NO176574B - Dynamisk kontinuerlig strömmende enzymreaktor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor og en fremgangsmåte som tillater in vitro målinger av hastighetene av blodkoagulasjonsreaksjoner og andre dynamisk enzymatiske reaksjoner som er avhengig av aktivitet på fosfolipider i et miljø som er en nær tilnærming av det som blir funnet i kroppen.

Koaguleringssystemet (koagulering) i mennesker og dyr er en hovedbidragsyter til opprettholdelse av hemostasen og også til trombedannelse (blodkoagel). Koagulering er i hovedsak en kaskade der hver koaguleringsfaktor, som normalt er tilstede i blod og annet vev som en inaktiv enzymforløper, dvs. zymogen, og blir i rekkefølge aktivert til et proteolytisk enzym som selektivt angriper den neste zymogen i rekkefølgen, og dermed omdanner det til et aktivt enzym. Amplifisering foregår ved hvert trinn i prosessen slik at en liten startstimulus kan til slutt resultere i en betydelig mengde fibrinkoagel.

Koaguleringskaskaden begynner som to adskilte veier som til slutt konvergerer. En vei er "indre" til blodet og den andre har betegnelsen "ytre" fordi den blir utløst av koaguleringsfaktorer som normalt ikke er tilstede i blod. Den indre veien spiller en hovedrolle i hemostastase etterfulgt av skade. Den ytre veien kan bli aktivert i mange patologiske situasjoner, f.eks. diffus endotelisk skade, fremskreden cancer, endotoksemi og komplikasjoner under svangerskap.

Det foreligger nå betydelig bevis at koagulering blir startet i kroppen når faktor VII, et vitamin K-avhengig plasma koaguleringsfaktor protein og vevsfaktor, et cellebundet protein som normalt ikke er assosiert med blodceller, virker gjensidig på hverandre. (Se f.eks. Nemerson, Blood 71:1-8, 1988 for en oversikt.) Denne gjensidige påvirkningen resulterer i et aktivert kompleks som har enzymatisk aktivitet og starter koagulering ved å omdanne to andre proteiner, dvs. faktor X og faktor IX til deres aktive enzymatiske former, hhv. faktor Xa og faktor IXa. (I henhold til vanlig praksis blir forløper, dvs. zymogen, former av de aktive blodkoaguleringsfaktorene betegnet med Romertall, og de aktive formene er angitt ved en indeks "a", f.eks. faktor X for zymogen og faktor Xa for aktivert faktor. )

Vevsfaktor er et prokoaguleringsprotein som er tilstede på overflaten av alle celler, normalt ikke i direkte kontakt med blod. Derimot er vevsfaktor induserbar i endotelceller og monocytter ved stimulering med forskjellig farmakologiske mediatorer, f.eks. tumor nekrosefaktor, interleukin-1 og endotoksin. Den ytre koaguleringsveien blir utløst med vevsfaktor som kompieksdanner med og aktiverer faktor VII, et vitamin K-avhengig serinproteasezymogen. Aktiveringen av faktor VII med vevsfaktor foregår i nærvær av kalsiumioner og er antatt å være resultat av en konformasjonsendring i faktor VII. Se f.eks. Nemerson et al. (1982) i Progress in Hemostasis and Thrombosis, Spaet, T.H. edit., Grune & Stratton, New York, bind 6, s. 237-261; Carson (1984) Prog. Clin. Pathol. 9:1-14. Omdanning av faktor VII zymogenet til faktor VIIa aktivt enzym blir gjennomført ved spalting av en Arg-Ile peptidbinding i zymogenet som resulterer i faktor VIIa som har en lett kjede som inneholder Gla-området og en tung kjede som inneholder enzymets aktive sete.

Hvis zymogen faktor VII hadde prokoagulerende aktivitet, kunne startingen av koaguleringen enkelt følges av brudd på en fysikalsk barriere som normalt adskiller faktor VII fra vevsfaktor. For at hemostase skal foregå kan således skaden i seg selv være tilstrekkelig for å starte koagulering. Erkjennelsen at et zymogen har en mindre mengde aktivitet relativt til dens derivatenzym medfører vanskeligheter fordi et aktivt zymogen vil ha den samme aktivitet som et inert zymogen kontaminert med en spormengde av et enzym. I de fleste tilfeller blir dette problemet tilnærmet løst enkelt ved å behandle zymogenet med en aktiv sete-rettet enzymhemmer slik som diisopropylfluorfosfat (DFP) eller et passende klormetylketon, og dermed hemme det kontaminerende enzymet. Fordi zymogener vanligvis nesten er inerte, vil dette resultere i et totalt tap av målbar aktivitet. Derimot er faktor VII zymogenet selv raskt hemmet av DFP, og således unngå denne tydelige tilnærmelse. Reaktiviteten til faktor VII mot DFP er tydelig så stor at den i seg selv antyder ekstraordinær aktivitet til faktor VII zymogenet.

