JPH08510908A - フィブリノーゲン測定を正確、迅速かつ簡単に行うための改良方法及び分析システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乾式試薬化学を回転磁界と一緒に使用し、産業界に於いて最高峰であるフィブロメーターと優れた相関を有する定量的フィブリノーゲン測定を行う方法を提供する。更に、この測定を行うための装置、定性的フィブリノーゲン測定及び定量的フィブリノーゲン測定で使用するための較正曲線の作成方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 フィブリノーゲン測定を正確、迅速かつ簡単に行うための 改良方法及び分析システム技術分野 本発明はフィブリノーゲン測定を行うための改良された方法及び改良された分 析システムに関する。背景技術 臨床測定として用いられる血液凝固反応では、典型的にフィブリンクロットの 形成に必要な時間を測定する。血液凝固測定は基本的に抗凝血治療を受けている 患者を選別し、診断しそして監視するために用いられる。 多くの種類の凝固測定法が存在している。これらには、プロトロンビン時間（ ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチ ン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン測定（即ち、検体中の凝固性フィブリノ ーゲンの濃度の測定）、トロンビン時間（トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）として も知られている）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）等々が含まれる。これらの測定の うちで最もしばしば行われるものはプロトロンビン時間の測定である。 血漿中の凝固性フィブリノーゲンの濃度の決定は、患者の凝固障害の究明にと って重要である。免疫学的方法及び凝固試験の両方がフィブリノーゲンを決定す るために使用されてきた。免疫学的方法は重大な診断上の欠点を示し、結局実際 的な重要性を有しなかった。 凝固試験に於いて、フィブリノーゲン含有量は凝塊の形成に必要な時間によっ て決定される。この方法の中で最も重要なものはクラウス（Clauss）の方法であ る（Acta Haemat．1957年、17巻、237-246頁参照）。 このクラウス法に於いては、希釈した血漿、即ち弱いフィブリノーゲン溶液を 、トロンビンの量が血漿の約１００Ｕ／ｍＬである濃縮トロンビン溶液と混合す る。典型的には、２体積のフィブリノーゲンを含有する希釈検体を、１体積の１ ００ Ｕ／ｍＬの濃縮トロンビン溶液に添加する。較正曲線を用いて、検体のフィブリ ノーゲン含有量を凝塊の目に見える出現に要した時間に対して相関付ける。凝固 過程の間の濁りの形成を光度測定法で記録する凝固試験も公知である。例えば、 Ratge等の報文（Clin．Chem．1987年、33巻(3)、420頁）を参照されたい。 最後に、形成された凝塊を単離し、そのタンパク質含有量を決定する定量方法 も知られている。この方法では、検体をトロンビンと反応させて、凝塊を形成さ せ、単離し、洗浄し次いで乾燥させる。次いで、凝塊のタンパク質含有量又はそ の重量を決定する。 Levine他の米国特許第5,137,832号には、遠心分離、加熱及び再遠心分離によ って管内に入っている浮遊体の上部のフィブリノーゲン富化溶液の帯域を層形成 することによる全血検体中のフィブリノーゲンの定量方法が開示されている。Be cker他の米国特許第4,692,406号には、血漿中のフィブリノーゲン及びフィブリ ノーゲン分裂生成物の同時決定法が開示されている。この方法ではトロンビン様 活性を有するヘビ毒液酵素が使用される。この方法に於いては、フィブリノーゲ ン分裂生成物の量の尺度である、酵素の添加と濁り形成の開始との間の時間を測 定する。次いで濁り形成の速度を測定して、検体中に存在するフィブリノーゲン の量を決定する。 プロトロンビン時間試験及び活性化部分トロンボプラスチン時間試験はそれぞ れ一般に、クロットを形成する患者の能力を決定するために臨床検査で用いられ ている。これらの試験及び前記のその他の試験は、術前評価のために及び数ある 患者の中で特に心臓患者に施される抗凝固療法のために病院、診療所及び検査室 で用いられている。これらの試験はそれぞれ時間測定に基づいており、大部分は フィブリノーゲンが重合してフィブリンになるとき生じる、終点又は凝固時間と 呼ばれているものを測定する。 これらの種類の測定の多くは反応を測定するために検体の光学濃度の変化をモ ニターするものである。例えば、Natelson他（Am．J．Clin．Path．1974年、61 巻(6)、828-833頁）、Lipscomb（米国特許第4,720,787号）、salto他（米国特許 第4,217,107号）、Baughman他（米国特許第4,289,498号）、Gross他（米国特許 第3,458,287号）、Eichelberger他（米国特許第4,047,890号）、Becker他（米国 特許第4,692,406号）、Callahan他（「ＰＴ凝固反応からの半定量的フィブリノ ーゲン決定」（Semiquantitative Fibrinogen Determination from the PT Clot ting Reaction）、Tech．Bulletin THR8804、著作権:1988年、Organon Teknika ，Durham，North Carolina,USA）及びCarroll他（「凝固試験に於けるクロット 特徴及び新しい様相」（The Clot Signature and New Aspects in Coagulation Testing）、1989年7月、Ortho Diagnostic Systems Inc.，Raritan,New Jersey ）を参照されたい。 前記のクラウス法に於けるように凝固速度によって測定することに加えて、Ve rmylen他（Clin．Chem．