WO2013105833A2 - 트롬빈 생성 측정 방법 - Google Patents

트롬빈 생성 측정 방법 Download PDF

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WO2013105833A2
WO2013105833A2 PCT/KR2013/000283 KR2013000283W WO2013105833A2 WO 2013105833 A2 WO2013105833 A2 WO 2013105833A2 KR 2013000283 W KR2013000283 W KR 2013000283W WO 2013105833 A2 WO2013105833 A2 WO 2013105833A2
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rhodamine
reaction
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송재우
홍성유
박노진
조조
이두규
김수정
송예진
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연세대학교 산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring trumpet production.
  • Blood clots excluding cellular components, are composed of fibrous proteins, as noted above.
  • the constituent unit of this fibrous protein is fibrin protein, which can form fibrin clot on its own through polymerization reaction.
  • the precursor of fibrin protein is a fibrinogen, which is converted to fibrin by the protein cleavage enzyme thrombin.
  • thrombin is therefore a plasma enzyme protein that is directly involved in fibrin clot formation.
  • Hemoglobin can be summarized as a process in which thrombin and fibrin clot are finally formed by the chain action of protein cleavage enzymes, the schematic diagram of which is shown in FIG.
  • Coagulation is composed of a series of enzyme-substrate reactions, most of which are substrates of other factors, and also enzymes that cleave other factors.
  • the unculture factor at each stage serves to convert the precursor from the precursor to the active enzyme or active coagulation factor.
  • Prothrombin It is cleaved by No.
  • thrombin plays an important role in the regulation of coagulation by activating antithrombin and protein C by binding to the vascular endothelial membrane protein called thrombomodulin and is involved in platelet activation.
  • Blood coagulation occurs along a continuous amplified stage involving various proenzymes and procofactors present in the blood, which are converted into activated forms via proteolytic enzymes. In the successive stages of coagulation (or continuous amplification), two pathways are distinguished: extrinsic coagulation pathways and intrinsic coagulation pathways.
  • prothrombinase consisting of activated system factor X (FXa), activated factor V (FVa), phospholipids and calcium.
  • FXa activated system factor X
  • FVa activated factor V
  • Prothrombin degrading enzymes activate prothrombin as thrombin, and thrombin can convert soluble fibrinogen (fibrinogen) into insoluble fibrin (fibrin) that forms clots.
  • the coagulation test which is mainly used for the screening of bleeding risk patients in clinical laboratories, is based on the measurement of the male formation rate. Coagulation factor deficiency or dysfunction generally tends to delay bullock formation. However, 90% of thrombin formation in the actual bleeding site is generated after the time reported in the nocturnal time and has a role and meaning from the physiological or pathological viewpoint as well as the generated thrombin. Decreased thrombin production is a risk of bleeding, and thrombin overproduction is associated with an increased risk of thrombosis. Although it is often not well detected by measurement of uneven time, two cases are clearly distinguished by the thrombin generation assay as shown below.
  • lupus anticoagulant which is known to be associated with the development of thrombosis in antiphospholipid syndrome, is named as an anticoagulant due to the prolonged uncoagulant time in the test, unlike the pathology in the body. It was found experimentally that the amount of thrombin actually produced increased despite the delay of the solidification time, from which the thrombin was measured. It can be seen that the measurement of production amount or production rate provides clinically meaningful information.
  • clinical laboratories due to the complexity and difficulty of classical experimental methods for measuring thrombin generation, clinical laboratories have developed and adopted clinical tests based on uneven time measurement.
  • the thrombin generation assay is widely adopted as an experimental study or purpose test due to the simplification of the experimental method, it is difficult to adopt it as a conventional clinical test from the viewpoint of the clinical laboratory. Has a weakness.
  • the conventional measuring method uses a 96-well plate and adopts a method of measuring the color reaction or fluorescence reaction according to the enzyme reaction in each well for a certain time, and storing contaminated wells after measurement (also applicable to the use of well strips).
  • the present inventors have sought to develop a method that can rapidly measure the generation of trumpbin.
  • plasma is added to the rhodamine thrombin substrate step; Obtaining a thrombogratn;
  • We have developed a new method for measuring thrombin production which includes measuring the concentration of thrombin from a thrombogram, and according to this method, the reaction time can be significantly lowered to quickly diagnose the risk of bleeding or thrombosis clinically. By confirming that the present invention was completed, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring thrombin generation.