Studier av DFP hemming ved å anvende bovine faktorer VII og VIIa, viste at faktor VII kvalitativt har den sammen enzymatiske aktivitet som faktor VIIa skjønt faktor VII zymogenet inneholder noe mindre enn 1% av aktiviteten til faktor VIIa. DFP er også blitt vist å hemme human faktor VII, og hastigheten er en tredjedel i forhold til hemmingen av faktor VIIa, som er ca. det samme forhold som er observert når bovine proteiner ble anvendt. Se f.eks. Nemerson, Blood 71:1-8,1988 og Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631, 1982.

Eksperimenter støtter oppfatningen at koagulering kan bli startet enkelt ved en fysikalsk kompleksdannelse av vevsfaktor og faktor VII. Videre bevis for denne forestilling er avledet fra observasjonen at bovine faktorer VII og VIIa bindes til vevsfaktor med i hovedsak samme dissosiasjonskon-stanter. Når monocytter ble anvendt som en kilde til human vevsfaktor, ble det samme fenomen observert for humane faktorer VII og VIIa. I henhold til dette behøver man ikke postulere en proteolytisk starting av koagulasjonen, og dermed unngå problemet med en uendelig tilbakegang av proteolytiske hendelser. Denne graden av aktivitet til zymogenet er generelt uvanlig og synes å være unik i koaguleringssystemet. Aktiviteten til faktor VII eller virkelig faktor VIIa, er pålitelig med et hvilende koagula-sjonssystem fordi i fravær av vevsfaktor kan den ikke utløse koagulasj on.

På grunn av sin indre reaktivitet blir faktor VII adskilt fra alle andre kjente koaguleringszymogener. Fordi faktor VII zymogenet har enzymatisk aktivitet når zymogenet og det aktive enzymet blir referert til uten å adskille mellom de to artene, blir betegnelsen på faktor VII(a) anvendt.

Vevsfaktor er på samme måte entydig blant kofaktorene fordi, i motsetning til koaguleringsf aktorene V og VIII og andre kofaktorer i koaguleringskaskaden, trenger det modne vevsfaktorproteinet tydeligvis ingen videre bearbeiding for sin aktivitet. Disse observasjonene vurdert sammen antyder at det eneste krav for starting av koagulasjon med vevsfaktor er dens fysikalske kompleksdannelse med faktor VII.

Vevsfaktor som er et membranbundet glykoprotein assosiert med fosfolipider, er ikke normalt tilstede i blodomløpet. Når blodkar blir brutt, kan derimot faktor VII som er en plasmakoagulasjonsfaktor, kompleksdanne med vevsfaktor og dermed danne en katalytisk-aktiv art som aktiviserer både faktor IX (plasma tromboplastin komponent) en komponent fra den indre veien for å danne faktor IXa og faktor X (Stuart faktor), som er involvert i både ytre og indre veier i koagulasjonen, og gir faktor Xa. Vevsfaktor har også en viktig klinisk anvendelse som diagnostisk reagens for å måle og studere koagulasjon.

Faktor VII er tilstede i spormengder i plasma (ca. 10 nM). Den kraftige blødningen som man kan se hos individer som har markert mangel på faktor VII, demonstrerer den fysiologiske viktigheten av dette protein. Mangel på faktor VII er sjelden, men nyere bevis antyder at rundt 16$ av påvirkede pasienter har hjerneblødninger som vanligvis resulterer i døden. Ragni et al., Factor VII Deficiency, Amer. J. Hematol., 10:79-88 (1981). På den annen side har pasienter med så lite som 5% av normaltnivå av faktor VII ofte mindre eller ingen blødningssymptomer. For et hvilket som helst faktor VII nivå er det derimot en "betydelig klinisk varia-s j on.

En rekke sykdommer, f.eks. kancer og kardiovaskulær sykdom, er forbundet med økninger i blodkoageldannelsen i blodkarene. En hovedbehandling for kardivaskulaer sykdom innbefatter anvendelsen av antikoagulasjonsmiddel, f.eks. warfarin og legemidler i slekt, som interfererer med syntese av vitamin K-avhengig koagulasjonsfaktorer (f.eks. faktorene II, VII, IX og X). Det er mange studier som indikerer at denne be-handlingen senker hyppigheten av venøs tromboemboli, lungeemboli og myokardial infarkt (hjerteanfall). Warfarin-terapi er derimot også assosiert med en høyere hyppighet av blødninger som ofte er dødlige.

