JP3497862B2 - フィブリノーゲン測定を正確、迅速かつ簡単に行うための改良方法及び分析システム - Google Patents
フィブリノーゲン測定を正確、迅速かつ簡単に行うための改良方法及び分析システムInfo
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Classifications
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
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-
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-
- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はフィブリノーゲン測定を行うための改良され
た方法及び改良された分析システムに関する。
た方法及び改良された分析システムに関する。
背景技術
臨床測定として用いられる血液凝固反応では、典型的
にフィブリンクロットの形成に必要な時間を測定する。
血液凝固測定は基本的に抗凝血治療を受けている患者を
選別し、診断しそして監視するために用いられる。
にフィブリンクロットの形成に必要な時間を測定する。
血液凝固測定は基本的に抗凝血治療を受けている患者を
選別し、診断しそして監視するために用いられる。
多くの種類の凝固測定法が存在している。これらに
は、プロトロンビン時間（PT）、部分トロンボプラスチ
ン時間（PTT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（A
PTT）、フィブリノーゲン測定（即ち、検体中の凝固性
フィブリノーゲンの濃度の測定）、トロンビン時間（ト
ロンビン凝固時間（TCT）としても知られている）、活
性化凝固時間（ACT）等々が含まれる。これらの測定の
うちで最もしばしば行われるものはプロトロンビン時間
の測定である。
は、プロトロンビン時間（PT）、部分トロンボプラスチ
ン時間（PTT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（A
PTT）、フィブリノーゲン測定（即ち、検体中の凝固性
フィブリノーゲンの濃度の測定）、トロンビン時間（ト
ロンビン凝固時間（TCT）としても知られている）、活
性化凝固時間（ACT）等々が含まれる。これらの測定の
うちで最もしばしば行われるものはプロトロンビン時間
の測定である。
血漿中の凝固性フィブリノーゲンの濃度の決定は、患
者の凝固障害の究明にとって重要である。免疫学的方法
及び凝固試験の両方がフィブリノーゲンを決定するため
に使用されてきた。免疫学的方法は重大な診断上の欠点
を示し、結局実際的な重要性を有しなかった。
者の凝固障害の究明にとって重要である。免疫学的方法
及び凝固試験の両方がフィブリノーゲンを決定するため
に使用されてきた。免疫学的方法は重大な診断上の欠点
を示し、結局実際的な重要性を有しなかった。
凝固試験に於いて、フィブリノーゲン含有量は凝塊の
形成に必要な時間によって決定される。この方法の中で
最も重要なものはクラウス（Clauss）の方法である（Ac
ta Haemat.1957年、17巻、237−246頁参照）。
形成に必要な時間によって決定される。この方法の中で
最も重要なものはクラウス（Clauss）の方法である（Ac
ta Haemat.1957年、17巻、237−246頁参照）。
このクラウス法に於いては、希釈した血漿、即ち弱い
フィブリノーゲン溶液を、トロンビンの量が血漿の約10
0U/mLである濃縮トロンビン溶液と混合する。典型的に
は、２体積のフィブリノーゲンを含有する希釈検体を、
１体積の100U/mLの濃縮トロンビン溶液に添加する。較
正曲線を用いて、検体のフィブリノーゲン含有量を凝塊
の目に見える出現に要した時間に対して相関付ける。凝
固過程の間の濁りの形成を光度測定法で記録する凝固試
験も公知である。例えば、Ratge等の報文（Clin.Chem.1
987年、33巻（３）、420頁）を参照されたい。
フィブリノーゲン溶液を、トロンビンの量が血漿の約10
0U/mLである濃縮トロンビン溶液と混合する。典型的に
は、２体積のフィブリノーゲンを含有する希釈検体を、
１体積の100U/mLの濃縮トロンビン溶液に添加する。較
正曲線を用いて、検体のフィブリノーゲン含有量を凝塊
の目に見える出現に要した時間に対して相関付ける。凝
固過程の間の濁りの形成を光度測定法で記録する凝固試
験も公知である。例えば、Ratge等の報文（Clin.Chem.1
987年、33巻（３）、420頁）を参照されたい。
最後に、形成された凝塊を単離し、そのタンパク質含
有量を決定する定量方法も知られている。この方法で
は、検体をトロンビンと反応させて、凝塊を形成させ、
単離し、洗浄し次いで乾燥させる。次いで、凝塊のタン
パク質含有量又はその重量を決定する。
有量を決定する定量方法も知られている。この方法で
は、検体をトロンビンと反応させて、凝塊を形成させ、
単離し、洗浄し次いで乾燥させる。次いで、凝塊のタン
パク質含有量又はその重量を決定する。
Levine他の米国特許第5,137,832号には、遠心分離、
加熱及び再遠心分離によって管内に入っている浮遊体の
上部のフィブリノーゲン富化溶液の帯域を層形成するこ
とによる全血検体中のフィブリノーゲンの定量方法が開
示されている。Becker他の米国特許第4,692,406号に
は、血漿中のフィブリノーゲン及びフィブリノーゲン分
裂生成物の同時決定法が開示されている。この方法では
トロンビン様活性を有するヘビ毒液酵素が使用される。
この方法に於いては、フィブリノーゲン分裂生成物の量
の尺度である、酵素の添加と濁り形成の開始との間の時
間を測定する。次いで濁り形成の速度を測定して、検体
中に存在するフィブリノーゲンの量を決定する。
加熱及び再遠心分離によって管内に入っている浮遊体の
上部のフィブリノーゲン富化溶液の帯域を層形成するこ
とによる全血検体中のフィブリノーゲンの定量方法が開
示されている。Becker他の米国特許第4,692,406号に
は、血漿中のフィブリノーゲン及びフィブリノーゲン分
裂生成物の同時決定法が開示されている。この方法では
トロンビン様活性を有するヘビ毒液酵素が使用される。
この方法に於いては、フィブリノーゲン分裂生成物の量
の尺度である、酵素の添加と濁り形成の開始との間の時
間を測定する。次いで濁り形成の速度を測定して、検体
中に存在するフィブリノーゲンの量を決定する。
プロトロンビン時間試験及び活性化部分トロンボプラ
スチン時間試験はそれぞれ一般に、クロットを形成する
患者の能力を決定するために臨床検査で用いられてい
る。これらの試験及び前記のその他の試験は、術前評価
のために及び数ある患者の中で特に心臓患者に施される
抗凝固療法のために病院、診療所及び検査室で用いられ
ている。これらの試験はそれぞれ時間測定に基づいてお
り、大部分はフィブリノーゲンが重合してフィブリンに
なるとき生じる、終点又は凝固時間と呼ばれているもの
を測定する。
スチン時間試験はそれぞれ一般に、クロットを形成する
患者の能力を決定するために臨床検査で用いられてい
る。これらの試験及び前記のその他の試験は、術前評価
のために及び数ある患者の中で特に心臓患者に施される
抗凝固療法のために病院、診療所及び検査室で用いられ
ている。これらの試験はそれぞれ時間測定に基づいてお
り、大部分はフィブリノーゲンが重合してフィブリンに
なるとき生じる、終点又は凝固時間と呼ばれているもの
を測定する。
これらの種類の測定の多くは反応を測定するために検
体の光学濃度の変化をモニターするものである。例え
ば、Natelson他（Am.J.Clin.Path.1974年、61巻
（６）、828−833頁）、Lipscomb（米国特許第4,720,78
7号）、Saito他（米国特許第4,217,107号）、Baughman
他（米国特許第4,289,498号）、Gross他（米国特許第3,
458,287号）、Eichelberger他（米国特許第4,047,890
号）、Becker他（米国特許第4,692,406号）、Callahan
他（「PT凝固反応からの半定量的フィブリノーゲン決
定」（Semiquantitative Fibrinogen Determination fr
om the PT Clotting Reaction）、Tech.Bulletin THR88
04、著作権:1988年、Organon Teknika,Durham,North Ca
rolina,USA）及びCarroll他（「凝固試験に於けるクロ
ット特徴及び新しい様相」（The Clot Signature and N
ew Aspects in Coagulation Testing）、1989年７月、O
rtho Diagnostic Systems Inc.,Raritan,New Jersey）
を参照されたい。
体の光学濃度の変化をモニターするものである。例え
ば、Natelson他（Am.J.Clin.Path.1974年、61巻
（６）、828−833頁）、Lipscomb（米国特許第4,720,78
7号）、Saito他（米国特許第4,217,107号）、Baughman
他（米国特許第4,289,498号）、Gross他（米国特許第3,
458,287号）、Eichelberger他（米国特許第4,047,890
号）、Becker他（米国特許第4,692,406号）、Callahan
他（「PT凝固反応からの半定量的フィブリノーゲン決
定」（Semiquantitative Fibrinogen Determination fr
om the PT Clotting Reaction）、Tech.Bulletin THR88
04、著作権:1988年、Organon Teknika,Durham,North Ca
rolina,USA）及びCarroll他（「凝固試験に於けるクロ
ット特徴及び新しい様相」（The Clot Signature and N
ew Aspects in Coagulation Testing）、1989年７月、O
rtho Diagnostic Systems Inc.,Raritan,New Jersey）
を参照されたい。
前記のクラウス法に於けるように凝固速度によって測
定することに加えて、Vermylen他（Clin.Chem.Acta 196
3年、８巻、418−24頁）により修正されたクラウス法に
於けるような凝固速度により、Rampling他（Clin.Chem.
Acta 1976年、67巻、43頁）の亜硫酸塩沈殿により、Rat
noff他（J.Lab.Clin.Med.1951年、37巻、316−320頁）
の全凝固性フィブリノーゲン法により又はDu Pontによ
り販売されているフィブリンポリマーへのフィブリノー
ゲンの転化の濁り速度測定に基づく測定システム（Du P
ont AcaTM,Du Pont Clinical Systems,Wilmington,Dela
ware,USA）により、フィブリノーゲンを測定することが
できる。Vermylen他の方法では、終点としてフィブリン
ウエブが出現するまで凝固混合物の中へ及び外へ連続的
に動かすガラスフック又は白金ループが使用されてい
る。
定することに加えて、Vermylen他（Clin.Chem.Acta 196
3年、８巻、418−24頁）により修正されたクラウス法に
於けるような凝固速度により、Rampling他（Clin.Chem.