  • Another object of the present invention is to provide a thrombin generation measurement kit.
  • the invention provides a method for measuring thrombin generation comprising the following steps:
  • step (c) measuring the concentration of thrombin from step (b).
  • the present inventors have tried to develop a method for rapidly measuring thrombin generation, and as a result, by using rhodamine thrombin substrate as a fluorescent substrate, the reaction volume is significantly reduced by reducing the volume of the total reaction reaction mixture to less than 15 yl.
  • a new method for measuring thrombin production was derived.
  • the present invention relates to a method for measuring thrombin generation, which is convenient using existing real-time PCR equipment and can efficiently reduce enzyme-substrate reaction time.
  • the step (a) may further comprise the step of mixing the thrombin generation reaction starting component to the rhodamine thrombin substrate.
  • thrombin generation reaction component or "initiation component” means an indispensable component that causes the production of thrombin from protrumbin.
  • Ingredients that initiate thrombin generating reactions of the present invention include essentially tissue factors.
  • the component initiating the thrombin generating reaction is sufficient to drive the thrombin generating reaction. In concentrations, it essentially comprises a chalc ion source (Ca 2+ ), a phospholipid substance and a tissue factor (TF).
  • Suitable sources of calcium ions in the present invention may be any biologically suitable source of chalc ions, such as CaCl 2 , the source of Ca 2+ in an immediate or delayed manner with other components initiating thrombin generation reactions. That is, after the addition of other components that initiate the thrombin generation reaction, may be added to the sample / plasma mixture.
  • the fluorescence substrate of the present invention may use rhodamine thrombin substrate.
  • it is a rhodamine no-based thrombin substrate.
  • the excitation wavelength of the rhodamine thrombin substrate is 498 nm and the emission wavelength is 521 nm.
  • the stratified concentration of calcium ions means a concentration equal to 16 mM, specifically, wherein the final concentration of calcium ions in the sample + plasma + starting component mixture falls within the range of 14 to 18 mM.
  • Phospholipids suitable for use in the present invention may be in the form of concentrated or lyophilized products and, according to embodiments of the present invention, comprise large amounts of phosphatidylcholine and phosphatidyl serine, or are exclusively phosphatidylcholine And a mixture containing phosphatidylserine.
  • the stratified concentration of the phospholipid substance is more specifically contained within the range of 0.5 to 2 ⁇ , wherein the final concentration of the phospholipid substance in the sample + plasma + starting component mixture is within the range of 0.1 to 5 ⁇ . Means a concentration equal to 1 ⁇ .
  • Tissue factors suitable for use in the present invention may be selected from the group consisting of any natural material, plasma, recombinant or transgene, or any modified tissue factor, wherein the modified tissue factor is very partial, The ability to act as a cof actor of enzymatic activity is maintained.
  • Suitable modified tissue factors may be those which have had the transmembrane domain removed, such as, for example, the tissue factors of the STACL0T kit commercially available from Diagnostica St ago.
  • the stratified concentration of tissue factor in the present invention includes the final concentration of tissue factor in the sample + plasma + starting component mixture within the range of 1-10 pM, According to one embodiment of the present invention, it is included in the range of 4 to 6 pM, and according to another embodiment of the present invention, the concentration is equal to 5 pM.
  • the mixing of the rhodamine thrombin substrate, thrombin generating reaction components and the plasma of the present invention can be carried out in a capillary tube, and according to an embodiment of the present invention, a capillary tube for real-time PCR.
  • plasma may be injected by connecting tubing to a capillary tube containing a mixture of a thrombin substrate and a start component of a thrombin generation reaction.
  • the volume of the mixture of plasma, rhodamine thrombin substrate, and thrombin generating reaction initiating ingredient is 5-15 ⁇ , according to another embodiment of the present invention, 8-14 ⁇ , According to another embodiment of the invention, 10-12 ⁇ . According to the present invention, there is an advantage that the reaction completion time can be significantly shortened by minimizing the volume of the enzyme-substrate reaction mixture.
  • the concentration of thrombin in the sample being tested can be determined by comparing the parameters of the "standard" trombogram obtained from the sample with known thrombin concentrations with the thrombogram parameters of the sample. .
  • Thrombin generation assays are well known to those skilled in the art (Thrombin generation assays: accruing clinical relevance, H. C Hemker et al., Curr. Op in. Hematol., 11: 170-175 (2004)), When placed in contact with the initiating product reaction, this makes it possible to measure, in a continuous manner, the amount of thrombin produced and the time required to produce such thrombin.