Standardmåten som doseringen av warfarin-type antikoagulasjonsmidlene blir målt med, er ved anvendelse av Quick en-trinns protrombin-tid. I denne testen som blir utført under statiske betingelser, blir en prøve av pasientens blodplasma oppvarmet til 37°C. En suspensjon av vevstromboplasti (rå vevsfaktor) blir deretter tilsatt til plasmaprøven sammen med kalsiumioner og koagulasjonstiden blir bestemt. Normal koagulasjonstid er 12 +/- 0,5 sekunder. Det terapeutiske området til antikoagulasjonsmidlene er en blodkonsentrasjon av legemidlet som tilveiebringer en koagulasjonstid som strekker seg mellom 1,2 og 1,5 ganger normalverdien. Dette smale området pålegger de kliniske laboratoriene en presisjon som ofte ikke er oppnåelig. Disse unøyaktighetene er antatt å være ansvarlig for noen av blødningssideeffektene i antikoagulasjonslegemidlene.

Faktor VII kan bli målt på en lignende måte. Fortynninger av pasientens plasma blir tilsatt til normalplasma og en-trinn protrombin tidstesten blir utført. Mengden av faktor VII som er tilstede i testprøven blir bestemt ved å sammenligne koaguleringstidene til testprøvene med de som er oppnådd fra fortynningene av normalt plasma. For å datere alle testene i koagulasjonssystemet er det basert på bestemmelse av koagulasjonstidene til forskjellige prøver, men alltid i et testrør under statiske betingelser. Fordi blodkoagulering in vivo alltid foregår i en bevegende strøm, kan effektene av strømmen på de enzymatiske reaksjonene ikke bli riktig evaluert i et statisk system.

Det har blitt funnet at de spesifikke blodkoagulerings-enzymatiske reaksjonene kan bli mer spesifikt gjennomført i en dynamisk utforming ved å føre forskjellige blodkoaguler-ingszymogener sammen med kalsiumioner ved en definert strømningshastighet gjennom en rørformet anordning som er dekket på sin indre overflate med en plan fosfolipid tolags membran. Valgfritt og fortrinnsvis har den plane membranen renset vevsfaktor inkorporert i seg. Reagensene som passerer gjennom anordningen inkluderer enten faktor VII eller faktor VIIa, som kompleksdanner med vevsfaktoren for å danne en enzymatisk art, sammen med faktor IX eller faktor X som er substrater for vevsfaktor - faktor VII komplekset. Hastighetene til faktor IXa eller Xa fremstilligenen kan bli raskt analysert ved en hvilken som helst hensiktsmessig analyse for disse faktorer. Den dynamiske reaksjone tillater mer spesifikke analyser av produksjonen av aktiverte faktorer enn det som kan bli oppnådd i nåværende statiske metoder.

Føring av plasmaprøver, f.eks. fra en pasient, gjennon en slik fosfolipid membrandekket anordning under definerte strømingshastigheter og andre betingelser i oppfinnelsen, tillater måling av spesifikke enzymatiske produkter fremstilt ved gjensidig påvirkning av plasmaprøvene med vevsfaktor-innholdende fosfolipidmembranen og kan tilveiebringe verdifull informasjon når det gjelder mangler av spesifikke koaguleringsfaktorer eller en mer følsom måling av riktig antikoaguleringsparametre i pasienter enn den som er oppnåelig i tidligere metoder.

Enzymreaktoren i oppfinnelsen kan også bli anvendt for å utføre og analysere andre fosfolipid-avhengig enzymatiske reaksjoner enn blodkoaguleringsreaksjoner. Slike reaksjoner involverer strømming av forskjellige inaktive enzymreaksjons-bestanddeler i reagensoppløsningen gjennom en fosfolipid dobbeltlag membrandekket rørformig anordning. De inaktive enzymbestanddelene i reagensoppløsningen blir enzymatisk aktive av gjensidig påvirkning av fosfolipidmembranen på den indre overflaten av anordningen og produktene fra reaksjonen kan bli analysert i den utstrømmende oppløsningen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor tilveiebragt som tillater in vitro måling av hastigheter til blodkoaguleringsreaksjoner og andre fosfolipidavhengig enzymatiske reaksjoner i et miljø som er nær tilnærmet det som finnes i kroppen. Det blir også tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse en metode for måling av hastigheten til aktiveringen av forskjellige koaguleringsfaktorer, særlig aktivering av faktor X til faktor Xa og faktor IX til faktor IXa> både via faktor VII eller faktor VIIa, så vel som en fremgangsmåte for å måle hastigheten av trombinproduksjon. Fig. 1 illustrerer aktivering av faktor X ved faktor VIIa og vevsfaktor ifølge en utførelsesform av foreliggende oppf innelse. Fig. 2 er et diagram av den kontinuerlig strømmende

enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse.