Acta 1976年、67巻、43頁）の亜硫酸塩沈殿により、Rat
noff他（J.Lab.Clin.Med.1951年、37巻、316−320頁）
の全凝固性フィブリノーゲン法により又はDu Pontによ
り販売されているフィブリンポリマーへのフィブリノー
ゲンの転化の濁り速度測定に基づく測定システム（Du P
ont AcaTM,Du Pont Clinical Systems,Wilmington,Dela
ware,USA）により、フィブリノーゲンを測定することが
できる。Vermylen他の方法では、終点としてフィブリン
ウエブが出現するまで凝固混合物の中へ及び外へ連続的
に動かすガラスフック又は白金ループが使用されてい
る。
フィブリノーゲン決定をするための多くの現存する先
行技術では、血液細胞が測定を妨害するので測定を行う
前に血液を遠心分離することが必要である。血液細胞の
分離は時間がかかり、測定に必要な全体の時間が長くな
る。血液を採取してすぐフィブリノーゲン測定を行うこ
とができれば、（血栓崩壊性薬剤の作用のために）プラ
スミン活性化から生じる試験管内人為結果はあったとし
ても試験結果に殆ど影響を与えないであろう。血栓崩壊
治療患者から採取した血液試料について、数分間（現存
する方法では現在10〜15分間）の遅れでも不正確な結果
になるであろう。この問題点に対する一解決法は、試験
する前に検体を保存するために、血液捕集管に添加剤と
してプラスミン又はプラスミノゲン活性化剤の抑制剤を
使用することであった。しかしながら、抑制剤を使用す
ることは追加の費用がかかり、また続いて検体に行うか
もしれない機能測定の分野を制限する。
行技術では、血液細胞が測定を妨害するので測定を行う
前に血液を遠心分離することが必要である。血液細胞の
分離は時間がかかり、測定に必要な全体の時間が長くな
る。血液を採取してすぐフィブリノーゲン測定を行うこ
とができれば、（血栓崩壊性薬剤の作用のために）プラ
スミン活性化から生じる試験管内人為結果はあったとし
ても試験結果に殆ど影響を与えないであろう。血栓崩壊
治療患者から採取した血液試料について、数分間（現存
する方法では現在10〜15分間）の遅れでも不正確な結果
になるであろう。この問題点に対する一解決法は、試験
する前に検体を保存するために、血液捕集管に添加剤と
してプラスミン又はプラスミノゲン活性化剤の抑制剤を
使用することであった。しかしながら、抑制剤を使用す
ることは追加の費用がかかり、また続いて検体に行うか
もしれない機能測定の分野を制限する。
フィブリノーゲンは出血危険性の重要な指標である。
出血の危険がある血栓崩壊治療患者及びその他の患者で
は、病院検査室での長い所要時間のために迅速なフィブ
リノーゲン決定を得ることができない。先ず血液を患者
から採取し、検査室に送り、遠心分離しそしてフィブリ
ノーゲン分析計にかけなくてはならず、この分析計は検
体を測定する前に先ず較正しなくてはならない。検体を
試験したとき、その結果を医師に送らなくてはならな
い。乾式化学システムで行うことができた迅速なフィブ
リノーゲン決定は、これまで得られなかった。
出血の危険がある血栓崩壊治療患者及びその他の患者で
は、病院検査室での長い所要時間のために迅速なフィブ
リノーゲン決定を得ることができない。先ず血液を患者
から採取し、検査室に送り、遠心分離しそしてフィブリ
ノーゲン分析計にかけなくてはならず、この分析計は検
体を測定する前に先ず較正しなくてはならない。検体を
試験したとき、その結果を医師に送らなくてはならな
い。乾式化学システムで行うことができた迅速なフィブ
リノーゲン決定は、これまで得られなかった。
米国に於ける死亡の50％より多くは単独の血栓事象、
即ち心臓、脳又は肺臓の血管系内の血液クロット又は深
い静脈血栓症若しくは抹消脈管血栓症からもたらされる
合併症に起因している。血栓が関係する死亡に加えて、
制御されない内出血によって多数の死者がでる。フィブ
リノーゲンは血栓又はクロットを作る重要なタンパク質
である。過剰のフィブリノーゲンは患者を血栓症に罹り
やすくする可能性がある。不十分なフィブリノーゲンは
突発性出血にいたらしめる可能性がある。フィブリノー
ゲンレベルは肝不全、敗血症及び播種性血管内血液凝固
等の多くの医学的障害、並びにある種の外科手術処置の
間に変えれるようになるかもしれない。血栓崩壊治療及
び開胸手術のような近代的な治療様式の出現は、患者の
フィブリノーゲンレベルの急激な医原性減少をもたらし
た。更に、フィブリノーゲンレベルは心筋梗塞の急性期
反応物質として突然増加するかもしれない。実際、多数
の臨床研究では、フィブリノーゲンレベルがコレステロ
ールよりも一層、心臓血管疾患に罹患している患者では
虚血性心臓病及び発作にとって重要な危険因子であるこ
とが示された。例えば、Banerjee他、Thromb.Haemosta
s,1992年、68巻、261−263頁及び「アテローム硬化性心
臓血管疾患、止血及び内皮機能」（Atherosclerotic Ca
rdiovascular Disease,Hemostasis and Endothelial Fu
nction）、R.B.Francis,Jr.編、Marcel Dekker,Inc.,NY
（1992年）のMeadeを参照されたい。これらの、またそ
の他の理由のために、試験のために患者の枕元又は患者
の近くに持っていくことができる迅速で便利なフィブリ
ノーゲン測定を有することは、医学に於いて多年に亘っ
て果させなかった願望であった。
即ち心臓、脳又は肺臓の血管系内の血液クロット又は深
い静脈血栓症若しくは抹消脈管血栓症からもたらされる
合併症に起因している。血栓が関係する死亡に加えて、
制御されない内出血によって多数の死者がでる。フィブ
リノーゲンは血栓又はクロットを作る重要なタンパク質
である。過剰のフィブリノーゲンは患者を血栓症に罹り
やすくする可能性がある。不十分なフィブリノーゲンは
突発性出血にいたらしめる可能性がある。フィブリノー
ゲンレベルは肝不全、敗血症及び播種性血管内血液凝固
等の多くの医学的障害、並びにある種の外科手術処置の
間に変えれるようになるかもしれない。血栓崩壊治療及
び開胸手術のような近代的な治療様式の出現は、患者の
フィブリノーゲンレベルの急激な医原性減少をもたらし
た。更に、フィブリノーゲンレベルは心筋梗塞の急性期
反応物質として突然増加するかもしれない。実際、多数
の臨床研究では、フィブリノーゲンレベルがコレステロ
ールよりも一層、心臓血管疾患に罹患している患者では
虚血性心臓病及び発作にとって重要な危険因子であるこ
とが示された。例えば、Banerjee他、Thromb.Haemosta
s,1992年、68巻、261−263頁及び「アテローム硬化性心
臓血管疾患、止血及び内皮機能」（Atherosclerotic Ca
rdiovascular Disease,Hemostasis and Endothelial Fu
nction）、R.B.Francis,Jr.編、Marcel Dekker,Inc.,NY
（1992年）のMeadeを参照されたい。これらの、またそ
の他の理由のために、試験のために患者の枕元又は患者
の近くに持っていくことができる迅速で便利なフィブリ
ノーゲン測定を有することは、医学に於いて多年に亘っ
て果させなかった願望であった。
二十世紀の後半では、フィブロメーター（Fibromete
r）（登録商標）として知られている、凝固性フィブリ
ノーゲンを測定するための半自動検査室分析計が、殆ど
の臨床検査室でベストのものとされていた。この分析計
は非常に正確でクラウス法を用いている。しかしなが
ら、フィブロメーターは患者の枕元又は医療の現場で使
用するには適していない。それはこの器械が頻繁に較正
を必要とし、労働集約的であり、持ち運びできないため
である。更に、消息子は侵襲性で、検体の中に浸漬し、
サンプリングする毎に後できれいにする必要がある。フ
ィブロメーターの方法ではまた試薬を再構成する必要が
ある。この試薬調製段階では追加の時間がかかり、正確
にピペットで試薬を移すことが必要である。典型的に、
この方法の使用者は全ての検体を回分処理し、一日に一
回システムを動かすので迅速な測定時間を得られにくく
している Oberhardt及びGresalfiは、血液検体中のフィブリノ
ーゲンを測定するために磁性粒子を含む乾式化学試薬を
使用することを教示した（米国特許出願第07/550,570
号）。しかしながらこの方法では、典型的には、フィブ
ロメーターの結果との相関はピアーソン（Pearson）相
関係数（ｒ）値で約0.85でしかない。本発明まで、この
レベルの相関性は修正クラウス法と亜硫酸塩沈殿法のよ
うな二つの本質的に異なるフィブリノーゲン法の間で得
られるものと同然とされている。例えば、Stump他（Thr
omb Haemostas 1988年、59巻、133−137頁）を参照され
たい。
r）（登録商標）として知られている、凝固性フィブリ
ノーゲンを測定するための半自動検査室分析計が、殆ど
の臨床検査室でベストのものとされていた。この分析計
は非常に正確でクラウス法を用いている。しかしなが
ら、フィブロメーターは患者の枕元又は医療の現場で使
用するには適していない。それはこの器械が頻繁に較正
を必要とし、労働集約的であり、持ち運びできないため
である。更に、消息子は侵襲性で、検体の中に浸漬し、
サンプリングする毎に後できれいにする必要がある。フ
ィブロメーターの方法ではまた試薬を再構成する必要が
ある。この試薬調製段階では追加の時間がかかり、正確
にピペットで試薬を移すことが必要である。典型的に、
この方法の使用者は全ての検体を回分処理し、一日に一
回システムを動かすので迅速な測定時間を得られにくく
している Oberhardt及びGresalfiは、血液検体中のフィブリノ
ーゲンを測定するために磁性粒子を含む乾式化学試薬を
使用することを教示した（米国特許出願第07/550,570
号）。しかしながらこの方法では、典型的には、フィブ
ロメーターの結果との相関はピアーソン（Pearson）相