Acta 1963年、8巻、418-24頁）により修正されたクラウ ス法に於けるような凝固速度により、Rampling他（C1in．Chem．Acta 1976年、6 7巻、43頁）の亜硫酸塩沈殿により、Ratnoff他（J．Lab．Clin．Med．1951年、3 7巻、316-320頁）の全凝固性フィブリノーゲン法により又はDu Pontにより販売 されているフィブリンポリマーへのフィブリノーゲンの転化の濁り速度測定に基 づく測定システム（Du Pont Aca^TM，Du Pont CliniCal Systems，Wilmington,De 1aware，USA）により、フィブリノーゲンを測定することができる。Vermylen他 の方法では、終点としてフィブリンウエブが出現するまで凝固混合物の中へ及び 外へ連続的に動かすガラスフック又は白金ループが使用されている。 フィブリノーゲン決定をするための多くの現存する先行技術では、血液細胞が 測定を妨害するので測定を行う前に血液を遠心分離することが必要である。血液 細胞の分離は時間がかかり、測定に必要な全体の時間が長くなる。血液を採取し てすぐフィブリノーゲン測定を行うことができれば、（血栓崩壊性薬剤の作用の ために）プラスミン活性化から生じる試験管内人為結果はあったとしても試験結 果に殆ど影響を与えないであろう。血栓崩壊治療患者から採取した血液試料につ いて、数分間（現存する方法では現在１０〜１５分間）の遅れでも不正確な結果 になるであろう。この問題点に対する一解決法は、試験する前に検体を保存する ために、血液捕集管に添加剤としてプラスミン又はプラスミノゲン活性化剤の抑 制剤を使用することであった。しかしながら、抑制剤を使用することは追加の費 用がかかり、また続いて検体に行うかもしれない機能測定の分野を制限する。 フィブリノーゲンは出血危険性の重要な指標である。出血の危険がある血栓崩 壊治療患者及びその他の患者では、病院検査室での長い所要時間のために迅速な フィブリノーゲン決定を得ることができない。先ず血液を患者から採取し、検査 室に送り、遠心分離しそしてフィブリノーゲン分析計にかけなくてはならず、こ の分析計は検体を測定する前に先ず較正しなくてはならない。検体を試験したと き、その結果を医師に送らなくてはならない。乾式化学システムで行うことがで きた迅速なフィブリノーゲン決定は、これまで得られなかった。 米国に於ける死亡の５０％より多くは単独の血栓事象、即ち心臓、脳又は肺臓 の血管系内の血液クロット又は深い静脈血栓症若しくは抹消脈管血栓症からもた らされる合併症に起因している。血栓が関係する死亡に加えて、制御されない内 出血によって多数の死者がでる。フィブリノーゲンは血栓又はクロットを作る重 要なタンパク質である。過剰のフィブリノーゲンは患者を血栓症に罹りやすくす る可能性がある。不十分なフィブリノーゲンは突発性出血にいたらしめる可能性 がある。フィブリノーゲンレベルは肝不全、敗血症及び播種性血管内血液凝固等 の多くの医学的障害、並びにある種の外科手術処置の間に変えられるようになる かもしれない。血栓崩壊治療及び開胸手術のような近代的な治療様式の出現は、 患者のフィブリノーゲンレベルの急激な医原性減少をもたらした。更に、フィブ リノーゲンレベルは心筋梗塞の急性期反応物質として突然増加するかもしれない 。実際、多数の臨床研究では、フィブリノーゲンレベルがコレステロールよりも 一層、心臓血管疾患に罹患している患者では虚血性心臓病及び発作にとって重要 な危険因子であることが示された。例えば、Banerjee他、Thromb．Haemostas，1 992年、68巻、261-263頁及び「アテローム硬化性心臓血管疾患、止血及び内皮機 能」（Atherosclerotic Cardiovascu1ar Disease，Hemostasis and Endothelial Function）、R．B．Francis，Jr.編、 Marcel Dekker，Inc.，NY（1992年）の Meadeを参照されたい。これらの、またその他の理由のために、試験のために患 者の枕元又は患者の近くに持っていくことができる迅速で便利なフィブリノーゲ ン測定を有することは、医学に於いて多年に亘って果たせなかった願望であった 。 二十世紀の後半では、フィブロメーター（Fibrometer）（登録商標）として知 られている、凝固性フィブリノーゲンを測定するための半自動検査室分析計が、 殆 どの臨床検査室でベストのものとされていた。この分析計は非常に正確でクラウ ス法を用いている。しかしながら、フィブロメーターは患者の枕元又は医療の現 場で使用するには適していない。それはこの器械が頻繁に較正を必要とし、労働 集約的であり、持ち運びできないためである。更に、消息子は侵襲性で、検体の 中に浸漬し、サンプリングする毎に後できれいにする必要がある。フィブロメー ターの方法ではまた試薬を再構成する必要がある。この試薬調製段階では追加の 時間がかかり、正確にピペットで試薬を移すことが必要である。典型的に、この 方法の使用者は全ての検体を回分処理し、一日に一回システムを動かすので迅速 な測定時間を得られにくくしている Oberhardt及びGresalfiは、血液検体中のフィブリノーゲンを測定するために 磁性粒子を含む乾式化学試薬を使用することを教示した（米国特許出願第07/550 ,570号）。しかしながらこの方法では、典型的には、フィブロメーターの結果と の相関はピアーソン（Pearson）相関係数（ｒ）値で約０．８５でしかない。本 発明まで、このレベルの相関性は修正クラウス法と亜硫酸塩沈殿法のような二つ の本質的に異なるフィブリノーゲン法の間で得られるものと同然とされている。 例えば、Stump他（Thromb Haemostas 1988年、59巻、133-137頁）を参照された い。 しかしながら、フィブロメーターは現在検査室で絶対的なものであるので、患 者の近くで（そして中央検査室から離れて）使用するための試験方法がフィブロ メーターと非常によく相関していることが望ましい。それはフィブロメーターが 未だ殆どの検査室で選択されている方法であるためである。発明の開示 従って、本発明の目的は前記のような欠点を解消したフィブリノーゲン測定を 行うための簡単でかつ正確な方法及び分析システムを提供することである。 