NO176574B

NO176574B - Dynamic continuous flowing enzyme reactor

Info

Publication number: NO176574B
Application number: NO893956A
Authority: NO
Inventors: Yale Nemerson; Vincent Turitto
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-10-04
Publication date: 1995-01-16
Also published as: NO893956D0; DE68904616T2; NO893956L; DE68904616D1; NO176574C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor og en fremgangsmåte som tillater in vitro målinger av hastighetene av blodkoagulasjonsreaksjoner og andre dynamisk enzymatiske reaksjoner som er avhengig av aktivitet på fosfolipider i et miljø som er en nær tilnærming av det som blir funnet i kroppen. The present invention relates to a dynamic continuous flowing enzyme reactor and a method that allows in vitro measurements of the rates of blood coagulation reactions and other dynamic enzymatic reactions that depend on activity on phospholipids in an environment that is a close approximation of what is found in the body.

Koaguleringssystemet (koagulering) i mennesker og dyr er en hovedbidragsyter til opprettholdelse av hemostasen og også til trombedannelse (blodkoagel). Koagulering er i hovedsak en kaskade der hver koaguleringsfaktor, som normalt er tilstede i blod og annet vev som en inaktiv enzymforløper, dvs. zymogen, og blir i rekkefølge aktivert til et proteolytisk enzym som selektivt angriper den neste zymogen i rekkefølgen, og dermed omdanner det til et aktivt enzym. Amplifisering foregår ved hvert trinn i prosessen slik at en liten startstimulus kan til slutt resultere i en betydelig mengde fibrinkoagel. The coagulation system (coagulation) in humans and animals is a major contributor to the maintenance of hemostasis and also to thrombus formation (blood clot). Coagulation is essentially a cascade in which each coagulation factor, normally present in blood and other tissues as an inactive enzyme precursor, i.e. zymogen, is sequentially activated into a proteolytic enzyme that selectively attacks the next zymogen in the sequence, thereby converting it to an active enzyme. Amplification takes place at each step of the process so that a small initial stimulus can eventually result in a significant amount of fibrin clot.

Koaguleringskaskaden begynner som to adskilte veier som til slutt konvergerer. En vei er "indre" til blodet og den andre har betegnelsen "ytre" fordi den blir utløst av koaguleringsfaktorer som normalt ikke er tilstede i blod. Den indre veien spiller en hovedrolle i hemostastase etterfulgt av skade. Den ytre veien kan bli aktivert i mange patologiske situasjoner, f.eks. diffus endotelisk skade, fremskreden cancer, endotoksemi og komplikasjoner under svangerskap. The coagulation cascade begins as two separate pathways that eventually converge. One pathway is "intrinsic" to the blood and the other is termed "extrinsic" because it is triggered by clotting factors that are not normally present in blood. The intrinsic pathway plays a major role in hemostasis followed by injury. The extrinsic pathway can be activated in many pathological situations, e.g. diffuse endothelial damage, advanced cancer, endotoxemia and complications during pregnancy.

Det foreligger nå betydelig bevis at koagulering blir startet i kroppen når faktor VII, et vitamin K-avhengig plasma koaguleringsfaktor protein og vevsfaktor, et cellebundet protein som normalt ikke er assosiert med blodceller, virker gjensidig på hverandre. (Se f.eks. Nemerson, Blood 71:1-8, 1988 for en oversikt.) Denne gjensidige påvirkningen resulterer i et aktivert kompleks som har enzymatisk aktivitet og starter koagulering ved å omdanne to andre proteiner, dvs. faktor X og faktor IX til deres aktive enzymatiske former, hhv. faktor Xa og faktor IXa. (I henhold til vanlig praksis blir forløper, dvs. zymogen, former av de aktive blodkoaguleringsfaktorene betegnet med Romertall, og de aktive formene er angitt ved en indeks "a", f.eks. faktor X for zymogen og faktor Xa for aktivert faktor. ) There is now substantial evidence that coagulation is initiated in the body when factor VII, a vitamin K-dependent plasma coagulation factor protein, and tissue factor, a cell-bound protein not normally associated with blood cells, interact with each other. (See, e.g., Nemerson, Blood 71:1-8, 1988 for a review.) This interaction results in an activated complex that has enzymatic activity and initiates coagulation by converting two other proteins, i.e., factor X and factor IX to their active enzymatic forms, resp. factor Xa and factor IXa. (According to common practice, precursor, i.e. zymogen, forms of the active blood coagulation factors are designated by Roman numerals, and the active forms are indicated by an index "a", e.g. factor X for zymogen and factor Xa for activated factor. )

Vevsfaktor er et prokoaguleringsprotein som er tilstede på overflaten av alle celler, normalt ikke i direkte kontakt med blod. Derimot er vevsfaktor induserbar i endotelceller og monocytter ved stimulering med forskjellig farmakologiske mediatorer, f.eks. tumor nekrosefaktor, interleukin-1 og endotoksin. Den ytre koaguleringsveien blir utløst med vevsfaktor som kompieksdanner med og aktiverer faktor VII, et vitamin K-avhengig serinproteasezymogen. Aktiveringen av faktor VII med vevsfaktor foregår i nærvær av kalsiumioner og er antatt å være resultat av en konformasjonsendring i faktor VII. Se f.eks. Nemerson et al. (1982) i Progress in Hemostasis and Thrombosis, Spaet, T.H. edit., Grune & Stratton, New York, bind 6, s. 237-261; Carson (1984) Prog. Clin. Pathol. 9:1-14. Omdanning av faktor VII zymogenet til faktor VIIa aktivt enzym blir gjennomført ved spalting av en Arg-Ile peptidbinding i zymogenet som resulterer i faktor VIIa som har en lett kjede som inneholder Gla-området og en tung kjede som inneholder enzymets aktive sete. Tissue factor is a procoagulation protein present on the surface of all cells, normally not in direct contact with blood. In contrast, tissue factor is inducible in endothelial cells and monocytes by stimulation with different pharmacological mediators, e.g. tumor necrosis factor, interleukin-1 and endotoxin. The extrinsic coagulation pathway is triggered by tissue factor that complexes with and activates factor VII, a vitamin K-dependent serine protease zymogen. The activation of factor VII with tissue factor takes place in the presence of calcium ions and is thought to be the result of a conformational change in factor VII. See e.g. Nemerson et al. (1982) in Progress in Hemostasis and Thrombosis, Spaet, T.H. edit., Grune & Stratton, New York, vol. 6, pp. 237-261; Carson (1984) Prog. Clin. Pathol. 9:1-14. Conversion of the factor VII zymogen to factor VIIa active enzyme is carried out by cleavage of an Arg-Ile peptide bond in the zymogen resulting in factor VIIa which has a light chain containing the Gla region and a heavy chain containing the active site of the enzyme.