  • the desired sample or solution containing the sample
  • the thrombin generation reaction begins. This starting time corresponding to the start of the thrombin generation test is named to. Then, the generated thmbin decomposes a fluorogenic agent to generate fluorescence.
  • the fluorogenic or chromogenic material participates in the plasma complex at the same time as the starting component of the thrombin reaction.
  • the fluorescence generated from the decomposition of the fluorogenic material by the newly generated thrombin is detected by a measuring device such as a fluorimeter.
  • Fluorometers are known in the art Fluorometer may be used, and according to an embodiment of the present invention, may be a real-time PCR equipment.
  • the fluorometer used also provides a means for recording or displaying a change in fluorescence over time. The data collected by the fluorometer makes it possible to establish a change curve of fluorescence over time, called a thrombogram.
  • the peak height expressed in thrombin of nM
  • the lag time expressed in minutes, corresponds to the start of the thrombin generation test (to) and the elapsed time of the appearance time of thrombin
  • the time to reach the peak expressed in minutes corresponds to the time that elapses between the start of TGT (t0) and the time tmax that rises to the maximum thrombin produced
  • the rate expressed in nM / min (min) of thrombin formed is equal to the value obtained by dividing the height of the peak by the difference between the time tmax at which the peak is reached and the lag time.
  • these parameters are provided directly by the apparatus used to measure thrombin formation.
  • the kit of the present invention is a kit capable of measuring thrombin generation in the same manner as the method for measuring thrombin generation, in order to avoid excessive description of the present specification, a description common to the method for measuring thrombin is omitted.
  • the present invention provides a method for measuring novel trombin generation.
  • the present invention minimizes the volume of the reaction mixture and significantly lowers the reaction time, thereby rapidly deriving the risk of bleeding or thrombosis clinically.
  • the present invention has an advantage that it is possible to easily obtain a result without installing expensive equipment by using PCR equipment which is widely used in the related art.
  • the present invention also provides a thrombin generation measurement kit. [Brief Description of Drawings]
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a process for forming thrombin and fibrin bullion.
  • FIG. 2 is a graph showing the difference between thrombosis (G20210A) and anti-alcoholic (AVK) doses by thrombin generation assay
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the injection of the rhodamine thrombin substrate and the thrombin generating reaction component into the capillary.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which a tubing containing plasma is fixed to a sample injected into a capillary tube.
  • FIG. 5 shows a real-time PCR instrument for measuring plasma and thrombin substrate response.
  • Figure 6 is a schematic diagram showing that the thrombin substrate, the thrombin generating reaction component and the plasma is mixed to start the fluorescence production.
  • Figure 7 is a graph showing the results of measuring the reaction of plasma and thrombin substrate by real-time PCR.
  • the completion time of enzyme-substrate reaction was greatly shortened by minimizing the volume of the thrombin-substrate reaction mixture. This is based on the same principle that the micro-ELISA measurement method reduces reaction time.
  • Fluorescent substrate was used Rhodamine 110-based thrombin substrate (Invitrogen), because Rhodamine 110-based thrombin substrate is similar to FITC with excitation wavelength and emission wavelength of 498 nm and 521 nm, respectively Applicable to various fluorescence detection based assays.
  • the tubing was inserted into the capillary and treated with an adhesive at the capillary inlet to fix the capillary and the tubing (FIG. 4). After fixing the capillary tube / tubing on the rotating plate as shown in Figure 5 and mounting the rotating plate to the real-time PCR equipment was covered with the instrument lid. Only the tubing connected to the capillary tube came out of the instrument through the gap between the lid and the instrument.

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Abstract

본 발명은 (a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계; (b) 트롬보그램(thrombogram)을 얻는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)로부터 트롬빈의 농도를 추론하는 단계를 포함하는 신규한 트롬빈 생성 측정 방법을 제공한다. 본 발명은 반응 혼합물의 볼륨을 극소화하여 반응시간을 현저하게 낮춤으로써 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 도출할 수 있다. 본 발명은 종래에 널리 이용되고 있는 PCR 장비를 이용함으로써 부가적으로 고가의 장비를 설치하지 않고도 쉽게 결과를 도출할 수 있다는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
트름빈 생성 측정 방법
【기술분야】
본 특허출원은 2012년 1월 13일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 1으 2012-0004273호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 트름빈 생성 측정 방법에 관한 것이다.
