KR101383333B1 - 트롬빈 생성 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계; (b) 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)로부터 트롬빈의 농도를 추론하는 단계를 포함하는 신규한 트롬빈 생성 측정 방법을 제공한다. 본 발명은 반응 혼합물의 볼륨을 극소화하여 반응시간을 현저하게 낮춤으로써 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 도출할 수 있다. 본 발명은 종래에 널리 이용되고 있는 PCR 장비를 이용함으로써 부가적으로 고가의 장비를 설치하지 않고도 쉽게 결과를 도출할 수 있다는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공한다.

Description

트롬빈 생성 측정 방법{A Method for Measuring Thrombin Generation}
본 발명은 트롬빈 생성 측정 방법에 관한 것이다.
혈관 내의 세포 성분과 혈장 단백이 혈관 외 조직에 노출되면, 혈소판과 섬유상 단백으로 구성된 응괴를 형성하여 혈관 손상 부위를 막음으로써 혈액이 손실되지 않도록 한다. 반면 동일 기전이 과도하게 작용하게 되면 혈전을 형성함으로써 관상동맥질환이나 뇌졸중 등의 다양한 순환기 질환을 초래하게 된다.
트롬빈 형성의 의미를 이해하기 위해서는 혈액 응괴 형성 과정에서 혈액응고인자들의 작용을 이해할 필요가 있다. 세포성분을 제외한 혈액응괴는 앞서 밝힌 바와 같이 섬유상 단백으로 구성되어 있다. 이 섬유상 단백의 구성단위는 섬유소 단백으로 중합반응을 통해 그 자체로도 섬유소 응괴를 형성할 수 있다.
섬유소 단백의 전구체는 섬유소원인데, 단백 절단 효소인 트롬빈에 의해 섬유소로 전환된다. 그러므로 트롬빈은 섬유소 응괴 형성과 직접적으로 관련된 혈장 효소단백이다. 혈액응고는 혈액 내 단백절단 효소들의 연쇄작용에 의해 최종적으로 트롬빈과 섬유소 응괴가 형성되는 과정으로 요약할 수 있으며, 그 모식도는 도 1과 같다. 응고 작용은 일련의 효소-기질 반응으로 구성되어 있으며, 대부분의 응고인자는 다른 응고인자의 기질인 동시에 다른 응고인자를 절단하는 효소이기도 하다. 각 단계의 응고인자는 다음 단계의 응고인자를 절단함으로써 전구체에서 활성 효소 또는 활성 응고인자로 전환 시키는 역할을 한다. 프로트롬빈은 응고인자 10번에 의해 절단되어 활성 효소인 트롬빈으로 전환된다. 연쇄 반응 결과 트롬빈 및 섬유소가 단시간 내에 급격히 증가하여 응괴가 신속히 형성될 수 있다. 트롬빈은 섬유소 형성 외에도 트롬보모듈린이라는 혈관 내피 세포막 단백과 결합하여 안티트롬빈과 단백질 C를 활성화시킴으로써 응고작용의 조절에도 중요한 역할을 하며, 혈소판 활성화에도 관여한다.
혈액 응고는, 단백질 가수분해 효소를 통하여 활성화된 형태로 전환되는, 혈액내에 존재하는 다양한 효소전구체(proenzyme) 및 보조인자 전구체(procofactor)가 관여되는 연속증폭된 단계를 따라서 발생한다. 이러한 응고의 연속적 단계(또는 연속증폭)에 있어서, 외인성 응고 경로(extrinsic coagulation pathway)와 내인성 응고 경로(intrinsic coagulation pathway)로 명명되는 2가지 경로가 구별된다. 2가지 경로 모두 활성화된 제X인자(FXa), 활성화된 제V인자(FVa), 인지질 및 칼슘으로 구성되는 프로트롬빈 분해효소(prothrombinase)로 명명된 복합체의 형성을 유도한다. 프로트롬빈 분해효소는 프로트롬빈(prothrombin)을 트롬빈(thrombin)으로 활성화시키고, 트롬빈은 용해성 피브리노겐(fibrinogen, 섬유소원)을 혈괴(clot)를 형성하는 불용성 피브린(fibrin, 섬유소)으로 전환시킬 수 있다.