Fig. 3 er et langsgående snitt av den kontinuerlig strømm-ende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse. Fig. 4 er et diagram av den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse knyttet til en anordning for pumping av reagenser inn i reaktoren og en anordning for å analysere det som strømmer ut fra reaksjonen av både trombin og faktor Xa.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor som består av en rørformig anordning dekket på sin innsideoverflate avd en lipidmembran som består av et plant fosfolipid dobbeltlag som valgfritt og fortrinnsvis inneholder et enzym eller en enzymkofaktor. Den rørformige anordningen har en ende som kan knyttes til en anordning for avlevering av spesifikke fluidreagenser til den og kan tilknyttes ved en annen åpning til en anordning for oppsamling og analysering av utstrømmende fluid derfra. Fortrinnsvis er den rørformige anordningen et kapillærrør som er åpent eller kan åpnes i begge ender.

Forskjellig rensede koaguleringsfaktorer eller zymogener eller, alternativt plasma, kan bli pumpet gjennom enzymreaktoren sammen med kalsiumioner og får anledning til å reagere med enzymet eller kofaktoren i fosfolipidmembranen. Ved å regulere strømningshastigheten til disse faktorene ved at de entrer reaktoren og måling av konsentrasjonene til produktene i utstrømmende fluid som forlater reaktoren, kan aktiverings-hastighetene til de forskjellige zymogenene i blodkoaguler-ingskaskaden til aktive produkter bli bestemt og effekten av strømming på produktdannelsen kan bli bestemt. I tillegg kan tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonsnivå av en hvilken som helst aktivert art, også bli beregnet.

I henhold til den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen, inneholder fosfolipid dobbeltlaget renset vevsfaktor som er den enzymkofaktoren som starter aktivering av blodkoaguleringsfaktorer. Koaguleringsfaktorer som blir pumpet gjennom reaktoren er faktor VII eller faktor VIIa sammen med faktor IX eller faktor X. Koaguleringsfaktorene blir pumpet gjennom det fosfolipid membrandekkede kapillærrøret sammen med kalsiumioner og får anledning til å strømme over den vevsfaktor-inneholdende fosfolipid dobbeltlag membranen på den indre overflaten av røret. Når vevsfaktoren i membranen kommer i kontakt med faktor VII eller faktor VIIa i det strømmende materialet, blir et enzymatisk aktivt kompleks dannet på innsiden av kapillærrøret. Dette enzymatiske aktive kompleks aktiviserer i sin tur faktor IX til faktor IXa eller faktor X til faktor Xa i strømningsmaterialet. Ved å regulere strømningshastigheten og konsentrasjonene til faktor IX eller faktor X og faktor VII eller faktor VIIa ved innløpet av reaktoren og å måle konsentrasjonene til faktor IXa eller faktor Xa i utstrømningen fra reaktoren, kan aktivitetshastighetene av faktor IX til faktor IXa eller faktor X til faktor Xa bli beregnet og effektene av strømning kan bli bestemt. I tillegg kan tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonen av faktor IXa eller faktor Xa ved forskjellige konsentrasjoner av faktor VII eller VIIa også bli beregnet.

Faktor VII kan bli substituert med faktor VIIa og vice-versa, siden, som diskutert over, zymogenfaktor VII kvalitativt har den samme prokoagulerende aktivitet som dens aktive enzym-derivat faktor VIIa, selv om aktiviteten til zymogenet bare er ca. 1% av det aktive enzymet. Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631 (1982); Nemerson, Blood 71:1-8 (1988). Faktor VII kan således bli benyttet som et startende materiale i foreliggende enzymreaktor uten forbearbeiding til faktor VIIa-

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan en blanding av renset faktor VII eller faktor VIIa sammen med de rensede koaguleringsfaktorene V, faktor VIII, faktor IX og faktor X bli innført i det membrandekkede kapillærrøret sammen med protrombin. Hastigheten av trombin-produksjonen, faktor IXa produksjonen eller faktor Xa produksjonen kan deretter bli målt og effekten av forskjellige konsentrasjoner på hver av koaguleringsfaktorene på trombin, faktor IXa eller faktor Xa produksjonen kan bli målt.