【배경기술]
혈관 내의 세포 성분과 혈장 단백이 혈관 외 조직에 노출되면ᅳ 혈소판과 섬유상 단백으로 구성된 웅괴를 형성하여 혈관 손상 부위를 막음으로써 혈액이 손실되지 않도록 한다. 반면 동일 기전이 과도하게 작용하게 되면 혈전을 형성함으로써 관상동맥질환이나 뇌졸중 등의 다양한 순환기 질환을 초래하게 된다.
트롬빈 형성의 의미를 이해하기 위해서는 혈액 웅괴 형성 과정에서 혈액응고인자들의 작용을 이해할 필요가 있다. 세포성분을 제외한 혈액응괴는 앞서 밝힌 바와 같이 섬유상 단백으로 구성되어 있다. 이 섬유상 단백의 구성단위는 섬유소 단백으로 중합반웅을 통해 그 자체로도 섬유소 응괴를 형성할 수 있다.
섬유소 단백의 전구체는 섬유소원인데， 단백 절단 효소인 트롬빈에 의해 섬유소로 전환된다. 그러므로 트롬빈은 섬유소 응괴 형성과 직접적으로 관련된 혈장 효소단백이다. 혈액웅고는 혈액 내 단백절단 효소들의 연쇄작용에 의해 최종적으로 트롬빈과 섬유소 응괴가 형성되는 과정으로 요약할 수 있으며， 그 모식도는 도 1과 같다. 응고 작용은 일련의 효소 -기질 반응으로 구성되어 있으며, 대부분의 웅고인자는 다른 웅고인자의 기질인 동시에 다른 웅고인자를 절단하는 효소이기도 하다. 각 단계의 웅고인자는 다음 단계의 웅고인자를 절단함으로써 전구체에서 활성 효소 또는 활성 응고인자로 전환 시키는 역할을 한다. 프로트롬빈은 웅고인자 10번에 의해 절단되어 활성 효소인 트롬빈으로 전환된다. 연쇄 반웅 결과 트롬빈 및 섬유소가 단시간 내에 급격히 증가하여 웅괴가 신속히 형성될 수 있다. 트롬빈은 섬유소 형성 외에도 트롬보모들린이라는 혈관 내피 세포막 단백과 결합하여 안티트롬빈과 단백질 C를 활성화시킴으로써 응고작용의 조절에도 중요한 역할을 하며， 혈소판 활성화에도 관여한다. 혈액 응고는， 단백질 가수분해 효소를 통하여 활성화된 형태로 전환되는， 혈액내에 존재하는 다양한 효소전구체 (proenzyme) 및 보조인자 전구체 (procofactor)가 관여되는 연속증폭된 단계를 따라서 발생한다. 이러한 응고의 연속적 단계 (또는 연속증폭)에 있어서, 외인성 웅고 경로 (extrinsic coagulation pathway)와 내인성 응고 경로 (intrinsic coagulation pathway)로 명명되는 2가지 경로가 구별된다. 2가지 경로 모두 활성화된 계 X인자 (FXa), 활성화된 제 V인자 (FVa), 인지질 및 칼슘으로 구성되는 프로트름빈 분해효소 (prothrombinase)로 명명된 복합체의 형성을 유도한다. 프로트롬빈 분해효소는 프로트롬빈 (prothrombin)을 트롬빈 (thrombin)으로 활성화시키고， 트롬빈은 용해성 피브리노겐 (fibrinogen, 섬유소원)을 혈괴 (clot)를 형성하는 불용성 피브린 (fibrin, 섬유소)으로 전환시킬 수 있다.