本発明の他の目的は、試薬含有溶液の調製を必要としないフィブリノーゲン測 定を行うための方法及び分析システムを提供することである。 本発明の他の目的は、試薬の不安定性に伴う問題点を最小にするフィブリノー ゲン測定を行うための方法及び分析システムを提供することである。 本発明の他の目的は、非常に少量の検体しか必要としないフィブリノーゲン測 定を行うための方法及び分析システムを提供することである。 本発明の他の目的は、フィブロメーターのような、クラウス法及び半自動の機 械式又は電気機械式クロット検出システムを用いる検査室方法と非常によく相関 している、血液又は血漿検体中のフィブリノーゲンを測定するための迅速で便利 な方法を提供することである。 驚くべきことに、これらの目的の全て及び本明細書に記載する本発明の記述か ら明らかになる他の目的は、 （ｉ）トロンビンを含み、全体に均一に分布された多数の磁性粒子が中に埋め 込まれている予め測定した量の乾式試薬マトリックスを有する反応チャンバーを 回転磁界に付す工程、 （ｉｉ）この乾式試薬マトリックスを反応チャンバーを充填するに十分な量の 希釈血液検体と接触させて、磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動できるよ うにする工程、 （ｉｉｉ）血液検体が凝固する間に磁性粒子の回転磁界に対する応答を光学的 にモニターして、応答曲線を作る工程、 （ｉｖ）応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及び （ｖ）工程（ｉｖ）から得られる凝固時間終点を、既知のフィブリノーゲン含 有量の検体を用いて工程（ｉ）〜（ｉｖ）によって作成した凝固時間終点対フィ ブリノーゲン含有量に関する蓄えておいた標準較正曲線と比較して、検体中の凝 固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行う方法を見出すことによって達成された 。 別の態様として、 （ｉ）液体検体を加えるための検体ウエルを有する反応スライド及び多数の磁 性粒子が全体に均一に分布して中に埋め込まれている乾式試薬マトリックスと、 トロンビンを含有する試薬とを有する反応チャンバー、（ここで検体ウエルと反 応チャンバーとは、検体ウエルに入っている、反応チャンバーの体積に相当する 体積の液体分析物検体が、検体ウエルから反応チャンバーの方に移送されるよう な形状の移送帯域を介して液体結合されている）、 （ｉｉ）回転磁界を発生する手段、及び （ｉｉｉ）回転磁界に対する磁性粒子の応答を検出するための光学的検出手段 を包含する上記フィブリノーゲン測定を行うためのシステムが提供される。図面の簡単な説明 本発明及び多くのその付随する利点の一層完全な理解は、添付する図面と結び つけて考えたとき下記の詳細な記述を参照することによって同様に容易に得られ 、よりよく理解されるようになるであろう。幾つかの図面を通して、類似の参照 数字は同一又は対応する部分を示す。 図１は、本発明の方法と、検査室の“最高峰”であるフィブロメーターとの相 関性を示す。 図２は、本発明の方法で使用することができる組立反応スライド及び回転磁界 発生手段の分解図である。 図３は、本発明の方法で使用するための装置の図解表示である。図４は、本発 明の装置及び乾式化学反応スライドを用いて得られた典型的な生データ曲線を示 す。 図５は、本発明に於ける回転磁界を発生するために使用する磁石の構成図を示 す。発明を実施するための最良の形態 本発明は、 （ｉ）全体に均一に分布された多数の磁性粒子が中に埋め込まれている乾式試 薬マトリックスと、トロンビン含有試薬とを有する反応チャンバーを回転磁界に 付す工程、 （ｉｉ）該乾式試薬マトリックスを希釈血液検体と接触させて、該磁性粒子を 回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ｉｉｉ）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁界に対する応答を 光学的にモニターして、応答曲線を作る工程、 （ｉｖ）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及び（ｖ）工程（ｉｖ ） から得られる凝固時間終点を、既知のフィブリノーゲン含有量の検体を用いて工 程（ｉ）〜（ｉｖ）によって作成した凝固時間終点対フィブリノーゲン含有量に 関する記憶標準較正曲線と比較して、検体中の凝固性フィブリノーゲンの量を得 る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行うための改良方法に関する。 本発明の乾式試薬には、フィブリノーゲンをフィブリンモノマーに転化し、次 いで重合させるように作用する試薬としてトロンビンが含まれている。本発明の トロンビンはフィブリノーゲン重合を誘導するために有効などのようなトロンビ ンを含んでいてもよく、好ましくはヒトトロンビン、ウシトロンビン及びブタト ロンビンから選択され、最も好ましくはヒトトロンビン又はウシトロンビンであ る。 本発明の方法は、全血の検体又は血漿のような血液から得られる検体を使用す ることができる。本発明によってフィブリノーゲン測定を行うために、先ず検体 を適当な希釈剤で希釈することが必要である。この希釈はクラウスフィブリノー ゲン試験用の標準物質であるオーレン（Owren）の緩衝液を用いて行うことが好 ましくかつ簡単である。しかしながら種々の緩衝液を使用することができる。希 釈は非常に低濃度のフィブリノーゲン検体の場合の緩衝液５部中に検体１部から 、遭遇する最高レベルの検体の場合の緩衝液２０部中に検体１部までの範囲であ ってよく、緩衝液１０部中に検体１部で希釈することが好ましい。他の希釈も使 用することができるが、得られる凝固時間が不当に長くなったり又は不当に短く なったりしないようにすることが必要である。 更に、本発明で使用される希釈血液検体である全血又は血漿には、所望により １種又は２種以上の抗凝固薬が含まれていてもよい。適当な抗凝固薬としては、 クエン酸塩、低レベルのヘパリン及びＥＤＴＡのような当該技術分野で使用され る普通の抗凝固薬が挙げられる。