Hvis zymogen faktor VII hadde prokoagulerende aktivitet, kunne startingen av koaguleringen enkelt følges av brudd på en fysikalsk barriere som normalt adskiller faktor VII fra vevsfaktor. For at hemostase skal foregå kan således skaden i seg selv være tilstrekkelig for å starte koagulering. Erkjennelsen at et zymogen har en mindre mengde aktivitet relativt til dens derivatenzym medfører vanskeligheter fordi et aktivt zymogen vil ha den samme aktivitet som et inert zymogen kontaminert med en spormengde av et enzym. I de fleste tilfeller blir dette problemet tilnærmet løst enkelt ved å behandle zymogenet med en aktiv sete-rettet enzymhemmer slik som diisopropylfluorfosfat (DFP) eller et passende klormetylketon, og dermed hemme det kontaminerende enzymet. Fordi zymogener vanligvis nesten er inerte, vil dette resultere i et totalt tap av målbar aktivitet. Derimot er faktor VII zymogenet selv raskt hemmet av DFP, og således unngå denne tydelige tilnærmelse. Reaktiviteten til faktor VII mot DFP er tydelig så stor at den i seg selv antyder ekstraordinær aktivitet til faktor VII zymogenet. If zymogenic factor VII had procoagulant activity, the initiation of coagulation could easily be followed by a breach of a physical barrier that normally separates factor VII from tissue factor. In order for hemostasis to take place, the damage in itself may thus be sufficient to initiate coagulation. The recognition that a zymogen has a smaller amount of activity relative to its derivative enzyme causes difficulties because an active zymogen will have the same activity as an inert zymogen contaminated with a trace amount of an enzyme. In most cases, this problem is virtually solved simply by treating the zymogen with an active site-directed enzyme inhibitor such as diisopropylfluorophosphate (DFP) or an appropriate chloromethyl ketone, thereby inhibiting the contaminating enzyme. Because zymogens are usually nearly inert, this will result in a total loss of measurable activity. In contrast, the factor VII zymogen itself is quickly inhibited by DFP, thus avoiding this clear approximation. The reactivity of factor VII against DFP is clearly so great that it in itself suggests extraordinary activity of the factor VII zymogen.

Studier av DFP hemming ved å anvende bovine faktorer VII og VIIa, viste at faktor VII kvalitativt har den sammen enzymatiske aktivitet som faktor VIIa skjønt faktor VII zymogenet inneholder noe mindre enn 1% av aktiviteten til faktor VIIa. DFP er også blitt vist å hemme human faktor VII, og hastigheten er en tredjedel i forhold til hemmingen av faktor VIIa, som er ca. det samme forhold som er observert når bovine proteiner ble anvendt. Se f.eks. Nemerson, Blood 71:1-8,1988 og Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631, 1982. Studies of DFP inhibition using bovine factors VII and VIIa showed that factor VII qualitatively has the same enzymatic activity as factor VIIa, although the factor VII zymogen contains somewhat less than 1% of the activity of factor VIIa. DFP has also been shown to inhibit human factor VII, and the rate is one-third that of the inhibition of factor VIIa, which is approx. the same ratio as observed when bovine proteins were used. See e.g. Nemerson, Blood 71:1-8, 1988 and Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631, 1982.

Eksperimenter støtter oppfatningen at koagulering kan bli startet enkelt ved en fysikalsk kompleksdannelse av vevsfaktor og faktor VII. Videre bevis for denne forestilling er avledet fra observasjonen at bovine faktorer VII og VIIa bindes til vevsfaktor med i hovedsak samme dissosiasjonskon-stanter. Når monocytter ble anvendt som en kilde til human vevsfaktor, ble det samme fenomen observert for humane faktorer VII og VIIa. I henhold til dette behøver man ikke postulere en proteolytisk starting av koagulasjonen, og dermed unngå problemet med en uendelig tilbakegang av proteolytiske hendelser. Denne graden av aktivitet til zymogenet er generelt uvanlig og synes å være unik i koaguleringssystemet. Aktiviteten til faktor VII eller virkelig faktor VIIa, er pålitelig med et hvilende koagula-sjonssystem fordi i fravær av vevsfaktor kan den ikke utløse koagulasj on. Experiments support the notion that coagulation can be initiated simply by a physical complex formation of tissue factor and factor VII. Further evidence for this notion is derived from the observation that bovine factors VII and VIIa bind to tissue factor with essentially the same dissociation constants. When monocytes were used as a source of human tissue factor, the same phenomenon was observed for human factors VII and VIIa. According to this, one does not need to postulate a proteolytic initiation of the coagulation, thus avoiding the problem of an infinite decline of proteolytic events. This degree of activity of the zymogen is generally unusual and appears to be unique in the coagulation system. The activity of factor VII, or indeed factor VIIa, is reliable with a quiescent coagulation system because in the absence of tissue factor it cannot trigger coagulation.

På grunn av sin indre reaktivitet blir faktor VII adskilt fra alle andre kjente koaguleringszymogener. Fordi faktor VII zymogenet har enzymatisk aktivitet når zymogenet og det aktive enzymet blir referert til uten å adskille mellom de to artene, blir betegnelsen på faktor VII(a) anvendt. Because of its intrinsic reactivity, factor VII is distinguished from all other known coagulation zymogens. Because the factor VII zymogen has enzymatic activity when the zymogen and the active enzyme are referred to without distinguishing between the two species, the term factor VII(a) is used.

Vevsfaktor er på samme måte entydig blant kofaktorene fordi, i motsetning til koaguleringsf aktorene V og VIII og andre kofaktorer i koaguleringskaskaden, trenger det modne vevsfaktorproteinet tydeligvis ingen videre bearbeiding for sin aktivitet. Disse observasjonene vurdert sammen antyder at det eneste krav for starting av koagulasjon med vevsfaktor er dens fysikalske kompleksdannelse med faktor VII. Tissue factor is similarly unique among the cofactors because, unlike coagulation factors V and VIII and other cofactors in the coagulation cascade, the mature tissue factor protein apparently needs no further processing for its activity. Taken together, these observations suggest that the only requirement for initiation of coagulation with tissue factor is its physical complexation with factor VII.

Vevsfaktor som er et membranbundet glykoprotein assosiert med fosfolipider, er ikke normalt tilstede i blodomløpet. Når blodkar blir brutt, kan derimot faktor VII som er en plasmakoagulasjonsfaktor, kompleksdanne med vevsfaktor og dermed danne en katalytisk-aktiv art som aktiviserer både faktor IX (plasma tromboplastin komponent) en komponent fra den indre veien for å danne faktor IXa og faktor X (Stuart faktor), som er involvert i både ytre og indre veier i koagulasjonen, og gir faktor Xa. Vevsfaktor har også en viktig klinisk anvendelse som diagnostisk reagens for å måle og studere koagulasjon. Tissue factor, which is a membrane-bound glycoprotein associated with phospholipids, is not normally present in the bloodstream. When blood vessels are broken, on the other hand, factor VII, which is a plasma coagulation factor, can complex with tissue factor and thus form a catalytically active species that activates both factor IX (plasma thromboplastin component) a component from the intrinsic pathway to form factor IXa and factor X ( Stuart factor), which is involved in both extrinsic and intrinsic pathways in coagulation, and produces factor Xa. Tissue factor also has an important clinical application as a diagnostic reagent to measure and study coagulation.

Faktor VII er tilstede i spormengder i plasma (ca. 10 nM). Den kraftige blødningen som man kan se hos individer som har markert mangel på faktor VII, demonstrerer den fysiologiske viktigheten av dette protein. Mangel på faktor VII er sjelden, men nyere bevis antyder at rundt 16$ av påvirkede pasienter har hjerneblødninger som vanligvis resulterer i døden. Ragni et al., Factor VII Deficiency, Amer. J. Hematol., 10:79-88 (1981). På den annen side har pasienter med så lite som 5% av normaltnivå av faktor VII ofte mindre eller ingen blødningssymptomer. For et hvilket som helst faktor VII nivå er det derimot en "betydelig klinisk varia-s j on. Factor VII is present in trace amounts in plasma (about 10 nM). The profuse bleeding seen in individuals markedly deficient in factor VII demonstrates the physiological importance of this protein. Factor VII deficiency is rare, but recent evidence suggests that about 16$ of affected patients have brain hemorrhages that usually result in death. Ragni et al., Factor VII Deficiency, Amer. J. Hematol., 10:79-88 (1981). On the other hand, patients with as little as 5% of normal levels of factor VII often have less or no bleeding symptoms. For any factor VII level, however, there is considerable clinical variation.

