KR20080025043A - 전혈 중의 트롬빈 활성 측정 방법 - Google Patents

전혈 중의 트롬빈 활성 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시험관 내에서 샘플 중의 트롬빈 활성을 측정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 샘플은 혈액 샘플이고 트롬빈 생성은 하기 단계들: - 상기 샘플의 층을 트롬빈의 형광원성 기질과 접촉시키는 단계로서, 상기 층은 0.05 ㎜ 내지 5 ㎜ 범위 내의 두께 및 10 ㎟ 내지 500 ㎟ 범위 내의 표면을 갖는 것인 단계; - 상기 샘플 중에서 트롬빈을 생성시키는 단계; 및 - 상기 형광원성 기질 상의 생성된 트롬빈의 효소적 작용의 결과로서 형광원성 기질로부터 방출된 형광 기에 의해, 상기 층의 표면으로부터 방사된 형광도를 측정하는 단계에 의해 측정한다.

Description

전혈 중의 트롬빈 활성 측정 방법{MEASURING THROMBIN ACTIVITY IN WHOLE BLOOD}
본 발명은 특히, 전혈로 구성된 응고 샘플 중에서 트롬빈이 생성될 때 시험관 내에서 시간 경과에 따른 트롬빈 활성을 결정하는 특히, 측정하는 방법 즉, 샘플 중의 활성 트롬빈을 측정하는 방법에 관한 것이다. 트롬빈 활성의 측정 결과는 도 1에 도시된 소위 "트롬빈 생성 곡선"으로 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서 샘플 중의 트롬빈 생성 후 활성 트롬빈을 측정할 수 있게 하는 수단에 관한 것이다. 또한, 혈액 응고 결핍증과 관련된 병리학적 상태를 검출 또는 모니터링하기 위한 것을 비롯하여 환자의 증상을 검출 또는 모니터링하기 위한 상기 측정 방법의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 응고 과정, 특히 트롬빈 활성과 상호작용할 수 있는 약물의 검색을 비롯한 물질 검색을 위한 상기 측정 방법의 용도에 관한 것이다.
혈전 질환 예컨대, 관상동맥 경색증, 졸증, 폐색전증 및 여러 기타 질환이 서구 사회에서 모든 사망 및 장애의 약 절반의 원인이다. 개발 국가에서, 상기 질환들은 개발 정도에 따라 증가한다. 혈액 질환 역시 수치적으로는 덜 중요할지라도 사망의 중요 원인이다. 따라서, 지혈 시스템의 과도한 기능 또는 기능 저하는 매우 중요한 병인 기작이다. 그러므로, 우수한 임상적 기능 시험을 이용할 수 없다는 것은 더욱 더 놀라운 것이다.
지혈 및 혈전 질환에서의 트롬빈의 역할:
지혈 및 혈전증에서, 트롬빈은 중추적인 역할을 수행한다. 정맥 혈전 질환에서, 이는 인식된 지 오래되었고(참고문헌 1) 정맥 혈전증의 예방 및 치료가 트롬빈 활성의 감소, 직접적인 억제(히루딘(hirudin), 멜라가스트란(melagastran)) 또는 감소된 합성(비타민 K 길항제), 또는 증가된 분해(헤파린)에 의해 가장 잘 야기된다는 사실에 의해 확실히 입증되었다. 최근 10년간, 트롬빈은 정맥 질환에서 중요한 만큼 동맥 질환에서도 중요하다는 것이 점차 명백해졌다. 임상 시험은 헤파린(참고문헌 3) 뿐만 아니라 비타민 K 길항제(참고문헌 2)가 심근경색의 재발률을 감소시킴을 입증하였다. 출혈에서의 트롬빈의 역할은 트롬빈 생성이 구강 항응고제(참고문헌 4) 또는 헤파린(참고문헌 5)의 심각한 과다투여에서만큼 심각하게 영향을 받는 경우 관찰된 지연된 출혈 시간에 의해 암시된다. 또한, 혈우병은 트롬빈 형성 시스템의 질환이다(참고문헌 6).
트롬빈 형성에서의 혈액 침전물의 모든 요소:
최근 연구에 의하면, 트롬빈은 혈액 및 혈장의 형성된 요소들의 상호작용을 통해 형성되는 것으로 인식되어 있다. 적혈구(RBC: red blood cell)는 이러한 면에서 가장 낮은 활성을 갖지만 이들 중 소수 비율에서 외막이 전구응고 활성을 나타낸다(참고문헌 7). 훨씬 더 중요한 것은 백혈구가 조직 인자 활성을 보유한다는 것이다. 이 활성은 일반적으로 드러나지 않지만 병소에서 혈액 혈소판과의 상호작용 을 통해 발현된다(참고문헌 8 및 9). 주요 역할자는 의심의 여지 없이 혈소판 및 혈장 응고 시스템이다. 교재에는, 혈소판이 일차적 지혈 및 동맥 혈전증의 원인임에 반해, 혈장 응고가 지혈 플러그(plug)의 통합에 기여하고 동맥 혈전증의 배후 기작인 것으로 여전히 기재되어 있다. 이 견해는 혈장 및 혈소판이 서로 별도로 연구되었다는 사실에 기인한 것이다. 사실상, 혈소판 및 혈장과 다른 혈액 세포 사이의 상호작용은 일차적 및 이차적 지혈, 및 동맥 및 정맥 혈전증 둘 다에서 필수적이다. 혈소판 플러그 형성은 트롬빈 생성에서 특정 역할을 수행하는데, 이는 혈소판 응집체 내의 틈이 뒤섞이지 않는 함요(niche)를 형성하고, 이 함요에서 트롬빈이 유동 혈액에 의해 쓸려나가지 않으면서 형성될 수 있기 때문이다. 이는 응고 전혈 중의 트롬빈 생성의 측정이 생리학적으로 매우 중요한 이유이다.
혈소판은 트롬빈이 형성될 수 있는 "해면(sponge)"을 형성하는 것과는 별개로, 트롬빈의 생성에도 적극적으로 기여한다. 이들은 인자 V에 영향을 주고 프로트롬비나제(prothrombinase) 형성에 이르게 하는 응고 기작에서의 상이한 단계를 위해 요구될 뿐만 아니라 프로트롬빈 전환을 위해서도 요구되는 전구응고 인지질 표면을 제공한다(참고문헌 10). 따라서, 트롬빈 생성의 속도 및 형성된 양은 관여된 혈장 단백질 뿐만 아니라 혈소판 활성에도 의존한다. 특히 흥미로운 것은 중합되는 피브린의 역할이다. 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor; vWf)는 중합되는 피브린과 상호작용하고, 그가 혈소판 수용체 GPIb에 반응하게 하는 구조적 변화를 받게 되고, 이 결합을 통해 전구응고제가 될 혈소판과 상호작용한다(참고문헌 11 및 12). 이는 피브린 응괴의 형성이 지혈의 마지막 작용이 아니고 플러그(혈전 또 는 응괴) 중의 트롬빈 형성이 상기 과정에서 핵심 사건임을 보여준다. 사실상, 본 발명자들이 하기에서 보여주는 바와 같이, 형성된 모든 트롬빈의 >95%가 응고가 일어난 후에 형성되며, 이 트롬빈은 지혈 및 혈전증(H&T) 과정에서 필수적이다. 아마도, 혈소판과 혈장 응고 시스템 사이의 밀접한 관계의 최상의 증거는 모든 "침전 억제제" 및 다른 항혈소판제도 혈소판 농후 혈장(Platelet Rich Plasma; PRP) (또는 전혈) 중의 트롬빈 생성을 억제한다는 사실이다. 이는 아스피린(참고문헌 13), 아브식시마브(abciximab)(참고문헌 14), MK383(참고문헌 15) 및 클로피도그렐(clopidogrel)(참고문헌 16)에 대해 입증된 바 있다. 역으로, 우수한 항혈소판제인 아스피린이 정맥 혈전증을 예방한다는 사실(참고문헌 17)은 혈소판 기능과 혈액 응고 사이의 밀접한 관계를 더 입증한다.
따라서, 요약하면, 응괴 중의 형성된 트롬빈의 양은 지혈 및 혈전증의 과정에서 본질적인 특징이며 혈액의 모든 요소들이 그의 형성에 참여한다.
혈전증 위험 및 출혈 위험의 지표로서의 트롬빈 생성( TG ):
증가된 TG는 이것이 항트롬빈이 결핍으로 인한 것이든 프로트롬빈의 과도함으로 인한 것이든 혈전증 위험을 변함없이 표시한다. 또한, 단백질 C 경로에서의 장애(단백질 S 및 C, 인자 VLeiden의 결핍)에서, 트롬빈 생성은 정상보다 더 높다. 이는 그것 나름대로 혈장 응고를 유지하지만, 단백질 C 경로가 트롬보모듈린에 의해 활성화된 경우 특히 분명해진다(도 1). 경구 피임에 의해 유도된 혈전증 경향은 TM 또는 APC가 첨가될 때 더욱 분명해지는 트롬빈 생성의 10% 증가를 초래하는 활성화 된 단백질 C에 대한 후천적 내성에 기인할 수 있다(참고문헌 18 및 19).