中でもクエン酸塩を使用することが好ましい。 本発明の方法で全血を使用するとき、血液の細胞フラクション％又はヘマトク リットを計算に入れた適当な算出法を使用することによって、血液フィブリノー ゲン濃度を血漿フィブリノーゲン濃度に変えることができる。適当な算出法は下 記の通りである。 ［φ］_p＝［φ］_B／［１−（Ｈ／１００） （式中、［φ］_P ＝血漿中のフィブリノーゲンの濃度 ［φ］_B ＝血液中のフィブリノーゲンの濃度 Ｈ ＝検体中の細胞フラクション％（典型的にヘマトクリット）） フィブリノーゲンレベルを決定するための以前の方法では、凝固時間対検体中 のフィブリノーゲン含有量に関する較正曲線をしばしば作成することが必要であ る。先行技術の方法ではこの較正曲線を正確にするために検体毎に又は２０〜３ ０個の検体からなるグループ毎に少なくとも１回この較正曲線を作ることが必要 である。しかしながら、本発明では既知のフィブリノーゲン含有量の検体を使用 することによって作成した記憶較正曲線を、検体スライド、回転磁界及び本発明 の方法と結び付けて使用することが可能である。 全血又は血漿を希釈しないで使用し、より低濃度（１〜５単位／ｍＬ）のトロ ンビンを乾式試薬に使用すると、フィブリノーゲンを定量的に測定する代わりに 、トロンビン時間又はトロンビン凝固時間を測定することができる。このような 決定法は異常なフィブリノーゲン濃度についてのスクリーニング試験として使用 することができる。例えば、正常なフィブリノーゲン濃度は１８０〜４００ｍｇ ／ｄＬであると考えられる。希釈しない検体を使用することによって、測定した トロンビン凝固時間により検体のフィブリノーゲンレベルが正常な範囲の中であ るか又は正常な範囲の外であるかを決定することができる。上記の正常なフィブ リノーゲンレベルによって１０〜１３秒のトロンビン時間が得られる。異常なフ ィブリノーゲンレベルによって１３秒よりも長い、時には２０秒よりも長いトロ ンビン時間が得られる。しかしながら、希釈しない検体を使用するとフィブリノ ーゲンレベルが高すぎるか又は低すぎるかを決定することができない。 本発明の別の態様に於いては、本発明の方法によって得られる結果をマッピン グして容易に個別参照法と一致する結果を得ることができる。例えば、殆どの病 院は独自の参照標準のセット及びその病院が「正常」であると考えているフィブ リノーゲンの値を有している。二つの異なった病院の参照方法は同じ検体を使用 しても２５〜５０ｍｇ／ｄＬ以上も異なる可能性があるので、本発明の方法は、 （本発明によって作成した）同一の記憶較正曲線を使用して、この差異を考慮す るべく十分に柔軟性のあるものとすることが有利である。これは本発明の方法を 使用して得られる結果を個別参照法にマッピングして、得られた値を問題にして いる特定の病院によって解釈し、その特定の病院が通常使用している参照法によ って得られた値と相関させることができるようにすることによって行われる。こ のマッピングは、二つの方法のいずれかによって行うことができる。即ち（１） 本発明の反応スライドを有する試験カードの磁性片のデータマッピング座標を磁 気的に符号化する方法又は（２）ユーザー自身が、マッピングされた試験結果を 出すように本発明の方法の応答を測定する器械をプログラムし直す方法、である 。マッピング方法自体では、本発明の記憶標準較正曲線を特定の使用者の個別参 照法に相関させるために通常のデータ操作方法が使用される。 本発明の測定は単に予め測定した量の磁性粒子を含む乾式試薬をマイクロタイ タープレート又は他の実質的に平らな表面のような全ての固体表面上で使用する ことによって機能するけれども、適切にパターン化されたフォーマットを作成し 、乾式試薬を入れ、検体をモニターするために、毛管スライド形状が理想的に適 合している。適当な毛管スライド形状は、全てOberhardtの米国特許第4,849,340 号、米国特許第5,110,727号又は米国特許出願第08/018,415号に記載されている もののようなスライドである。これらの特許及び特許出願を明細書の一部を構成 するものとして引用する。 特に好ましい反応スライドは、一端に隣接して排気開口部を有する毛管反応チ ャンバー及び検体ウエルに向かって先細りになり検体ウエルの中に開口している ネック領域を包含するプラスチック積層構造物から製造することができる。反応 スライドはスライドに毛管性質を与えるどのような寸法で構成されていてもよい けれども、反応スライドの特に好ましい態様は、８×３ｍｍの排気開口部を有す る１０×８×０．１７８ｍｍの直方体毛管反応チャンバー及び直径６．５ｍｍの 円形ウエルに隣接したネック領域の端で２ｍｍに先細りになっている９ｍｍのネ ック領域を有している。好ましい反応スライドの基板は不透明、好ましくは白色 であり、カバー及びスペーサーは透明である。反応スライドは両面接着プラスチ ックフィルムのようなスペーサーを用いて組み立てることができる。基板及びカ バーの厚さは好ましくは０．２５ｍｍであり、スペーサーの厚さは好ましくは０ ．１７８ｍｍである。反応スライドに乾式試薬マトリックスを充填し、磁性粒子 を入れ、凍結させ、次いで通常の凍結乾燥器で凍結乾燥する。乾燥したとき、反 応スライドを乾燥剤と一緒に包装し、使用するまで好ましくは２〜８℃で冷蔵貯 蔵することができる。 本発明の乾式化学反応スライドには、２０〜１００単位／ｍＬのトロンビンが 含まれており、５０単位／ｍＬのトロンビンが好ましい。ヘビ毒（ボスロプスア トロックス（Bothrops atrox）又はレプチラーゼ（reptilase））のような、フ ィブリノーゲンの重合を起こさせるトロンビン以外の試薬を使用することはあま り好ましくない。それはトロンビンをベースとする方法との相関が、一般的に幾 つかの有意の個別患者孤立値のためにピアーソン相関係数（ｒ）で０．８５のオ ーダーであるからである。この結果はフィブロメーターを用いてレプチラーゼ試 薬及びトロンビン試薬の両方で試験を行って容易に確認される。トロンビン時間 のレプチラーゼ等価物でも幾らか異なった結果を生じ、「レプチラーゼ時間」と 呼ばれる。