En rekke sykdommer, f.eks. kancer og kardiovaskulær sykdom, er forbundet med økninger i blodkoageldannelsen i blodkarene. En hovedbehandling for kardivaskulaer sykdom innbefatter anvendelsen av antikoagulasjonsmiddel, f.eks. warfarin og legemidler i slekt, som interfererer med syntese av vitamin K-avhengig koagulasjonsfaktorer (f.eks. faktorene II, VII, IX og X). Det er mange studier som indikerer at denne be-handlingen senker hyppigheten av venøs tromboemboli, lungeemboli og myokardial infarkt (hjerteanfall). Warfarin-terapi er derimot også assosiert med en høyere hyppighet av blødninger som ofte er dødlige. A number of diseases, e.g. cancers and cardiovascular disease, are associated with increases in blood clot formation in the blood vessels. A main treatment for cardiovascular disease includes the use of anticoagulants, e.g. warfarin and related drugs, which interfere with the synthesis of vitamin K-dependent coagulation factors (eg factors II, VII, IX and X). There are many studies that indicate that this treatment lowers the frequency of venous thromboembolism, pulmonary embolism and myocardial infarction (heart attack). Warfarin therapy, on the other hand, is also associated with a higher frequency of bleeding, which is often fatal.

Standardmåten som doseringen av warfarin-type antikoagulasjonsmidlene blir målt med, er ved anvendelse av Quick en-trinns protrombin-tid. I denne testen som blir utført under statiske betingelser, blir en prøve av pasientens blodplasma oppvarmet til 37°C. En suspensjon av vevstromboplasti (rå vevsfaktor) blir deretter tilsatt til plasmaprøven sammen med kalsiumioner og koagulasjonstiden blir bestemt. Normal koagulasjonstid er 12 +/- 0,5 sekunder. Det terapeutiske området til antikoagulasjonsmidlene er en blodkonsentrasjon av legemidlet som tilveiebringer en koagulasjonstid som strekker seg mellom 1,2 og 1,5 ganger normalverdien. Dette smale området pålegger de kliniske laboratoriene en presisjon som ofte ikke er oppnåelig. Disse unøyaktighetene er antatt å være ansvarlig for noen av blødningssideeffektene i antikoagulasjonslegemidlene. The standard way in which the dosage of the warfarin-type anticoagulants is measured is by the use of the Quick one-step prothrombin time. In this test, which is carried out under static conditions, a sample of the patient's blood plasma is heated to 37°C. A suspension of tissue thromboplastin (crude tissue factor) is then added to the plasma sample along with calcium ions and the clotting time is determined. Normal coagulation time is 12 +/- 0.5 seconds. The therapeutic range of the anticoagulants is a blood concentration of the drug that provides a coagulation time that ranges between 1.2 and 1.5 times the normal value. This narrow area imposes on the clinical laboratories a precision that is often not achievable. These inaccuracies are thought to be responsible for some of the bleeding side effects of the anticoagulant drugs.

Faktor VII kan bli målt på en lignende måte. Fortynninger av pasientens plasma blir tilsatt til normalplasma og en-trinn protrombin tidstesten blir utført. Mengden av faktor VII som er tilstede i testprøven blir bestemt ved å sammenligne koaguleringstidene til testprøvene med de som er oppnådd fra fortynningene av normalt plasma. For å datere alle testene i koagulasjonssystemet er det basert på bestemmelse av koagulasjonstidene til forskjellige prøver, men alltid i et testrør under statiske betingelser. Fordi blodkoagulering in vivo alltid foregår i en bevegende strøm, kan effektene av strømmen på de enzymatiske reaksjonene ikke bli riktig evaluert i et statisk system. Factor VII can be measured in a similar way. Dilutions of the patient's plasma are added to normal plasma and the one-step prothrombin time test is performed. The amount of factor VII present in the test sample is determined by comparing the clotting times of the test samples with those obtained from the dilutions of normal plasma. To date all the tests in the coagulation system, it is based on determining the coagulation times of different samples, but always in a test tube under static conditions. Because blood coagulation in vivo always takes place in a moving current, the effects of the current on the enzymatic reactions cannot be properly evaluated in a static system.

Det har blitt funnet at de spesifikke blodkoagulerings-enzymatiske reaksjonene kan bli mer spesifikt gjennomført i en dynamisk utforming ved å føre forskjellige blodkoaguler-ingszymogener sammen med kalsiumioner ved en definert strømningshastighet gjennom en rørformet anordning som er dekket på sin indre overflate med en plan fosfolipid tolags membran. Valgfritt og fortrinnsvis har den plane membranen renset vevsfaktor inkorporert i seg. Reagensene som passerer gjennom anordningen inkluderer enten faktor VII eller faktor VIIa, som kompleksdanner med vevsfaktoren for å danne en enzymatisk art, sammen med faktor IX eller faktor X som er substrater for vevsfaktor - faktor VII komplekset. Hastighetene til faktor IXa eller Xa fremstilligenen kan bli raskt analysert ved en hvilken som helst hensiktsmessig analyse for disse faktorer. Den dynamiske reaksjone tillater mer spesifikke analyser av produksjonen av aktiverte faktorer enn det som kan bli oppnådd i nåværende statiske metoder. It has been found that the specific blood coagulation enzymatic reactions can be more specifically carried out in a dynamic design by passing different blood coagulation zymogens together with calcium ions at a defined flow rate through a tubular device covered on its inner surface with a planar phospholipid bilayer membrane. Optionally and preferably, the planar membrane has purified tissue factor incorporated therein. The reagents passing through the device include either factor VII or factor VIIa, which complex with the tissue factor to form an enzymatic species, along with factor IX or factor X which are substrates for the tissue factor - factor VII complex. The rates of factor IXa or Xa production can be rapidly analyzed by any appropriate assay for these factors. The dynamic response allows more specific analyzes of the production of activated factors than can be achieved in current static methods.

Føring av plasmaprøver, f.eks. fra en pasient, gjennon en slik fosfolipid membrandekket anordning under definerte strømingshastigheter og andre betingelser i oppfinnelsen, tillater måling av spesifikke enzymatiske produkter fremstilt ved gjensidig påvirkning av plasmaprøvene med vevsfaktor-innholdende fosfolipidmembranen og kan tilveiebringe verdifull informasjon når det gjelder mangler av spesifikke koaguleringsfaktorer eller en mer følsom måling av riktig antikoaguleringsparametre i pasienter enn den som er oppnåelig i tidligere metoder. Administration of plasma samples, e.g. from a patient, again such a phospholipid membrane-covered device under defined flow rates and other conditions of the invention, allows the measurement of specific enzymatic products produced by interaction of the plasma samples with the tissue factor-containing phospholipid membrane and can provide valuable information regarding deficiencies of specific coagulation factors or a more sensitive measurement of correct anticoagulation parameters in patients than is achievable in previous methods.