특히 흥미로운 것은 루프스(lupus) 항응고제이다. 이러한 종류의 항체는 트롬빈 형성의 지체기(lag time)의 증가 및 그로 인한 응고 시간의 증가를 유도하지만, 단백질 C 시스템의 활성에 대한 중요한 내성도 유도한다(참고문헌 20). 이는 "LE 역설" 즉, 혈전증 경향에 동반되는 항응고 효과를 설명한다.
과량의 인자 Ⅱ, Ⅷ 및 Ⅶ은 심근경색의 발병과 상관관계를 가지는 것으로 밝혀졌다(참고문헌 21 내지 24). 또한, 트롬빈 생성을 증가시키는 정상 수준보다 더 높은 수준의 vWF(참고문헌 12)는 동맥 혈전증에 대한 위험 인자이다(참고문헌 25 및 26).
젊은 졸증 환자의 하위집단에서(대략 30%), 혈소판 농후 혈장(PRP) 중의 트롬빈 생성 및 vWF 둘다가 정상보다 상당히 더 높은 것으로 밝혀졌다(참고문헌 27). 모든 선천적 응고 인자 결핍증에서, 트롬빈 생성은 감소된다. 이는 모든 희귀 결핍증(프로트롬빈, 인자 V, Ⅶ, X, XII; 참고문헌 32)에 대해서 뿐만 아니라 혈우병 A, B 및 C(인자 Ⅷ, Ⅸ 또는 ⅩI의 결핍; 참고문헌 28 내지 31)에 대해서도 입증되었다. 출혈 경향은 TG가 정상의 20% 미만인 즉시 관찰된다. 혈우병 A에서, 인자 Ⅷ의 주입 또는 DDAVP의 투여가 트롬빈을 형성하는 혈액의 능력을 증강시킬 뿐만 아니라 프로트롬빈 및/또는 인자 Ⅶ를 함유하는 제품을 사용한 억제제 대체 요법 역시 트롬빈 생성을 증가시킨다.
심각한 혈소판감소증(<50000 ㎕-1)은 글랜즈만(Glanzman) 및 베르나르드-소 울리에르(Bernard-Soulier) 혈소판병증 뿐만 아니라 감소된 트롬빈 생성을 초래한다. 폰 빌레브란트병(지금까지는 높은 전단 속도에서 혈소판 부착의 장애를 유도하는 것으로 공지됨)에서, 혈소판 농후 혈장 중의 트롬빈 생성이 상당히 손상되어 있다(상기 참조). PRP 중의 상기 손상은 혈소판 부족 혈장(PPP) 중의 손상보다 훨씬 더 높고, 이는 상기 손상이 동반된 -대체적으로 약간의- 인자 Ⅷ의 감소에 의해 설명될 수 없다는 것을 의미한다.
트롬보그램
하기 설명은 본 발명에 따라 해결하고자 하는 문제점을 논의할 때 트롬빈 생성의 기작과 관련하여 고려되어야 한다.
트롬빈 형성 기작의 단순화된 도식조차도(도 1) 상기 기작이 매우 복잡하고 양성 및 음성 피드백 반응으로 가득차 있다는 것을 보여준다. 사실상, 비-선형 시스템이 될 정도로 매우 복잡하여, 즉, 반응물 및 생성물의 농도와 역치 현상(threshold phenomena) 사이의 단순한 관계가 없어서 시스템이 본질적으로 예측불가능하게 반응할 수 있다. 그러므로, 소정의 유발제에 대한 전체의 반응은 (심지어 공지될 수 없는) 관련 반응물의 개별 농도에 대한 지식으로부터 유추될 수 없고 환자의 혈액 중에 함유된 완전한 시스템의 기능을 측정하는 시험만이 그 환자의 지혈/혈전 상태를 보여준다.
트롬빈 생성의 전체 과정의 결과는 일시적인 트롬빈 활성의 등장 및 소멸이다. 시간에 대한 트롬빈 활성의 곡선 또는 트롬보그램(Thrombogram™ (TG))은 소량의 트롬빈만이 형성되는 개시기 또는 지체기 후, 증대기(propagation phase)로서 공지된 활성의 폭발을 특징으로 한다(도 1). 혈액은 상기 폭발의 극히 초기에 응괴를 형성하고, 거의 모든 트롬빈이 응괴의 형성 후에 형성된다. 그 후, 형성된 모든 트롬빈은 혈액의 항트롬빈에 의해 불활성화된다. 이 단백질들은 느린 반응에서 트롬빈에 화학량론적으로 결합한다. 불활성화 속도는 트롬빈 및 항트롬빈의 농도에 비례한다. 프로트롬빈의 전환 속도가 트롬빈의 불활성화 속도보다 더 높은 한, 트롬빈의 농도는 증가한다. 트롬빈의 농도가 증가하기 때문에, 불활성화 속도 역시 증가한다. 정점(peak)에서, 두 속도는 동일하고, 그 후 감소가 우세하다. 얻은 트롬빈 활성 곡선은 다양한 주기를 보이고 특히, 트롬빈 생성의 정점, 이 정점에 도달하는 데 걸린 시간 및 내인성 트롬빈 전위(ETP)를 보여준다.
지난 세기에 걸쳐, 지혈 및 혈전증 시스템의 기능을 측정할 필요성이 의약분야의 주목을 벗어나지 못하였다. 이 문제에 대한 해결책은 실용적이지만 부적당하거나 적당하지만 실용적이지 못한 수단이 제공되어 왔던 1990년대까지 본질적으로 변화되지 못하였다.
실용적인 해결책은 응고 시간 및 출혈 시간의 측정에 대한 것이다. 응고 시간은 트롬빈 생성의 개시기의 시간을 측정하므로 함수의 일부만을 반영한다(참고문헌 33, 상기 또한 참조). 시험의 많은 변수가 임상 실험에서 사용되며, 이때 각각의 변수가 특정 상황에서만 유용하다는 사실만이 응고 시간이 전체로서 응고 기작을 반영하지 못한다는 점을 이미 보여주었다. 출혈 시간의 경우, 이것이 약 40%의 변동 계수를 가진다는 점에서 극히 부정확하고 이점이 그의 실용적 용도를 강하게 제한한다고 주장될 수 있다(참고문헌 34).
1950년대 이후, 시간 경과에 따른 응고 혈액 중의 트롬빈을 측정하는 것이 H&T 함수를 평가하는 최선책이라고 인식되어 왔다(참고문헌 35 내지 37). 1992년까지, TG를 측정하는 유일한 방법은 응고 혈액 또는 혈장으로부터 샘플을 채취하고 상기 혈액 또는 혈장 중의 트롬빈 함량을 측정하는 것이었다. 이는 곡선 당 1 인시(man-hour)가 소요되므로 연구 목적에는 적합할 수 있으나 현대 임상 및 전염병학적 용도에는 적합하지 않다.
1990년, 헴커 및 베귀인 등(Hemker and Beguin et al.; 유럽특허 제B1-0 420 332호)은 트롬빈에 대한 특이성이 높으나 전환 속도가 낮으며(낮은 Kcat) 트롬빈에 대한 결합 친화도가 거의 없는(높은 Km) 발색성 (색상 발현) 기질을 응고 혈액에 첨가한다는 생각을 제시하였다. 이러한 기질은 TG의 전체 과정 동안에 존재하여 잔존하고 시간에 따른 트롬빈 활성의 합계(즉, 적분)는 형성된 생성물의 총량으로부터 측정될 수 있다. 이상적으로, 이는 내인성 트롬빈 전위(ETP) 즉, 트롬빈 생성 하의 면적(AUC)을 측정한다.
그 후, 헴커 등은 TG 곡선 전체를 얻기 위해 이 방법을 더 개선시켰다(참고문헌 38). 이는 기질의 속도 상수가 유리한 경우 반응 속도가 응고 과정 전체 동안에 우수한 근사치로 트롬빈 농도에 비례적으로 잔존하여 생성물 농도의 제1 미분계수가 트롬빈 활성에 비례하는 곡선을 제공한다는 원리에 기초한 것이었다. 국제특허출원 공개 제WO 03/093831 A1호에 기재된 이 방법은 생성물의 최종-농도만이 측정되는, 유럽특허 제B2-0420332호에 먼저 개시된 방법을 연장하고 보다 정교하게 디자인한 것이며, 이 방법에 의해 TG 곡선 하의 면적 즉, ETP가 얻어진다.
이 방법에서 사용된 기질은 황색 생성물을 생성시키고, 이 생성물의 모니터링은 광학 밀도의 측정을 요구하므로 광학적으로 투명한 반응 매질을 필요로 한다. 따라서, 피브리노겐의 응고에 의해 초래된 탁함이 없어야 하고 피브리노겐이 제거되거나 그의 중합이 중합 억제제의 첨가에 의해 방지되어야 한다. 그러나, 피브리노겐의 제거는 중요한 반응물의 제거라는 단점을 가지며 세포의 요소들 예컨대, 중요한 혈액 혈소판의 제거 없이 수행될 수 없다. 더욱이, 피브린 형성을 완전히 방지하기 위해 필요한 높은 농도의 중합 억제제의 첨가는 피브린의 형성을 이끌어 내는 프로트롬빈 전환 효소 및 생화학적 반응을 억제한다.
