この球の動きは、2つの独立したコイルによってもたらされる交流電磁場によって得られる。振動振幅は、周囲流体の粘度が一定である限りは一定のままであるが、環境粘度が増大する場合には減少する。キュベット内の球の位置は、受信コイルによって受信されるシグナルを決定する。これらの磁場変動は、振動振幅及び凝血時間を決定する。
好ましくは、基本エレメント及び試料ホルダーは、試料によって放射される蛍光シグナルの、その表面を通した蛍光光度計による検出及び数量化を可能にする、透明な表面を備える。
止血及び血栓形成システムの以下の典型的な説明では、その最も重要な酵素、トロンビンを重視しながら、本発明について考慮されている。しかし、本発明はまた、他の酵素、及び他の生理学的システム、例えば、プラスミン及び血液及び血漿中の線維素溶解システムの他の活性化された成分を含めた、血液及び血漿中の凝血システムの他の活性化されたタンパク質分解酵素(因子)、並びに血液及び血漿中の活性化された補体因子にも関することに留意するべきである。
a)生物学的試料における凝血を可能にするように、前記生物学的試料におけるタンパク質分解酵素産生を誘発することと、前記生物学的試料を、産生されたタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物と関連する検出可能なシグナルを引き起こす前記シグナル基質と接触させることと、
b)a)で得られた試料混合物を薄層として広げることと、測定システムと、シグナル基質とタンパク質分解酵素との反応後に得られた検出可能なシグナルの測定に適した容器内に保持された、a)で得られた試料混合物との間の測定ギャップ、特にゼロギャップを設定することと、
c)b)で得られた試料混合物に回転力を適用し、それによって、決定されたインビボでの生理学的又は臨床的状態の静脈又は動脈血流をシミュレーションすることと、
d)生物学的試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
e)前記誘発された生物学的試料に関して、回転式レオメーターを用いて、経時的な粘度の増大を、該生物学的試料におけるフィブリンの形成の測定と同時にモニタリングすること。
-生物学的試料を、第1の副次試料と第2の副次試料を含めた、副次試料と呼ばれる少なくとも2つの部分に分割する最初のステップと、
-決定されたタンパク質分解酵素産生とフィブリン形成との本発明の同時検出の方法のステップa)からe)を実施することが、第1の副次試料に対して実施されることと、
-タンパク質分解酵素活性の測定の結果の較正のために、第2の副次試料に対して以下のステップを実施すること:
f)凝血しない第2の副次試料に、前記決定されたタンパク質分解酵素のためのシグナル基質に対する一定の安定した活性を有するか、又は副次試料の凝血反応においては不活性である(血液中の生理学的抗トロンビン剤に対して不活性である)較正化合物を添加することと、前記較正化合物と第2の副次試料との得られた混合物を、シグナル基質と前記第2の副次試料のタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質と接触させることと、
g)第2の副次試料との、ステップf)で得られた前記混合物を、本明細書で定義した発明の方法のステップb)及びc)にかけることと、
h)第2の副次試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
i)ステップg)で得られた結果を、ステップd)で得られたタンパク質分解酵素活性の結果と比較して、第1の副次試料における時間内のタンパク質分解酵素活性の較正された結果を、特に、較正された曲線として得ること。
-決定された物質、特に薬物又は医薬品の、生物学的試料中のトロンビン活性及び血餅強度に対する効果を検出する又はモニタリングするために(ここでは、前記決定された物質(1又は複数)は、分析されることとなる試料に添加される、又はトロンビン産生中に添加される)、又は
-薬物の、この薬物で治療中の患者の生物学的試料に対する効果をモニタリングするために、又は
-物質をスクリーニングして、該物質のトロンビン産生又は線維素溶解又は凝血との相互作用能力を決定するために、
-止血-血栓形成システムにおける分子の欠乏を評価するために、又は
-血餅開始を開始するのに必要なトロンビンの最小量を決定するために。
-回転式レオメーター上での使用に適した透明な底面を有する使い捨ての試料ホルダー中の、シグナル基質と、誘発された試料中で産生されるタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質の組成物、並びに該試料中のタンパク質分解酵素活性を誘発するための組成物、
-任意に、シグナル基質に対する一定の安定したタンパク質分解酵素活性を有する較正化合物、
-任意に、生物学的試料への添加に適した緩衝液、例えば、20mM HEPES及びウシ血清アルブミン5mg/mlを含む、pH=7.35のBSA5緩衝液。
(反応混合物)