Ifølge enda en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan plasma bli innført i den fosfolipid membrandekkede enzymreaktoren i en konstant strømningshastighet, for å starte aktivering av koaguleringsfaktorer ved at de gjensidig reagerer med vevsfaktoren i fosfolipid membranen. Frem-stilling av utvalgte faktorer slik som IXa, Xa eller trombin kan deretter bli målt. Denne utførelsesformen tillater en mer spesifikk evaluering av koageldannelsen enn den som kan bli oppnådd ved de statiske målingene av protrombin-tid og er anvendelig til å evaluere pasienter med koagulerings-mangler eller de som er i antikoaguleringsterapi.

Kapillærrøret med den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren kan være av varierende dimensjoner, og kan ha en indre diameter mellom 0,10-1.10 mm og en lengde på 1-15 cm. Ved lave skjærbelastningsforhold i veggen (ca. 20 s-3-) er produktdannelsen proporsjonal med størrelsen av kapillærrøret i henhold til ligningen (L/Q)<2>/^, der L er rørlengden og Q er strømningshastigheten gjennom reaktoren, som er en indikasjon på en diffusjonskontrollert reaksjon. Ved høye skjærbelastningsf orhold (større enn 100 s-<1>) er det å anta at diffu-sjonen blir mindre viktig og enzymkinetikken dominerer.

Kapillærrøret blir fremstilt ved først å senke det helt ned i en kokende detergentoppløsning, f.eks. Sparkleen, og deretter rense det i destillert deionisert vann i et ultrasonisk bad. Det blir deretter tørket ved 120°C og fylt med en suspensjon av lipidvesikler som inneholder vevsfaktor. Kapillærrøret blir deretter skylt med en bufferoppløsning av 0,01 M N-2-hydroksyetyl piperazin-N'-2-etan sulfonsyre (HEPES) med 0,14M NaCl og 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) der pH blir justert til 7,5 med HC1. Det fylte kapillærrøret blir til slutt lagret ved romtemperatur i en bufferoppløsning for å hindre eksponering av membranen i luft.

Suspensjonen av lipidvesikler som inneholder renset vevsfaktor blir fortrinnsvis fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i Bach et al., "Factor VII Binding to Tissue Factor in reconstituted Phospholipid Vesicles: Induction of Cooperativity by Phosphatidylserine", Biochemistry 25:4007

(1986), som involverer inkorporering av vevsfaktor inn i fosfolipidvesikler i nærvær av et stort overskudd, f.eks. et 15-gangers molart overskudd, av dialyserbart ikke-ionisk detergent oktylglykosid. Fjerning av detergenten ved dialyse resulterer i den spontane inkorporeringen av renset vevsfaktor i store fosfolipidvesikler. Vesiklene blir fremstilt fra en blanding av fosfatidylserin eller andre sure fosfolipider og fosfatidylcholin. Fortrinnsvis blir en blanding av 0-40$ fosfatidylserin (PS) og 60-100$ fosfatidylcholin (PC) kompleksdannet med vevsfaktor i et forhold på tilnærmet 1-10 mol vevsfaktor til 100.000 mol fosfolipid.

Renset vevsfaktor kan bli fremstilt ved kjente teknikker fra bovin hjerne eller human hjerne eller placenta (se f.eks. Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987) eller fremstilt ved rekombinant DNA kloningsteknikker som i US-062 166 til Nemerson et al., inngitt 12. juni 1987.

Ved å referere til fig. 2 og 4, når enzymreaktoren skal bli anvendt, blir kapillærrøret (1) fjernet fra lagringsbufferen og knyttet til en sprøyte (3) som inneholder en oppløsning med kalsiumioner og enten faktor VII eller faktor VIIa og en eller flere rensede koaguleringsfaktorer som inkluderer faktor V, faktor VIII, faktor IX, faktor X og protrombin. Disse rensede faktorene kan bli tilveiebragt ved kjente proteinisoleringsteknikker eller fremstilt ved rekombinante DNA kloningsteknikker. Ved å anvende pumpe (4) blir oppløsningen sendt gjennom kapillærrøret (1) ved en konstant hastighet og de forskjellige koaguleringsfaktorene får anledning til å reagere med vevsfaktoren - som er inneholdt i den plane fosfolipidmembranen. Det utstrømmende materialet som inneholder aktiverte enzymprodukter blir deretter oppsamlet i oppsamleren (2) ved utgangsenden av kapillærrøret (1) og analysert.