광학 밀도와 대조적으로, 형광도는 탁한 매질 중에서 측정될 수 있다. 따라서, 발색성 기질과 달리, 형광 생성물을 생성시키는 기질(형광원성 기질(fluorogenic substrate))은 피브린이 제거되지 않은 혈장에서 사용될 수 있으므로 혈소판 농후 혈장(PRP)에서도 사용될 수 있다(참고문헌 33 및 39 내지 43). 그러나, 형광원성 기질의 사용은 하기 두 가지 중요한 단점을 도입시킨다: 1) 형광 강도가 소위 내부 필터 효과 때문에 형광발색단(fluorophore)의 농도에 비례하지 않다는 점; 및 2) 사용가능한 기질을 사용한 경우 생성물 형성의 속도가 효소 농도에 반드시 비례하지 않다는 점. 상기 2)의 단점은 발색 방법에서와 같이 유의하게 소모되지 않는 기질을 사용함에 의해 극복될 수 있다. 이러한 기질은 현재 이용가능하지 않다. 현재 실제 실시에서, 상기 두 가지 문제점은 측정된 샘플 중의 조건과 정확히 동일한 조건 하에 작용하는 일정한 트롬빈-유사 활성의 신호와 실험 신 호의 연속적 비교에 의해 함께 해결된다(국제특허출원 공개 제WO 03/093831 A1호).
발색 방법은 혈액이 반투명하지 않기 때문에 전혈의 경우 이용될 수 없음이 분명하다. 형광원성 기질은 전혈 중의 TG를 측정하는 데 적용될 수 있는 것으로 보고된 바 있다(참고문헌 44). 실제 실시에서, 이 공개된 방법은 확립된 서브샘플링(subsampling) 방법으로부터 공지된 바와 같은 트롬빈 생성 경과와 유사하지 않은 산만한 신호를 자주 생성시킨다(도 2). 또한, 수득된 신호와 존재하는 트롬빈의 양 사이의 정량적 관계가 실험마다 다르다. 요약하면, 공지된 방법은 재현가능하고 정량가능한 결과를 제공하지 못한다.
또 다른 가능성은 적혈구 RBC가 보다 덜 영향을 주도록 혈액을 많이 희석하는(10-배 이상) 것이다(참고문헌 45). 이는 최소한으로 희석된 혈액으로부터 얻은 곡선보다 사실상 더 우수한 곡선을 제공한다. 그러나, 이 방법은 하기 두 가지 이유로 생리학적 상태를 대표하는 것으로 간주될 수 없다. 첫번째 이유로, 응괴 형성 후(즉, 트롬빈 생성의 가장 중요한 주기 동안), 트롬빈 형성 반응이 불용성 계면(피브린 네트워크 중에 부동화된 혈소판 및 다른 세포의 표면)에서 일어나기 때문에 트롬빈 형성 반응은 그 확산이 한정된다. 이는 상기 반응을 자유 용액 중의 반응 예컨대, 트롬빈 불활성화 반응보다 희석에 더 민감하게 만든다. 그러므로, 희석된 혈액 중의 트롬빈 형성 반응과 트롬빈 불활성화 반응 사이의 평형이 생체 내에 존재하는 상태를 대표하지 못한다. 이는 병리학적 억제제(예를 들어, 치료 불응성 혈우병 또는 홍반성 루프스 억제제)가 혈액 중에 함유된 경우 훨씬 더 중요하다. 응고 억제제가 시험관 내에서 희석 시 그의 효과를 상실한다는 것은 임상 분야에서 잘 공지되어 있다.
그러므로, 변화하는 트롬빈 농도를 10배 미만으로 희석된 응고 혈액 샘플 중에서 측정할 수 있게 하는 신호를 얻는 방법이라는 문제점이 남는다. 본 발명은 선행기술에서 직면한 결점들 중 적어도 일부를 극복하는, 상기 문제점에 대한 해결책을 제공하고자 한다.
본 발명자들은 본 발명 전에 얻은 재현불가능하고 산만한 결과들이 적어도 하기 두 가지 원인에 의한 것이었음을 발견하였다: a - 혈액 응고 전의 침강 및 b - 응고가 일어난 후 응괴의 퇴축(retraction)(도 4 참조). 상기 원인에 의한 당연한 결과로서, 부피(이로부터 형광도가 얻어짐)가 반응 도중에 변화하고 표면의 기학학적 형태가 변화하여 회수된 신호를 교란하는 광의 산만한 초점 맞추기 및 반사가 초래된다. 예기치 않게, 본 발명자들은 이 현상들이 혈액의 박층, 특히 그리드(grid) 및/또는 마이크로비드가 구비된 박층 상에서 작업할 때 일어나지 않는다는 것을 발견하였다. 상기 그리드 및/또는 마이크로비드를 가지든 아니면 가지지 않든 박층의 기하학적 형태는 사실상 상기 침강 및 퇴축을 방지한다. 그러나, 반응 부피는 공지되지 않은 상태로 남아있으므로 측정하는 도중에 결정되어야 한다. 이는 실험을 시작할 때 공지된 농도의 형광 분자를 첨가함에 의해 달성된다. 신호가 작으므로, 당분야에 공지된 임의의 적절한 장치를 이용하여 넓은 표면적에 걸쳐 측정함으로써 신호-대-잡음 비율(signal to noise ratio)을 증가시키는 것이 유리하다. 더욱이, 큰 부피-대-표면적 비율이 증발에 도움이 되기 때문에, 이를 방지하기에 적합한 조치를 취해야 하는 것이 유리하다.
본 발명에 따르면, 시간 경과에 따른 샘플 중의 트롬빈 활성을 시험관 내에서 측정하는 방법이 기재되며, 여기서 상기 샘플은 혈액 샘플이고 트롬빈 생성은 하기 단계들: - 상기 샘플의 층을 트롬빈의 형광원성 기질(fluorogenic substrate)과 접촉시키는 단계로서, 상기 층은 0.05 ㎜ 내지 5 ㎜ 범위 내의 두께 및 10 ㎟ 내지 500 ㎟ 범위 내의 표면을 갖는 것인 단계; - 상기 샘플 중에서 트롬빈을 생성시키는 단계; 및 - 상기 형광원성 기질 상의 생성된 트롬빈의 효소적 작용의 결과로서 형광원성 기질로부터 방출된 형광 기에 의해, 상기 층의 표면으로부터 방사된 형광도(fluorescence)를 측정하는 단계에 의해 측정된다.
트롬빈 활성을 측정하는 방법은 응고 도식에 따라 트롬빈의 형성부터 후속 불활성화까지 시간 경과에 따른 트롬빈 농도의 측정을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 혈액 샘플 예컨대, 전혈 샘플 또는 혈소판 농후 혈장(PRP) 샘플에 대해 실시될 수 있다.
트롬빈은 상기 샘플이 트롬빈 생성의 개시에 적합한 성분들과 접촉된 후 통상적으로 샘플 중에서 생성될 수 있다. 이러한 성분들은 응고 인자 예컨대, 조직 인자 및 가능하게는 칼슘 이온을 포함할 수 있다.
트롬빈이 생성되고 반응 혼합물에 존재하는 동안(활성 트롬빈), 트롬빈은 그의 형광원성 기질과 반응하여, 기질의 형광 기가 방출되는 결과를 가져온다.
반응은 형광원성 기질이 트롬빈 활성의 측정을 허용하기에 충분히 많은 양으로 반응의 전체 기간 동안 존재하는 방식으로 디자인된다. 예를 들어, 기질의 소모가 반응 속도에 그다지 많은 영향을 주지 않도록 기질 농도가 트롬빈에 대한 기질의 Km의 근사치이거나 상기 Km보다 높다. 기질은 트롬빈에 의해 전환되어, 분석된 샘플의 표면으로부터 방사된 형광도를 증가시킨다.
본 발명에서 정의된 방법은 체내에서 일어나는 트롬빈 생성에 본질적으로 필적할만한 방식으로 트롬빈 생성이 혈액 샘플 특히, 전혈 샘플 중에서 일어날 수 있게 한다. 그러므로, 본 발명은 지혈 및 혈전증 연구에서 적용될 수 있는 신뢰가능한 측정 방법을 제공한다.
트롬빈 작용을 통해 형광 기가 기질로부터 방출된 결과로서, 분석된 샘플 층의 표면으로부터 방사된 형광도의 증가를 측정하는 단계는 특히, 넓은 표면 예컨대, 10 ㎟ 내지 500 ㎟의 표면을 조명할 수 있고 그 표면으로부터 방사된 광을 수집할 수 있는 광학 장치를 이용하여 수행한다. 형광도의 측정에 대해 선택된 파장은 선택된 형광 기에 의해 결정된다. 한 파장은 측정을 진행시키기 위해 샘플에 전달되는 여기 광에 대해 결정된다. 또 다른 파장은 트롬빈의 형광원성 기질의 형광 기의 방출로부터 생기는 방사된 광에 대해 결정된다. 광학 장치 예컨대, 당업자에게 공지된 형광 플레이트 판독기(예를 들어, 아센트(Ascent) 형광 플레이트 판독기, Thermolabsystems)가 형광을 측정하기에 적합하다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 분석하고자 하는 샘플 특히, 전혈 샘플은 유리하게는 여러 샘플들을 동시에 분석될 수 있게 하는 하나 이상의 용기 중에 충전된다. 이러한 용기는 분석될 샘플 층의 두께 및 표면의 정해진 조건에 따라 샘플이 충전될 수 있도록 디자인되어 있다. 예를 들어, 이 분석 분야의 숙련된 자에게 공지된, 또 다른 적절한 기하학적 디자인을 가진 웰, 용기 또는 지지체를 보유하는 평평 바닥 마이크로플레이트가 사용될 수 있다.