(粘度検出に基づく血餅強度と関連するトロンビン産生)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに全血中で誘発した。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、10Hzの頻度及び1°の角度で振動にかけた。誘発された試料(試料の第1の部分、すなわち、第1の副次試料)と、較正物質を含有する試料(試料の第2の部分、すなわち、第2の副次試料)との両方について、トルク及び蛍光を、先に示した通りに測定した。較正物質の使用によって、蛍光の光の吸収及び消光による、蛍光シグナルのドナー依存性の影響が防げられる。依然として基質を変換する能力がある、試料中に存在するα2M-トロンビンの補正後、較正物質曲線に基づいて、先に記載した通りに、誘発された試料についてのトロンビン産生曲線を決定した。2回の測定の平均を、図3(上のパネル)に示す。血餅開始(下のパネルにおいてトルクとして示される)は、トロンビン産生の最初に既に始まっている。興味深いことに、300U/mlの濃度の組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)を添加することによって、血液試料(内線)中で線維素溶解を起こすことができた。
(粘度検出;血流のシミュレーションに基づくフィブリン形成と関連するトロンビン産生)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに乏血小板血漿又は全血中で誘発した。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、回転を施した。測定システムのこの回転は、血流のシミュレーションを可能にし、100〜300/sのずり速度は、静脈血流に、800/s超のずり速度は動脈血流に相当する。誘発された試料と、較正物質を含有する試料との両方について、粘度及び蛍光を、先に示した通りに測定した。測定は3連で行い、平均を図5a(乏血小板血漿)及び5b(全血)に示す。乏血小板血漿では、100/sよりも大きいずり速度は、トロンビン産生及び血餅強度の低下をもたらした。血餅強度に対する効果は、全血で繰り返されたが、トロンビン産生に対する効果は、異なっていた。
(トロンビン産生及び血餅強度に対するDoolittleペプチドの効果の視覚化)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに乏血小板血漿中で誘発した。この試料及び対応する較正物質に、0.5mMから2mMまでの漸増濃度のDoolittleペプチド(Gly-Pro-Arg-Pro)を添加した。Doolittleペプチドは、高親和性でフィブリノゲンと結合し、フィブリン重合の阻害がもたらされる。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、回転を施し、300/sのずり速度をもたらした。誘発された試料と、較正物質を含有する試料との両方について、粘度及び蛍光を、先に示した通りに測定した。測定は2連で行い、平均を図6に示す。予想通り、漸増量のDoolittleペプチドは、対照試料と比較して、試料の粘度を有意に低下させた(上のパネル)。トロンビン産生に対する影響は最小限であった(下のパネル)。
(対照-対-脱フィブリン化血漿におけるトロンビン産生及び血餅強度)
(組織プラスミノゲン活性化因子によって誘発された乏血小板血漿におけるプラスミン産生及び血餅強度)
(参考文献)
Claims (19)
- 生物学的試料中の、タンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度との、インビボでの血流条件をシミュレーションしながらのリアルタイムでのインビトロ同時決定のための方法であって、以下のステップを含む、前記方法:
a)生物学的試料における凝血を可能にするように、該生物学的試料におけるタンパク質分解酵素産生を誘発することと、該生物学的試料を、産生されたタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物と関連する検出可能なシグナルを引き起こすシグナル基質と接触させることと、
b)a)で得られた試料混合物を薄層として広げることと、シグナル基質とタンパク質分解酵素との反応後に得られた検出可能なシグナルの測定に適した容器内に保持された、a)で得られた試料混合物との間の測定ギャップ、特にゼロギャップを設定することと、
c)b)で得られた試料混合物に回転力を適用し、それによって、決定されたインビボでの生理学的又は臨床的状態の静脈又は動脈血流をシミュレーションすることと、
d)生物学的試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
e)前記誘発された生物学的試料に関して、回転式レオメーターを用いて、経時的な粘度の増大を、該生物学的試料におけるフィブリンの形成の測定と同時にモニタリングすること。 - 決定されたタンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度とを、リアルタイムで決定するための請求項1記載の方法であって、前記生物学的試料を、第1の副次試料と第2の副次試料を含めた、副次試料と呼ばれる少なくとも2つの部分に分割する最初のステップを含み、かつ請求項1のステップa)からe)が、第1の副次試料に対して実施され、かつ決定されたタンパク質分解酵素活性の測定結果の較正のために、第2の副次試料に対して以下のステップが実施される、前記方法:
f)凝血しない第2の副次試料に、前記決定されたタンパク質分解酵素のためのシグナル基質に対する一定の安定した活性を有するか、又は副次試料の凝血反応においては不活性である較正化合物を添加することと、該較正化合物と第2の副次試料との得られた混合物を、シグナル基質と該第2の副次試料のタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質と接触させることと、