関係数（ｒ）値で約0.85でしかない。本発明まで、この
レベルの相関性は修正クラウス法と亜硫酸塩沈殿法のよ
うな二つの本質的に異なるフィブリノーゲン法の間で得
られるものと同然とされている。例えば、Stump他（Thr
omb Haemostas 1988年、59巻、133−137頁）を参照され
たい。
しかしながら、フィブロメーターは現在検査室で絶対
的なものであるので、患者の近くで（そして中央検査室
から離れて）使用するための試験方法がフィブロメータ
ーと非常によく相関していることが望ましい。それはフ
ィブロメーターが未だ殆どの検査室で選択されている方
法であるためである。
的なものであるので、患者の近くで（そして中央検査室
から離れて）使用するための試験方法がフィブロメータ
ーと非常によく相関していることが望ましい。それはフ
ィブロメーターが未だ殆どの検査室で選択されている方
法であるためである。
発明の開示
従って、本発明の目的は前記のような欠点を解消した
フィブリノーゲン測定を行うための簡単でかつ正確な方
法及び分析システムを提供することである。
フィブリノーゲン測定を行うための簡単でかつ正確な方
法及び分析システムを提供することである。
本発明の他の目的は、試薬含有溶液の調製を必要とし
ないフィブリノーゲン測定を行うための方法及び分析シ
ステムを提供することである。
ないフィブリノーゲン測定を行うための方法及び分析シ
ステムを提供することである。
本発明の他の目的は、試薬の不安定性に伴う問題点を
最小にするフィブリノーゲン測定を行うための方法及び
分析システムを提供することである。
最小にするフィブリノーゲン測定を行うための方法及び
分析システムを提供することである。
本発明の他の目的は、非常に少量の検体しか必要とし
ないフィブリノーゲン測定を行うための方法及び分析シ
ステムを提供することである。
ないフィブリノーゲン測定を行うための方法及び分析シ
ステムを提供することである。
本発明の他の目的は、フィブロメーターのような、ク
ラウス法及び半自動の機械式又は電気機械式クロット検
出システムを用いる検査室方法と非常によく相関してい
る、血液又は血漿検体中のフィブリノーゲンを測定する
ための迅速で便利な方法を提供することである。
ラウス法及び半自動の機械式又は電気機械式クロット検
出システムを用いる検査室方法と非常によく相関してい
る、血液又は血漿検体中のフィブリノーゲンを測定する
ための迅速で便利な方法を提供することである。
驚くべきことに、これらの目的の全て及び本明細書に
記載する本発明の記述から明らかになる他の目的は、 （ｉ）トロンビンを含み、全体に均一に分布された多数
の磁性粒子が中に埋め込まれている予め測定した量の乾
式試薬マトリックスを有する反応チャンバーを回転磁界
に付す工程、 （ii）この乾式試薬マトリックスを反応チャンバーを充
填するに十分な量の希釈血液検体と接触させて、磁性粒
子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工
程、 （iii）血液検体が凝固する間に磁性粒子の回転磁界に
対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を作る工
程、 （iv）応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及び （ｖ）工程（iv）から得られる凝固時間終点を、既知の
フィブリノーゲン含有量の検体を用いて工程（ｉ）〜
（iv）によって作成した凝固時間終点対フィブリノーゲ
ン含有量に関する蓄えておいた標準較正曲線と比較し
て、検体中の凝固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行う方法を見出す
ことによって達成された。
記載する本発明の記述から明らかになる他の目的は、 （ｉ）トロンビンを含み、全体に均一に分布された多数
の磁性粒子が中に埋め込まれている予め測定した量の乾
式試薬マトリックスを有する反応チャンバーを回転磁界
に付す工程、 （ii）この乾式試薬マトリックスを反応チャンバーを充
填するに十分な量の希釈血液検体と接触させて、磁性粒
子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする工
程、 （iii）血液検体が凝固する間に磁性粒子の回転磁界に
対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を作る工
程、 （iv）応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及び （ｖ）工程（iv）から得られる凝固時間終点を、既知の
フィブリノーゲン含有量の検体を用いて工程（ｉ）〜
（iv）によって作成した凝固時間終点対フィブリノーゲ
ン含有量に関する蓄えておいた標準較正曲線と比較し
て、検体中の凝固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行う方法を見出す
ことによって達成された。
別の態様として、
（ｉ）液体検体を加えるための検体ウエルを有する反応
スライド及び多数の磁性粒子が全体に均一に分布して中
に埋め込まれている乾式試薬マトリックスと、トロンビ
ンを含有する試薬とを有する反応チャンバー、（ここで
検体ウエルと反応チャンバーとは、検体ウエルに入って
いる、反応チャンバーの体積に相当する体積の液体分析
物検体が、検体ウエルから反応チャンバーの方に移送さ
れるような形状の移送帯域を介して液体結合されてい
る）、 （ii）回転磁界を発生する手段、及び （iii）回転磁界に対する磁性粒子の応答を検出するた
めの光学的検出手段を包含する上記フィブリノーゲン測
定を行うためのシステムが提供される。
スライド及び多数の磁性粒子が全体に均一に分布して中
に埋め込まれている乾式試薬マトリックスと、トロンビ
ンを含有する試薬とを有する反応チャンバー、（ここで
検体ウエルと反応チャンバーとは、検体ウエルに入って
いる、反応チャンバーの体積に相当する体積の液体分析
物検体が、検体ウエルから反応チャンバーの方に移送さ
れるような形状の移送帯域を介して液体結合されてい
る）、 （ii）回転磁界を発生する手段、及び （iii）回転磁界に対する磁性粒子の応答を検出するた
めの光学的検出手段を包含する上記フィブリノーゲン測
定を行うためのシステムが提供される。
図面の簡単な説明
本発明及び多くのその付随する利点の一層完全な理解
は、添付する図面と結びつけて考えたとき下記の詳細な
記述を参照することによって同様に容易に得られ、より
よく理解されるようになるであろう。幾つかの図面を通
して、類似の参照数字は同一又は対応する部分を示す。
は、添付する図面と結びつけて考えたとき下記の詳細な
記述を参照することによって同様に容易に得られ、より
よく理解されるようになるであろう。幾つかの図面を通
して、類似の参照数字は同一又は対応する部分を示す。
図１は、本発明の方法と、検査室との“最高峰”であ
るフィブロメーターとの相関性を示す。
るフィブロメーターとの相関性を示す。
図２は、本発明の方法で使用することができる組立反
応スライド及び回転磁界発生手段の分解図である。
応スライド及び回転磁界発生手段の分解図である。
図３は、本発明の方法で使用するための装置の図解表
示である。図４は、本発明の装置及び乾式化学反応スラ
イドを用いて得られた典型的な生データ曲線を示す。
示である。図４は、本発明の装置及び乾式化学反応スラ
イドを用いて得られた典型的な生データ曲線を示す。
図５は、本発明に於ける回転磁界を発生するために使
用する磁石の構成図を示す。
用する磁石の構成図を示す。
発生を実施するための最良の形態
本発明は、
（ｉ）全体に均一に分布された多数の磁性粒子が中に埋
め込まれている乾式試薬マトリックスと、トロンビン含
有試薬とを有する反応チャンバーを回転磁界に付す工
程、 （ii）該乾式試薬マトリックスを希釈血液検体と接触さ
せて、該磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動でき
るようにする工程、 （iii）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転
磁界に対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を
作る工程、 （iv）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及
び（ｖ）工程（iv）から得られる凝固時間終点を、既知
のフィブリノーゲン含有量の検体を用いて工程（ｉ）〜
（iv）によって作成した凝固時間終点対フィブリノーゲ
ン含有量に関する記憶標準較正曲線と比較して、検体中
の凝固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行うための改良方
法に関する。
め込まれている乾式試薬マトリックスと、トロンビン含
有試薬とを有する反応チャンバーを回転磁界に付す工
程、 （ii）該乾式試薬マトリックスを希釈血液検体と接触さ
せて、該磁性粒子を回転磁界の影響下に自由に移動でき
るようにする工程、 （iii）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転
磁界に対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を
作る工程、 （iv）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、及
び（ｖ）工程（iv）から得られる凝固時間終点を、既知
のフィブリノーゲン含有量の検体を用いて工程（ｉ）〜
（iv）によって作成した凝固時間終点対フィブリノーゲ
ン含有量に関する記憶標準較正曲線と比較して、検体中
の凝固性フィブリノーゲンの量を得る工程 を包含する、フィブリノーゲン測定を行うための改良方
法に関する。
本発明の乾式試薬には、フィブリノーゲンをフィブリ