다른 장치들 역시 샘플에 대한 지지체로서 사용될 수 있되, 이들은 샘플이 본 발명의 정의를 만족시키는 층으로서 분석을 위해 제공될 수 있어야 한다는 요건을 충족시켜야 한다. 따라서, 샘플을 함유하는 (마이크로플레이트의) 웰이 언급된, 본 발명의 실시를 위한 방법 및 수단에 대한 설명은 샘플을 함유하는 다른 장치 (용기 또는 지지체)에 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 분석 도중의 트롬빈의 농도는 형광원성 트롬빈 기질로부터 방출된 형광 기의 측정된 형광도의 함수이다. 이는 특히 형광도 발현의 증가율에 비례한다.
따라서, 본 발명의 방법은 형광원성 기질이 적정량으로 존재하는 한 샘플 중의 트롬빈 활성의 전체 시간 동안에 트롬빈 농도의 측정을 가능하게 한다.
그러므로, 혈액의 응고 전 및 후, 트롬빈 정점까지, 및 트롬빈 정점 후 트롬빈 불활성화의 결과로서 얻어진 트롬빈 농도의 감소 동안의 트롬빈 활성의 경과는 시간-의존적 트롬빈 농도 곡선의 측정치에 의해 표시된다. 트롬빈 활성의 다양한 단계 동안, 형광원성 기질은 존재하는 트롬빈과 반응하고 특히 가수분해되어 형광 기를 방출시킨다.
본 발명의 구체적인 장점은 본 방법이 샘플 특히, 희석되지 않거나 최대 10배 특히, 4배 이하의 범위 내에서 최소한으로 희석된 전혈 샘플 중의 트롬빈 생성의 측정을 가능하게 한다는 점이다.
상기 본 방법의 구체적인 실시양태에서, 분석될 샘플 층 특히, 전혈 층의 두께는 1 ㎜ 내지 3 ㎜, 특히 약 2 ㎜ 이하이다.
본 방법의 구체적인 실시양태에서, 샘플 특히, 전혈 샘플이 마이크로플레이트의 웰 또는 임의의 적절한 용기 또는 지지체 내에 충전될 때 상기 샘플 특히, 전혈 샘플의 표면은 20 ㎟ 초과 예를 들어, 30 ㎟ 내지 200 ㎟, 특히 100 ㎟ 초과, 구체적으로 150 ㎟ 내지 200 ㎟이다.
예를 들어, 상기 샘플은 마이크로플레이트의 웰 내에 충전되고, 여기서 각각의 웰의 직경은 15 ㎜이고 혈액 샘플의 두께는 2 ㎜ 미만이어서, 약 175 ㎟의 표면 상에서의 측정을 가능하게 한다.
트롬빈 활성의 측정은 각각의 샘플의 표면에서 다수의 형광 강화점(lecture point)을 허용하는 방식으로 수행된다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 본 방법은 플레이트의 웰 또는 다른 용기나 지지체 내에 충전된 샘플 특히, 전혈 샘플을 사용함에 의해 수행되며, 이때 상기 웰은 특히 메쉬(mesh) 크기가 50 ㎛인 그리드 또한 함유한다.
본 발명의 실시양태에서, 샘플 특히, 전혈 샘플은 상기 그리드의 대안으로 또는 상기 그리드 이외에 마이크로비드를 함유하는 마이크로플레이트의 웰 또는 다른 용기 또는 지지체 내에 충전된다.
상기 그리드 및/또는 마이크로비드의 존재는 웰 내의 혈액의 분산을 돕는 데 유리하고, 응고 혈액 중의 응괴의 퇴축을 방지하는 데 특히 유리하다. 다시 말해, 상기 그리드 또는 마이크로비드의 존재는 트롬빈이 활성을 나타내는 동안에 측정되는 신호를 흐리게 하는, 응고 혈액 표면의 교란을 방지할 수 있다. 이러한 그리드 및/또는 마이크로비드는 측정을 위한 넓은 표면을 사용함에 의해 얻어지는 퇴축 효과의 약화를 개선시킬 수 있다. 상기 효과를 허용하는 다른 수단도 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 샘플 특히, 전혈 샘플을 함유하는 웰을 덮어 트롬빈 활성의 측정 기간 동안 증발로 인한 혈액의 건조를 피한다. 이처럼 웰을 덮는 것은 통상의 물질 예컨대, 플라스틱 박막 종류를 사용하여 수행할 수 있되, 상기 물질은 형광도 측정을 방해하지 않아야 한다.
혈액 샘플 중의 트롬빈 활성의 측정은 샘플이 웰 (또는 임의의 다른 적절한 장치 예컨대, 슬릿) 내에 충전되어 있으며 트롬빈 생성을 개시하는 데 필요한 조직 인자를 포함하는 성분들이 상기 샘플에 공급되어 있는 시간부터 트롬빈이 응고 과정에서 소모되는 시간까지 수행된다.
본 발명의 방법의 구체적인 실시양태에서, 샘플에 첨가된 트롬빈 형광원성 기질의 양은 50 μM 내지 1000 μM의 범위 내에 있다. 개시된 방법에 따르면, 절대 단위로 (즉, nM/ℓ으로) 활성 트롬빈의 농도를 알 수 있기 위해, 형광도의 측정이 수행되는 혈액 샘플의 부피를 알 필요가 있다. 결국, 공지된 농도의 형광발색단을 트롬빈의 형광원성 기질에 첨가할 수 있고, 이때 트롬빈 기질 대 형광발색단의 각 비율은 트롬빈 기질에 결합된 형광 분자의 양의 1% 내지 10%의 범위, 특히 1% 내지 5%의 범위 내에 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 형광발색단은 형광원성 기질에 대한 트롬빈의 작용에 의해 방출되는 형광 분자와 동일한 성질을 가진다.
또 다른 실시양태에서, 이 형광발색단은 형광원성 기질의 형광 분자와 상이한 종이다. 이 경우, 형광도의 측정은 형광발색단의 이 새로운 종의 존재를 고려하는데, 특히 형광발색단의 형광의 측정을 포함한다.
공지된 농도의 이러한 형광발색단의 첨가는 분석될 샘플 중의 내부 표준을 제공하고 형광도가 실제로 측정되는 샘플의 부피의 평가를 허용한다.
샘플 특히, 전혈 샘플 중의 트롬빈 생성을 측정하는 방법을 수행하기 위해, 형광 분자와 커플링된 유기 화학물질로 구성된, 트롬빈에 대한 합성 기질을 사용하는 것이 유리하다.
상기 합성 형광원성 기질은 형광 분자와 커플링된 2개 내지 30개의 아미노산 잔기의 서열을 가진 올리고펩티드일 수 있다.
트롬빈이 바람직하게는 이들 아미노산 잔기에 결합된 기를 분할하기 때문에, 형광 기가 기질의 말단 라이신 또는 아르기닌 잔기에 결합되어 있는 것이 특히 유용할 수 있다.
구체적인 실시양태에 따르면, 사용되는 형광 분자는 AMC(7-아미노-4 메틸쿠마린) 또는 p-니트로아닐리드이다. 합성 기질은 문헌[Rijkers, D.T., H.C. Hemker, et al. (1996), Int. J. Pept. Protein. Res. 48(2): 182-93; Rijkers, D.T., S.J. Wielders, et al. (1995), Thromb. Res. 79(5-6): 491-9; Wielders, S.M. Mukherjee, et al. (1997), Thromb. Haemost. 77(4): 629-36]에 기재되어 있다.
본 발명을 실시하기에 적합한 구체적인 합성 형광 트롬빈 기질은 (바켐(BACHEM)으로부터 입수가능한) Z-Gly-Gly-Arg-AMC이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 샘플을 함유하는 웰 (또는 임의의 다른 적절한 장치)는 겔, 가능하게는 칼슘 이온을 함유하는 겔을 추가로 포함할 수 있고, 상기 겔은 이것이 샘플의 전혈의 희석을 허용하지 않도록 제조된다. 겔 예컨대, 세파덱스 또는 아가로스 겔은 이들이 혈장액이 겔 내로 들어가는 것을 허용하는 방식으로 건조되지 않은 정도로 사용될 수 있다.
겔이 사용되는 경우, 겔은 전혈 샘플 전에 또는 전혈 샘플과 함께 웰 내에 충전될 수 있다.
트롬빈 생성을 허용하기 위해 샘플에 첨가될 수 있는 화합물은 조직 인자 및 칼슘 이온을 포함하고, 이 화합물은 응고를 개시시킬 수 있는 양으로 첨가된다.