임상검사실에서 주로 출혈 위험 환자의 선별 목적으로 사용되는 응고 검사는 응괴형성속도의 측정을 검사 원리로 한다. 응고인자 결핍이나 기능 이상은 일반적으로 응괴형성을 지연시키는 경향이 있다. 하지만 실제 출혈 부위에서 트롬빈 형성양의 90%는 응고시간으로 보고되는 시점 이후에 생성되며 생성된 트롬빈은 물론 생리적 또는 병리적 관점에서의 역할과 의미를 갖고 있다. 트롬빈 생성 저하는 출혈 위험을, 트롬빈 과생성은 혈전증의 위험이 높아짐을 의미하는데, 응고시간 측정으로 잘 탐지되지 않는 경우가 많은 반면, 트롬빈 생성 분석법으로는 아래 그림과 같이 두 경우가 뚜렷이 구분된다(G20210A: 혈전성향증, AVK: 항응고제 복용)(도 2).
일례로 항인지질 증후군에서 혈전증 발생과 관련이 높은 것으로 알려진 루푸스 항응고제는 체내에서의 병리 작용과 달리 검사에서는 응고시간을 연장시키는 현상으로 인해 항응고제라는 역설적 이름이 붙여졌다. 응고시간이 지연됨에도 불구하고 실제로 생성되는 트롬빈 양은 증가됨이 실험적으로 밝혀졌는데, 이로부터 응고시간 측정보다 트롬빈 생성량 또는 생성률의 측정이 임상적으로 의미 있는 정보를 제공함을 알 수 있다. 다만 트롬빈 생성을 측정하는 고전적 실험 방법이 복잡하고 난이도가 높은 관계로 임상 검사실에서는 응고시간 측정에 기초한 임상 검사들을 개발하고 채택해 왔다. 하지만 최근 트롬빈 생성 분석법에 발색 트롬빈 기질과 형광 플레이트 리더 장비를 적용하면서 실험 방법이 단순해짐으로 인해 점차 그 활용 빈도가 지속적으로 증가되어 왔다. 최근 거의 대부분의 응고 관련 실험 연구 논문들은 응고 작용의 세계적 평가 방법으로 트롬빈 생성 분석법을 사용하고 있다.
실험 방법의 간편해짐에 따라 실험연구 또는 연구목적 검사로서 트롬빈 생성 분석법(thrombin generation assay)이 보편적으로 채택되는 상황임에도 임상 검사실의 관점에서 이를 통상적인 임상 검사로 채택하기엔 현 응고 검사와 비교하여 몇 가지 약점을 갖고 있다. 첫째, 검사 소요 시간이 매우 긴 문제점으로 인해 포괄적인 정보를 제공함에도 불구하고 수분 이내에 각 검체 별 검사를 완료하는 현 응고시간 측정 검사의 신속성을 따라잡기 어렵다. 둘째, 종래의 측정방식은 고가의 다목적 플레이트 리더를 필요로 한다. 셋째, 종래의 측정방법은 96-웰 플레이트를 사용하며 각 웰 내 효소반응에 따른 발색 또는 형광 반응을 일정 시간 동안 측정하는 방식을 채택하고 있어, 측정 후 오염된 웰의 보관(웰 스트립 사용에도 해당) 문제와 미사용 웰을 포함한 플레이트 처리의 비용 문제로 인해 검체를 모아서 한꺼번에 처리를 해야 하는데 수 시간 내 결과 보고를 요하는 통상 검사의 성격에도 맞지 않는 방식이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 트롬빈 생성을 신속하게 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계; 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 단계; 트롬보그램으로부터 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 신규한 트롬빈 생성 측정 방법을 개발하였고, 이러한 방법에 따르면, 반응시간을 현저하게 낮추어 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 트롬빈 생성 측정 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 트롬빈 생성 측정 방법을 제공한다:
(a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계;
(b) 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 트롬빈의 농도를 측정하는 단계.
본 발명자들은 트롬빈 생성을 신속하게 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과, 형광 기질로 로다민 트롬빈 기질을 이용하면서 총 반응 혼합물의 볼륨을 15 μl 이하로 줄여 반응시간을 현저하게 낮출 수 있는 새로운 트롬빈 생성 측정 방법을 도출하였다.