Produksjonshastighetene til utvalgte enzymer blir deretter målt. En fremgangsmåte for måling av produksjonshastighetene til faktor IXa eller faktor Xa er å anvende tritium-merket faktor IX eller faktor X som et utgangsmateriale, og deretter måle mengden av sur oppløselig tritium fremstilt i det som strømmer ut av kapillærrøret. I tillegg kan standard radioanalyser eller fluorescente (fluorogeniske) analysetek-nikker bli anvendt til å analysere produktene fra enzymreaksjoner som tar plass innenfor reaktoren i foreliggende oppfinnelse. Når det anvendes en fluorescensanalyse blir den gjensidige reaksjon av de forskjellige kjemiske komponentene fulgt ved å måle fluorescensen i det som strømmer ut av kapillærrøret som en funksjon av tid.

En annen metode for å måle produksjonshastigheten til et gitt enzym er å tilsette et kromogent substrat som er spesifikt for et enzymprodukt til det som strømmer ut av enzymreaktoren og deretter rette strømmen gjennom et kontinuerlig strømmende fotometer. F.eks. som vist i fig. 4, når produksjonshastigheten av faktor Xa skal bli målt, blir kromogent substrat S2222 (6) (Lottenberg et al., Meth. Enzymol. 80:341-361, 1981) tilsatt til det som strømmer ut før det passerer gjennom fotometeret. Deretter kan konsentrasjonen av faktor Xa som er dannet i enzymreaktoren bli målt ved endringer i optisk absorbans ved 405 nm. Eller f.eks. når produksjonshastigheten til trombin skal bli målt, blir kromogent substrat S2238 (7) (Lottenberg et al., Meth. Enxymol. 80:341-361, 1981) tilsatt til det som strømmer ut av enzymreaktoren før det kommer inn i fotometeret. Hvis mer enn en enzymproduksjonshastighet skal bli målt samtidig, kan den utgående strømmen fra enzymreaktoren bli splittet og forskjellige kromogene substrater kan bli tilsatt til hver strøm og målt separat for optisk absorbans. En proporsjons-pumpe (8) blir anvendt for å sende strømmen til et blande-trinn (9) og etter det blir separate strømmer sendt til spektrofotometeret (10) og (11).

Ved å anvende konsentrasjonsnivåene som blir målt for et eller flere enzymprodukter kan tiden for å oppnå en likevektstilstand i produksjonen for hvert av disse produktene bli beregnet. For analyseformål kan tiden for å oppnå halvparten av 1ikevektstilstandproduksjonen (T^/2) av et gitt produkt også bli målt, og dette tilveiebringer enklere sammenligning av data. Denne nye parameter, dvs. tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonen, som nå kan bli oppnådd ved å anvende den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse, tillater bedrede analyser av blodkoaguleringsmekanismer. I motsetning kan konvensjonelle statiske koaguleringsanalyser ikke gi informasjon om likevektstilstandsbetinglser, heller ikke kan de bli anvendt til å evaluere effektene av strømningshastig-het på tiden for å oppnå likevektstilstand.

Enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse er stabil i skjæringsbelastningsforhold i veggen på minst 3000 s-<1>, som kan sammenlignes med maksimal gjennomsnittlig skjærebelast-ningsforhold i veggen i karsystemet i den menneskelige kroppen, dvs. ca. 2000 s-<1> til 5000 s-<1>.

De følgende ikke-begrensende eksemplene har til hensikt å illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Fosfolipidvesikler som inneholder renset vevsfaktor tilveiebragt i rekombinant DNA kloningsteknikker som beskrevet i US-patentsøknad serienr. 062 166 eller ved kjente proteinisoleringsteknikker fra bovin hjerne eller human hjerne eller placentapulver som beskrevet av Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987, ble fremstilt på følgende måte: PS og PC i CHC13 ble kombinert i molare forhold som varierte fra 0:100 (PS:PC) til 40:60 (PS:PC) og tørket til en tynn film på veggen av et borsilikatglassrør under en strøm av N2 og deretter i vakuum i to timer. Et 15-gangers molart overskudd av oktylglykosid (200 nM) i 0,1 M NaCl og 0,05M tris, pH ved 7.5 (TBS) ble deretter tilsatt og blandingen ble inkubert ved romtemperatur med tilfeldig hvirvelristing inntil den var fullstendig klar.

Renset vevsfaktor i TBS som inneholdt 0,1$ Triton X-100 ble tilsatt til fosfolipid-oktylglykosidfremstillingen, og ga en sluttoppløsning der konsentrasjonen av Triton C-100 var

< 0,02$ og vevsfaktoren: fosfolipid: oktylglykosid molare forhold var 1-10:100 000: 1 500 000.