ンモノマーに転化し、次いで重合させるように作用する
試薬としてトロンビンが含まれている。本発明のトロン
ビンはフィブリノーゲン重合を誘導するために有効など
のようなトロンビンを含んでいてもよく、好ましくはヒ
トトロンビン、ウシトロンビン及びブタトロンビンから
選択され、最も好ましくはヒトトロンビン又はウシトロ
ンビンである。
ンモノマーに転化し、次いで重合させるように作用する
試薬としてトロンビンが含まれている。本発明のトロン
ビンはフィブリノーゲン重合を誘導するために有効など
のようなトロンビンを含んでいてもよく、好ましくはヒ
トトロンビン、ウシトロンビン及びブタトロンビンから
選択され、最も好ましくはヒトトロンビン又はウシトロ
ンビンである。
本発明の方法は、全血の検体又は血漿のような血液か
ら得られる検体を使用することができる。本発明によっ
てフィブリノーゲン測定を行うために、先ず検体を適当
な希釈剤で希釈することが必要である。この希釈はクラ
ウスフィブリノーゲン試験用の標準物質であるオーレン
（Owren）の緩衝液を用いて行うことが好ましくかつ簡
単である。しかしながら種々の緩衝液を使用することが
できる。希釈は非常に低濃度のフィブリノーゲン検体の
場合の緩衝液５部中に検体１部から、遭遇する最高レベ
ルの検体の場合の緩衝液20部中に検体１部までの範囲で
あってよく、緩衝液10部中に検体１部で希釈することが
好ましい。他の希釈も使用することができるが、得られ
る凝固時間が不当に長くなったり又は不当に短くなった
りしないようにすることが必要である。
ら得られる検体を使用することができる。本発明によっ
てフィブリノーゲン測定を行うために、先ず検体を適当
な希釈剤で希釈することが必要である。この希釈はクラ
ウスフィブリノーゲン試験用の標準物質であるオーレン
（Owren）の緩衝液を用いて行うことが好ましくかつ簡
単である。しかしながら種々の緩衝液を使用することが
できる。希釈は非常に低濃度のフィブリノーゲン検体の
場合の緩衝液５部中に検体１部から、遭遇する最高レベ
ルの検体の場合の緩衝液20部中に検体１部までの範囲で
あってよく、緩衝液10部中に検体１部で希釈することが
好ましい。他の希釈も使用することができるが、得られ
る凝固時間が不当に長くなったり又は不当に短くなった
りしないようにすることが必要である。
更に、本発明で使用される希釈血液検体である全血又
は血漿には、所望により１種又は２種以上の抗凝固薬が
含まれていてもよい。適当な抗凝固薬としては、クエン
酸塩、低レベルのヘパリン及びEDTAのような当該技術分
野で使用される普通の抗凝固薬が挙げられる。中でもク
エン酸塩を使用することが好ましい。
は血漿には、所望により１種又は２種以上の抗凝固薬が
含まれていてもよい。適当な抗凝固薬としては、クエン
酸塩、低レベルのヘパリン及びEDTAのような当該技術分
野で使用される普通の抗凝固薬が挙げられる。中でもク
エン酸塩を使用することが好ましい。
本発明の方法で全血を使用するとき、血液の細胞フラ
クション％又はヘマトクリットを計算に入れた適当な算
出法を使用することによって、血液フィブリノーゲン濃
度を血漿フィブリノーゲン濃度に変えることができる。
適当な算出法は下記の通りである。
クション％又はヘマトクリットを計算に入れた適当な算
出法を使用することによって、血液フィブリノーゲン濃
度を血漿フィブリノーゲン濃度に変えることができる。
適当な算出法は下記の通りである。
［φ］Ｐ＝［φ］B/［１−（H/100）
（式中、［φ］Ｐ＝血漿中のフィブリノーゲンの濃度
［φ］Ｂ＝血液中のフィブリノーゲンの濃度
Ｈ＝検体中の細胞フラクション％（典型的にヘ
マトクリット）） フィブリノーゲンレベルを決定するための以前の方法
では、凝固時間対検体中のフィブリノーゲン含有量に関
する較正曲線をしばしば作成することが必要である。先
行技術の方法ではこの較正曲線を正確にするために検体
毎に又は20〜30個の検体からなるグループ毎に少なくと
も１回この較正曲線を作ることが必要である。しかしな
がら、本発明では既知のフィブリノーゲン含有量の検体
を使用することによって作成した記憶較正曲線を、検体
スライド、回転磁界及び本発明の方法と結び付けて使用
することが可能である。
マトクリット）） フィブリノーゲンレベルを決定するための以前の方法
では、凝固時間対検体中のフィブリノーゲン含有量に関
する較正曲線をしばしば作成することが必要である。先
行技術の方法ではこの較正曲線を正確にするために検体
毎に又は20〜30個の検体からなるグループ毎に少なくと
も１回この較正曲線を作ることが必要である。しかしな
がら、本発明では既知のフィブリノーゲン含有量の検体
を使用することによって作成した記憶較正曲線を、検体
スライド、回転磁界及び本発明の方法と結び付けて使用
することが可能である。
全血又は血漿を希釈しないで使用し、より低濃度（１
〜５単位/mL）のトロンビンを乾式試薬に使用すると、
フィブリノーゲンを定量的に測定する代わりに、トロン
ビン時間又はトロンビン凝固時間を測定することができ
る。このような決定法は異常なフィブリノーゲン濃度に
ついてのスクリーニング試験として使用することができ
る。例えば、正常なフィブリノーゲン濃度は180〜400mg
/dLであると考えられる。希釈しない検体を使用するこ
とによって、測定したトロンビン凝固時間により検体の
フィブリノーゲンレベルが正常な範囲の中であるか又は
正常な範囲の外であるかを決定することができる。上記
の正常なフィブリノーゲンレベルによって10〜13秒のト
ロンビン時間が得られる。異常なフィブリノーゲンレベ
ルによって13秒よりも長い、時には20秒よりも長いトロ
ンビン時間が得られる。しかしながら、希釈しない検体
を使用するとフィブリノーゲンレベルが高すぎるか又は
低すぎるかを決定することができない。
〜５単位/mL）のトロンビンを乾式試薬に使用すると、
フィブリノーゲンを定量的に測定する代わりに、トロン
ビン時間又はトロンビン凝固時間を測定することができ
る。このような決定法は異常なフィブリノーゲン濃度に
ついてのスクリーニング試験として使用することができ
る。例えば、正常なフィブリノーゲン濃度は180〜400mg
/dLであると考えられる。希釈しない検体を使用するこ
とによって、測定したトロンビン凝固時間により検体の
フィブリノーゲンレベルが正常な範囲の中であるか又は
正常な範囲の外であるかを決定することができる。上記
の正常なフィブリノーゲンレベルによって10〜13秒のト
ロンビン時間が得られる。異常なフィブリノーゲンレベ
ルによって13秒よりも長い、時には20秒よりも長いトロ
ンビン時間が得られる。しかしながら、希釈しない検体
を使用するとフィブリノーゲンレベルが高すぎるか又は
低すぎるかを決定することができない。
本発明の別の態様に於いては、本発明の方法によって
得られる結果をマッピングして容易に個別参照法と一致
する結果を得ることができる。例えば、殆どの病院は独
自の参照標準のセット及びその病院が「正常」であると
考えているフィブリノーゲンの値を有している。二つの
異なった病院の参照方法は同じ検体を使用しても25〜50
mg/dL以上も異なる可能性があるので、本発明の方法
は、（本発明によって作成した）同一の記憶較正曲線を
使用して、この差異を考慮するべく十分に柔軟性のある
ものとすることが有利である。これは本発明の方法を使
用して得られる結果を個別参照法にマッピングして、得
られた値を問題にしている特定の病院によって解釈し、
その特定の病院が通常使用している参照法によって得ら
れた値と相関させることができるようにすることによっ
て行われる。このマッピングは、二つの方法のいずれか
によって行うことができる。即ち（１）本発明の反応ス
ライドを有する試験カードの磁性片のデータマッピング
座標を磁気的に符号化する方法又は（２）ユーザー自身
が、マッピングされた試験結果を出すように本発明の方
法の応答を測定する器械をプログラムし直す方法、であ
る。マッピング方法自体では、本発明の記憶標準較正曲
線を特定の使用者の個別参照法に相関させるために通常
のデータ操作方法が使用される。
得られる結果をマッピングして容易に個別参照法と一致
する結果を得ることができる。例えば、殆どの病院は独
自の参照標準のセット及びその病院が「正常」であると
考えているフィブリノーゲンの値を有している。二つの
異なった病院の参照方法は同じ検体を使用しても25〜50
mg/dL以上も異なる可能性があるので、本発明の方法
は、（本発明によって作成した）同一の記憶較正曲線を
使用して、この差異を考慮するべく十分に柔軟性のある
ものとすることが有利である。これは本発明の方法を使
用して得られる結果を個別参照法にマッピングして、得
られた値を問題にしている特定の病院によって解釈し、
その特定の病院が通常使用している参照法によって得ら
れた値と相関させることができるようにすることによっ
て行われる。このマッピングは、二つの方法のいずれか
によって行うことができる。即ち（１）本発明の反応ス
ライドを有する試験カードの磁性片のデータマッピング
座標を磁気的に符号化する方法又は（２）ユーザー自身
が、マッピングされた試験結果を出すように本発明の方
法の応答を測定する器械をプログラムし直す方法、であ
る。マッピング方法自体では、本発明の記憶標準較正曲
線を特定の使用者の個別参照法に相関させるために通常
のデータ操作方法が使用される。
本発明の測定は単に予め測定した量の磁性粒子を含む
乾式試薬をマイクロタイタープレート又は他の実質的に
平らな表面のような全ての固体表面上で使用することに
よって機能するけれども、適切にパターン化されたフォ
ーマットを作成し、乾式試薬を入れ、検体をモニターす
るために、毛管スライド形状が理想的に適合している。
適当な毛管スライド形状は、全てOberhardtの米国特許
第4,849,340号、米国特許第5,110,727号又は米国特許出
願第08/018,415号に記載されているもののようなスライ
ドである。これらの特許及び特許出願を明細書の一部を
構成するものとして引用する。