g)第2の副次試料との、ステップf)で得られた前記混合物を、本明細書で定義した発明の方法のステップb)及びc)にかけることと、
h)第2の副次試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
i)ステップg)で得られた結果を、ステップd)で得られたタンパク質分解酵素活性の結果と比較して、第1の副次試料における時間内のタンパク質分解酵素活性の較正された結果を、特に、較正された曲線として得ること。 - ステップb)で得られた混合物に、回転力に加えて振動力が適用される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記生物学的試料が、全血、多血小板血漿、乏血小板血漿、及び無血小板血漿からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質分解活性が、活性化された凝固因子活性、活性化された線維素溶解因子活性、及び補体系活性の活性化された成分からなる群から選択される、請求項1及び2記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素活性が、トロンビン活性である、請求項1から5のいずれか一項記載の方法。
- 前記シグナル基質が、該シグナル基質と形成されたタンパク質分解酵素との反応時に、検出可能な変換生成物として選択的に放出される脱離基を含む化合物からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項記載の方法。
- 前記シグナル基質が、トロンビンに対する中程度の結合親和性及び動力学定数を有する、トロンビンによって選択的に加水分解される蛍光発生基質であり、かつ、特に、蛍光分子と結合された、トロンビンに対する合成の基質である、請求項7記載の方法。
- 前記蛍光発生基質が、蛍光分子と結合された、2から30個のアミノ酸残基の配列を有するオリゴペプチドである、請求項9記載の方法。
- 前記オリゴペプチドが、蛍光分子と結合するための末端リシン又はアルギニンを有する、請求項10記載の方法。
- 前記シグナル基質が、(Z-Gly-Gly-Arg)2Rho110又はZ-Gly-Gly-Arg-AMCである、請求項11記載の方法。
- 前記生物学的試料を誘発するプロテアーゼ活性化因子が、リン脂質、組織因子、可溶性の組織因子、トロンボプラスチン、カオリン、及びエラグ酸からなる群から選択され、かつ、凝血反応を誘発する試薬が、カルシウムイオンである、請求項1から11のいずれか一項記載の方法。
- 止血又は血栓形成疾患を検出する又はモニタリングするために使用される場合の、請求項1から12のいずれか一項記載の方法。
- 以下のために使用される場合の、請求項1から13のいずれか一項記載の方法:
-決定された物質、特に薬物又は医薬品の、生物学的試料中のトロンビン活性及び血餅強度に対する効果を検出する又はモニタリングする(ここで、該決定された物質は、分析される試料に添加される、又はトロンビン産生中に添加される)、又は
-薬物の、この薬物で治療中の患者の生物学的試料に対する効果をモニタリングする、又は
-物質をスクリーニングして、該物質のトロンビン産生又は線維素溶解又は凝血との相互作用能力を決定する、
-止血-血栓形成システムにおける分子の欠乏を評価する、又は
-血餅開始を開始するのに必要なトロンビンの最小量を決定する。 - タンパク質分解酵素活性の推移の決定のための、及び、生物学的試料中の形成されたフィブリン血餅の強度の同時決定のためのキットであって、以下を含む、前記キット:
-回転式レオメーター上での使用に適した透明な底面を有する使い捨ての試料ホルダー中の、シグナル基質と、誘発された試料中で産生されるタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質の組成物、並びに該試料中のタンパク質分解酵素活性を誘発するための組成物、
-任意に、該シグナル基質に対する一定の安定したタンパク質分解酵素活性を有する較正化合物、及び
-任意に、適切な緩衝液。 - 試験される試料(13)の導入のための、基本エレメント(6)及び回転エレメント(4)、これらの間隔を決定付ける測定ギャップ(g)、回転エレメント(4)の回転速度を測定するための手段(8)、及び/又は、回転エレメント(4)に適用されるトルクを備える、生物学的試料の特性、特に血餅強度を測定するための回転式レオメーターであって、生物学的試料(13)によって放出される蛍光シグナルを数量化するための蛍光光度計(12)を備える、前記レオメーター。
- 前記回転エレメントが、円錐体(4)を備え、前記基本エレメントが、プレート(14’)を備え、前記測定ギャップ(g)が、該円錐体(4)のチップ(5)と該プレート(14’)との間に形成される、請求項16記載の回転式レオメーター
- 前記基本エレメント(7)が、試料(13)によって放出される蛍光シグナルの、その表面(7、14)を通した蛍光光度計(7)による検出及び数量化を可能にする、透明な表面(7、14)を備える、請求項17又は18記載の回転式レオメーター。
- 材料を配置して、血液凝固に対する該材料の効果を研究し、該材料生体適合性を研究することができる、請求項16又は17記載の回転式レオメーター。
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