임상검사실에서 주로 출혈 위험 환자의 선별 목적으로 사용되는 응고 검사는 웅괴형성속도의 측정을 검사 원리로 한다. 응고인자 결핍이나 기능 이상은 일반적으로 웅괴형성을 지연시키는 경향이 있다. 하지만 실제 출혈 부위에서 트롬빈 형성양의 90%는 웅고시간으로 보고되는 시점 이후에 생성되며 생성된 트롬빈은 물론 생리적 또는 병리적 관점에서의 역할과 의미를 갖고 있다. 트름빈 생성 저하는 출혈 위험을， 트롬빈 과생성은 혈전증의 위험이 높아짐을 의미하는데, 웅고시간 측정으로 잘 탐지되지 않는 경우가 많은 반면, 트롬빈 생성 분석법으로는 아래 그림과 같이 두 경우가 뚜렷이 구분된다 (G20210A: 혈전성향증, AVK: 항응고제 복용) (도 2). 일례로 항인지질 증후군에서 혈전증 발생과 관련이 높은 것으로 알려진 루푸스 항웅고제는 체내에서의 병리 작용과 달리 검사에서는 웅고시간을 연장시키는 현상으로 인해 항웅고제라는 역설적 이름이 붙여졌다. 응고시간이 지연됨에도 불구하고 실제로 생성되는 트롬빈 양은 증가됨이 실험적으로 밝혀졌는데， 이로부터 웅고시간 측정보다 트롬빈 생성량 또는 생성률의 측정이 임상적으로 의미 있는 정보를 제공함을 알 수 있다. 다만 트롬빈 생성을 측정하는 고전적 실험 방법이 복잡하고 난이도가 높은 관계로 임상 검사실에서는 웅고시간 측정에 기초한 임상 검사들을 개발하고 채택해 왔다. 하지만 최근 트름빈 생성 분석법에 발색 트름빈 기질과 형광 플레이트 리더 장비를 적용하면서 실험 방법이 단순해짐으로 인해 점차 그 활용 빈도가 지속적으로 증가되어 왔다. 최근 거의 대부분의 웅고 관련 실험 연구 논문들은 웅고 작용의 세계적 평가 방법으로 트름빈 생성 분석법을 사용하고 있다.
실험 방법의 간편해짐에 따라 실험연구 또는 연구목적 검사로서 트롬빈 생성 분석법 (thrombin generation assay)이 보편적으로 채택되는 상황임에도 임상 검사실의 관점에서 이를 통상적인 임상 검사로 채택하기엔 현 웅고 검사와 비교하여 몇 가지 약점을 갖고 있다. 첫째， 검사 소요 시간이 매우 긴 문제점으로 인해 포괄적인 정보를 제공함에도 불구하고 수분 이내에 각 검체 별 검사를 완료하는 현 응고시간 측정 검사의 신속성을 따라잡기 어렵다. 둘째 종래의 측정방식은 고가의 다목적 플레이트 리더를 필요로 한다. 셋째， 종래의 측정방법은 96-웰 플레이트를 사용하며 각 웰 내 효소반응에 따른 발색 또는 형광 반웅을 일정 시간 동안 측정하는 방식을 채택하고 있어， 측정 후 오염된 웰의 보관 (웰 스트립 사용에도 해당) 문제와 미사용 웰을 포함한 플레이트 처리의 비용 문제로 인해 검체를 모아서 한꺼번에 처리를 해야 하는데 수 시간 내 결과 보고를 요하는 통상 검사의 성격에도 맞지 않는 방식이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
[해결하려는 과제】
본 발명자들은 트름빈 생성을 신속하게 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계; 트롬보그램 (thrombogratn)을 얻는 단계; 트롬보그램으로부터 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 신규한 트름빈 생성 측정 방법을 개발하였고, 이러한 방법에 따르면, 반웅시간을 현저하게 낮추어 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 트롬빈 생성 측정 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
[과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 트롬빈 생성 측정 방법을 제공한다:
(a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계;
(b) 트름보그램 (thrombogram)을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 트롬빈의 농도를 측정하는 단계. 본 발명자들은 트롬빈 생성을 신속하게 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였으며， 그 결과, 형광 기질로 로다민 트름빈 기질을 이용하면서 총 반웅 흔합물의 볼륨을 15 yl 이하로 줄여 반웅시간을 현저하게 낮출 수 있는 새로운 트름빈 생성 측정 방법을 도출하였다.