乾式試薬をマイクロタイタープレート又は他の実質的に
平らな表面のような全ての固体表面上で使用することに
よって機能するけれども、適切にパターン化されたフォ
ーマットを作成し、乾式試薬を入れ、検体をモニターす
るために、毛管スライド形状が理想的に適合している。
適当な毛管スライド形状は、全てOberhardtの米国特許
第4,849,340号、米国特許第5,110,727号又は米国特許出
願第08/018,415号に記載されているもののようなスライ
ドである。これらの特許及び特許出願を明細書の一部を
構成するものとして引用する。
特に好ましい反応スライドは、一端に隣接して排気開
口部を有する毛管反応チャンバー及び検体ウエルに向か
って先細りになり検体ウエルの中に開口しているネック
領域を包含するプラスチック積層構造物から製造するこ
とができる。反応スライドはスライドに毛管性質を与え
るどのような寸法で構成されていてもよいけれども、反
応スライドの特に好ましい態様は、８×3mmの排気開口
部を有する10×８×0.178mmの直方体毛管反応チャンバ
ー及び直径6.5mmの円形ウエルに隣接したネック領域の
端で2mmに先細りになっている9mmのネック領域を有して
いる。好ましい反応スライドの基板は不透明、好ましく
は白色であり、カバー及びスペーサーは透明である。反
応スライドは両面接着プラスチックフィルムのようなス
ペーサーを用いて組み立てることができる。基板及びカ
バーの厚さは好ましくは0.25mmであり、スペーサーの厚
さは好ましくは0.178mmである。反応スライドに乾式試
薬マトリックスを充填し、磁性粒子を入れ、凍結させ、
次いで通常の凍結乾燥器で凍結乾燥する。乾燥したと
き、反応スライドを乾燥剤と一緒に包装し、使用するま
で好ましくは２〜８℃で冷蔵貯蔵することができる。
口部を有する毛管反応チャンバー及び検体ウエルに向か
って先細りになり検体ウエルの中に開口しているネック
領域を包含するプラスチック積層構造物から製造するこ
とができる。反応スライドはスライドに毛管性質を与え
るどのような寸法で構成されていてもよいけれども、反
応スライドの特に好ましい態様は、８×3mmの排気開口
部を有する10×８×0.178mmの直方体毛管反応チャンバ
ー及び直径6.5mmの円形ウエルに隣接したネック領域の
端で2mmに先細りになっている9mmのネック領域を有して
いる。好ましい反応スライドの基板は不透明、好ましく
は白色であり、カバー及びスペーサーは透明である。反
応スライドは両面接着プラスチックフィルムのようなス
ペーサーを用いて組み立てることができる。基板及びカ
バーの厚さは好ましくは0.25mmであり、スペーサーの厚
さは好ましくは0.178mmである。反応スライドに乾式試
薬マトリックスを充填し、磁性粒子を入れ、凍結させ、
次いで通常の凍結乾燥器で凍結乾燥する。乾燥したと
き、反応スライドを乾燥剤と一緒に包装し、使用するま
で好ましくは２〜８℃で冷蔵貯蔵することができる。
本発明の乾式化学反応スライドには、20〜100単位/mL
のトロンビンが含まれており、50単位/mLのトロンビン
が好ましい。ヘビ毒（ボスロプスアトロックス（Bothro
ps atrox）又はレプチラーゼ（reptilase））のよう
な、フィブリノーゲンの重合を起こさせるトロンビン以
外の試薬を使用することはあまり好ましくない。それは
トロンビンをベースとする方法との相関が、一般的に幾
つかの有意の個別患者孤立値のためにピアーソン相関係
数（ｒ）で0.85のオーダーであるからである。この結果
はフィブロメーターを用いてレプチラーゼ試薬及びトロ
ンビン試薬の両方で試験を行って容易に確認される。ト
ロンビン時間のレプチラーゼ等価物でも幾らか異なった
結果を生じ、「レプチラーゼ時間」と呼ばれる。それ
で、本発明を用いてフィブロメーターとの高い相関（即
ち、ｒ＞0.95）を望むなら、トロンビンをベースとする
試薬を使用することが必要である。
のトロンビンが含まれており、50単位/mLのトロンビン
が好ましい。ヘビ毒（ボスロプスアトロックス（Bothro
ps atrox）又はレプチラーゼ（reptilase））のよう
な、フィブリノーゲンの重合を起こさせるトロンビン以
外の試薬を使用することはあまり好ましくない。それは
トロンビンをベースとする方法との相関が、一般的に幾
つかの有意の個別患者孤立値のためにピアーソン相関係
数（ｒ）で0.85のオーダーであるからである。この結果
はフィブロメーターを用いてレプチラーゼ試薬及びトロ
ンビン試薬の両方で試験を行って容易に確認される。ト
ロンビン時間のレプチラーゼ等価物でも幾らか異なった
結果を生じ、「レプチラーゼ時間」と呼ばれる。それ
で、本発明を用いてフィブロメーターとの高い相関（即
ち、ｒ＞0.95）を望むなら、トロンビンをベースとする
試薬を使用することが必要である。
本発明の乾式試薬には更に、全体に実質的に均一に散
在している磁性粒子が含まれている。適当な磁性粒子に
は米国特許第4,849,340号又は米国特許第5,110,727号に
記載されているものが含まれる。
在している磁性粒子が含まれている。適当な磁性粒子に
は米国特許第4,849,340号又は米国特許第5,110,727号に
記載されているものが含まれる。
本発明の乾式試薬は、血液又は血液誘導検体を添加し
たとき急速に溶解するように製造することが重要であ
る。上記反応スライドに於けるような、表面の又はもっ
と良い毛管又は近似毛管距離で近接して並置されている
２個の表面の間の凍結乾燥が最も良く機能する。これに
よって急速な検体浸透及び溶解が可能な底物質含有量の
塊が作られる。凍結乾燥は市販の凍結乾燥装置を用いて
行うことができる。
たとき急速に溶解するように製造することが重要であ
る。上記反応スライドに於けるような、表面の又はもっ
と良い毛管又は近似毛管距離で近接して並置されている
２個の表面の間の凍結乾燥が最も良く機能する。これに
よって急速な検体浸透及び溶解が可能な底物質含有量の
塊が作られる。凍結乾燥は市販の凍結乾燥装置を用いて
行うことができる。
試薬を凍結乾燥する前に、反応スライドの毛管空間に
試薬を充填する。凍結乾燥の際に、得られた試薬は少な
くとも二つの異なった形で出現するであろう。これらの
形の第一のものは、実際に「ふわふわして」おり、「ふ
わふわした」試薬内に穴又は間隙ができて毛管空間を完
全に満たしている。試薬がとり得る第二の形は毛管チャ
ンバーの底にできたフイルムの形であり、フィルムと毛
管チャンバーの天井との間に頭隙ができている。これら
の形の両方が本発明で機能するけれども、第二の形であ
る試薬フィルムが特に好ましい。それはこのフィルムが
壊れ難く試験カード（反応スライド）が機械的衝撃を受
けた際に破砕されそうもないからである。
試薬を充填する。凍結乾燥の際に、得られた試薬は少な
くとも二つの異なった形で出現するであろう。これらの
形の第一のものは、実際に「ふわふわして」おり、「ふ
わふわした」試薬内に穴又は間隙ができて毛管空間を完
全に満たしている。試薬がとり得る第二の形は毛管チャ
ンバーの底にできたフイルムの形であり、フィルムと毛
管チャンバーの天井との間に頭隙ができている。これら
の形の両方が本発明で機能するけれども、第二の形であ
る試薬フィルムが特に好ましい。それはこのフィルムが
壊れ難く試験カード（反応スライド）が機械的衝撃を受
けた際に破砕されそうもないからである。
しかしながら、第三の中間形状又は反応スライドの底
のフィルムから天井まで「プレート」の形状で延びてい
る「結晶状態」は、最も良い精密度（２％のように低い
変動係数（cv））を与える。この状態はもっと多く湿分
を含むフィルムと非常に乾燥した粉末、即ちふわふわし
た状態との中間である。後の状態は両方とも典型的に３
〜６のcv値％を与える。この結晶状態は、液体を充填し
た反応スライドを−190℃より低い温度で凍結させ、反
応スライドを−15℃で約14時間高真空に付した後25℃に
加温することによって得られる。これは凍結乾燥装置を
用いて行われる。
のフィルムから天井まで「プレート」の形状で延びてい
る「結晶状態」は、最も良い精密度（２％のように低い
変動係数（cv））を与える。この状態はもっと多く湿分
を含むフィルムと非常に乾燥した粉末、即ちふわふわし
た状態との中間である。後の状態は両方とも典型的に３
〜６のcv値％を与える。この結晶状態は、液体を充填し
た反応スライドを−190℃より低い温度で凍結させ、反
応スライドを−15℃で約14時間高真空に付した後25℃に
加温することによって得られる。これは凍結乾燥装置を
用いて行われる。
凍結乾燥によって乾式磁性粒子含有試薬の製造に優れ
た結果が得られるけれども、室温、真空、乾燥剤、対流
又はその他の乾燥手段も良好な結果を得るために使用す
ることができる。例えば、自己計量乾式試薬含有要素を
得るために、きちんとスペーサを置き次いでカバーを取
り付けて反応スライドの基板の上で行う試薬の室温乾燥
を使用することができる。
た結果が得られるけれども、室温、真空、乾燥剤、対流
又はその他の乾燥手段も良好な結果を得るために使用す
ることができる。例えば、自己計量乾式試薬含有要素を
得るために、きちんとスペーサを置き次いでカバーを取
り付けて反応スライドの基板の上で行う試薬の室温乾燥
を使用することができる。
本発明で使用される回転磁界によって起きる磁性粒子
の運動は、光散乱／反射によって測定することができ
る。反応チャンバーに入射光を与えるために赤外光発光
ダイオードのような光源が適当に配置され、反応空間内
で検体から反射又は散乱された光線を検出するために検
出器が配置される。検出器は反射（散乱）光線を検出で
きるどのような場所にも配置することができるが、磁界
の回転面から90゜〜10゜の位置が好ましく、90゜〜45゜
の位置が更に好ましい。磁界の回転面から90゜（毛管反
応チャンバーの最も大きい平面に対して垂直）に検出器
を配置することが最も好ましい。光源は好ましくは約93
0nmで極大光出力を有する発光ダイオードであり、発光
した光が反応スライドの表面に対して45゜の角度で反応