Spormengder av [<14>C] PC og <3>H-vevsfaktor ble tilsatt for presis kvantifisering av protein og fosfolipid i sluttmate-rialet. Forholdet mellom <3>H tellinger og <14>C tellinger var tilnærmet 10-100 til 1 (avhengig av vevsfaktor-konsentrasjonen). Prøver ble tatt til væskescintillasjonstelling, og resten ble dialysert mot 3x1 liter TBS ved romtemperatur i 72-96 timer, og etter dette ble materialet gelfiltrert ved romtemperatur i TBS på en kolonne med Sepharose CL-2B (1.5 x 55 cm). Gjenvinningen av ^H-vevsfaktor og <l>^C-fosfolipid ble bestemt i væskescintillasjonstelling. Den resulterende suspensjonen besto av 2nM PS/PC lipidvesikler og 20-200 nM vevsfaktor.

Standardglasskapillærer ble fremstilt ved først å sende dem i en kokende detergentoppløsning av 1 g Sparkleen/500 ml destillert/deionisert vann i 30 minutter og rense dem tre ganger i 5 minutter med destillert/deionisert vann i et ultrasonisk bad i totalt 15 minutter. Kapillærrørene ble deretter tørket ved 120"C i 30 minutter, og ble fylt med den fremstilte suspensjonen av PS/PC lipidvesikler som inneholdt vevsfaktor. Etter 10 minutter ble rørene skylt med HEPES/- albuminbuffer (0.01M HEPES, 0.14 NaCl, 1 mg/ml BSA, med pH justert til 7.5 ved å anvende HCL) og lagret nedsunket i buffer for å forhindre kontakt mellom lipidmembranen og luft.

Eksempel 2

Kapillær rør (I.D. = 0,56 mm, L = 75 mm) som fremstilt og dekket ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ble knyttet til en sprøyte som inneholdt forskjellige oppløs-ninger med en faktor VIIa, 100 nM med tritiummerket faktor X og 5 mM CaCl2- Ved å anvende en nøyaktig pumpe ble oppløs-ningene ført gjennom rørene ved en konstant hastighet på 27.1 pl/min. Strømmene som kom ut av rørene ble deretter analysert for faktor Xa produksjon og konsentrasjonene ved måling av mengden syreoppløselig tritium som var produsert. Resultatene ved likevektstilstanden er vist i tabell 1.

Som man kan se, var konsentrasjonen av faktor Xa som ble dannet uavhengig av faktor VIIa konsentrasjonen ved likevektstilstanden. Derimot illustrerer fig. 1 mengden av faktor Xa som blir produsert over tid for de ovenfor nevnte fire konsentrasjoner av faktor VIIa. Det er funnet at tiden til å oppnå nivået med likevektstilstand til faktor Xa varierte omvendt med faktor VIIa konsentrasjoner. I tillegg ble faktor VII utnyttet under de samme betingelsene og ga lignende resultater, dvs. når konsentrasjonen av faktor VII avtok, økte tiden for å oppnå likevektstilstand. For en faktor VII konsentrasjon på 0.1 nM var likevektstilstandskon-sentrasjonen til faktor Xa 10.6 nM.

Siden tilnærmelsen til likevektstilstandsproduksjonen av faktor Xa var gradvis, ble T-^/g av faktor Xa beregnet. I fig. 1 vises det at T^/g var tilsvarende som konsentrasjonene av 0,5-10 nM faktor VIIa, nemlig tilnærmet 4 minutter. Disse faktor VIIa nivåene svarer til 5-100$ av normal faktor VII nivå i den menneskelige kropp, selv om strengere blødning ofte oppstår når faktor VII nivået i kroppen er mindre enn 5$. Som det vises i fig. 1, øker T^/g markert når nivåene av faktor VIIa synker til 0,1 nM (1$ av normal) og 0,075 nM (0,75$ av normal). Veggens skjærbelastningsforhold utviklet seg i dette eksempelet tilnærmet til de i det humane venesystemet, f.eks. ca. 20-40 s"<l>.

Eksempel 3

De samme eksperimentelle betingelsene ble gjennomført som i eksempel 2, med unntagelse at dimensjonene på kapillærrøret og strømningshastigheten ble variert. Resultatene for en indre diameter av kapillærrøret lik 0,33 mm og lengden lik 125 mm er gitt i tabell 2

Ved lavere strømningshastighet (200 jjl/min.) var beregnet skjærbelastningsforhold i veggen 856 s_<1>, som ligger mellom gjennomsnittlig skjærbelastningsf orhold oppnådd i små arterier og i mikrosirkulasjon; ved 400 jjl/min. , var oppnådd skjaerbelastningsf orhold 1712 s-<1>, tilsvarende til mik-rosirkulatoriske forhold. Således var enzymreaktoren klart stabil i skjaerbelastningsforhold sammenlignet med det fysiologiske området. Således kan effekten av forskjellige unormaliteter i koagulasjonssystemet bli evaluert under strømmende betingelser som strekker seg fra i det venøse systemet til de i mikrosirkulasjon.