Enzymreaktoren i oppfinnelsen kan også bli anvendt for å utføre og analysere andre fosfolipid-avhengig enzymatiske reaksjoner enn blodkoaguleringsreaksjoner. Slike reaksjoner involverer strømming av forskjellige inaktive enzymreaksjons-bestanddeler i reagensoppløsningen gjennom en fosfolipid dobbeltlag membrandekket rørformig anordning. De inaktive enzymbestanddelene i reagensoppløsningen blir enzymatisk aktive av gjensidig påvirkning av fosfolipidmembranen på den indre overflaten av anordningen og produktene fra reaksjonen kan bli analysert i den utstrømmende oppløsningen. The enzyme reactor in the invention can also be used to perform and analyze other phospholipid-dependent enzymatic reactions than blood coagulation reactions. Such reactions involve the flow of various inactive enzyme reaction components in the reagent solution through a phospholipid bilayer membrane-covered tubular device. The inactive enzyme components in the reagent solution become enzymatically active by mutual influence of the phospholipid membrane on the inner surface of the device and the products of the reaction can be analyzed in the flowing solution.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor tilveiebragt som tillater in vitro måling av hastigheter til blodkoaguleringsreaksjoner og andre fosfolipidavhengig enzymatiske reaksjoner i et miljø som er nær tilnærmet det som finnes i kroppen. Det blir også tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse en metode for måling av hastigheten til aktiveringen av forskjellige koaguleringsfaktorer, særlig aktivering av faktor X til faktor Xa og faktor IX til faktor IXa> både via faktor VII eller faktor VIIa, så vel som en fremgangsmåte for å måle hastigheten av trombinproduksjon. Fig. 1 illustrerer aktivering av faktor X ved faktor VIIa og vevsfaktor ifølge en utførelsesform av foreliggende oppf innelse. Fig. 2 er et diagram av den kontinuerlig strømmende According to the present invention, a dynamic continuously flowing enzyme reactor is provided which allows in vitro measurement of rates of blood coagulation reactions and other phospholipid-dependent enzymatic reactions in an environment that closely approximates that found in the body. There is also provided according to the present invention a method for measuring the speed of the activation of various coagulation factors, in particular the activation of factor X to factor Xa and factor IX to factor IXa> both via factor VII or factor VIIa, as well as a method for measuring the rate of thrombin production. Fig. 1 illustrates activation of factor X by factor VIIa and tissue factor according to an embodiment of the present invention. Fig. 2 is a diagram of the continuous flowing

enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse. the enzyme reactor in the present invention.

Fig. 3 er et langsgående snitt av den kontinuerlig strømm-ende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse. Fig. 4 er et diagram av den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse knyttet til en anordning for pumping av reagenser inn i reaktoren og en anordning for å analysere det som strømmer ut fra reaksjonen av både trombin og faktor Xa. Fig. 3 is a longitudinal section of the continuously flowing enzyme reactor in the present invention. Fig. 4 is a diagram of the continuously flowing enzyme reactor in the present invention linked to a device for pumping reagents into the reactor and a device for analyzing what flows out from the reaction of both thrombin and factor Xa.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en dynamisk kontinuerlig strømmende enzymreaktor som består av en rørformig anordning dekket på sin innsideoverflate avd en lipidmembran som består av et plant fosfolipid dobbeltlag som valgfritt og fortrinnsvis inneholder et enzym eller en enzymkofaktor. Den rørformige anordningen har en ende som kan knyttes til en anordning for avlevering av spesifikke fluidreagenser til den og kan tilknyttes ved en annen åpning til en anordning for oppsamling og analysering av utstrømmende fluid derfra. Fortrinnsvis er den rørformige anordningen et kapillærrør som er åpent eller kan åpnes i begge ender. The present invention relates to a dynamic continuously flowing enzyme reactor which consists of a tubular device covered on its inner surface with a lipid membrane which consists of a planar phospholipid bilayer which optionally and preferably contains an enzyme or an enzyme cofactor. The tubular device has an end that can be connected to a device for delivering specific fluid reagents to it and can be connected via another opening to a device for collecting and analyzing fluid flowing out from there. Preferably, the tubular device is a capillary tube which is open or can be opened at both ends.

Forskjellig rensede koaguleringsfaktorer eller zymogener eller, alternativt plasma, kan bli pumpet gjennom enzymreaktoren sammen med kalsiumioner og får anledning til å reagere med enzymet eller kofaktoren i fosfolipidmembranen. Ved å regulere strømningshastigheten til disse faktorene ved at de entrer reaktoren og måling av konsentrasjonene til produktene i utstrømmende fluid som forlater reaktoren, kan aktiverings-hastighetene til de forskjellige zymogenene i blodkoaguler-ingskaskaden til aktive produkter bli bestemt og effekten av strømming på produktdannelsen kan bli bestemt. I tillegg kan tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonsnivå av en hvilken som helst aktivert art, også bli beregnet. Various purified coagulation factors or zymogens or, alternatively, plasma can be pumped through the enzyme reactor together with calcium ions and are allowed to react with the enzyme or cofactor in the phospholipid membrane. By controlling the flow rate of these factors as they enter the reactor and measuring the concentrations of the products in the effluent fluid leaving the reactor, the rates of activation of the various zymogens in the blood coagulation cascade to active products can be determined and the effect of flow on product formation can be determined specific. In addition, the time to reach an equilibrium state in the production level of any activated species can also be calculated.

I henhold til den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen, inneholder fosfolipid dobbeltlaget renset vevsfaktor som er den enzymkofaktoren som starter aktivering av blodkoaguleringsfaktorer. Koaguleringsfaktorer som blir pumpet gjennom reaktoren er faktor VII eller faktor VIIa sammen med faktor IX eller faktor X. Koaguleringsfaktorene blir pumpet gjennom det fosfolipid membrandekkede kapillærrøret sammen med kalsiumioner og får anledning til å strømme over den vevsfaktor-inneholdende fosfolipid dobbeltlag membranen på den indre overflaten av røret. Når vevsfaktoren i membranen kommer i kontakt med faktor VII eller faktor VIIa i det strømmende materialet, blir et enzymatisk aktivt kompleks dannet på innsiden av kapillærrøret. Dette enzymatiske aktive kompleks aktiviserer i sin tur faktor IX til faktor IXa eller faktor X til faktor Xa i strømningsmaterialet. Ved å regulere strømningshastigheten og konsentrasjonene til faktor IX eller faktor X og faktor VII eller faktor VIIa ved innløpet av reaktoren og å måle konsentrasjonene til faktor IXa eller faktor Xa i utstrømningen fra reaktoren, kan aktivitetshastighetene av faktor IX til faktor IXa eller faktor X til faktor Xa bli beregnet og effektene av strømning kan bli bestemt. I tillegg kan tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonen av faktor IXa eller faktor Xa ved forskjellige konsentrasjoner av faktor VII eller VIIa også bli beregnet. According to the preferred embodiment of the invention, the phospholipid bilayer contains purified tissue factor which is the enzyme cofactor that initiates activation of blood coagulation factors. Coagulation factors that are pumped through the reactor are factor VII or factor VIIa together with factor IX or factor X. The coagulation factors are pumped through the phospholipid membrane-covered capillary together with calcium ions and allowed to flow across the tissue factor-containing phospholipid bilayer membrane on the inner surface of the pipe. When tissue factor in the membrane comes into contact with factor VII or factor VIIa in the flowing material, an enzymatically active complex is formed on the inside of the capillary tube. This enzymatically active complex in turn activates factor IX to factor IXa or factor X to factor Xa in the flow material. By controlling the flow rate and concentrations of factor IX or factor X and factor VII or factor VIIa at the inlet of the reactor and measuring the concentrations of factor IXa or factor Xa in the effluent from the reactor, the activity rates of factor IX to factor IXa or factor X to factor Xa be calculated and the effects of flow can be determined. In addition, the time to reach equilibrium state in the production of factor IXa or factor Xa at different concentrations of factor VII or VIIa can also be calculated.