スライドに直射するように配置することが好ましい。検
出器は好ましくは920nm±120nmで極大を有するフィルタ
ーを有するフォトダイオードであり、反応スライド表面
に対して垂直に配置する。検出器は信号送出手段に接続
されている。適当な信号送出手段には前置増幅器及びチ
ャート記録器又は電流電圧増幅器、10−ビット200サン
プル／秒デジタイザー及びコンピュータが含まれる。
の運動は、光散乱／反射によって測定することができ
る。反応チャンバーに入射光を与えるために赤外光発光
ダイオードのような光源が適当に配置され、反応空間内
で検体から反射又は散乱された光線を検出するために検
出器が配置される。検出器は反射（散乱）光線を検出で
きるどのような場所にも配置することができるが、磁界
の回転面から90゜〜10゜の位置が好ましく、90゜〜45゜
の位置が更に好ましい。磁界の回転面から90゜（毛管反
応チャンバーの最も大きい平面に対して垂直）に検出器
を配置することが最も好ましい。光源は好ましくは約93
0nmで極大光出力を有する発光ダイオードであり、発光
した光が反応スライドの表面に対して45゜の角度で反応
スライドに直射するように配置することが好ましい。検
出器は好ましくは920nm±120nmで極大を有するフィルタ
ーを有するフォトダイオードであり、反応スライド表面
に対して垂直に配置する。検出器は信号送出手段に接続
されている。適当な信号送出手段には前置増幅器及びチ
ャート記録器又は電流電圧増幅器、10−ビット200サン
プル／秒デジタイザー及びコンピュータが含まれる。
本発明で使用する回転磁界は、通常のＵ字形磁石のよ
うな同じ方向に向いている磁極片又はこのような通常の
Ｕ字形磁石によって作られる磁界の中心線の方に同時に
向かうか若しくは中心線から同時に離れる磁極片を有す
る永久磁石を回転させることによって発生させることが
できる。これは図５によってもっと容易に理解される。
図５には、磁石の回転の際に適当な磁界を作る磁石の配
置が示されている。図５に於いて、磁極片のそれぞれは
反応スライドの平面に対して垂直である線10及び10′か
ら角度θをなしている。本発明の方法に於いて、この角
度θは−45゜〜＋45゜であり、磁極片はそれぞれ中心線
20の方に向かうか又は中心線20から離れている。本発明
の回転磁界を発生させるための他の適当な磁石は、円形
列の電磁コイルであり、これは回転磁界を発生させるた
めに順次に配置され賦勢される。このコイルは鉄心の周
りに巻かれており、順次付勢したとき回転Ｕ字形磁石の
等価物を作るために共通点に結線されている。この形式
の組立に於いて、鉄心は45゜を越えてもよい角度（図５
のθ）で内側に傾斜している。
うな同じ方向に向いている磁極片又はこのような通常の
Ｕ字形磁石によって作られる磁界の中心線の方に同時に
向かうか若しくは中心線から同時に離れる磁極片を有す
る永久磁石を回転させることによって発生させることが
できる。これは図５によってもっと容易に理解される。
図５には、磁石の回転の際に適当な磁界を作る磁石の配
置が示されている。図５に於いて、磁極片のそれぞれは
反応スライドの平面に対して垂直である線10及び10′か
ら角度θをなしている。本発明の方法に於いて、この角
度θは−45゜〜＋45゜であり、磁極片はそれぞれ中心線
20の方に向かうか又は中心線20から離れている。本発明
の回転磁界を発生させるための他の適当な磁石は、円形
列の電磁コイルであり、これは回転磁界を発生させるた
めに順次に配置され賦勢される。このコイルは鉄心の周
りに巻かれており、順次付勢したとき回転Ｕ字形磁石の
等価物を作るために共通点に結線されている。この形式
の組立に於いて、鉄心は45゜を越えてもよい角度（図５
のθ）で内側に傾斜している。
回転磁界は好ましくは２個の磁極片を反応スライドの
方に向けたＵ字形アルニコ磁石を使用することによって
発生される。また、適当な磁界強度であるが全体質量が
小さいＵ字形アルニコ磁石の等価物を得るために、希土
類を組み合わせた磁石を磁極片及びベースと組み合わせ
て使用することができる。これは適当に載せたネオジム
−鉄−ホウ素磁石を用いて得ることができる。磁石組立
体の磁石は、軸の周りに磁石が回転できるように磁石の
中心に空けた穴を通して直流モーターの軸に取り付ける
ことができる。磁極片は、本発明の乾式試薬を有する反
応チャンバーから、反応チャンバー及びその内容物に回
転磁界作用を与えるに十分などのような距離で配置して
もよい。磁石の磁極片と反応スライド基板の底面との間
の距離は、好ましくは約5mmである。反応スライドの温
度は試薬が溶解した後で磁性粒子の運動が抑制されない
どのような温度（即ち、試薬及び検体の凍結又は変性を
起こさせない温度）でも維持することができ、好ましく
は電気帯ヒーターのような適当な加熱手段で37℃に維持
する。電気帯ヒーターを使用するとき、ヒーターを熱安
定性接着剤によって約0.04厚さのアルミニウム板に貼り
付け、ヒーターと板との組立体を回転磁石と反応スライ
ドとの間に配置する。
方に向けたＵ字形アルニコ磁石を使用することによって
発生される。また、適当な磁界強度であるが全体質量が
小さいＵ字形アルニコ磁石の等価物を得るために、希土
類を組み合わせた磁石を磁極片及びベースと組み合わせ
て使用することができる。これは適当に載せたネオジム
−鉄−ホウ素磁石を用いて得ることができる。磁石組立
体の磁石は、軸の周りに磁石が回転できるように磁石の
中心に空けた穴を通して直流モーターの軸に取り付ける
ことができる。磁極片は、本発明の乾式試薬を有する反
応チャンバーから、反応チャンバー及びその内容物に回
転磁界作用を与えるに十分などのような距離で配置して
もよい。磁石の磁極片と反応スライド基板の底面との間
の距離は、好ましくは約5mmである。反応スライドの温
度は試薬が溶解した後で磁性粒子の運動が抑制されない
どのような温度（即ち、試薬及び検体の凍結又は変性を
起こさせない温度）でも維持することができ、好ましく
は電気帯ヒーターのような適当な加熱手段で37℃に維持
する。電気帯ヒーターを使用するとき、ヒーターを熱安
定性接着剤によって約0.04厚さのアルミニウム板に貼り
付け、ヒーターと板との組立体を回転磁石と反応スライ
ドとの間に配置する。
血液凝固反応を回転磁界内で測定できるこの配置で、
懸濁している磁性酸化鉄粒子の凝結とフィブリンを重合
させることによる包含（entrapment）によって光散乱及
び吸収の急速に進行する減少及びその結果としての反応
スライド基板からのバックグラウンド反射の増加が得ら
れる。
懸濁している磁性酸化鉄粒子の凝結とフィブリンを重合
させることによる包含（entrapment）によって光散乱及
び吸収の急速に進行する減少及びその結果としての反応
スライド基板からのバックグラウンド反射の増加が得ら
れる。
本発明で有用な磁界回転周波数の範囲は約15〜60Hzで
ある。最善の信号対雑音比についての磁石の好ましい回
転周波数は希釈血漿検体については約35Hzであり、全血
検体については約20Hzである。磁石が止まっていると
き、磁界は好ましくは検体に平行に420ガウス±20ガウ
スであり、検体に垂直に０ガウス±50ガウスである。得
られる終点（図４、長い平坦域の後の上昇）は信号処理
の当業者に公知の種々の方法で検出できる。好ましい態
様に於いて、全波形をコンピュータのメモリーに入れ、
平坦領域及び上昇領域について線形回帰を行い、これら
の回帰直線の交点によって終了時間又は終点が得られ
る。また、凝固時間終点は平坦部で確立された信号振幅
から予めセットされた閾値を越える上昇として決定する
ことができる。終点は曲線の下に延ばされた下方参照直
線として図４に示されている。この線は実際の信号の一
部ではない。
ある。最善の信号対雑音比についての磁石の好ましい回
転周波数は希釈血漿検体については約35Hzであり、全血
検体については約20Hzである。磁石が止まっていると
き、磁界は好ましくは検体に平行に420ガウス±20ガウ
スであり、検体に垂直に０ガウス±50ガウスである。得
られる終点（図４、長い平坦域の後の上昇）は信号処理
の当業者に公知の種々の方法で検出できる。好ましい態
様に於いて、全波形をコンピュータのメモリーに入れ、
平坦領域及び上昇領域について線形回帰を行い、これら
の回帰直線の交点によって終了時間又は終点が得られ
る。また、凝固時間終点は平坦部で確立された信号振幅
から予めセットされた閾値を越える上昇として決定する
ことができる。終点は曲線の下に延ばされた下方参照直
線として図４に示されている。この線は実際の信号の一
部ではない。
この配置はAdler（米国特許第3,650,698号）及びLich
tenstein（オーストラリア特許出願第47981/72号｛460.
038｝｛1971年12月13日、米国特許出願第207196号｝）
によって先行技術で教示されているものとは異なってい
る。Adlerは粒子を混合域の周辺に移動させる傾向があ
る回転バー又は円筒形磁石を用いた。更に、Adlerの磁
性粒子は毛管反応チャンバーのない表面の一つのスポッ
トでポリビニルピロリドンフィルムの中に入っていた。
Adlerでは更に血漿の正確なアリコートを粒子を含むス
ポットに付与する必要があり、液体中に粒子を適当に懸
濁させるために予備インキュベーション時間（例えば、
60秒間）が必要であった。その後、メーカーの使用説明
書に従って予め調製した液体凝固試薬（トロンボプラス
チン）の正確なアリコートを、検体及び懸濁している粒
子を有するスポットに付与した。試薬を付与した瞬間に
タイマーをスタートさせ、粒子が凝結して反射に大きな
変化が出たとき止めた。Adlerは凍結乾燥した凝集試薬
を全体に本質的に均一に分散させた磁性粒子と一緒に使
用することを教示してはおらず、毛管反応チャンバーを
使用することも教示しなかった。それで、本発明の使用
者にとっての便利性は得られなかった。更に、Adlerは
検体中のフィブリノーゲンの測定を教示しなかった。
tenstein（オーストラリア特許出願第47981/72号｛460.