이러한 양은 시트레이트 처리된 혈액이 사용되는 경우 조직 인자에 대해 0.05 피코몰/ℓ 내지 15 나노몰/ℓ 및 Ca++-이온에 대해 약 10 mM의 범위 내일 수 있다. 본 발명은 천연 비-항응고화된 혈액이 사용되는 경우 또한 명백히 포함하며, 이 경우 Ca++은 전혀 첨가될 필요가 없다. 별법으로, 일부 경우, 혈액의 자발적인 응고능력을 조사하기 위해 조직 인자를 첨가하지 않는 것이 유리할 수 있다. 필요한 경우, 조직 인자는 측정의 개시 직전에 첨가된다.
칼슘 이온 및/또는 형광원성 기질은 특히, 칼슘 및 형광원성 기질이 용액 중에서 사용되는 경우 혈액 샘플과 함께 직접 첨가될 수 있다. 조직 인자 또한 혈액 샘플에 대안적으로 첨가될 수 있다.
샘플 및 다양한 화합물이 웰 내로 충전되는 경우, 측정을 즉시 수행한다.
본 발명의 방법의 구체적인 실시양태에서, 분석될 전혈은 시트레이트 처리된 혈액이다.
전혈 샘플 중의 트롬빈 활성의 측정 방법은 유리하게는 지혈 질환 또는 혈전 질환을 검출하거나 모니터링하는 데 이용될 수 있거나 상기 질환이 환자에서 나타날 가능성을 검출하거나 모니터링하는 데 이용될 수 있다.
또한, 본 방법은 전혈 샘플 중의 트롬빈 활성에 대한 측정된 물질(들)의 상호작용을 검출하거나 모니터링할 수 있게 하며, 이때 상기 측정된 물질(들)은 분석될 샘플에 첨가되거나 트롬빈이 생성되는 동안에 첨가된다.
본 방법에 따라 시험될 수 있는 물질은 예를 들어, 혈액에 대한 응고 효과를 가지는 약제 또는 기타 화합물 예컨대, 응고 인자 또는 약물, 또는 항응고 인자 또는 약물이다. 특히, 트롬빈 억제제를 본 발명의 방법에 따라 시험할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 트롬빈 활성과 상호작용하는 물질의 능력을 측정하기 위해 상기 물질을 검색하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 전술되고 실시예에서 설명될 방법은 특히 전혈 샘플의 내인성 트롬빈 전위(ETP)의 측정에 사용될 수 있다.
또한, 상기 방법은 트롬빈에 대한 정점까지의 시간의 측정 또는 응고 시간의 측정을 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 방법은 분석 도중에 생성된 트롬빈의 정점의 수준을 측정하는 데 유용하다.
본 발명의 방법은 트롬빈과 형광원성 기질 사이의 반응으로부터 나오는 측정 된 형광도의 제1 미분계수(derivative)인 소위 트롬빈 곡선의 측정을 사실상 허용한다.
본 발명의 구체적인 방법에서, 보정(calibration) 단계 예를 들면, 국제특허출원 공개 제WO 03/093831호에 기재된 보정이 수행된다.
본 발명의 방법은 전혈 샘플인 생물학적 샘플과 관련하여 기술된다. 또한, 상기 방법은 혈소판 농후 혈장(PRP) 또는 심지어 혈소판 부족 혈장(PPP)일 수 있는 샘플을 분석하는 데 사용될 수 있다.
또한, 본 방법은 상기 및 하기 실시예에서 개시되어 있는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는
- 트롬빈에 대한 형광원성 기질,
- 트롬빈 생성을 가능하게 하는 조직 인자 및 칼슘 이온,
- 임의로, 혈액 응괴의 퇴축(retraction)을 방지하고 전혈의 분산을 돕는 그리드 또는 마이크로비드, 및
- 임의로, 겔, 가능하게는 칼슘 이온을 포함하는 겔
을 포함한다.
임의로, 상기 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 구체적인 지침을 제공하기 위해 사용 설명서 또한 포함한다. 본 발명의 다른 특징 및 이의 장점은 실시예 및 하기 도면에 개시될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: 서브샘플링 실험으로부터 얻은 트롬보그램. 주요 특징: 지체기(=응고시간), 정점 높이 및 곡선 하의 면적(=내인성 트롬빈 전위, ETP)이 존재한다.
도 2: 보정된 자동화 트롬비노그래피(thrombinography)에 의해 얻은 혈소판 부족 혈장 중의 트롬빈 생성 곡선의 예. AVK: 항-비타민 K 처리; TM: 트롬보모듈린.
도 3: 트롬빈 형성의 단순화된 도식. 양성 및 음성 피드백이 뚜렷이 보인다.
도 4: 응고 전혈로부터의 형광 신호에 대한 침강 및 응괴 퇴축의 효과를 나타내는 개략적 도식.
범례:
유충모양의 타원: 적혈구 세포
별모양의 원: 여기된 형광 분자
정사각형: 여기되지 않은 형광 분자
상부 수평선(곡선을 포함함): 유체 표면
하부 수평선: 측정 웰의 투명한 바닥부
단계 A: 웰의 충전 직후의 혈액(도 1, t=0)
단계 B: 응고 직전의 혈액(도 1, t=B)
단계 C: 응고 직후의 혈액(도 1, t=C)
단계 D: 퇴축 개시 후의 혈액(도 1, t=D)
도 5: 호이겐스 접안렌즈 및 집광렌즈
도 6: 일반적인 마이크로타이터 플레이트 웰 내의 혈액의 박층(3 mm). 7회의 동일한 실험.
도 7: 넓은 표면 마이크로타이터 플레이트 웰 내의 혈액의 박층. 동일한 실험에서 웰 당 32개의 강화점.
도 8: 메쉬 및 커버를 가진 넓은 표면 마이크로타이터 플레이트 웰 내의 혈액의 박층. 광 수집 장치(호이겐스 접안렌즈)를 통한 1개의 강화점. (1) 실험 곡선, (2) α2M-트롬빈에 대한 보정 후.
도 9: 임의 단위(AU)로부터 트롬빈까지.
도 10a: 샘플 카트리지 디자인이 2개의 구획 측정 카트리지의 가능한 디자인을 보여준다. 생체적합성 피복제로 피복될 수 있는 재료(바람직하게는 단단한 재료 예컨대, 유리)로 만들어진 하나의 얇은 조각("슬라이드"로서 지칭됨)을 적절한 스페이서를 사용하여 구획으로 나눈다. 이 스페이서는 저항의 하강 및/또는 전류의 증가에 의해 샘플 주입을 검출하는 전극으로서 작용할 수도 있다. 각 구획은 보정제(calibrator) 및/또는 기질과 같은 물질 (또는 억제제 및 조직 인자와 같은 임의의 다른 필요한 물질)로 피복될 수 있다. 제2 슬라이드를 다른 슬라이드의 상부 상에 부착시킨다. 두 개의 슬라이드 사이의 간격은 5 ㎛ 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 50 ㎛이다.
카트리지는 광학적 증폭을 가능하게 하는 적절한 이색성 반사경 피복제에 의해 하나 이상의 측면 상에서 피복될 수 있다. 이는 여기 광이 카트리지로 들어가는 것을 허용하지만, 방사 광은 카트리지 내에서 반사되고(도 10b 참조) 카트리지의 비-피복 측면에 집중될 것이다.
도 11: 대안적 카트리지 디자인은 고체 매트릭스 조각 예컨대, 다공성 중합체 또는 셀룰로스가 두 개의 슬라이드 사이에 배치된 것을 보여준다. 이 매트릭스는 기질 및/또는 칼슘(또는 조직 인자, 억제제와 같은 임의의 다른 물질)을 함유할 수 있다. 이 물질들은 건조된 형태 또는 동결건조된 형태로 용매와 함께 존재할 수 있다.
도 12는 스타필로코아귤라제(Staphylocoagulase) 보정제에 의해 nM 트롬빈으로 전환되는, 여과지 셀 내의 혈액 박층 중에서 측정된 TG 곡선을 보여준다.
I. 전혈 중의 TG 측정: TG 측정에 대해 관찰된 현상 및 기술적 곤란성
형광원성 기질이 사용된 경우, 형광도는 적혈구 즉, 방사된 광이 관찰될 수 있는 공간이기도 한, 여기 광에 접근가능한 혈장 공간 내의 적혈구에 의해 광이 차단되지 않는 경우에만 유발되고 측정될 수 있다. 간단하게 설명하기 위해, 본 발명자들은 적혈구가 두 가지 유형의 광에 완전한 불투과성을 나타낸다고 가정한다. 그러나, RBC가 약간의 투과성을 나타내는 경우에도, 이러한 추론은 근본적으로 변경될 필요가 없다.
전혈은 트롬빈 생성의 개시기의 말기 즉, 트롬빈 생성의 폭발적인 증가가 시작되는 시점에서 응괴를 형성한다. 도 4에서, 4개의 단계는 형광원성 기질의 존재 하에 형광계 플레이트의 벽 내에서 응고하며 상부 또는 하부로부터 조명된 혈액의 상부면 및 하부면 상의 상태를 나타낸다.