Faktor VII kan bli substituert med faktor VIIa og vice-versa, siden, som diskutert over, zymogenfaktor VII kvalitativt har den samme prokoagulerende aktivitet som dens aktive enzym-derivat faktor VIIa, selv om aktiviteten til zymogenet bare er ca. 1% av det aktive enzymet. Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631 (1982); Nemerson, Blood 71:1-8 (1988). Faktor VII kan således bli benyttet som et startende materiale i foreliggende enzymreaktor uten forbearbeiding til faktor VIIa- Factor VII can be substituted for factor VIIa and vice-versa, since, as discussed above, zymogen factor VII qualitatively has the same procoagulant activity as its active enzyme derivative factor VIIa, although the activity of the zymogen is only approx. 1% of the active enzyme. Zur et al., J. Biol. Chem. 257:5623-5631 (1982); Nemerson, Blood 71:1-8 (1988). Factor VII can thus be used as a starting material in the present enzyme reactor without preprocessing to factor VIIa-

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan en blanding av renset faktor VII eller faktor VIIa sammen med de rensede koaguleringsfaktorene V, faktor VIII, faktor IX og faktor X bli innført i det membrandekkede kapillærrøret sammen med protrombin. Hastigheten av trombin-produksjonen, faktor IXa produksjonen eller faktor Xa produksjonen kan deretter bli målt og effekten av forskjellige konsentrasjoner på hver av koaguleringsfaktorene på trombin, faktor IXa eller faktor Xa produksjonen kan bli målt. According to another embodiment of the present invention, a mixture of purified factor VII or factor VIIa together with the purified coagulation factors V, factor VIII, factor IX and factor X can be introduced into the membrane-covered capillary tube together with prothrombin. The rate of thrombin production, factor IXa production or factor Xa production can then be measured and the effect of different concentrations of each of the coagulation factors on thrombin, factor IXa or factor Xa production can be measured.

Ifølge enda en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan plasma bli innført i den fosfolipid membrandekkede enzymreaktoren i en konstant strømningshastighet, for å starte aktivering av koaguleringsfaktorer ved at de gjensidig reagerer med vevsfaktoren i fosfolipid membranen. Frem-stilling av utvalgte faktorer slik som IXa, Xa eller trombin kan deretter bli målt. Denne utførelsesformen tillater en mer spesifikk evaluering av koageldannelsen enn den som kan bli oppnådd ved de statiske målingene av protrombin-tid og er anvendelig til å evaluere pasienter med koagulerings-mangler eller de som er i antikoaguleringsterapi. According to yet another embodiment of the present invention, plasma can be introduced into the phospholipid membrane-covered enzyme reactor at a constant flow rate, to initiate activation of coagulation factors by their mutual reaction with the tissue factor in the phospholipid membrane. Production of selected factors such as IXa, Xa or thrombin can then be measured. This embodiment allows a more specific evaluation of clot formation than can be achieved by the static measurements of prothrombin time and is applicable to evaluate patients with coagulation deficiencies or those on anticoagulation therapy.

Kapillærrøret med den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren kan være av varierende dimensjoner, og kan ha en indre diameter mellom 0,10-1.10 mm og en lengde på 1-15 cm. Ved lave skjærbelastningsforhold i veggen (ca. 20 s-3-) er produktdannelsen proporsjonal med størrelsen av kapillærrøret i henhold til ligningen (L/Q)<2>/^, der L er rørlengden og Q er strømningshastigheten gjennom reaktoren, som er en indikasjon på en diffusjonskontrollert reaksjon. Ved høye skjærbelastningsf orhold (større enn 100 s-<1>) er det å anta at diffu-sjonen blir mindre viktig og enzymkinetikken dominerer. The capillary tube with the continuously flowing enzyme reactor can be of varying dimensions, and can have an inner diameter between 0.10-1.10 mm and a length of 1-15 cm. At low wall shear conditions (about 20 s-3-), product formation is proportional to the size of the capillary tube according to the equation (L/Q)<2>/^, where L is the tube length and Q is the flow rate through the reactor, which is a indication of a diffusion-controlled reaction. At high shear stress conditions (greater than 100 s-<1>) it is assumed that diffusion becomes less important and enzyme kinetics dominates.

Kapillærrøret blir fremstilt ved først å senke det helt ned i en kokende detergentoppløsning, f.eks. Sparkleen, og deretter rense det i destillert deionisert vann i et ultrasonisk bad. Det blir deretter tørket ved 120°C og fylt med en suspensjon av lipidvesikler som inneholder vevsfaktor. Kapillærrøret blir deretter skylt med en bufferoppløsning av 0,01 M N-2-hydroksyetyl piperazin-N'-2-etan sulfonsyre (HEPES) med 0,14M NaCl og 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) der pH blir justert til 7,5 med HC1. Det fylte kapillærrøret blir til slutt lagret ved romtemperatur i en bufferoppløsning for å hindre eksponering av membranen i luft. The capillary tube is prepared by first immersing it completely in a boiling detergent solution, e.g. Sparkleen, then clean it in distilled deionized water in an ultrasonic bath. It is then dried at 120°C and filled with a suspension of lipid vesicles containing tissue factor. The capillary tube is then rinsed with a buffer solution of 0.01 M N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid (HEPES) with 0.14 M NaCl and 1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) where the pH is adjusted to 7 .5 with HC1. The filled capillary tube is finally stored at room temperature in a buffer solution to prevent exposure of the membrane to air.

Suspensjonen av lipidvesikler som inneholder renset vevsfaktor blir fortrinnsvis fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i Bach et al., "Factor VII Binding to Tissue Factor in reconstituted Phospholipid Vesicles: Induction of Cooperativity by Phosphatidylserine", Biochemistry 25:4007 The suspension of lipid vesicles containing purified tissue factor is preferably prepared according to the method described in Bach et al., "Factor VII Binding to Tissue Factor in reconstituted Phospholipid Vesicles: Induction of Cooperativity by Phosphatidylserine", Biochemistry 25:4007

(1986), som involverer inkorporering av vevsfaktor inn i fosfolipidvesikler i nærvær av et stort overskudd, f.eks. et 15-gangers molart overskudd, av dialyserbart ikke-ionisk detergent oktylglykosid. Fjerning av detergenten ved dialyse resulterer i den spontane inkorporeringen av renset vevsfaktor i store fosfolipidvesikler. Vesiklene blir fremstilt fra en blanding av fosfatidylserin eller andre sure fosfolipider og fosfatidylcholin. Fortrinnsvis blir en blanding av 0-40$ fosfatidylserin (PS) og 60-100$ fosfatidylcholin (PC) kompleksdannet med vevsfaktor i et forhold på tilnærmet 1-10 mol vevsfaktor til 100.000 mol fosfolipid. (1986), which involves the incorporation of tissue factor into phospholipid vesicles in the presence of a large excess, e.g. a 15-fold molar excess of dialyzable non-ionic detergent octyl glycoside. Removal of the detergent by dialysis results in the spontaneous incorporation of purified tissue factor into large phospholipid vesicles. The vesicles are produced from a mixture of phosphatidylserine or other acidic phospholipids and phosphatidylcholine. Preferably, a mixture of 0-40$ phosphatidylserine (PS) and 60-100$ phosphatidylcholine (PC) is complexed with tissue factor in a ratio of approximately 1-10 mol of tissue factor to 100,000 mol of phospholipid.

Renset vevsfaktor kan bli fremstilt ved kjente teknikker fra bovin hjerne eller human hjerne eller placenta (se f.eks. Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987) eller fremstilt ved rekombinant DNA kloningsteknikker som i US-062 166 til Nemerson et al., inngitt 12. juni 1987. Purified tissue factor can be prepared by known techniques from bovine brain or human brain or placenta (see, e.g., Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987) or prepared by recombinant DNA cloning techniques such as in US-062,166 to Nemerson et al., filed Jun. 12, 1987.