それで、本発明を用いてフィブロメーターとの高い相関（即ち、ｒ＞ ０．９５）を望むなら、トロンビンをベースとする試薬を使用することが必要で ある。 本発明の乾式試薬には更に、全体に実質的に均一に散在している磁性粒子が含 まれている。適当な磁性粒子には米国特許第4,849,340号又は米国特許第5,110,7 27号に記載されているものが含まれる。 本発明の乾式試薬は、血液又は血液誘導検体を添加したとき急速に溶解するよ うに製造することが重要である。上記反応スライドに於けるような、表面の又は もっと良い毛管又は近似毛管距離で近接して並置されている２個の表面の間の凍 結乾燥が最も良く機能する。これによって急速な検体浸透及び溶解が可能な低物 質含有量の塊が作られる。凍結乾燥は市販の凍結乾燥装置を用いて行うことがで きる。 試薬を凍結乾燥する前に、反応スライドの毛管空間に試薬を充填する。凍結乾 燥の際に、得られた試薬は少なくとも二つの異なった形で出現するであろう。こ れらの形の第一のものは、実際に「ふわふわして」おり、「ふわふわした」試薬 内に穴又は間隙ができて毛管空間を完全に満たしている。試薬がとり得る第二の 形は毛管チャンバーの底にできたフィルムの形であり、フィルムと毛管チャンバ ーの天井との間に頭隙ができている。これらの形の両方が本発明で機能するけれ ども、第二の形である試薬フィルムが特に好ましい。それはこのフィルムが壊れ 難く試験カード（反応スライド）が機械的衝撃を受けた際に破砕されそうもない からである。 しかしながら、第三の中間形状又は反応スライドの底のフィルムから天井まで 「プレート」の形状で延びている「結晶状態」は、最も良い精密度（２％のよう に低い変動係数（ｃｖ））を与える。この状態はもっと多く湿分を含むフィルム と非常に乾燥した粉末、即ちふわふわした状態との中間である。後の状態は両方 とも典型的に３〜６のｃｖ値％を与える。この結晶状態は、液体を充填した反応 スライドを−１９０℃より低い温度で凍結させ、反応スライドを−１５℃で約１ ４時間高真空に付した後２５℃に加温することによって得られる。これは凍結乾 燥装置を用いて行われる。 凍結乾燥によって乾式磁性粒子含有試薬の製造に優れた結果が得られるけれど も、室温、真空、乾燥剤、対流又はその他の乾燥手段も良好な結果を得るために 使用することができる。例えば、自己計量乾式試薬含有要素を得るために、きち んとスペーサを置き次いでカバーを取り付けて反応スライドの基板の上で行う試 薬の室温乾燥を使用することができる。 本発明で使用される回転磁界によって起きる磁性粒子の運動は、光散乱／反射 によって測定することができる。反応チャンバーに入射光を与えるために赤外光 発光ダイオードのような光源が適当に配置され、反応空間内で検体から反射又は 散乱された光線を検出するために検出器が配置される。検出器は反射（散乱）光 線を検出できるどのような場所にも配置することができるが、磁界の回転面から ９０°〜１０°の位置が好ましく、９０°〜４５°の位置が更に好ましい。磁界 の回転面から９０°（毛管反応チャンバーの最も大きい平面に対して垂直）に検 出器を配置することが最も好ましい。光源は好ましくは約９３０ｎｍで極大光出 力を有する発光ダイオードであり、発光した光が反応スライドの表面に対して４ ５°の角度で反応スライドに直射するように配置することが好ましい。検出器 は好ましくは９２０ｎｍ±１２０ｎｍで極大を有するフィルターを有するフォト ダイオードであり、反応スライド表面に対して垂直に配置する。検出器は信号送 出手段に接続されている。適当な信号送出手段には前置増幅器及びチャート記録 器又は電流電圧増幅器、１０−ビット２００サンプル／秒デジタイザー及びコン ピュータが含まれる。 本発明で使用する回転磁界は、通常のＵ字形磁石のような同じ方向に向いてい る磁極片又はこのような通常のＵ字形磁石によって作られる磁界の中心線の方に 同時に向かうか若しくは中心線から同時に離れる磁極片を有する永久磁石を回転 させることによって発生させることができる。これは図５によってもっと容易に 理解される。図５には、磁石の回転の際に適当な磁界を作る磁石の配置が示され ている。図５に於いて、磁極片のそれぞれは反応スライドの平面に対して垂直で ある線１０及び１０′から角度θをなしている。本発明の方法に於いて、この角 度θは−４５°〜＋４５°であり、磁極片はそれぞれ中心線２０の方に向かうか 又は中心線２０から離れている。本発明の回転磁界を発生させるための他の適当 な磁石は、円形列の電磁コイルであり、これは回転磁界を発生させるために順次 に配置され賦勢される。このコイルは鉄心の周りに巻かれており、順次付勢した とき回転Ｕ字形磁石の等価物を作るために共通点に結線されている。この形式の 組立に於いて、鉄心は４５°を越えてもよい角度（図５のθ）で内側に傾斜して いる。 回転磁界は好ましくは２個の磁極片を反応スライドの方に向けたＵ字形アルニ コ磁石を使用することによって発生される。また、適当な磁界強度であるが全体 質量が小さいＵ字形アルニコ磁石の等価物を得るために、希土類を組み合わせた 磁石を磁極片及びベースと組み合わせて使用することができる。これは適当に載 せたネオジム−鉄−ホウ素磁石を用いて得ることができる。磁石組立体の磁石は 、軸の周りに磁石が回転できるように磁石の中心に空けた穴を通して直流モータ ーの軸に取り付けることができる。磁極片は、本発明の乾式試薬を有する反応チ ャンバーから、反応チャンバー及びその内容物に回転磁界作用を与えるに十分な どのような距離で配置してもよい。磁石の磁極片と反応スライド基板の底面との 間の距離は、好ましくは約５ｍｍである。反応スライドの温度は試薬が溶解した 後 で磁性粒子の運動が抑制されないどのような温度（即ち、試薬及び検体の凍結又 は変性を起こさせない温度）でも維持することができ、好ましくは電気帯ヒータ ーのような適当な加熱手段で３７℃に維持する。電気帯ヒーターを使用するとき 、ヒーターを熱安定性接着剤によって約０．０４厚さのアルミニウム板に貼り付 け、ヒーターと板との組立体を回転磁石と反応スライドとの間に配置する。 