단계 A에서, 교반된 혈액은 정치되고 적혈구는 혈장액 중에 균일하게 분산되 었다(도 4A). 응고 전의 지체기 동안에 (전형적으로 3분 내지 12분), 적혈구의 침강이 일어나고, 상부에서 더 많은 혈장이 광에 접근가능하게 되며, 하부에서 보다 적은 혈장이 광에 접근가능하게 되었다(도 4B). 혈액이 응고되자마자(도 4C), 단계 B에서 일어난 현상 유지가 피브린 응괴의 등장에 의해 "동결되었다". 혈액에 대한 트롬빈의 작용 때문에, 혈소판 응괴 퇴축은 응괴가 형성되자마자 시작되었다. 침강 및 응괴 퇴축은 시간 당 1 mm 크기로 육안으로 볼 수 있는 현상이었다. 마이크로미터 도메인에서, 이들은 분 단위의 시간 즉, TG 실험의 시간 규모로 일어났다. 퇴축은 RBC의 불균등한 분포를 야기하였고 표면에서의 변화 또한 야기하였으므로 표면은 더 이상 수평하지 않고 기복이 생겼다. 이 기복은 표면에서 혈장 및 응괴의 불균등한 분배를 야기하였고 예측될 수 없는 광학적 효과를 초래하였다. 표면 불균일은 mm 크기로 일어나고 육안으로 볼 수 있었다. 그러므로, 표면 불균일은 통상의 형광계에서의 여기 광 점과 거의 동일한 규모였다.
침강 및 퇴축은 형광 분자가 여기 광에 의해 도달될 수 있는 유체 부피의 변화를 유도하였다. 이 변화로 인해, 측정이 일어나는 실제 부피는 변동될 수 있었고 공지되지 않았다. 따라서, 침강 및 퇴축의 효과가 무시될 수 있다 하더라도, 이 조건 하에서 얻은 신호 생성률로부터 트롬빈의 양의 재현가능한 정량화가 불가능하였다.
실험은 통상의 마이크로타이터 플레이트 웰을 사용하여 수행하였고, 이 웰을 일반적인 높이(6 mm)까지 충전시키는 부피는 만족스러운 결과가 모든 웰 중 소수 비율에서만 얻어지게 하였다. 이는 측정된 표면의 점(약 4 ㎟)이 충분한 혈장이 사 용될 수 있기 때문에 충분한 신호가 얻어질 수 있는 영역 즉, 퇴축되는 응괴-덩어리 위에서가 아니라 표면의 "골(valley)"과 일치하는 경우에만 통상의 형광계에서 충분한 신호가 얻어진다는 사실에 의해 설명된다(도 4의 단계 D 참조). 측정이 기재된 문헌에서의 양성 보고는 얻어진 데이타의 조심스런 선택에 의한 것임이 틀림없다. 정확한 형태의 신호가 얻어진 경우에서, 트롬빈의 정량적 측정은 측정되는 부피가 공지되어 있지 않고 변동가능하기 때문에 불가능하다. 투명한 호일을 통한 바닥부로부터의 측정은 표면 불균일이라는 문제점을 해결하지만, RBC의 침강 때문에 신호가 너무 작아져서 상기 신호가 배경 잡음에 묻히게 된다.
최근까지 사용가능한 유형의 96-웰 플레이트의 웰을 통상적으로 충전시킴으로써 10개 웰 중 1개 또는 2개의 웰에서 해석가능한 신호를 얻을 수 있다는 것이 관찰되었다. 웰이 통상적으로 유용한 높이보다 2 mm 더 낮은 높이까지 충전되는 경우, 신호는 모든 측정치에 근사한 정도로 얻어졌다. 그럼에도 불구하고, 통상의 형광계에서 이 방식으로 얻은 신호는 매우 변동가능하였고 혈장을 사용하여 얻은 신호의 1% 내지 5%에 상응하는 정도로 작았으며, 큰 신호-대-잡음 비율을 보였다(도 6). 본 발명자들은 통상의 형광계의 광학 장치를 이용하여 전혈 중의 TG를 측정하는 실용적인 방법이 없다는 결론을 내렸다.
II . 본 발명의 방법의 디자인
1. 본 발명의 원리
예기치 않게, (a) 침강 및 퇴축의 효과가 응고 혈액의 층의 두께에 따라 점진적으로 감소된다는 사실과, (b) 약 10 ㎟ 보다 넓은 표면으로부터 형광도를 측정 하는 것이 퇴축에 의해 야기된 표면의 잔존 불균일 부분을 균일하게 하는 경향이 있다는 사실을 발견하였다. 마찬가지로 예기치 않게, 침강 및 퇴축의 효과는 미로 또는 틈 예컨대, (메쉬 개구가 50 ㎛ 내지 500 ㎛인) 필터 그리드 또는 (직경이 50 ㎛ 내지 500 ㎛인) 팩킹된 구(sphere) 중에 혈액을 함유시킴에 의해 더 감소될 수 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 측정이 약 10 ㎟ 보다 넓은 표면에 걸쳐 퍼져 있는 혈액의 박층(특히, 2 ㎜ 보다 작음) 중에서 수행될 수 있게 함으로써 트롬빈 활성의 생성물로부터 교란받지 않은 형광 신호를 얻기 위한 조건을 제공한다.
반응이 측정되는 미공지 부피라는 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 또한 순수한 기질을 사용하지 않고 공지되어 있으면서 용이하게 측정될 수 있는 고정된 낮은 농도의 형광 물질을 이미 함유하는 기질을 사용하기로 결심하였다.
2. 측정을 위한 광학 장치
통상의 표면보다 더 넓은 표면에 걸친 측정은 넓은 표면을 조명할 수 있으며 그 표면으로부터 방사된 광을 수집할 수 있는 광학 장치를 필요로 한다. 이러한 장치 중 하나는 호이겐스 접안렌즈 또는 현미경 집광렌즈와 같은 것이다(도 5). 형광 신호를 증가시키기 위해, 혈액을 반사면 상에 퍼지게 할 수 있고, 이러한 면은 하기 장치의 본질적인 일부일 수 있다.
3. 혈액 샘플을 함유하는 장치
구조의 틈 내에 혈액을 함유하는 장치의 사용은 상처에서 흐르는 혈액 상태의 시뮬레이션을 허용하므로, 상기 장치는 조직 인자, 트롬보모듈린, 및/또는 TG 과정에 영향을 주는 통상의 관벽 내에 존재하는 것으로 공지된 다른 요소(예를 들 어, 콜라겐)를 함유하도록 만들어질 수 있다. 비교를 위해, 장치를 만드는데 사용되는 물질은 불활성 물질 예컨대, 나일론 및 폴리프로필렌 중에서 선택될 수 있다.
표면의 건조를 방지하기 위해, 혈액의 박층을 고체 또는 유체 물질로 만들어진 박막으로 덮을 수 있다. 별법으로, 혈액을 예컨대, 모세관 힘에 의해 반투명 물질 내의 슬릿(slit) 내로 유도할 수 있다.
4. 측정
박층 중에서의 측정의 장점은 형광 신호가 형광 분자의 농도에 비례하다는 점 다시 말해, 내부 필터 효과가 작용하지 않는다는 점이다. 그러나, 기질 소모는 작용한다. 이 소모는 하기 세 가지 방법으로 보충될 수 있다: (a) 발색성 방법(38)에서와 같은 방법, 즉 기질 소모가 무시할만한 효과를 가질 정도의 속도 상수를 기질에 제공하는 방법, (b) 기질 소모를 수학적으로 보정하는 방법 즉, 통합된 속도 방정식을 적용하는 방법, 및 (c) 국제특허출원 공개 제WO 03/093831호에 기재된 바와 같은 보정제를 사용하는 방법.
응고 전혈 중의 트롬빈 농도의 경과는 혈액에 첨가된 형광원성 기질에 대한 트롬빈의 효소적 작용으로부터 결정된다. 안정하고 충분한 신호는 (10 ㎟보다 더 넓은 표면에 의해 예시되는) 넓은 표면에 걸친 2 mm 미만의 두께를 가진 층에 의해 예시된 박층 중에서 측정함에 의해 얻어졌다. 반응이 일어나는 실제 부피를 측정하기 위해, 소량의 형광발색단을 기질에 첨가하였다. 표면 전체를 조명하기 위한 특별한 광학 장치 및 표면으로부터 방사된 광을 수집하기 위한 또 다른 특별한 광학 장치가 필요하다.
박층은 일련의 기계적 수단 예컨대, 불활성 그리드, 또는 관벽의 특정 성질을 모방하도록 선택된 물질로 만들어진 그리드에 의해 안정화되고 건조를 방지할 수 있었다.
혈소판 부족 혈장 및 혈소판 농후 혈장 중의 트롬빈 생성을 측정하기 위한 장치 또한 사용될 수 있다.
5. 반응 혼합물
화학물질
폴리브렌(polybrene) 또는 Ca++을 함유하지 않은 재조합 재지질화(relipidated) 조직 인자(rTF)는 데이드 베링(Dade Behring; Marburg, Germany) 제품이었다. 형광원성 기질인 Z-Gly-Gly-Arg-AMC는 바켐(Bachem; Switzerland)으로부터 얻었다. 트롬빈에 의해 상기 기질이 분할될 때, 상기 기질은 390 nm 여기 및 460 nm 방사 필터 셋트에 의해 측정되는 형광 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)을 방출한다.