Ved å referere til fig. 2 og 4, når enzymreaktoren skal bli anvendt, blir kapillærrøret (1) fjernet fra lagringsbufferen og knyttet til en sprøyte (3) som inneholder en oppløsning med kalsiumioner og enten faktor VII eller faktor VIIa og en eller flere rensede koaguleringsfaktorer som inkluderer faktor V, faktor VIII, faktor IX, faktor X og protrombin. Disse rensede faktorene kan bli tilveiebragt ved kjente proteinisoleringsteknikker eller fremstilt ved rekombinante DNA kloningsteknikker. Ved å anvende pumpe (4) blir oppløsningen sendt gjennom kapillærrøret (1) ved en konstant hastighet og de forskjellige koaguleringsfaktorene får anledning til å reagere med vevsfaktoren - som er inneholdt i den plane fosfolipidmembranen. Det utstrømmende materialet som inneholder aktiverte enzymprodukter blir deretter oppsamlet i oppsamleren (2) ved utgangsenden av kapillærrøret (1) og analysert. Referring to FIG. 2 and 4, when the enzyme reactor is to be used, the capillary tube (1) is removed from the storage buffer and connected to a syringe (3) containing a solution of calcium ions and either factor VII or factor VIIa and one or more purified coagulation factors including factor V, factor VIII, factor IX, factor X and prothrombin. These purified factors can be obtained by known protein isolation techniques or produced by recombinant DNA cloning techniques. By using pump (4), the solution is sent through the capillary tube (1) at a constant speed and the various coagulation factors are given the opportunity to react with the tissue factor - which is contained in the planar phospholipid membrane. The flowing material containing activated enzyme products is then collected in the collector (2) at the outlet end of the capillary tube (1) and analyzed.

Produksjonshastighetene til utvalgte enzymer blir deretter målt. En fremgangsmåte for måling av produksjonshastighetene til faktor IXa eller faktor Xa er å anvende tritium-merket faktor IX eller faktor X som et utgangsmateriale, og deretter måle mengden av sur oppløselig tritium fremstilt i det som strømmer ut av kapillærrøret. I tillegg kan standard radioanalyser eller fluorescente (fluorogeniske) analysetek-nikker bli anvendt til å analysere produktene fra enzymreaksjoner som tar plass innenfor reaktoren i foreliggende oppfinnelse. Når det anvendes en fluorescensanalyse blir den gjensidige reaksjon av de forskjellige kjemiske komponentene fulgt ved å måle fluorescensen i det som strømmer ut av kapillærrøret som en funksjon av tid. The production rates of selected enzymes are then measured. One method for measuring the production rates of factor IXa or factor Xa is to use tritium-labeled factor IX or factor X as a starting material, and then measure the amount of acid-soluble tritium produced in the effluent from the capillary tube. In addition, standard radioanalyses or fluorescent (fluorogenic) analysis techniques can be used to analyze the products from enzyme reactions that take place within the reactor of the present invention. When a fluorescence assay is used, the mutual reaction of the different chemical components is followed by measuring the fluorescence in what flows out of the capillary tube as a function of time.

En annen metode for å måle produksjonshastigheten til et gitt enzym er å tilsette et kromogent substrat som er spesifikt for et enzymprodukt til det som strømmer ut av enzymreaktoren og deretter rette strømmen gjennom et kontinuerlig strømmende fotometer. F.eks. som vist i fig. 4, når produksjonshastigheten av faktor Xa skal bli målt, blir kromogent substrat S2222 (6) (Lottenberg et al., Meth. Enzymol. 80:341-361, 1981) tilsatt til det som strømmer ut før det passerer gjennom fotometeret. Deretter kan konsentrasjonen av faktor Xa som er dannet i enzymreaktoren bli målt ved endringer i optisk absorbans ved 405 nm. Eller f.eks. når produksjonshastigheten til trombin skal bli målt, blir kromogent substrat S2238 (7) (Lottenberg et al., Meth. Enxymol. 80:341-361, 1981) tilsatt til det som strømmer ut av enzymreaktoren før det kommer inn i fotometeret. Hvis mer enn en enzymproduksjonshastighet skal bli målt samtidig, kan den utgående strømmen fra enzymreaktoren bli splittet og forskjellige kromogene substrater kan bli tilsatt til hver strøm og målt separat for optisk absorbans. En proporsjons-pumpe (8) blir anvendt for å sende strømmen til et blande-trinn (9) og etter det blir separate strømmer sendt til spektrofotometeret (10) og (11). Another method of measuring the production rate of a given enzyme is to add a chromogenic substrate specific for an enzyme product to the effluent of the enzyme reactor and then direct the flow through a continuous flow photometer. E.g. as shown in fig. 4, when the production rate of factor Xa is to be measured, chromogenic substrate S2222 (6) (Lottenberg et al., Meth. Enzymol. 80:341-361, 1981) is added to the effluent before it passes through the photometer. Then, the concentration of factor Xa that is formed in the enzyme reactor can be measured by changes in optical absorbance at 405 nm. Or e.g. when the production rate of thrombin is to be measured, chromogenic substrate S2238 (7) (Lottenberg et al., Meth. Enxymol. 80:341-361, 1981) is added to the effluent of the enzyme reactor before entering the photometer. If more than one enzyme production rate is to be measured simultaneously, the output stream from the enzyme reactor can be split and different chromogenic substrates can be added to each stream and measured separately for optical absorbance. A proportional pump (8) is used to send the stream to a mixing stage (9) and after that separate streams are sent to the spectrophotometer (10) and (11).

Ved å anvende konsentrasjonsnivåene som blir målt for et eller flere enzymprodukter kan tiden for å oppnå en likevektstilstand i produksjonen for hvert av disse produktene bli beregnet. For analyseformål kan tiden for å oppnå halvparten av 1ikevektstilstandproduksjonen (T^/2) av et gitt produkt også bli målt, og dette tilveiebringer enklere sammenligning av data. Denne nye parameter, dvs. tiden for å oppnå likevektstilstand i produksjonen, som nå kan bli oppnådd ved å anvende den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse, tillater bedrede analyser av blodkoaguleringsmekanismer. I motsetning kan konvensjonelle statiske koaguleringsanalyser ikke gi informasjon om likevektstilstandsbetinglser, heller ikke kan de bli anvendt til å evaluere effektene av strømningshastig-het på tiden for å oppnå likevektstilstand. By using the concentration levels that are measured for one or more enzyme products, the time to reach an equilibrium state in production for each of these products can be calculated. For analytical purposes, the time to reach half of the steady-state production (T^/2) of a given product can also be measured, and this provides easier comparison of data. This new parameter, i.e. the time to reach an equilibrium state in the production, which can now be obtained by using the continuous flow enzyme reactor of the present invention, allows improved analyzes of blood coagulation mechanisms. In contrast, conventional static coagulation assays cannot provide information on steady state conditions, nor can they be used to evaluate the effects of flow rate on the time to reach steady state.

Enzymreaktoren i foreliggende oppfinnelse er stabil i skjæringsbelastningsforhold i veggen på minst 3000 s-<1>, som kan sammenlignes med maksimal gjennomsnittlig skjærebelast-ningsforhold i veggen i karsystemet i den menneskelige kroppen, dvs. ca. 2000 s-<1> til 5000 s-<1>. The enzyme reactor in the present invention is stable in shear stress conditions in the wall of at least 3000 s-<1>, which can be compared to the maximum average shear stress condition in the wall of the vascular system in the human body, i.e. approx. 2000 s-<1> to 5000 s-<1>.

De følgende ikke-begrensende eksemplene har til hensikt å illustrere foreliggende oppfinnelse. The following non-limiting examples are intended to illustrate the present invention.