038｝｛1971年12月13日、米国特許出願第207196号｝）
によって先行技術で教示されているものとは異なってい
る。Adlerは粒子を混合域の周辺に移動させる傾向があ
る回転バー又は円筒形磁石を用いた。更に、Adlerの磁
性粒子は毛管反応チャンバーのない表面の一つのスポッ
トでポリビニルピロリドンフィルムの中に入っていた。
Adlerでは更に血漿の正確なアリコートを粒子を含むス
ポットに付与する必要があり、液体中に粒子を適当に懸
濁させるために予備インキュベーション時間（例えば、
60秒間）が必要であった。その後、メーカーの使用説明
書に従って予め調製した液体凝固試薬（トロンボプラス
チン）の正確なアリコートを、検体及び懸濁している粒
子を有するスポットに付与した。試薬を付与した瞬間に
タイマーをスタートさせ、粒子が凝結して反射に大きな
変化が出たとき止めた。Adlerは凍結乾燥した凝集試薬
を全体に本質的に均一に分散させた磁性粒子と一緒に使
用することを教示してはおらず、毛管反応チャンバーを
使用することも教示しなかった。それで、本発明の使用
者にとっての便利性は得られなかった。更に、Adlerは
検体中のフィブリノーゲンの測定を教示しなかった。
Lichtensteinは彼の装置の潜在的応用としてフィブリ
ノーゲン測定を考えているが、この目的を達成する方法
は教示していない。更に、Lichtensteinの装置では教示
される応用に有用な混合を行うために回転する第一磁石
に加えて静止している第二磁石が必要である。Lichtens
teinの装置は単にAlderの装置を改善したものと考えら
れる。
ノーゲン測定を考えているが、この目的を達成する方法
は教示していない。更に、Lichtensteinの装置では教示
される応用に有用な混合を行うために回転する第一磁石
に加えて静止している第二磁石が必要である。Lichtens
teinの装置は単にAlderの装置を改善したものと考えら
れる。
本発明を一般的に記載したが、ある特定の実施例を参
照することによってより以上の理解が得られるであろ
う。この実施例は単に例示する目的のために本明細書に
記載するものであり、他に特定しない限り限定すること
を意図するものではない。
照することによってより以上の理解が得られるであろ
う。この実施例は単に例示する目的のために本明細書に
記載するものであり、他に特定しない限り限定すること
を意図するものではない。
実施例
実施例１
0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）中に0.3ミクロン
平均粒子径のFe3O4（磁性酸化鉄）を7mg/mL含む懸濁液
及び約50単位/mLに希釈されたウシトロンビン試薬Dade
（登録商標）Data−Fi（登録商標）トロンビン試薬（Ba
xter Diagnostics,Inc.,カタログ番号B4233−27）を加
えることによって、検体中のフィブリノーゲンを測定す
るための乾式化学反応スライドを作成した。混合物を反
応スライドの反応空間に入れ、次いで液体窒素中で−19
5℃で凍結させた。この方法で作成した反応スライドを
次いで−35℃の初期棚温度で凍結乾燥器内で凍結乾燥し
た。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、これをフ
ィブリノーゲン決定に使用するまでフォイルパウチ内に
包装した。フィブロメーター凝固装置を用いる血漿検体
中のフィブリノーゲン測定のために、同じトロンビン試
薬を50単位/mL濃度で液体状で使用した。それぞれの装
置について、測定された参照血漿（ARP）（Helena Labo
ratories,Inc.）を使用して較正を行った。血漿検体を
オーレンの緩衝液に希釈し、クラウス法によって試験し
た。図１にこの実施例で行った研究の結果を示す。乾式
化学反応スライド及び付属する装置（図２）で得られた
フィブリノーゲン（mg/DL）を、フィブロメーターで得
られたフィブリノーゲンに対して縦軸にプロットし、ｒ
＝0.989のピアーソン相関係数を有する直線が得られ
た。図１に示すデータは76個の病院患者、３個の測定し
た参照血漿（ARP）及び２個のプールした正常血漿（PN
P）からなっている。図３に、この装置及び乾式化学反
応スライドから得られた典型的な生データ曲線を示す。
これは繰り返し測定での凝固時間の正確性を示してい
る。
平均粒子径のFe3O4（磁性酸化鉄）を7mg/mL含む懸濁液
及び約50単位/mLに希釈されたウシトロンビン試薬Dade
（登録商標）Data−Fi（登録商標）トロンビン試薬（Ba
xter Diagnostics,Inc.,カタログ番号B4233−27）を加
えることによって、検体中のフィブリノーゲンを測定す
るための乾式化学反応スライドを作成した。混合物を反
応スライドの反応空間に入れ、次いで液体窒素中で−19
5℃で凍結させた。この方法で作成した反応スライドを
次いで−35℃の初期棚温度で凍結乾燥器内で凍結乾燥し
た。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、これをフ
ィブリノーゲン決定に使用するまでフォイルパウチ内に
包装した。フィブロメーター凝固装置を用いる血漿検体
中のフィブリノーゲン測定のために、同じトロンビン試
薬を50単位/mL濃度で液体状で使用した。それぞれの装
置について、測定された参照血漿（ARP）（Helena Labo
ratories,Inc.）を使用して較正を行った。血漿検体を
オーレンの緩衝液に希釈し、クラウス法によって試験し
た。図１にこの実施例で行った研究の結果を示す。乾式
化学反応スライド及び付属する装置（図２）で得られた
フィブリノーゲン（mg/DL）を、フィブロメーターで得
られたフィブリノーゲンに対して縦軸にプロットし、ｒ
＝0.989のピアーソン相関係数を有する直線が得られ
た。図１に示すデータは76個の病院患者、３個の測定し
た参照血漿（ARP）及び２個のプールした正常血漿（PN
P）からなっている。図３に、この装置及び乾式化学反
応スライドから得られた典型的な生データ曲線を示す。
これは繰り返し測定での凝固時間の正確性を示してい
る。
実施例２
実施例１に於けるようにしてフィブリノーゲン測定用
の乾式化学反応スライドを作成し、続いてウシトロンビ
ン試薬（Sigma Companyカタログ番号4648）を使用して
試験した。
の乾式化学反応スライドを作成し、続いてウシトロンビ
ン試薬（Sigma Companyカタログ番号4648）を使用して
試験した。
実施例３
実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを
作成し、続いてヒトトロンビン試薬（Ortho Diagnostic
Systems,Inc.製品コード731200（Fibrindex））を使用
して試験した。
作成し、続いてヒトトロンビン試薬（Ortho Diagnostic
Systems,Inc.製品コード731200（Fibrindex））を使用
して試験した。
実施例４
実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを
作成したが、0.5％マンニトール（Sigmaカタログ番号Ｍ
−4125）を凍結乾燥する前に添加剤として反応混合物に
添加した。結果は匹敵するものであった。
作成したが、0.5％マンニトール（Sigmaカタログ番号Ｍ
−4125）を凍結乾燥する前に添加剤として反応混合物に
添加した。結果は匹敵するものであった。
実施例５
実施例１に於けるようにして乾式化学反応スライドを
作成したが、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）も凍結乾
燥する前に添加剤として反応混合物に使用した。測定正
確性は僅かに改良された。凍結乾燥する前に20mg/mLの
ポリエチレングリコール（PEG）を添加すると凝固時間
は短くなり、測定正確性は低下した。
作成したが、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）も凍結乾
燥する前に添加剤として反応混合物に使用した。測定正
確性は僅かに改良された。凍結乾燥する前に20mg/mLの
ポリエチレングリコール（PEG）を添加すると凝固時間
は短くなり、測定正確性は低下した。
実施例６
更に、50mMのHEPES緩衝液及び10mg/mLのマンニトール
を使用して、実施例２に於けるようにして乾式化学反応
スライドを作成した。良好な結果が得られた。
を使用して、実施例２に於けるようにして乾式化学反応
スライドを作成した。良好な結果が得られた。
実施例７
1.5/mLのヒトトロンビン、50mMのHEPES緩衝液、pH7.