血液凝固反応を回転磁界内で測定できるこの配置で、懸濁している磁性酸化鉄 粒子の凝結とフィブリンを重合させることによる包含（entrapment）によって光 散乱及び吸収の急速に進行する減少及びその結果としての反応スライド基板から のバックグラウンド反射の増加が得られる。 本発明で有用な磁界回転周波数の範囲は約１５〜６０Ｈｚである。最善の信号 対雑音比についての磁石の好ましい回転周波数は希釈血漿検体については約３５ Ｈｚであり、全血検体については約２０Ｈｚである。磁石が止まっているとき、 磁界は好ましくは検体に平行に４２０ガウス±２０ガウスであり、検体に垂直に ０ガウス±５０ガウスである。得られる終点（図４、長い平坦域の後の上昇）は 信号処理の当業者に公知の種々の方法で検出できる。好ましい態様に於いて、全 波形をコンピュータのメモリーに入れ、平坦領域及び上昇領域について線形回帰 を行い、これらの回帰直線の交点によって終了時間又は終点が得られる。また、 凝固時間終点は平坦部で確立された信号振幅から予めセットされた閾値を越える 上昇として決定することができる。終点は曲線の下に延ばされた下方参照直線と して図４に示されている。この線は実際の信号の一部ではない。 この配置はAdler（米国特許第3,650,698号）及びLichtenstein（オーストラリ ア特許出願第47981/72号｛460.038｝｛1971年12月13日、米国特許出願第207196 号｝）によって先行技術で教示されているものとは異なっている。Adlerは粒子 を混合域の周辺に移動させる傾向がある回転バー又は円筒形磁石を用いた。更に 、Adlerの磁性粒子は毛管反応チャンバーのない表面の一つのスポットでポリビ ニルピロリドンフィルムの中に入っていた。Adlerでは更に血漿の正確なアリコ ートを粒子を含むスポットに付与する必要があり、液体中に粒子を適当に懸濁さ せるために予備インキュベーション時間（例えば、６０秒間）が必要であった。 その後、メーカーの使用説明書に従って予め調製した液体凝固試薬（トロン ボプラスチン）の正確なアリコートを、検体及び懸濁している粒子を有するスポ ットに付与した。試薬を付与した瞬間にタイマーをスタートさせ、粒子が凝結し て反射に大きな変化が出たとき止めた。Adlerは凍結乾燥した凝集試薬を全体に 本質的に均一に分散させた磁性粒子と一緒に使用することを教示してはおらず、 毛管反応チャンバーを使用することも教示しなかった。それで、本発明の使用者 にとっての便利性は得られなかった。更に、Adlerは検体中のフィブリノーゲン の測定を教示しなかった。 Lichtensteinは彼の装置の潜在的応用としてフィブリノーゲン測定を考えてい るが、この目的を達成する方法は教示していない。更に、Lichtensteinの装置で は教示される応用に有用な混合を行うために回転する第一磁石に加えて静止して いる第二磁石が必要である。Lichtensteinの装置は単にAlderの装置を改善した ものと考えられる。 本発明を一般的に記載したが、ある特定の実施例を参照することによってより 以上の理解が得られるであろう。この実施例は単に例示する目的のために本明細 書に記載するものであり、他に特定しない限り限定することを意図するものでは ない。実施例 実施例１ ０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に０．３ミクロン平均粒子径のＦ ｅ₃Ｏ₄（磁性酸化鉄）を７ｍｇ／ｍＬ含む懸濁液及び約５０単位／ｍＬに希釈さ れたウシトロンビン試薬Ｄａｄｅ（登録商標）Ｄａｔａ−Ｆｉ（登録商標）トロ ンビン試薬（Baxter Diagnostics，Inc.，カタログ番号B4233-27）を加えること によって、検体中のフィブリノーゲンを測定するための乾式化学反応スライドを 作成した。混合物を反応スライドの反応空間に入れ、次いで液体窒素中で−１９ ５℃で凍結させた。この方法で作成した反応スライドを次いで−３５℃の初期棚 温度で凍結乾燥器内で凍結乾燥した。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、 これをフィブリノーゲン決定に使用するまでフォイルパウチ内に包装した。フィ ブロメーター凝固装置を用いる血漿検体中のフィブリノーゲン測定のために、 同じトロンビン試薬を５０単位／ｍＬ濃度で液体状で使用した。それぞれの装置 について、測定された参照血漿（ＡＲＰ）（Helena Laboratories，Inc.）を使 用して較正を行った。血漿検体をオーレンの緩衝液に希釈し、クラウス法によっ て試験した。図１にこの実施例で行った研究の結果を示す。乾式化学反応スライ ド及び付属する装置（図２）で得られたフィブリノーゲン（ｍｇ／ＤＬ）を、フ ィブロメーターで得られたフィブリノーゲンに対して縦軸にプロットし、ｒ＝０ ．９８９のピアーソン相関係数を有する直線が得られた。図１に示すデータは７ ６個の病院患者、３個の測定した参照血漿（ＡＲＰ）及び２個のプールした正常 血漿（ＰＮＰ）からなっている。図３に、この装置及び乾式化学反応スライドか ら得られた典型的な生データ曲線を示す。これは繰り返し測定での凝固時間の正 確性を示している。 実施例２ 実施例１に於けるようにしてフィブリノーゲン測定用の乾式化学反応スライド を作成し、続いてウシトロンビン試薬（Sigma Companyカタログ番号4648）を使 用して試験した。 実施例３ 実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを作成し、続いてヒトトロ ンビン試薬（Ortho Diagnostic Systems，Inc．製品コード731200(Fibrindex)） を使用して試験した。 実施例４ 実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを作成したが、０．５％マ ンニトール（Sigma カタログ番号M-4125）を凍結乾燥する前に添加剤として反応 混合物に添加した。結果は匹敵するものであった。 実施例５ 実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを作成したが、０．１％ウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）も凍結乾燥する前に添加剤として反応混合物に使用 した。