본 발명은 기존의 실시간 PCR 장비를 이용하여 편리하면서， 효소- 기질 반웅 시간을 효율적으로 단축시킬 수 있는 트롬빈 생성 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면， 단계 (a)에서 로다민 트롬빈 기질에 트롬빈 생성 반응 개시성분을 흔합하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트롬빈 생성 반웅 개시성분" 또는 "개시 성분" 은 프로트름빈으로부터 트롬빈의 생성이 시작되게 하는 필요 불가결한 성분을 의미한다. 본 발명의 트롬빈 생성 반웅을 개시하는 성분은 조직 인자를 필수적으로 포함한다. 본 발명의 구현예에 따르면， 트롬빈 생성 반웅을 개시하는 성분은 트롬빈 생성 반응을 작동시키는데 층분한 농도로, 필수적으로 칼슴 이온 제공원 (Ca2+), 인지질 물질 및 조직 인자 (TF)를 포함한다. 본 발명에서 칼슘 이온의 적당한 제공원으로는 CaCl2와 같이 칼슴 이온의 어떠한 생물학적으로 적합한 제공원이면 무방하다, Ca2+의 제공원은 트롬빈 생성 반웅을 개시하는 다른 성분과 함께 즉각적으로 또는 지연된 방식, 즉 트롬빈 생성 반응을 개시하는 다른 성분의 첨가 이후에， 시료 /혈장 흔합물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 형광생성 기질은 로다민 트름빈 기질을 이용할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 로다민 no-기반 트롬빈 기질이다. 본 발명에 따르면 로다민 트롬빈 기질의 여기 파장은 498 nm이고 방출 파장은 521 nm이다.
본 발명에서 칼슘 이온의 층분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 흔합물 내 칼슘 이온의 최종 농도가 14 내지 18 mM의 범위 내에 포함되는， 구체적으로， 16 mM와 동일한 농도를 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 인지질 물질은 농축되거나 동결건조된 제품의 형태일 수 있고， 본 발명의 구현예에 따르면， 다량의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine) 및 포스파티딜세린 (phosphatidyl serine)을 포함하거나, 독점적으로 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린을 함유하는 흔합물로 구성될 수 있다. 본 발명에서 인지질 물질의 층분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 흔합물내 인지질 물질의 최종 농도가 0.1 내지 5 μΜ의 범위 내에 포함되는, 구체적으로 0.5 내지 2 μΜ의 범 위내에 포함되는， 보다 구체적으로 1 μΜ과 동일한 농도를 의미한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 조직 인자는 어떠한 천연 물질, 혈장, 재조합 또는 이식유전자를 갖는 조직 인자, 어떠한 변형된 조직 인자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고， 이때 상기 변형된 조직 인자는 매우 부분적일지라도， 효소적 활성의 보조인자 (cof actor)로서 작용할 수 있는 능력이 유지되는 것을 특징으로 한다. 적합한 변형된 조직 인자는 예를 들면， 디아그노스티카 스타고 (Diagnostica St ago)로부터 상업적으로 입수 가능한 STACL0T 키트의 조직 인자와 같이 막관통 영역 (transmembrane domain)이 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 조직 인자의 층분한 농도는 시료 + 혈장 + 개시 성분 흔합물 내 조직 인자의 최종 농도가 1 내지 10 pM의 범위 내에 포함되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 4 내지 6 pM의 범위 내에 포함되고， 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 5 pM과 동일한 농도이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 로다민 트롬빈 기질 트름빈 생성 반웅 개시성분 및 혈장의 흔합은 모세관에서 실시할 수 있고， 본 발명의 구현예에 따르면, 실시간 PCR용 모세관이다.
본 발명의 구현예에 따르면， 트롬빈 기질 및 트름빈 생성 반응 개시성분의 흔합물이 담긴 모세관에 튜빙을 연결하여 혈장을 주입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 혈장， 로다민 트름빈 기질 및 트롬빈 생성 반응 개시성분의 흔합물의 볼륨은 5-15 μ ΐ이고， 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 8-14 μ ΐ이며， 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 10- 12 μ ΐ이다. 본 발명에 따르면, 효소 -기질 반웅 흔합물의 볼륨을 극소화함으로써 반웅 완료시간을 대폭 단축할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 따르면, 공지된 트름빈 농도를 포함하는 시료로부터 얻어진 "표준 " (standard) 트름보그램의 파라미터와 시료의 트롬보그램 파라미터를 비교함으로써， 테스트되는 상기 시료 내 트롬빈의 농도를 결정할 수 있다.
