JP2015521738A5 - - Google Patents
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Claims (26)
- 生物学的試料中の、タンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度との、インビボでの血流条件をシミュレーションしながらのリアルタイムでのインビトロ同時決定のための方法であって、以下のステップを含む、前記方法:
a)該生物学的試料における凝血を可能にするように、該生物学的試料におけるタンパク質分解酵素活性の産生を誘発することと、該生物学的試料を、産生されたタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物と関連する検出可能なシグナルを引き起こすシグナル基質と接触させることと、
b)a)で得られた試料混合物を薄層として広げることと、測定システムと、シグナル基質とタンパク質分解酵素との反応後に得られた検出可能なシグナルの測定に適した容器内に保持されたa)で得られた試料混合物との間の測定ギャップを設定することと、
c)b)で得られた試料混合物に回転力を適用し、それによって、決定されたインビボでの生理学的又は臨床的状態の、インビボでの静脈又は動脈血流をシミュレーションすることと、
d)生物学的試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を提供することと、
e)前記誘発された生物学的試料に関して、回転式レオメーターを用いて、経時的な粘度の増大を、該生物学的試料におけるフィブリンの形成の測定と同時にモニタリングすること。 - ステップd)において、前記経時的なタンパク質分解酵素活性の結果が、曲線として提供される、請求項1記載の方法。
- ステップb)において、前記レオメーター測定システムと前記試料混合物との間で設定された前記測定ギャップが、ゼロギャップである、請求項1記載の方法。
- 決定されたタンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度とをリアルタイムで決定するための請求項1〜4のいずれか一項記載の方法であって、前記生物学的試料を、第1の副次試料と第2の副次試料を含めた副次試料と呼ばれる少なくとも2つの部分に分割する最初のステップを含み、請求項1記載のステップa)からe)が、第1の副次試料に対して実施され、かつ決定されたタンパク質分解酵素活性の測定結果の較正のために、第2の副次試料に対して以下のステップが実施される、前記方法:
f)凝血しない第2の副次試料に、前記決定されたタンパク質分解酵素のためのシグナル基質に対する一定の安定した活性を有するか、又は副次試料の凝血反応においては不活性である較正化合物を添加することと、該較正化合物と第2の副次試料との得られた混合物を、シグナル基質と該第2の副次試料のタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質と接触させることと、
g)第2の副次試料との、ステップf)で得られた前記混合物を、本明細書で定義した発明の方法のステップb)及びc)にかけることと、
h)第2の副次試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を提供することと、
i)ステップg)で得られた結果を、ステップd)で得られたタンパク質分解酵素活性の結果と比較して、第1の副次試料における時間内のタンパク質分解酵素活性の較正された結果を得ること。 - ステップh)において、前記経時的なタンパク質分解酵素活性の結果が、曲線として提供される、請求項4記載の方法。
- ステップi)において、前記第1の副次試料における時間内のタンパク質分解酵素活性の較正された結果が、較正された曲線として提供される、請求項4又は5記載の方法。
- ステップb)で得られた混合物に、回転力に加えて、振動力が適用される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記生物学的試料が、全血、多血小板血漿、乏血小板血漿、及び無血小板血漿からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質分解活性が、活性化された凝固因子活性、活性化された線維素溶解因子活性、及び補体系活性の活性化された成分からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素活性が、トロンビン活性である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記シグナル基質が、該シグナル基質と形成されたタンパク質分解酵素との反応時に、検出可能な変換生成物として選択的に放出される脱離基を含む化合物からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記シグナル基質が、トロンビンに対する中程度の結合親和性及び低い動力学定数を有する、トロンビンによって選択的に加水分解される蛍光発生基質である、請求項11記載の方法。
- 前記シグナル基質が、蛍光分子と結合された、トロンビンに対する合成の基質である、請求項12記載の方法。
- 前記蛍光発生基質が、蛍光分子と結合された、2から30個のアミノ酸残基の配列を有するオリゴペプチドである、請求項12記載の方法。
- 前記オリゴペプチドが、蛍光分子と結合するための末端リシン又はアルギニンを有する、請求項14記載の方法。
- 前記シグナル基質が、(Z-Gly-Gly-Arg)2Rho110又はZ-Gly-Gly-Arg-AMCである、請求項15記載の方法。
- 前記生物学的試料を誘発するプロテアーゼ活性化因子が、リン脂質、組織因子、可溶性の組織因子、トロンボプラスチン、カオリン、及びエラグ酸からなる群から選択され、かつ、凝血反応を誘発する試薬が、カルシウムイオンである、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 止血又は血栓形成疾患を検出する又はモニタリングするために使用される場合の、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 以下のために使用される場合の、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法:
-生物学的試料中のトロンビン活性及び血餅強度に対する決定された物質の効果を検出する又はモニタリングすること(ここで、該決定された物質は、分析される試料に添加されるか、又はトロンビン産生中に添加される)、又は
-薬物による治療中の患者の生物学的試料に対する該薬物の効果をモニタリングすること、又は
-物質をスクリーニングして、該物質のトロンビン産生又は線維素溶解又は凝血との相互作用能力を決定すること、
-止血-血栓形成システムにおける分子の欠乏を評価すること、又は
-血餅開始を引き起こすのに必要なトロンビンの最小量を決定すること。 - 前記決定された物質が、薬物又は医薬品である、請求項19記載の方法。
- タンパク質分解酵素活性の推移の決定のための、及び、生物学的試料中の形成されたフィブリン血餅の強度の同時決定のためのキットであって、以下を含む、前記キット:
-回転式レオメーター上での使用に適した透明な底面を有する使い捨ての試料ホルダー中の、シグナル基質と、誘発された試料中で産生されるタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質の組成物、並びに該試料中のタンパク質分解酵素活性を誘発するための組成物、
-任意に、該シグナル基質に対する一定の安定したタンパク質分解酵素活性を有する較正化合物、及び
-任意に、適切な緩衝液。 - 生物学的試料の血餅強度及び該生物学的試料から放出される蛍光シグナルを測定するための回転式レオメーターであって、それらの間で試験される試料(13)の導入のための測定ギャップ(g)を決定付ける基本エレメント(6)及び回転エレメント(4)、該回転エレメント(4)の回転速度を測定するための手段(8)、及び/又は、該回転エレメント(4)に適用されるトルクを備え、該生物学的試料(13)から放出された蛍光シグナルを数量化するための蛍光光度計(12)を備える、前記レオメーター。
- 前記回転エレメントが、円錐体(4)を備え、前記基本エレメントが、プレート(14’)を備え、前記測定ギャップ(g)が、該円錐体(4)のチップ(5)と該プレート(14’)との間に形成されている、請求項22記載の回転式レオメーター。
- 前記基本エレメント(7)が、透明な表面(7、14)を備え、該透明な表面(7、14)が、該表面(7、14)を通過した、試料(13)から放出された蛍光シグナルの、蛍光光度計(7)による検出及び数量化を可能にするものである、請求項22又は23記載の回転式レオメーター。
- 材料を配置して、血液凝固に対する該材料の効果を研究し、該材料生体適合性を研究することができる、請求項22〜24のいずれか一項記載の回転式レオメーター。
- 請求項1〜19のいずれか一項記載の、生物学的試料中のタンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度との、インビボの血流条件をシミュレーションしながらのリアルタイムでのインビトロ同時決定のための方法における、請求項22〜25のいずれか一項記載の回転式レオメーターの使用。
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