Eksempel 1 Example 1

Fosfolipidvesikler som inneholder renset vevsfaktor tilveiebragt i rekombinant DNA kloningsteknikker som beskrevet i US-patentsøknad serienr. 062 166 eller ved kjente proteinisoleringsteknikker fra bovin hjerne eller human hjerne eller placentapulver som beskrevet av Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5148-5152, 1987, ble fremstilt på følgende måte: PS og PC i CHC13 ble kombinert i molare forhold som varierte fra 0:100 (PS:PC) til 40:60 (PS:PC) og tørket til en tynn film på veggen av et borsilikatglassrør under en strøm av N2 og deretter i vakuum i to timer. Et 15-gangers molart overskudd av oktylglykosid (200 nM) i 0,1 M NaCl og 0,05M tris, pH ved 7.5 (TBS) ble deretter tilsatt og blandingen ble inkubert ved romtemperatur med tilfeldig hvirvelristing inntil den var fullstendig klar. Phospholipid vesicles containing purified tissue factor obtained by recombinant DNA cloning techniques as described in US patent application serial no. 062 166 or by known protein isolation techniques from bovine brain or human brain or placenta powder as described by Spicer et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. 84:5148-5152, 1987, was prepared as follows: PS and PC in CHCl 3 were combined in molar ratios ranging from 0:100 (PS:PC) to 40:60 (PS:PC) and dried to a thin film on the wall of a borosilicate glass tube under a stream of N2 and then in vacuum for two hours. A 15-fold molar excess of octyl glycoside (200 nM) in 0.1 M NaCl and 0.05 M tris, pH at 7.5 (TBS) was then added and the mixture was incubated at room temperature with random vortexing until completely clear.

Renset vevsfaktor i TBS som inneholdt 0,1$ Triton X-100 ble tilsatt til fosfolipid-oktylglykosidfremstillingen, og ga en sluttoppløsning der konsentrasjonen av Triton C-100 var Purified tissue factor in TBS containing 0.1% Triton X-100 was added to the phospholipid-octylglycoside preparation, yielding a final solution in which the concentration of Triton C-100 was

< 0,02$ og vevsfaktoren: fosfolipid: oktylglykosid molare forhold var 1-10:100 000: 1 500 000. < 0.02$ and the tissue factor: phospholipid: octylglycoside molar ratio was 1-10:100,000: 1,500,000.

Spormengder av [<14>C] PC og <3>H-vevsfaktor ble tilsatt for presis kvantifisering av protein og fosfolipid i sluttmate-rialet. Forholdet mellom <3>H tellinger og <14>C tellinger var tilnærmet 10-100 til 1 (avhengig av vevsfaktor-konsentrasjonen). Prøver ble tatt til væskescintillasjonstelling, og resten ble dialysert mot 3x1 liter TBS ved romtemperatur i 72-96 timer, og etter dette ble materialet gelfiltrert ved romtemperatur i TBS på en kolonne med Sepharose CL-2B (1.5 x 55 cm). Gjenvinningen av ^H-vevsfaktor og <l>^C-fosfolipid ble bestemt i væskescintillasjonstelling. Den resulterende suspensjonen besto av 2nM PS/PC lipidvesikler og 20-200 nM vevsfaktor. Trace amounts of [<14>C] PC and <3>H tissue factor were added for precise quantification of protein and phospholipid in the final material. The ratio between <3>H counts and <14>C counts was approximately 10-100 to 1 (depending on the tissue factor concentration). Samples were taken for liquid scintillation counting, and the remainder was dialyzed against 3x1 liter TBS at room temperature for 72-96 hours, and after this the material was gel filtered at room temperature in TBS on a column with Sepharose CL-2B (1.5 x 55 cm). The recovery of ^H-tissue factor and <l>^C-phospholipid was determined in liquid scintillation counting. The resulting suspension consisted of 2 nM PS/PC lipid vesicles and 20-200 nM tissue factor.

Standardglasskapillærer ble fremstilt ved først å sende dem i en kokende detergentoppløsning av 1 g Sparkleen/500 ml destillert/deionisert vann i 30 minutter og rense dem tre ganger i 5 minutter med destillert/deionisert vann i et ultrasonisk bad i totalt 15 minutter. Kapillærrørene ble deretter tørket ved 120"C i 30 minutter, og ble fylt med den fremstilte suspensjonen av PS/PC lipidvesikler som inneholdt vevsfaktor. Etter 10 minutter ble rørene skylt med HEPES/- albuminbuffer (0.01M HEPES, 0.14 NaCl, 1 mg/ml BSA, med pH justert til 7.5 ved å anvende HCL) og lagret nedsunket i buffer for å forhindre kontakt mellom lipidmembranen og luft. Standard glass capillaries were prepared by first immersing them in a boiling detergent solution of 1 g Sparkleen/500 mL distilled/deionized water for 30 min and cleaning them three times for 5 min with distilled/deionized water in an ultrasonic bath for a total of 15 min. The capillary tubes were then dried at 120°C for 30 minutes, and were filled with the prepared suspension of PS/PC lipid vesicles containing tissue factor. After 10 minutes, the tubes were rinsed with HEPES/albumin buffer (0.01 M HEPES, 0.14 NaCl, 1 mg/ ml BSA, with pH adjusted to 7.5 using HCL) and stored submerged in buffer to prevent contact between the lipid membrane and air.

Eksempel 2 Example 2

Kapillær rør (I.D. = 0,56 mm, L = 75 mm) som fremstilt og dekket ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ble knyttet til en sprøyte som inneholdt forskjellige oppløs-ninger med en faktor VIIa, 100 nM med tritiummerket faktor X og 5 mM CaCl2- Ved å anvende en nøyaktig pumpe ble oppløs-ningene ført gjennom rørene ved en konstant hastighet på 27.1 pl/min. Strømmene som kom ut av rørene ble deretter analysert for faktor Xa produksjon og konsentrasjonene ved måling av mengden syreoppløselig tritium som var produsert. Resultatene ved likevektstilstanden er vist i tabell 1. Capillary tube (I.D. = 0.56 mm, L = 75 mm) prepared and capped according to the method described in Example 1 was attached to a syringe containing various solutions of a factor VIIa, 100 nM of tritiated factor X and 5 mM CaCl2- Using an accurate pump, the solutions were passed through the tubes at a constant rate of 27.1 pl/min. The streams that came out of the tubes were then analyzed for factor Xa production and the concentrations by measuring the amount of acid-soluble tritium that had been produced. The results at the equilibrium state are shown in table 1.

Som man kan se, var konsentrasjonen av faktor Xa som ble dannet uavhengig av faktor VIIa konsentrasjonen ved likevektstilstanden. Derimot illustrerer fig. 1 mengden av faktor Xa som blir produsert over tid for de ovenfor nevnte fire konsentrasjoner av faktor VIIa. Det er funnet at tiden til å oppnå nivået med likevektstilstand til faktor Xa varierte omvendt med faktor VIIa konsentrasjoner. I tillegg ble faktor VII utnyttet under de samme betingelsene og ga lignende resultater, dvs. når konsentrasjonen av faktor VII avtok, økte tiden for å oppnå likevektstilstand. For en faktor VII konsentrasjon på 0.1 nM var likevektstilstandskon-sentrasjonen til faktor Xa 10.6 nM. As can be seen, the concentration of factor Xa that was formed independently of factor VIIa was the concentration at equilibrium. In contrast, fig. 1 the amount of factor Xa that is produced over time for the above-mentioned four concentrations of factor VIIa. It has been found that the time to reach the steady state level of factor Xa varied inversely with factor VIIa concentrations. In addition, factor VII was utilized under the same conditions and gave similar results, i.e., as the concentration of factor VII decreased, the time to reach equilibrium increased. For a factor VII concentration of 0.1 nM, the steady state concentration of factor Xa was 10.6 nM.