트롬빈 생성 분석법은 당업자에게 공지된 테스트이고 (Thrombin generation assays: accruing clinical relevance, H. C Hemker et al . , Curr. Op in. Hematol. , 11:170-175(2004)), 목적하는 시료를 트롬빈 생성 반웅을 개시하는 성분과 접촉하도록 놓았을 때, 이것은 생성된 트름빈의 분량과 이러한 트롬빈을 생성하는데 필요한 시간을， 연속적 방식으로， 측정하는 것을 가능케 한다. 목적하는 시료 (또는 상기 시료를 포함하는 용액)가 상기 반응을 개시하는 성분과 접촉하도록 놓여졌을 때, 상기 트롬빈 생성 반웅이 시작된다. 상기 트롬빈 생성 테스트의 출발에 상응하는 이러한 시작 시간올 to로 명명한다. 그리고 나서， 생성된 트름빈은 형광생성 물질 (fluorogenic agent)을 분해하여 형광을 발생시킨다. 바람직하게는， 상기 형광생성 물질 또는 발색 물질은 트름빈 생성 반웅 개시성분과 동시에 혈장 흔합물에 참가된다. 새롭게 생성된 트롬빈에 의해 형광생성 물질의 분해로부터 생성되는 형광은 형광측정기 (fluorimeter)와 같은 측정 장치에 의해 검출된다. 형광측정기는 당업계에 공지된 다양한 형광측정기를 이용할 수 있으며， 본 발명의 구현예에 따르면, 실시간 PCR 장비일 수 있다. 또한， 사용되는 형광측정기는 시간 경과에 따른 형광의 변화를 기록하는 수단 또는 표시하는 수단을 제공한다. 상기 형광측정기에 의해 수집된 데이터는 트롬보그램 (thrombogram)이라 명명된， 시간 경과에 대한 형광의 변화 커브를 확립하는 것을 가능케 한다. 트롬보그램으로부터 4가지 유도된 파라미터를 측정할 수 있다: nM의 트롬빈으로 표현되는 피크 높이는 반웅 동안에 특정 시간 tmax에 생성된 트롬빈의 최대 농도에 상웅한다; 분으로 표현되는 지체 시간 (lag time)은 트롬빈 생성 테스트의 출발 (to)과 트롬빈의 출현시간의 경과된 시간에 상웅한다; 분으로 표현되는 피크에 도달한 시간은 TGT의 출발 (t0)과 생성된 최대 트롬빈에 상웅하는 시간 tmax 간에 경과된 시간에 상웅한다; 형성된 트롬빈의 nM/분 (min)로 표현되는 속도는, 피크의 높이를 피크에 도달한 시간 tmax 와 지체 시간 간의 차이로 나눈 값에 상웅한다. 본 발명의 구현예에 따르면， 이들 파라미터는 트롬빈 형성을 측정하기 위해 사용되는 장치에 의해 직접 제공된다.
본 발명의 키트는 상기 트롬빈 생성 측정 방법과 동일한 방법으로 트롬빈 생성을 측정할 수 있는 키트이기 때문에， 본 명세서의 과도한 기재를 회피하기 위하여 상기 트름빈 생성 측정 방법과 공통된 내용은 생략한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 신규한트름빈 생성 측정 방법을 제공한다.
(ϋ) 본 발명은 반웅 흔합물의 볼륨을 극소화하여 반응시간을 현저하게 낮춤으로써 임상적으로 출혈 위험 또는 혈전증의 위험을 빠르게 도출할수 있다.
(iii) 본 발명은 종래에 널리 이용되고 있는 PCR장비를 이용함으로써 부가적으로 고가의 장비를 설치하지 않고도 쉽게 결과를 도출할 수 있다는 이점이 있다.
(iv) 또한， 본 발명은 트롬빈 생성 측정 키트를 제공한다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 트롬빈 및 섬유소 웅괴가 형성되는 과정에 대한 모식도이다. 도 2는 트롬빈 생성 분석법에 의한 혈전성향증 (G20210A) 및 항웅고제 (AVK) 복용 차이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 모세관에 로다민 트롬빈 기질 및 트름빈 생성 반웅 개시성분의 주입을 나타낸 모식도이다.
도 4는 모세관에 주입한 시료에 혈장이 담긴 튜빙을 연결하여 고정시킨 모습을 나타낸 모식도이다.
도 5는 혈장 및 트롬빈 기질 반응을 측정하는 실시간 PCR 기기를 나타낸 그림이다.
도 6은 트롬빈 기질， 트름빈 생성 반웅 개시성분 및 혈장이 흔합되어 형광 생성이 개시되는 것을 나타낸 모식도이다.