형광원성 기질과 CaCl2(FluCa)의 즉석제조 혼합물을 하기와 같이 각 실험을 위해 제조하였다: 60 g/ℓ의 BSA((Sigma, A-7030)를 함유하는 875 ㎕의 완충제(헤페스 20 mM, pH 7.35)에 100 ㎕의 1 M CaCl2를 첨가하였다. 37℃에서, 형광원성 기질의 100 mM DMSO-용액 25 ㎕를 분출시켜 넣고 즉시 격렬히 혼합하였다. 그 결과, FluCa로 지칭되는 생성된 투명한 용액은 형광원성 기질 농도가 2.5 mM이고 CaCl2 농도가 100 mM이었다. 완충제 A는 20 mM의 헤페스, 140 mM의 NaCl 및 5 mg/㎖의 BSA 를 함유하였고 pH는 7.35이었다. 완충제 B는 20 mM의 헤페스, 140 mM의 NaCl 및 60 mg/㎖의 BSA를 함유하였고 pH는 7.35이었다.
혈액 및 혈장
혈액은 정맥천자를 통해 얻었다(1 부피의 트리소듐 시트레이트 0.13 M 대 9 부피의 혈액). 자유 유동 또는 최소 흡입을 이용해야 했고, 진공 용기가 필요 없었다.
측정은 390/460 필터 셋트(여기/방사)가 장착된 플레이트 형광계(Ascent reader, Thermolabsystems OY, Helsinki Finland)에서 수행되었다. 일반적인 96-웰 플레이트 대신에, 직경이 15 mm이고 그에 따라 표면이 175 ㎟인 24개의 둥근 웰을 가진 웰 플레이트를 사용하였다. 이 웰은 완충제 A를 사용한 수회 세척 및 웰의 건조를 통해 준비하였다.
이어서, 혈액과 기질의 혼합물을 첨가하였고, 이때 트롬빈 생성이 일어났다. 이 혼합물은 충전될 웰 당 80 ㎕의 시트레이트-처리된(citrated) 전혈, 완충제 A 중에 1:1000으로 희석된 20 ㎕의 인노빈(Innovin®) 및 20 ㎕의 FluCa를 함유하고 경우에 따라 상기 부피는 변동될 수 있다.
FluCa의 첨가 직후, 혼합물을 보르텍스(Vortex) 혼합기 상에서 교반하고 웰에 첨가하였다. 플레이트를 형광계 내로 삽입하고 1200 rpm에서 10초 동안 진탕시킨 후, 1시간 동안 37℃ 및 390/460 nm에서 2분 마다 측정하였다.
120 ㎕의 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다.
실시예 1
메쉬 및 커버의 부가 시 다수의 강화점
트롬빈 생성은 3개의 웰에서 전술한 바와 같이 유발되었다. 웰 당 24개의 점이 조명되었고 차례대로 측정되었다. 24개의 점으로부터의 신호를 각각 판독하였다. 결과는 도 7에 나타내었다. 그리드, 본원에서는 600 μM의 메쉬 개구, 51%의 개구 면적 및 445 μM의 두께를 가진 나일론 필터(Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez California, USA)를 부가함에 의해 신호가 증강되고 안정화된다는 것이 관찰되었다. 그러나, 신호는 상부층의 증발 및 농축으로 인해 시간에 따라 변덕스럽게 증가하였다. 이는 플라스틱 호일[QPCR(Bilatec AG, Mannheim, Germany)용 써모스프린트(Thermosprint) 광학 투명 밀봉 테이프]로 덮음에 의해 방지되었다.
실시예 2
겔 및 커버의 부가 시 다수의 강화점
트롬빈 생성은 3개의 웰에서 전술한 바와 같이 유발되었다. 웰 당 24개의 점이 조명되었고 차례대로 측정되었다. 24개의 점으로부터의 신호를 각각 판독하였다. 150 mM NaCl 용액 중의 50%(부피/부피) 세파덱스-25 700 ㎕를 2개의 웰에 첨가하였고 분말을 5분 동안 정치시켰다. 상청액(300 ㎕ 내지 400 ㎕)을 피펫으로 웰로부터 제거하였다.
그 다음, 응고 혈액 혼합물 120 ㎕를 첨가하였다. 이들 2개의 웰 중 하나의 웰의 상부를 플라스틱 호일[QPCR(Bilatec AG, Mannheim, Germany)용 써모스프린트 광학 투명 밀봉 테이프]로 덮었다. 결과는 도 7에 나타낸 결과와 필적할만하였다.
실시예 3
광학 장치를 사용한 광의 수집
본 실험을 위해, 실시예 1에서와 같이 그리드 및 커버를 가진 하나의 웰을 플루오스타 옵티마 형광계[Fluostar optima fluorimeter; BMG Labtech, Offenburg, Germany)를 사용하여 측정하였다. 샘플로부터의 광을 호이겐스 접안렌즈 내로 수집하였고(10X 배율) 이 광학 장치를 통과시킨 후 판독하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.
실시예 4
임의 단위로부터 트롬빈까지
본 실험은 메쉬 및 커버를 사용하여 본질적으로 실시예 1의 실험과 같이 수행하였으나, 공지된 양(10 nM)의 AMC를 기질 Z-Gly-Gly-Arg-AMC에 첨가하였다. 적혈구의 침강으로 인해, 측정이 일어나는 부피가 증가하여 존재하는 AMC로부터의 신호가 증가하였다. 응고 시점에서, 상태는 "동결되었고" 추가 침강은 일어나지 않았다. 신호의 갑작스런 증가로부터 알 수 있는 상기 시점에서, 본 발명자들은 첨가된 10 nM의 AMC 때문에 형광도의 양을 측정할 수 있었다. 이 방식으로, 본 발명자들은 형광도의 단위(F)를 AMC의 농도로 전환시키는 방법을 알았다. 따라서, 측정된 dF/dt는 d[AMC]/dt로 전환될 수 있었다. 독립적인 실험으로부터, 본 발명자들은 어느 d[AMC]/dt가 어느 트롬빈 농도에 상응하는지를 알았다. 따라서, 형광도의 변화 속도(도 9, 흑색 선)는 샘플 중의 트롬빈의 농도로 전환될 수 있었다.
실시예 5
혈액 샘플을 함유하는 장치
기질 및 Ca2 +-이온을 함유하는 여과지 셀은 형광원성 기질의 100 mM DMSO-용액 50 ㎕ 및 1 M CaCl2 용액 100 ㎕를 에탄올 5850 ㎕에 첨가하여 제조하였다. 이 용액 11 ㎕를 7×9 ㎜의 고체 매트릭스 조각(와트만(Whatman) 1 MM 크로마토그래피 종이) 상에 뿌리고 질소 하에 건조하였다. 그 다음, 상기 고체 매트릭스 조각은 도 11에 나타낸 바와 같이 플라스틱 조각[QPCR(Bilatec AG, Mannheim, Germany)용 써모스프린트 광학 투명 밀봉 테이프] 사이에 끼워 덮여지게 하였다.
동일한 절차를 이용하여 기질만을 함유하는 여과지 셀을 제조하였고, 이 경우, 형광원성 기질 100 mM DMSO-용액 50 ㎕를 에탄올 5950 ㎕에 첨가하였고, 이 용액 11 ㎕를 고체 매트릭스 조각 상에 뿌리고 질소 하에 건조하였다.
여과지 셀의 사용 시 다수의 강화점
2개의 여과지 셀, 즉 형광원성 기질 및 칼슘 이온을 함유하는 여과지 셀(A) 및 기질만을 함유하는 여과지 셀(B)을 전술한 바와 같이 즉석에서 제조하였다.
시트레이트-처리 전혈, 완충제 B 및 인노빈®(완충제 A 중에 1:1000배 희석됨)의 4:1:1 혼합물을 제조하였다. 보정제로서, 시트레이트-처리 전혈, 완충제 B 중의 중합 억제제(H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH·AcOH)(Bachem feinchemikalien AG, Bubendorf, Switzerland)(1.0 mM) 및 20 μM의 스타필로코아귤라제의 4:1:1 혼합물을 전혈과 중합 억제제를 혼합하여 제조하였다. 실험 개시 직전, 스타필로코아귤라 제를 첨가하고 샘플을 잘 혼합하였다.
스타필로코아귤라제를 첨가한 직후, TG 샘플 11 ㎕를 셀 A에 첨가하고 보정제 11 ㎕를 셀 B에 첨가함으로써 실험을 개시하였다. 이는 소적이 매트릭스와 접촉하여(도 11 참조) 모세관 힘에 의해 매트릭스 내로 흡수되게 하는 방식으로 소적을 고체 매트릭스에 가깝게 피펫팅함으로써 수행되었다. 셀 당, 4개의 점이 조명되었고 차례대로 측정되었다.
보정제로부터의 신호는 직선이었고, 경사를 이용하여 샘플 셀로부터의 신호를 nM 트롬빈으로 전환시켰다. 이는 당분야에 공지된 통상의 신호 보정이며 국제특허출원 제PCT/EP03/04705호의 관점에서 연속적인 보정이 아니다. 결과는 도 12에 나타내었다.