Siden tilnærmelsen til likevektstilstandsproduksjonen av faktor Xa var gradvis, ble T-^/g av faktor Xa beregnet. I fig. 1 vises det at T^/g var tilsvarende som konsentrasjonene av 0,5-10 nM faktor VIIa, nemlig tilnærmet 4 minutter. Disse faktor VIIa nivåene svarer til 5-100$ av normal faktor VII nivå i den menneskelige kropp, selv om strengere blødning ofte oppstår når faktor VII nivået i kroppen er mindre enn 5$. Som det vises i fig. 1, øker T^/g markert når nivåene av faktor VIIa synker til 0,1 nM (1$ av normal) og 0,075 nM (0,75$ av normal). Veggens skjærbelastningsforhold utviklet seg i dette eksempelet tilnærmet til de i det humane venesystemet, f.eks. ca. 20-40 s"<l>. Since the approach to steady state production of factor Xa was gradual, the T-^/g of factor Xa was calculated. In fig. 1 it is shown that T^/g was equivalent to the concentrations of 0.5-10 nM factor VIIa, namely approximately 4 minutes. These factor VIIa levels correspond to 5-100$ of the normal factor VII level in the human body, although more severe bleeding often occurs when the factor VII level in the body is less than 5$. As shown in fig. 1, T^/g increases markedly as levels of factor VIIa decrease to 0.1 nM (1$ of normal) and 0.075 nM (0.75$ of normal). The shear stress conditions of the wall developed in this example approximately to those of the human venous system, e.g. about. 20-40 s"<l>.

Eksempel 3 Example 3

De samme eksperimentelle betingelsene ble gjennomført som i eksempel 2, med unntagelse at dimensjonene på kapillærrøret og strømningshastigheten ble variert. Resultatene for en indre diameter av kapillærrøret lik 0,33 mm og lengden lik 125 mm er gitt i tabell 2 The same experimental conditions were carried out as in Example 2, with the exception that the dimensions of the capillary tube and the flow rate were varied. The results for an inner diameter of the capillary tube equal to 0.33 mm and a length equal to 125 mm are given in Table 2

Ved lavere strømningshastighet (200 jjl/min.) var beregnet skjærbelastningsforhold i veggen 856 s_<1>, som ligger mellom gjennomsnittlig skjærbelastningsf orhold oppnådd i små arterier og i mikrosirkulasjon; ved 400 jjl/min. , var oppnådd skjaerbelastningsf orhold 1712 s-<1>, tilsvarende til mik-rosirkulatoriske forhold. Således var enzymreaktoren klart stabil i skjaerbelastningsforhold sammenlignet med det fysiologiske området. Således kan effekten av forskjellige unormaliteter i koagulasjonssystemet bli evaluert under strømmende betingelser som strekker seg fra i det venøse systemet til de i mikrosirkulasjon. At a lower flow rate (200 jjl/min.), the calculated shear stress ratio in the wall was 856 s_<1>, which lies between the average shear stress ratio obtained in small arteries and in microcirculation; at 400 jjl/min. , a shear stress ratio of 1712 s-<1> was achieved, corresponding to microcirculatory conditions. Thus, the enzyme reactor was clearly stable in shear stress conditions compared to the physiological range. Thus, the effect of various abnormalities in the coagulation system can be evaluated under flow conditions ranging from those in the venous system to those in the microcirculation.

Det ble funnet at kapillærrør med indre diametre fra 0.10 til 1,10 mm og rørlengder fra ca. 1,0-15 cm var aksepterbare. Forandringer i rørdiameter ble funnet å endre mengden av produkter som ble fremstilt, men ikke basismekanismen. It was found that capillary tubes with inner diameters from 0.10 to 1.10 mm and tube lengths from approx. 1.0-15 cm was acceptable. Changes in tube diameter were found to change the amount of products produced, but not the basic mechanism.

De ovenfor nevnte eksemplene demonstrerer typen data som kan bli tilveiebragt ved å anvende den kontinuerlig strømmende enzymreaktoren fra foreliggende oppfinnelse som ikke er tilgjengelig ved å anvende kjente statiske teknikker. Det foregående har ikke til hensikt å begrense rekkevidden av oppfinnelsen, siden de nåværende fremsatte kravene på enzymreaktoren kan bli anvendt til å måle trombinproduksjons-hastigheter, produksjon av koaguleringsfaktorer i fullplasma og forskjellige andre fosfolipidavhengige enzymreaksjoner. The above examples demonstrate the type of data that can be provided using the continuous flow enzyme reactor of the present invention that is not available using known static techniques. The foregoing is not intended to limit the scope of the invention, since the present claims on the enzyme reactor can be used to measure thrombin production rates, production of coagulation factors in whole plasma, and various other phospholipid-dependent enzyme reactions.

Claims

1. Dynamic continuous enzyme reactor for carrying out and analyzing phospholipid-dependent enzymatic reactions, characterized in that it consists of a tubular part covered on its inner surface with a planar phospholipid double-layer membrane, where the device can be connected via an opening to a device for feeding fluid flowing reagents and that it can be connected via another opening to a device for collecting and analyzing a fluid flowing out from there.

2. Enzyme reactor according to claim 1, characterized in that the device is a capillary tube, which preferably has an inner diameter of 0.1 to 1.1 mm and a length of 1.0 to 15 cm.

3. Enzyme reactor according to claim 1, characterized in that the phospholipid membrane consists of at least one further component selected from the group consisting of enzymes and enzyme-cofactors.

4. Enzyme reactor according to claim 3, characterized in that the cofactor is tissue factor.

5. Enzyme reactor according to claim 1, characterized in that the phospholipid membrane consists of neutral and acidic phospholipids.

6. Enzyme reactor according to claim 1, characterized in that the phospholipid membrane consists of phosphatidylcholine and phosphatidylserine.

7 . Enzyme reactor according to claim 1, characterized in that the phospholipid membrane consists of a mixture of 60-100$, preferably 70$, phosphatidylcholine and 0-40$, preferably 30$, phosphatidylserine.

8. Enzyme reactor according to claim 4, characterized in that the phospholipid membrane contains tissue factor in a ratio of approximately 1-10 mol of tissue factor per 100,000 moles of phospholipid.

9. Method for continuously performing and measuring dynamic enzyme reactions, characterized in that it consists of: (a) feeding reagents to perform an enzymatic reaction at a defined flow rate to an inlet in a dynamic continuous flowing enzyme reactor consisting of a tubular device which is covered on its inner surface with a planar phospholipid bilayer membrane, where the reagents and membrane components are separately inactive for carrying out the enzymatic reaction, but together provide an enzymatically active system; (b) pumping the reagents through the enzyme reactor at a constant and defined flow rate so that an enzyme reaction occurs in the enzyme reactor upon contact between the reagents and the phospholipid membrane; (c) collecting the product of the enzyme reaction from the effluent of the enzyme reactor; and (d) measuring the amount of product formed during the enzyme reaction by an appropriate assay.

10. Method according to claim 9, characterized in that the phospholipid membrane further consists of at least one additional component selected from the group consisting of enzymes and enzyme cofactors.

11. Method according to claim 10, characterized in that the cofactor is tissue factor.

12. Method according to claim 11, characterized in that the reagents consist of blood coagulation factors and calcium ions.

13. Method according to claim 12, characterized in that the blood coagulation factors consist of a blood coagulation factor selected from the group consisting of factor VII and factor VIIa, together with at least one factor selected from the group consisting of factor IX, factor X, factor V, factor VIII, prothrombin and whole plasma.

14. Method according to claim 9, characterized in that the analysis for measuring the amount of product is selected from the group consisting of radioanalyses, chromogenic analyzes and fluorogenic analyses.

15. Method according to claim 9, characterized in that it further consists of adding a chromogenic or fluorogenic substrate specifically to the product from the reaction of what flows out before measuring the amount of the product formed.

16. Method according to claim 9, characterized in that it further consists of splitting the product flowing out of the enzyme reactor so that the amount of more than one product formed in the enzyme reactor can be measured.