測定正確性は僅かに改良された。凍結乾燥する前に２０ｍｇ／ｍＬのポリ エチレングリコール（ＰＥＧ）を添加すると凝固時間は短くなり、測定正確性は 低下した。 実施例６ 更に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液及び１０ｍｇ／ｍＬのマンニトールを使用 して、実施例２に於けるようにして乾式化学反応スライドを作成した。良好な結 果が得られた。 実施例７ １．５／ｍＬのヒトトロンビン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３、 ２ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコール（３４００ダルトン）、０．１ｍｇ／ｍ Ｌのポリブレン（polybrene）及び１．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを７ｍｇ／ｍＬの ０．３ミクロンの平均粒子直径を有するＦｅ₃Ｏ₄と一緒にすることによって、ト ロンビン時間決定用の試験カードを作成した。混合物を反応スライドの反応空間 の中にピペットで入れ、次いで液体窒素中で−１９５℃で凍結させた。この方法 で作成した反応スライドを次いで−３５℃の初期棚温度で凍結乾燥器内で凍結乾 燥した。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、これをトロンビン時間決定に 使用するまでフォイルパウチ内に包装した。トロンビン時間試験のために、未希 釈の検体を使用し、凝固時間を測定した。これらの条件下で正常なフィブリノー ゲンレベル（１８０〜４００ｍｇ／ｍＬ）は１０〜１３秒間の範囲内のトロンビ ン時間値を示した。異常なフィブリノーゲンレベルは１３秒よりも長い、時には ２０秒よりも長いトロンビン時間値になった。 実施例８ 約１２０、２１５、２１９及び３６０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンレベルを 有する血漿検体を実施例１に於けるようにして試験した。これらの検体を先ず希 釈した。これらの希釈検体のそれぞれの一つのアリコートを３７℃に加温し、そ の後この検体を反応スライドの検体ウエルに添加した。希釈した検体のそれぞれ の第二のアリコートを室温で検体ウエルに添加した。全ての場合に、乾式化学反 応スライドの反応チャンバーを３７℃に維持した。得られたフィブロメーター（ 全ての検体を３７℃に予め加温した）との相関は、３７℃に予め加温した検体ア リコートについてはｒ＝０．９９９であり、室温（２４℃）の検体アリコートに ついてはｒ＝０．９９９であり、対にした検体のそれぞれについての平均値は一 般的に単一測定についての標準偏差内であった。それで適用した検体の温度は この範囲内で小さい影響又は相関を有している。 実施例９ Autolet（登録商標）器具を用いて皮膚穿剌を行い、血液を毛細管に集めるこ とによって、５人の正常なボランティア供血者を試験した。各供血者について、 １本の毛細管中の血液検体を１分以内にクエン酸塩含有緩衝液（３．２％の緩衝 したクエン酸三ナトリウム抗凝固薬）の中に排出し、最終的に１：１０に希釈し 、実施例５（ＰＥＧ無し）の乾式化学反応スライドに適用し、分析した。５人の 供血者について静脈穿刺検体（血液９体積：３．２％クエン酸塩１体積）を吸引 採血管に集め、遠心分離して血小板の少ない血漿を調製し、フィブロメーターで 試験することによって血漿フィブリノーゲンを決定した。このフィブリノーゲン 値は約２３０〜３８０ｍｇ／ｄＬの範囲であった。得られたデータは、大きく劣 った相関を示すと予想されたこの狭い範囲内でも、同じ供血者について静脈穿刺 検体を用いてフィブロメーターで得られた血漿フィブリノーゲン値と０．９２４ の優れた相関を示した。 明らかに、本発明の多数の修正及び変形が上記の教示に照らして可能である。 それで、請求の範囲の範囲内で、明細書に特に記載したもの以外のやり方で本発 明を実施できることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/86 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/86

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒子が均一に中に埋め込まれており 、反応チャンバーの中に入れられており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬 マトリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な量の希釈血液検体と接触 させて、該磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ｉｉ）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁界に対する応答を光 学的にモニターして、応答曲線を作る工程、 （ｉｉｉ）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及び（ｉｖ）工程（ ｉｉｉ）から得られる凝固時間終点を、既知のフィブリノーゲン含有量の検体を 用いて作成した凝固時間終点対フィブリノーゲン含有量に関する記憶標準較正曲 線と比較して、検体中の凝固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、定量的フィブリノーゲン測定を行う方法。 ２．該トロンビンがヒトトロンビンである請求の範囲第１項記載のフィブリノ ーゲン測定を行う方法。 ３．該トロンビンがウシトロンビンである請求の範囲第１項記載のフィブリノ ーゲン測定を行う方法。 ４．該希釈血液検体が希釈全血である請求の範囲第１項記載のフィブリノーゲ ン測定を行う方法。 ５．該希釈血液検体が希釈血漿である請求の範囲第１項記載のフィブリノーゲ ン測定を行う方法。 ６．