Det ble funnet at kapillærrør med indre diametre fra 0.10 til 1,10 mm og rørlengder fra ca. 1,0-15 cm var aksepterbare. Forandringer i rørdiameter ble funnet å endre mengden av produkter som ble fremstilt, men ikke basismekanismen.

De ovenfor nevnte eksemplene demonstrerer typen data som kan bli tilveiebragt ved å anvende den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren fra foreliggende oppfinnelse som ikke er tilgjengelig ved å anvende kjente statiske teknikker. Det foregående har ikke til hensikt å begrense rekkevidden av oppfinnelsen, siden de nåværende fremsatte kravene på enzymreaktoren kan bli anvendt til å måle trombinproduksjons-hastigheter, produksjon av koaguleringsfaktorer i fullplasma og forskjellige andre fosfolipidavhengige enzymreaksjoner.

Claims (16)

1. Dynamisk kontinuerlig enzymreaktor til utføring av og analysering av fosfolipid-avhengige enzymatiske reaksjoner, karakterisert ved at den består av en rørformet del dekket på sin indre overflate med en plan fosfolipid dobbeltlag membran, hvor anordningen kan bli knyttet via en åpning til en anordning for innmating av fluidstrømmende reagenser og at den kan knyttes via en annen åpning til en anordning for oppsamling og analysering av et utstrømmende fluid derfra.

2. Enzymreaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at anordningen er et kapillærrør, som fortrinnsvis har en indre diameter på 0,1 til 1,1 mm og en lengde på 1,0 til 15 cm.

3. Enzymreaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidmembranen består av minst en ytterligere komponent valgt fra gruppen som består av enzymer og enzym-kof aktorer .

4 . Enzymreaktor ifølge krav 3, karakterisert ved at kofaktoren er vevsfaktor.

5. Enzymreaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidmembranen består av nøytrale- og sure fosfolipider.

6. Enzymreaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidmembranen består av fosfatidylcholin og fosfatidyIserin.

7 . Enzymreaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidmembranen består av en blanding av 60-100$, fortrinnsvis 70$, fosfatidylcholin og 0-40$, fortrinnsvis 30$, fosfatidylserin.

8. Enzymreaktor ifølge krav 4, karakterisert ved at fosfolipidmembranen inneholder vevsfaktor i et forhold på tilnærmet 1-10 mol av vevsfaktor pr. 100 000 mol fosfolipid.

9. Fremgangsmåte for kontinuerlig utføring og måling av dynamiske enzymreaksjoner, karakterisert ved at den består av: (a) innmating av reagenser for å utføre en enzymatisk reaksjon ved en definert strømningshastighet til et innløp i en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor som består av en rørformet anordning som er dekket på sin indre overflate med en plan fosfolipid dobbeltlag membran, der reagensene og membrankomponentene er separat inaktive for utføring av den enzymatiske reaksjonen, men sammen gir et enzymatisk aktivt system; (b) pumping av reagensene gjennom enzymreaktoren ved en konstant og definert strømningshastighet slik at en enzym-reaksjon skjer i enzymreaktoren ved kontakt mellom reagensene og fosfolipidmembranen; (c) oppsamling av produktet fra enzymreaksjonen i fra det som strømmer ut fra utløpet i enzymreaktoren; og (d) måling av mengden produkt som ble dannet under enzymreaksjonen ved hjelp av en hensiktsmessig analyse.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fosfolipidmembranen videre består av minst en ytterlige komponent valgt fra gruppen som består av enzymer og enzymkofaktorer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at kofaktoren er vevsfaktor.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at reagensene består av blodkoaguleringsfaktorer og kalsiumioner.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at blodkoaguleringsfaktorene består av en blod-koaguler ingsf aktor valgt fra gruppen som består av faktor VII og faktor VIIa, sammen med minst en faktor valgt fra gruppen som består av faktor IX, faktor X, faktor V, faktor VIII, protrombin og fullplasma.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at analysen for måling av mengden produkt blir valgt fra gruppen som består av radioanalyser, kromogene analyser og fluorogene analyser.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den videre består av tilsetning av et kromogent eller fluorogent substrat spesifikt til produktet fra reaksjonen av det som strømmer ut før måling av mengden av det dannede produktet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den videre består av splitting av produktet som strømmer ut fra enzymreaktoren slik at mengden av mer enn et dannet produkt i enzymreaktoren kan bli målt.