3、2mg/mLのポリエチレングリコール（3400ダルト
ン）、0.1mg/mLのポリブレン（polybrene）及び1.0mg/m
LのBSAを7mg/mLの0.3ミクロンの平均粒子直径を有するF
e3O4と一緒にすることによって、トロンビン時間決定用
の試験カードを作成した。混合物を反応スライドの反応
空間の中にピペットで入れ、次いで液体窒素中で−195
℃で凍結させた。この方法で作成した反応スライドを次
いで−35℃の初期棚温度で凍結乾燥器内で凍結乾燥し
た。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、これをト
ロンビン時間決定に使用するまでフォイルパウチ内に包
装した。トロンビン時間試験のために、未希釈の検体を
使用し、凝固時間を測定した。これらの条件下で正常な
フィブリノーゲンレベル（180〜400mg/mL）は10〜13秒
間の範囲内のトロンビン時間値を示した。異常なフィブ
リノーゲンレベルは13秒よりも長い、時には20秒よりも
長いトロンビン時間値になった。
3、2mg/mLのポリエチレングリコール（3400ダルト
ン）、0.1mg/mLのポリブレン（polybrene）及び1.0mg/m
LのBSAを7mg/mLの0.3ミクロンの平均粒子直径を有するF
e3O4と一緒にすることによって、トロンビン時間決定用
の試験カードを作成した。混合物を反応スライドの反応
空間の中にピペットで入れ、次いで液体窒素中で−195
℃で凍結させた。この方法で作成した反応スライドを次
いで−35℃の初期棚温度で凍結乾燥器内で凍結乾燥し
た。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、これをト
ロンビン時間決定に使用するまでフォイルパウチ内に包
装した。トロンビン時間試験のために、未希釈の検体を
使用し、凝固時間を測定した。これらの条件下で正常な
フィブリノーゲンレベル（180〜400mg/mL）は10〜13秒
間の範囲内のトロンビン時間値を示した。異常なフィブ
リノーゲンレベルは13秒よりも長い、時には20秒よりも
長いトロンビン時間値になった。
実施例８
約120、215、219及び360mg/mLのフィブリノーゲンレ
ベルを有する血漿検体を実施例１に於けるようにして試
験した。これらの検体を先ず希釈した。これらの希釈検
体のそれぞれの一つのアリコートを37℃に加温し、その
後この検体を反応スライドの検体ウエルに添加した。希
釈した検体のそれぞれの第二のアリコートを室温で検体
ウエルに添加した。全ての場合に、乾式化学反応スライ
ドの反応チャンバーを37℃に維持した。得られたフィブ
ロメーター（全ての検体を37℃に予め加温した）との相
関は、37℃に予め加温した検体アリコートについてはｒ
＝0.999であり、室温（24℃）の検体アリコートについ
てはｒ＝0.999であり、対にした検体のそれぞれについ
ての平均値は一般的に単一測定についての標準偏差内で
あった。それで適用した検体の温度はこの範囲内で小さ
い影響又は相関を有している。
ベルを有する血漿検体を実施例１に於けるようにして試
験した。これらの検体を先ず希釈した。これらの希釈検
体のそれぞれの一つのアリコートを37℃に加温し、その
後この検体を反応スライドの検体ウエルに添加した。希
釈した検体のそれぞれの第二のアリコートを室温で検体
ウエルに添加した。全ての場合に、乾式化学反応スライ
ドの反応チャンバーを37℃に維持した。得られたフィブ
ロメーター（全ての検体を37℃に予め加温した）との相
関は、37℃に予め加温した検体アリコートについてはｒ
＝0.999であり、室温（24℃）の検体アリコートについ
てはｒ＝0.999であり、対にした検体のそれぞれについ
ての平均値は一般的に単一測定についての標準偏差内で
あった。それで適用した検体の温度はこの範囲内で小さ
い影響又は相関を有している。
実施例９
Autolet（登録商標）器具を用いて皮膚穿刺を行い、
血液を毛細管に集めることによって、５人の正常なボラ
ンティア供血者を試験した。各供血者について、１本の
毛細管中の血液検体を１分以内にクエン酸塩含有緩衝液
（3.2％の緩衝したクエン酸三ナトリウム抗凝固薬）の
中に排出し、最終的に1:10に希釈し、実施例５（PEG無
し）の乾式化学反応スライドに適用し、分析した。５人
の供血者について静脈穿刺検体（血液９体積:3.2％クエ
ン酸塩１体積）を吸引採血管に集め、遠心分離して血小
板の少ない血漿を調製し、フィブロメーターで試験する
ことによって血漿フィブリノーゲンを決定した。このフ
ィブリノーゲン値は約230〜380mg/dLの範囲であった。
得られたデータは、大きく劣った相関を示すと予想され
たこの狭い範囲内でも、同じ供血者について静脈穿刺検
体を用いてフィブロメーターで得られた血漿フィブリノ
ーゲン値と0.924の優れた相関を示した。
血液を毛細管に集めることによって、５人の正常なボラ
ンティア供血者を試験した。各供血者について、１本の
毛細管中の血液検体を１分以内にクエン酸塩含有緩衝液
（3.2％の緩衝したクエン酸三ナトリウム抗凝固薬）の
中に排出し、最終的に1:10に希釈し、実施例５（PEG無
し）の乾式化学反応スライドに適用し、分析した。５人
の供血者について静脈穿刺検体（血液９体積:3.2％クエ
ン酸塩１体積）を吸引採血管に集め、遠心分離して血小
板の少ない血漿を調製し、フィブロメーターで試験する
ことによって血漿フィブリノーゲンを決定した。このフ
ィブリノーゲン値は約230〜380mg/dLの範囲であった。
得られたデータは、大きく劣った相関を示すと予想され
たこの狭い範囲内でも、同じ供血者について静脈穿刺検
体を用いてフィブロメーターで得られた血漿フィブリノ
ーゲン値と0.924の優れた相関を示した。
明らかに、本発明の多数の修正及び変形が上記の教示
に照らして可能である。それで、請求の範囲の範囲内
で、明細書に特に記載したもの以外のやり方で本発明を
実施できることが理解されるべきである。
に照らして可能である。それで、請求の範囲の範囲内
で、明細書に特に記載したもの以外のやり方で本発明を
実施できることが理解されるべきである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/86 Ａ６１Ｂ 5/14 ３１０
(56)参考文献 特開 平６−141895（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−500463（ＪＰ，Ａ)
特表 平１−502797（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/00 - 3/00
C12M 1/00 - 3/10
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (25)
- 【請求項１】（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒子
が均一に中に埋め込まれており、反応チャンバーの中に
入れられており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬
マトリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な
量の希釈血液検体と接触させて、該磁性粒子を回転磁界
の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ii）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁
界に対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を作
る工程、 （iii）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、
及び（iv）工程（iii）から得られる凝固時間終点を、
既知のフィブリノーゲン含有量の検体を用いて作成した
凝固時間終点対フィブリノーゲン含有量に関する記憶標
準較正曲線と比較して、検体中の凝固性フィブリノーゲ
ンの量を得る工程 を包含する、定量的フィブリノーゲン測定を行う方法。 - 【請求項２】該トロンビンがヒトトロンビンである請求
の範囲第１項記載のフィブリノーゲン測定を行う方法。 - 【請求項３】該トロンビンがウシトロンビンである請求
の範囲第１項記載のフィブリノーゲン測定を行う方法。 - 【請求項４】該希釈血液検体が希釈全血である請求の範
囲第１項記載のフィブリノーゲン測定を行う方法。 - 【請求項５】該希釈血液検体が希釈血漿である請求の範
囲第１項記載のフィブリノーゲン測定を行う方法。 - 【請求項６】該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれている
請求の範囲第４項記載のフィブリノーゲン測定を行う方
法。 - 【請求項７】（ｉ）液体検体を加えるための検体ウエル
を有する反応スライド及びトロンビンを含み、全体に均
一に分布された多数の磁性粒子が中に埋め込まれている
乾式試薬マトリックスを有する反応チャンバー、 （ii）回転磁界を発生する手段、及び （iii）該回転磁界に対する該磁性粒子の応答を検出す
るための光学的検出手段 を包含するフィブリノーゲン測定を行うためのシステム
であって、該検体ウエルと該反応チャンバーとは、該検
体ウエルに入れられた該反応チャンバーの体積に相当す
る体積の液体分析物検体が、該検体ウエルから該反応チ
ャンバーの方に移送されるような形状の移送帯域を介し
て液体接合されているものである、フィブリノーゲン測
定を行うためのシステム。 - 【請求項８】該トロンビンがヒトトロンビンである請求
の範囲第７項記載のフィブリノーゲン測定を行うための
システム。 - 【請求項９】該トロンビンがウシトロンビンである請求
の範囲第７項記載のフィブリノーゲン測定を行うための
システム。 - 【請求項１０】該希釈血液検体が希釈全血である請求の
範囲第７項記載のフィブリノーゲン測定を行うためのシ
ステム。 - 【請求項１１】該希釈血液検体が希釈血漿である請求の
範囲第７項記載のフィブリノーゲン測定を行うためのシ
ステム。 - 【請求項１２】該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれてい
る請求の範囲第10項記載のフィブリノーゲン測定を行う
ためのシステム。 - 【請求項１３】更に較正曲線を蓄えておく手段を包含す
る請求の範囲第10項記載のフィブリノーゲン測定を行う
ためのシステム。 - 【請求項１４】（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒
子が均一に中に埋め込まれており、反応チャンバーの中
に入っており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬マ
トリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な量
の未希釈血液検体と接触させて、該磁性粒子を回転磁界
の影響下に自由に移動できるようにする工程、 （ii）該血液検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁
界に対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を作
る工程、及び （iii）該応答曲線からトロンビン凝固時間を決定する
工程を包含する、トロンビン凝固時間試験を行う方法。 - 【請求項１５】該トロンビンがヒトトロンビンである請
求の範囲第14項記載のトロンビン凝固時間試験を行う方
法。 - 【請求項１６】該トロンビンがウシトロンビンである請
求の範囲第14項記載のトロンビン凝固時間試験を行う方
法。 - 【請求項１７】該未希釈血液検体が未希釈全血である請
求の範囲第14項記載のトロンビン凝固時間試験を行う方
法。 - 【請求項１８】該未希釈血液検体が未希釈血漿である請
求の範囲第14項記載のトロンビン凝固時間試験を行う方
法。 - 【請求項１９】該未希釈全血に更に抗凝固薬が含まれて
いる請求の範囲第17項記載のトロンビン凝固時間試験を
行う方法。 - 【請求項２０】（ｉ）トロンビンを含み、多数の磁性粒
子が均一に中に埋め込まれており、反応チャンバーの中
に入っており、そして回転磁界にかけられる乾式試薬マ
トリックスを、該反応チャンバーを充填するに十分な量
の希釈参照検体（但し、該希釈参照検体には既知量のフ
ィブリノーゲンが含まれている）と接触させて、該磁性
粒子を回転磁界の影響下に自由に移動できるようにする
工程、 （ii）該参照検体が凝固する間に該磁性粒子の該回転磁
界に対する応答を光学的にモニターして、応答曲線を作
る工程、 （iii）該応答曲線から凝固時間終点を決定する工程、 （iv）各凝固時間決定のために、既知量のフィブリノー
ゲンを含有する他の希釈参照検体（但し、使用する追加
の各希釈参照検体は、全ての使用する他の希釈参照検体
とは異なった既知量のフィブリノーゲンを含有する）を
用いて、工程（ｉ）〜（iii）を繰り返す工程、及び （ｖ）二次元プロットの一方の軸に各検体についての凝
固時間終点をプロットし、他の軸に工程（ｉ）〜（iv）
で使用した血液検体中のフィブリノーゲンの量をブロッ
トするか又は電子的にこのデータを蓄えて該二次元プロ
ットを生じさせる工程 を包含する、フィブリノーゲンを測定するための標準較
正曲線の作成方法。 - 【請求項２１】該トロンビンがヒトトロンビンである請
求の範囲第20項記載のフィブリノーゲンを測定するため
の標準較正曲線の作成方法。 - 【請求項２２】該トロンビンがウシトロンビンである請
求の範囲第20項記載のフィブリノーゲンを測定するため
の標準較正曲線の作成方法。 - 【請求項２３】該希釈参照検体が希釈全血である請求の
範囲第20項記載のフィブリノーゲンを測定するための標
準較正曲線の作成方法。 - 【請求項２４】該希釈参照検体が希釈血漿である請求の
範囲第20項記載のフィブリノーゲンを測定するための標
準較正曲線の作成方法。 - 【請求項２５】該希釈全血に更に抗凝固薬が含まれてい
る請求の範囲第23項記載のフィブリノーゲンを測定する
ための標準較正曲線の作成方法。
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