該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれている請求の範囲第４項記載のフィブ リノーゲン測定を行う方法。 ７．（ｉ）液体検体を加えるための検体ウエルを有する反応スライド及びトロ ンビンを含み、全体に均一に分布された多数の磁性粒子が中に埋め込まれている 乾式試薬マトリックスを有する反応チャンバー、 （ｉｉ）回転磁界を発生する手段、及び （ｉｉｉ）該回転磁界に対する該磁性粒子の応答を検出するための光学的検出 手段 を包含するフィブリノーゲン測定を行うためのシステムであって、該検体ウエル と該反応チャンバーとは、該検体ウエルに入れられた該反応チャンバーの体積に 相当する体積の液体分析物検体が、該検体ウエルから該反応チャンバーの方に移 送されるような形状の移送帯域を介して液体接合されているものである、フィブ リノーゲン測定を行うためのシステム。 ８．該トロンビンがヒトトロンビンである請求の範囲第７項記載のフィブリノ ーゲン測定を行うためのシステム。 ９．該トロンビンがウシトロンビンである請求の範囲第７項記載のフィブリノ ーゲン測定を行うためのシステム。 １０．該希釈血液検体が希釈全血である請求の範囲第７項記載のフィブリノー ゲン測定を行うためのシステム。 １１．該希釈血液検体が希釈血漿である請求の範囲第７項記載のフィブリノー ゲン測定を行うためのシステム。 １２．該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれている請求の範囲第１０項記載のフ ィブリノーゲン測定を行うためのシステム。 １３．更に較正曲線を蓄えておく手段を包含する請求の範囲第１０項記載のフ ィブリノーゲン測定を行うためのシステム。 １４．（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒子が均一に中に埋め込まれてお り、反応チャンバーの中に入っており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬マ トリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な量の未希釈血液検体と接触 させて、該磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ｉｉ）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁界に対する応答を光学 的にモニターして、応答曲線を作る工程、及び （ｉｉｉ）該応答曲線からトロンビン凝固時間を決定する工程を包含する、ト ロンビン凝固時間試験を行う方法。 １５．該トロンビンがヒトトロンビンである請求の範囲第１４項記載のトロン ビン凝固時間試験を行う方法。 １６．該トロンビンがウシトロンビンである請求の範囲第１４項記載のトロン ビン凝固時間試験を行う方法。 １７．該未希釈血液検体が未希釈全血である請求の範囲第１４項記載のトロン ビン凝固時間試験を行う方法。 １８．該未希釈血液検体が未希釈血漿である請求の範囲第１４項記載のトロン ビン凝固時間試験を行う方法。 １９．該未希釈全血に更に抗凝固薬が含まれている請求の範囲第１７項記載の トロンビン凝固時間試験を行う方法。 ２０．（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒子が均一に中に埋め込まれてお り、反応チャンバーの中に入っており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬マ トリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な量の希釈参照検体（但し、 該希釈参照検体には既知量のフィブリノーゲンが含まれている）と接触させて、 該磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ｉｉ）該参照検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁界に対する応答を光 学的にモニターして、応答曲線を作る工程、 （ｉｉｉ）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、 （ｉｖ）各凝固時間決定のために、既知量のフィブリノーゲンを含有する他の 希釈参照検体（但し、使用する追加の各希釈参照検体は、全ての使用する他の希 釈参照検体とは異なった既知量のフィブリノーゲンを含有する）を用いて、工程 （ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返す工程、及び （ｖ）二次元プロットの一方の軸に各検体についての凝固時間終点をプロットし 、他の軸に工程（ｉ）〜（ｉｖ）で使用した血液検体中のフィブリノーゲンの量 をプロットするか又は電子的にこのデータを蓄えて該二次元プロットを生じさせ る工程 を包含する、フィブリノーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。 ２１．該トロンビンがヒトトロンビンである請求の範囲第２０項記載のフィブ リノーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。 ２２．該トロンビンがウシトロンビンである請求の範囲第２０項記載のフィブ リノーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。 ２３．該希釈参照検体が希釈全血である請求の範囲第２０項記載のフィブリノ ーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。 ２４．該希釈参照検体が希釈血漿である請求の範囲第２０項記載のフィブリノ ーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。 ２５．該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれている請求の範囲第２３項記載のフ ィブリノーゲンを測定するための標準較正曲線の作成方法。