도 7은 혈장 및 트롬빈 기질의 반웅을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: 신속한 트롬빈 생성 측정방법
본 발명에서는 트름빈 -기질 반웅 흔합물의 볼륨을 극소화함으로써 효소 -기질 반웅 완료 시간을 대폭 단축하였다. 이는 마이크로 -ELISA 측정 방식이 반웅 시간 단축하는 것과 같은 원리를 이용한 것이다. 형광생성 기질은 로다민 110-기반 트롬빈 기질 (Invitrogen)을 이용하였는데， 로다민 110-기반 트롬빈 기질은 여기 (excitation) 파장 및 방출 (emission) 파장이 각각 498 nm 및 521 nm로 FITC와 유사하기 때문에 다양한 형광 검출 기반 분석법에 적용이 가능하다.
로다민 트름빈 기질 및 혈장의 반응 결과를 측정하기 위하여 라이트사이클러 2.0(Roche)를 사용하였으며, 실험 조건은 37°C항온에서 520 nm의 파장을 측정할 수 있도록 설정하였다. DMS0에 용해한 Ι,ΟΟΟχ 로다민 110-기반 트롬빈 기질 (10 mM) 스록 용액을 10 mM Tris buffer(pH 7.5)로 1,000배 희석하였다. 도 3과 같은 실시간 PCR 용 모세관 (Roche)에 3 μ 1의 고식적 자동화 옹고검사에 사용되는 조직 인자 + CaCl2 흔합물 (웅고시약)과 위에서 제조한 트롬빈 기질 (10 μΜ) 3 μΐ를 흔합하여 주입하였다. 외경 360 um의 teflon PFA HP 플러스 튜빙 (Upchurch)에 연결된 100 μ 1 시린지 (ILS)를 사용해 튜브 내로 6 μΐ 부피의 혈장 방울을 흡입하였으며, 흡입된 혈장 말단이 류빙 끝과 일치하도록 하였다 (도 4). 튜빙을 모세관 내로 삽입하고 모세관 입구에 접착제를 처리하여 모세관과 튜빙을 고정시켰다 (도 4). 도 5와 같은 회전판에 준바한 모세관 /튜빙을 고정하고ᅳ 실시간 PCR 장비에 회전판을 장착한 후 기기 뚜껑을 덮었다. 단 모세관에 연결된 튜빙은 뚜껑과 기기 사이 틈을 통해 기기 밖으로 나오도록 하였다. 실시간 PCR 장비의 구동이 시작되면 튜빙에 연결된 100 μΐ 주사기를 사용해 혈장을 모세관 내로 사출하고 트롬빈 생성에 따른 기질 분해 산물의 형광을 측정하였다 (도 6). 실시간으로 기질 분해 산물의 형광을 측정한 결과, 반응 시작 후 형광이 서서히 증가하다가 약 2 분 정도에 형광이 급격히 증가하는 경향을 나타내었으며， 측정 시작 후 5 분이 지나자 형광의 증가가크지 않았다 (도 7). 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음 단계를 포함하는 트롬빈 생성 측정 방법 :
(a) 로다민 트름빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계;
(b) 트롬보그램 (thrombogram)을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 트름빈의 농도를 추론하는 단계.
1
【청구항 2】 o
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 로다민 트롬빈 기질에 트롬빈 생성 반옹 개시성분을 흔합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 모세관에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 4】
제 1 항 내지 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 로다민 트롬빈 기질， 혈장 및 트롬빈 생성 반응 개시 성분의 흔합물은 5-15 인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5】
제 2 항에 있어서, 상기 트롬빈 생성 반웅을 개시하는 성분은 조직인자 (tissue factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6]
다음 단계를 포함하는 트롬빈 생성 측정 키트:
(a) 로다민 트롬빈 기질에 혈장을 첨가하는 단계;
(b) 트롬보그램 (thrombogram)을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 트름빈의 농도를 추론하는 단계 ,
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 단계 (a)에서 로다민 트롬빈 기질에 트롬빈 생성 반응 개시성분을 흔합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 8】
제 6 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 모세관에서 실시하는 것을 특징으로 하는 키트. 【청구항 9】
제 6 항 내지 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 로다민 트름빈 기질, 혈장 및 트름빈 생성 반웅 개시 성분의 흔합물은 5-15 μΐ인 것을 특징으로 하는 키트. 【청구항 10】
제 7 항에 있어서, 상기 트롬빈 생성 반응을 개시하는 성분은 조직인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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HEMKER, H. C. ET AL.: 'Thrombin generation assays: accruing clinical relevance.' CURRENT OPINION IN HEMATOLOGY vol. 11, no. 3, May 2004, pages 170 - 175 *

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