참고문헌
Figure 112007084566325-PCT00001
Figure 112007084566325-PCT00002
Figure 112007084566325-PCT00003
Figure 112007084566325-PCT00004
Figure 112007084566325-PCT00005

Claims (29)

  1. 샘플 중의 트롬빈 활성을 시험관 내에서 측정하는 방법으로서, 여기서 상기 샘플은 혈액 샘플이고 트롬빈 생성은 하기 단계들:
    - 상기 샘플의 층을 트롬빈의 형광원성 기질(fluorogenic substrate)과 접촉시키는 단계로서, 상기 층은 0.05 ㎜ 내지 5 ㎜ 범위 내의 두께 및 10 ㎟ 내지 500 ㎟ 범위 내의 표면을 갖는 것인 단계;
    - 상기 샘플 중에서 트롬빈을 생성시키는 단계; 및
    - 상기 형광원성 기질 상의 생성된 트롬빈의 효소적 작용의 결과로서 형광원성 기질로부터 방출된 형광 기에 의해, 상기 층의 표면으로부터 방사된 형광도를 측정하는 단계
    에 의해 측정하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분석하는 동안에 생성된 트롬빈의 농도는 방출된 형광 기의 측정된 형광도의 함수로서 결정하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전혈(whole blood) 샘플은 최대 10배의 범위 내로 희석시키는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 층의 두께가 약 2 ㎜ 이 하인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분석에 있어, 혈액 샘플은 50 ㎛ 내지 500 ㎛의 메쉬 크기를 가진 그리드(grid) 또한 함유하는 플레이트의 웰 내에 충전하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분석에 있어, 혈액 샘플은 마이크로비드 또한 함유하는 플레이트의 웰 내에 충전하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플을 함유하는 웰은 트롬빈 활성의 측정을 위해 덮여지는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광발색단(fluorophore)은 트롬빈의 형광원성 기질에 첨가하고, 여기서 첨가된 형광발색단의 각각의 비율은 트롬빈 기질에 결합된 형광 분자의 양의 1% 내지 10%의 범위 내에 있는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 첨가된 트롬빈 기질의 양은 50 μM 내지 1000 μM의 범위 내에 있는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형광원성 기질이 형광 분자와 커 플링된, 트롬빈에 대한 합성 기질인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 트롬빈 기질은 트롬빈에 의해 선택적으로 가수분해하고, 트롬빈에 대한 적당한 결합 친화성 및 낮은 속도 상수를 갖는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 형광원성 기질이 형광 분자와 커플링된 2개 내지 30개의 아미노 잔기의 서열을 가진 올리고펩티드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 올리고펩티드는 형광 분자와의 커플링을 위한 말단 라이신 또는 아르기닌을 가지는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 분자가 AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린)인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 웰은 겔, 가능하게는 칼슘 이온을 함유하는 겔을 추가로 포함하고, 여기서 상기 겔은 샘플의 혈액의 희석을 허용하지 않는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 인자 및 칼슘 이온은 트롬빈 생성이 일어날 수 있게 하는 양으로 혈액 샘플에 첨가하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈 샘플인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플이 혈장 샘플 특히, 혈소판 농후 혈장(Platelet Rich Plasma; PRP)인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 전혈 샘플은 시트레이트-처리한(citrated) 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 지혈 질환 또는 혈전 질환을 검출하거나 모니터링하는 데 이용하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 전혈 샘플 중의 트롬빈 활성에 대한 소정의 물질(들)의 상호작용을 검출하거나 모니터링하는 데 사용되는 방법으로서, 여기서 상기 소정의 물질(들)은 분석하고자 하는 샘플에 첨가하거나 트롬빈 생성 도중에 첨가하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 응고 인자 또는 약물의 상호작용을 모니터링하는 데 이용하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 트롬빈 생성과 상호작용하는 물질의 능력을 결정하기 위해 상기 물질을 검색하는 데 이용하는 방법.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전혈 샘플의 내인성 트롬빈 전위(Endogenous Thrombin Potential; ETP)를 측정하는 데 이용하는 방법.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈의 정점(peak)까지의 시간을 측정하는 데 이용하는 방법.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 시간을 측정하는 데 이용하는 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 트롬빈의 정점의 수준을 측정하는 데 이용하는 방법.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 보정(calibration) 단계를 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    - 트롬빈에 대한 형광원성 기질,
    - 트롬빈 생성을 가능하게 하는 조직 인자 및 칼슘 이온,
    - 임의로, 혈액 응괴의 퇴축(retraction)을 방지하고 전혈의 분산을 돕는 그리드 또는 마이크로비드, 및
    - 임의로, 겔, 가능하게는 칼슘 이온을 포함하는 겔
    을 포함하는 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013105833A2 (ko) * 2012-01-13 2013-07-18 연세대학교 산학협력단 트롬빈 생성 측정 방법

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8133696B2 (en) * 2006-06-06 2012-03-13 Thrombinoscope B.V. Method for determining thrombin activity
US8343730B2 (en) * 2006-11-02 2013-01-01 Thrombinoscope B.V. Method for determining the course of proteolytic activity
EP2088435B1 (en) 2008-02-07 2011-07-13 Synapse B.V. Time-course measurement of enzymatic activity corrected for impacts of disturbances relating to the reaction of the enzyme with a substrate
FR2933496B1 (fr) * 2008-07-02 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de mesure du taux de facteur vii active dans un echantillon
JP5606435B2 (ja) * 2008-07-16 2014-10-15 ラジオメーター・メディカル・アー・ペー・エス トロンビン基質およびサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するためのアッセイ
EP2313785B1 (en) 2008-08-05 2016-02-17 Synapse B.V. A method and assembly for measuring thrombin generation in plasma
JP5582745B2 (ja) * 2009-09-09 2014-09-03 メタウォーター株式会社 化学発光反応の時間計測による被検出物質の濃度を測定する方法およびそれに使用するキット
US8293493B2 (en) * 2010-01-27 2012-10-23 Adventist Health System/Sunbelt, Inc. Thrombin generation determination method
CN102798598A (zh) * 2011-05-25 2012-11-28 兆科药业（合肥）有限公司 一种检测磷脂依赖性凝血因子x激活物酶活性的方法
RU2518247C2 (ru) * 2011-07-26 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "ГемаКор Лабс" (ООО "ГемаКор Лабс") Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе
WO2013028069A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Synapse B.V. Thermostable inhibitors of activation of the blood clotting system through contact with foreign surfaces.
CA2878568A1 (en) * 2011-12-31 2013-04-07 The University Of Vermont And State Agriculture College Methods for dynamic visualization of clinical parameters over time
EP2677037B1 (en) 2012-06-21 2016-04-13 Synapse B.V. Simultaneous measurement of thrombin generation and clot strength in plasma and whole blood
JP6166279B2 (ja) 2012-12-18 2017-07-19 第一三共株式会社 トロンビン産生の測定方法
CN103185710B (zh) * 2013-02-04 2015-01-07 中国医学科学院输血研究所 人静脉注射免疫球蛋白中活化凝血因子ⅺ检测方法
CN104977259A (zh) * 2014-04-04 2015-10-14 天津药物研究院 一种基于高通量检测的血小板聚集测定方法及在药物筛选中的应用
US9986941B2 (en) 2014-06-26 2018-06-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and apparatus for rapid monitoring of hemostatic state
CN104459165B (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 中国医学科学院输血研究所 一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法
US10633645B2 (en) * 2015-12-30 2020-04-28 General Electric Company Calcium controlled activation of platelets via electrical stimulation
US10794896B2 (en) 2016-01-29 2020-10-06 Sony Corporation Blood coagulation system examination module, blood coagulation system examination system, blood coagulation system examination method, and determination method of parameter for blood coagulation system examination module
EP3363912B1 (en) 2017-02-17 2020-10-28 Synapse B.V. Self-calibrated assay for determining proteolytic enzyme generation, dedicated means and uses thereof
CN107102125B (zh) * 2017-04-17 2019-07-09 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 血栓弹力图仪的校准方法
RU2709341C1 (ru) * 2019-04-19 2019-12-17 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) Определение циркулирующего тромбина в тесте активации системы комплемента
US20220298539A1 (en) * 2019-07-31 2022-09-22 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Methods and kits for identifying thrombus origin and optimizing post-ischemic event treatment
CN110412001B (zh) * 2019-08-01 2022-02-11 武汉塞力斯生物技术有限公司 一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒
CN110568117B (zh) * 2019-09-19 2022-03-22 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 一种多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法
WO2022137002A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Ethicon, Inc. Bleeding detection method

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55164356A (en) * 1979-06-08 1980-12-22 Fuji Photo Film Co Ltd Multi-layer analysis sheet for liquid sample analysis
AU4287593A (en) * 1992-04-27 1993-11-29 Avocet Medical, Inc. Test article and method for performing blood coagulation assays
ES2291661T3 (es) * 2002-05-01 2008-03-01 Synapse B.V. Prueba de diagnostico para la determinacion de la concentracion de actividad proteolitica transitoria en medios biologicos compuestos.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013105833A2 (ko) * 2012-01-13 2013-07-18 연세대학교 산학협력단 트롬빈 생성 측정 방법
WO2013105833A3 (ko) * 2012-01-13 2013-09-19 연세대학교 산학협력단 트롬빈 생성 측정 방법

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