본 발명은 기존의 실시간 PCR 장비를 이용하여 편리하면서, 효소-기질 반응 시간을 효율적으로 단축시킬 수 있는 트롬빈 생성 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 단계 (a)에서 로다민 트롬빈 기질에 트롬빈 생성 반응 개시성분을 혼합하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “트롬빈 생성 반응 개시성분” 또는 “개시 성분”은 프로트롬빈으로부터 트롬빈의 생성이 시작되게 하는 필요 불가결한 성분을 의미한다. 본 발명의 트롬빈 생성 반응을 개시하는 성분은 조직 인자를 필수적으로 포함한다. 바람직하게는 트롬빈 생성 반응을 개시하는 성분은 트롬빈 생성 반응을 작동시키는데 충분한 농도로, 필수적으로 칼슘 이온 제공원(Ca2 +), 인지질 물질 및 조직 인자(TF)를 포함한다. 본 발명에서 칼슘 이온의 적당한 제공원으로는 CaCl2와 같이 칼슘 이온의 어떠한 생물학적으로 적합한 제공원이면 무방하다. Ca2 +의 제공원은 트롬빈 생성 반응을 개시하는 다른 성분과 함께 즉각적으로 또는 지연된 방식, 즉 트롬빈 생성 반응을 개시하는 다른 성분의 첨가 이후에, 시료/혈장 혼합물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형광생성 기질은 로다민 트롬빈 기질을 이용할 수 있다. 바람직하게는 로다민 110-기반 트롬빈 기질이다. 본 발명에 따르면 로다민 트롬빈 기질의 여기 파장은 498 nm이고 방출 파장은 521 nm이다.
본 발명에서 칼슘 이온의 충분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 혼합물 내 칼슘 이온의 최종 농도가 14 내지 18 mM의 범위 내에 포함되는, 구체적으로, 16 mM와 동일한 농도를 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 인지질 물질은 농축되거나 동결건조된 제품의 형태일 수 있고, 바람직하게는 다량의 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 포스파티딜세린(phosphatidylserine)을 포함하거나, 독점적으로 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린을 함유하는 혼합물로 구성될 수 있다.
본 발명에서 인지질 물질의 충분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 혼합물내 인지질 물질의 최종 농도가 0.1 내지 5 μM의 범위 내에 포함되는, 구체적으로 0.5 내지 2 μM의 범 위내에 포함되는, 보다 구체적으로 1 μM과 동일한 농도를 의미한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 조직 인자는 어떠한 천연 물질, 혈장, 재조합 또는 이식유전자를 갖는 조직 인자, 어떠한 변형된 조직 인자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이때 상기 변형된 조직 인자는 매우 부분적일지라도, 효소적 활성의 보조인자(cofactor)로서 작용할 수 있는 능력이 유지되는 것을 특징으로 한다. 적합한 변형된 조직 인자는 예를 들면, 디아그노스티카 스타고(Diagnostica Stago)로부터 상업적으로 입수 가능한 STACLOT 키트의 조직 인자와 같이 막관통 영역(transmembrane domain)이 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 조직 인자의 충분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 혼합물 내 조직 인자의 최종 농도가 1 내지 10 pM의 범위 내에 포함되며, 바람직하게는 4 내지 6 pM의 범위 내에 포함되고, 보다 바람직하게는 5 pM과 동일한 농도이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 로다민 트롬빈 기질, 트롬빈 생성 반응 개시성분 및 혈장의 혼합은 모세관에서 실시할 수 있고, 바람직하게는 실시간 PCR 용 모세관이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 트롬빈 기질 및 트롬빈 생성 반응 개시성분의 혼합물이 담긴 모세관에 튜빙을 연결하여 혈장을 주입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혈장, 로다민 트롬빈 기질 및 트롬빈 생성 반응 개시성분의 혼합물의 볼륨은 바람직하게는 5-15 μl이고, 보다 바람직하게는 8-14 μl이며, 보다 더 바람직하게는 10-12 μl이다. 본 발명에 따르면, 효소-기질 반응 혼합물의 볼륨을 극소화함으로써 반응 완료시간을 대폭 단축할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 따르면, 공지된 트롬빈 농도를 포함하는 시료로부터 얻어진 “표준”(standard) 트롬보그램의 파라미터와 시료의 트롬보그램 파라미터를 비교함으로써, 테스트되는 상기 시료 내 트롬빈의 농도를 결정할 수 있다.
트롬빈 생성 분석법은 당업자에게 공지된 테스트이고(Thrombin generation assays: accruing clinical relevance, H. C Hemker et al., Curr . Opin . Hematol. , 11:170-175(2004)), 목적하는 시료를 트롬빈 생성 반응을 개시하는 성분과 접촉하도록 놓았을 때, 이것은 생성된 트롬빈의 분량과 이러한 트롬빈을 생성하는데 필요한 시간을, 연속적 방식으로, 측정하는 것을 가능케 한다. 목적하는 시료(또는 상기 시료를 포함하는 용액)가 상기 반응을 개시하는 성분과 접촉하도록 놓여졌을 때, 상기 트롬빈 생성 반응이 시작된다. 상기 트롬빈 생성 테스트의 출발에 상응하는 이러한 시작 시간을 t0로 명명한다. 그리고 나서, 생성된 트롬빈은 형광생성 물질(fluorogenic agent)을 분해하여 형광을 발생시킨다. 바람직하게는, 상기 형광생성 물질 또는 발색 물질은 트롬빈 생성 반응 개시성분과 동시에 혈장 혼합물에 참가된다. 새롭게 생성된 트롬빈에 의해 형광생성 물질의 분해로부터 생성되는 형광은 형광측정기(fluorimeter)와 같은 측정 장치에 의해 검출된다. 형광측정기는 당업계에 공지된 다양한 형광측정기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 실시간 PCR 장비일 수 있다. 또한, 사용되는 형광측정기는 시간 경과에 따른 형광의 변화를 기록하는 수단 또는 표시하는 수단을 제공한다. 상기 형광측정기에 의해 수집된 데이터는 트롬보그램(thrombogram)이라 명명된, 시간 경과에 대한 형광의 변화 커브를 확립하는 것을 가능케 한다. 트롬보그램으로부터 4가지 유도된 파라미터를 측정할 수 있다: nM의 트롬빈으로 표현되는 피크 높이는 반응 동안에 특정 시간 tmax에 생성된 트롬빈의 최대 농도에 상응한다; 분으로 표현되는 지체 시간(lag time)은 트롬빈 생성 테스트의 출발(t0)과 트롬빈의 출현시간의 경과된 시간에 상응한다; 분으로 표현되는 피크에 도달한 시간은 TGT의 출발(t0)과 생성된 최대 트롬빈에 상응하는 시간 tmax 간에 경과된 시간에 상응한다; 형성된 트롬빈의 nM/분(min)로 표현되는 속도는, 피크의 높이를 피크에 도달한 시간 tmax 와 지체 시간 간의 차이로 나눈 값에 상응한다. 바람직하게는, 이들 파라미터는 트롬빈 형성을 측정하기 위해 사용되는 장치에 의해 직접 제공된다.
본 발명의 키트는 상기 트롬빈 생성 측정 방법과 동일한 방법으로 트롬빈 생성을 측정할 수 있는 키트이기 때문에, 본 명세서의 과도한 기재를 회피하기 위하여 상기 트롬빈 생성 측정 방법과 공통된 내용은 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 신규한 트롬빈 생성 측정 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 반응 혼합물의 볼륨을 극소화하여 반응시간을 현저하게 낮춤으로써 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 도출할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명은 종래에 널리 이용되고 있는 PCR 장비를 이용함으로써 부가적으로 고가의 장비를 설치하지 않고도 쉽게 결과를 도출할 수 있다는 이점이 있다.
(ⅳ) 또한, 본 발명은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공한다.
도 1은 트롬빈 및 섬유소 응괴가 형성되는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 트롬빈 생성 분석법에 의한 혈전성향증(G20210A) 및 항응고제(AVK) 복용 차이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 모세관에 로다민 트롬빈 기질 및 트롬빈 생성 반응 개시성분의 주입을 나타낸 모식도이다.
도 4는 모세관에 주입한 시료에 혈장이 담긴 튜빙을 연결하여 고정시킨 모습을 나타낸 모식도이다.
도 5는 혈장 및 트롬빈 기질 반응을 측정하는 실시간 PCR 기기를 나타낸 그림이다.
도 6은 트롬빈 기질, 트롬빈 생성 반응 개시성분 및 혈장이 혼합되어 형광 생성이 개시되는 것을 나타낸 모식도이다.
도 7은 혈장 및 트롬빈 기질의 반응을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 신속한 트롬빈 생성 측정방법
본 발명에서는 트롬빈-기질 반응 혼합물의 볼륨을 극소화함으로써 효소기질 반응 완료 시간을 대폭 단축하였다. 이는 마이크로-ELISA 측정 방식이 반응 시간 단축하는 것과 같은 원리를 이용한 것이다. 형광생성 기질은 로다민 110-기반 트롬빈 기질(Invitrogen)을 이용하였는데, 로다민 110-기반 트롬빈 기질은 여기(excitation) 파장 및 방출(emission) 파장이 각각 498 nm 및 521 nm로 FITC와 유사하기 때문에 다양한 형광 검출 기반 분석법에 적용이 가능하다.
로다민 트롬빈 기질 및 혈장의 반응 결과를 측정하기 위하여 라이트사이클러 2.0(Roche)를 사용하였으며, 실험 조건은 37°C 항온에서 520 nm의 파장을 측정할 수 있도록 설정하였다. DMSO에 용해한 1,000x 로다민 110-기반 트롬빈 기질(10 mM) 스톡 용액을 10 mM Tris buffer(pH 7.5)로 1,000배 희석하였다. 도 3과 같은 실시간 PCR 용 모세관(Roche)에 3 μl의 고식적 자동화 응고검사에 사용되는 조직 인자 + CaCl2 혼합물(응고시약)과 위에서 제조한 트롬빈 기질(10 μM) 3 μl를 혼합하여 주입하였다. 외경 360 μm의 teflon PFA HP 플러스 튜빙(Upchurch)에 연결된 100 μl 시린지(ILS)를 사용해 튜브 내로 6 μl 부피의 혈장 방울을 흡입하였으며, 흡입된 혈장 말단이 튜빙 끝과 일치하도록 하였다(도 4). 튜빙을 모세관 내로 삽입하고 모세관 입구에 접착제를 처리하여 모세관과 튜빙을 고정시켰다(도 4). 도 5와 같은 회전판에 준비한 모세관/튜빙을 고정하고, 실시간 PCR 장비에 회전판을 장착한 후 기기 뚜껑을 덮었다. 단 모세관에 연결된 튜빙은 뚜껑과 기기 사이 틈을 통해 기기 밖으로 나오도록 하였다. 실시간 PCR 장비의 구동이 시작되면 튜빙에 연결된 100 μl 주사기를 사용해 혈장을 모세관 내로 사출하고 트롬빈 생성에 따른 기질 분해 산물의 형광을 측정하였다(도 6). 실시간으로 기질 분해 산물의 형광을 측정한 결과, 반응 시작 후 형광이 서서히 증가하다가 약 2분 정도에 형광이 급격히 증가하는 경향을 나타내었으며, 측정 시작 후 5분이 지나자 형광의 증가가 크지 않았다(도 7).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 트롬빈 생성 측정 방법:
    (a) 모세관에서 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계;
    (b) 실시간 PCR 장비를 이용하여 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)로부터 트롬빈의 농도를 추론하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 로다민 트롬빈 기질에 트롬빈 생성 반응 개시성분을 혼합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 로다민 트롬빈 기질, 혈장 및 트롬빈 생성 반응 개시 성분의 혼합물은 5-15 μl인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 트롬빈 생성 반응을 개시하는 성분은 조직인자(tissue factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 다음을 포함하는 트롬빈 생성 측정 키트:
    (a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 모세관; 및
    (b) 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 실시간 PCR 장비.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 (a)에서 트롬빈 생성 반응 개시 성분을 추가하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 (a)의 로다민 트롬빈 기질, 혈장 및 트롬빈 생성 반응 개시 성분의 혼합물은 5-15 μl인 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 트롬빈 생성 반응 개시 성분은 조직인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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