JP5582745B2 - 化学発光反応の時間計測による被検出物質の濃度を測定する方法およびそれに使用するキット - Google Patents
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ところが化学発光においては、蛍光分子の励起源は化学反応によるエネルギーであるため光源が不要になりその影響を考慮しなくてよい。したがって、光電子倍増管の感度を高くすることで、極めて微弱な光でも検出することが可能である。この他にも、高感度であることによって試料のダウンサイジングが可能であるという利点がある。これにより高濃度で起こりがちな副反応が生じにくくなり、試薬の使用量を少なくできるため、結果として試薬コストを抑えつつ、高感度分析ができるといったメリットがある。また、化学発光法は励起源が不要なことにより装置化が簡便であることや、応答性が速くて迅速であるなど、多くの利点がある。
(1.基本操作)
化学発光用セルにpH緩衝溶液(和光純薬社製四ホウ酸ナトリウム(Borax)を使用した。Boraxを蒸留水に溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを調整したのち、0.1Mに希釈して使用した。以下、同じ)100μl、L−アスコルビン酸水溶液(和光純薬社製)100μl、DMSO(和光純薬社製)100μl、Cu2+標準溶液120μl、発光基質(鉄フタロシアニンスルホン酸水溶液:Aldrich社製鉄フタロシアニンスルホン酸ナトリウムを蒸留水に溶解させて使用した。以下、同じ。)40μlをマイクロシリンジにより注入して混合した。化学発光測定装置(日音医理科機器製作所製のLUMICOUNTER NU−600またはマイクロテック・ニチオン社製GENELIGHT GL−200S)のセルホルダーにセットし、過酸化水素水溶液(和光純薬社製30%溶液を蒸留水で希釈して使用した。)40μlをマイクロシリンジにより注入した。その後、注入後に現れる化学発光シグナルを測定した。
20mlサンプル管にウシ血清200μl、2ML−アスコルビン酸を含む塩酸水溶液(関東化学製12N塩酸を蒸留水で1Nに希釈して使用した。)100μlを加えて混合し5分間静置した。次に、1.2Mトリクロロ酢酸(関東化学製)100μlを加え、2000rpmで5分間遠心分離した後、ろ過した。このろ液を0.1M Brax BufferでpHを調整したものをサンプルとして使用した。
鉄フタロシアニンスルホン酸錯体(Fe−PTS)と過酸化水素との化学発光反応系を用いてL−アスコルビン酸の影響を検討した。過酸化水素濃度が6.4×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%、pH10のアルカリ性条件下において、過酸化水素水溶液中にFe−PTSを注入すると、その直後に鋭い化学発光シグナルが観測された(図2)。しかしながら、酸化反応に起因する化学発光に対して強い還元剤であるL−アスコルビン酸(1.6×10−3M)を添加すると、溶液を混合後、ある一定時間経過後に化学発光シグナルが観測された(図3)。このように、酸化剤と、鉄ポルフィリン錯体との反応系に還元剤を添加すると、化学発光のピーク検出までに一定の誘導時間が生じた。
化学発光基質と酸化剤と還元剤とからなる本化学発光反応系において、触媒の影響について検討した。L−アスコルビン酸が1.6×10−3M、過酸化水素濃度が6.4×10−4M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%の条件下において、各触媒の化学発光の誘導時間への影響を観察した。その結果を表1に示す。
表1は、触媒無添加の誘導時間に対して、±5%以上の影響を与えた濃度を許容濃度として示している。表1に示すように、検討した物質では、一重項酸素の消去剤であるL−チロシン、L−トリプトファン、還元性の物質であるL−システイン、還元糖であるD−グルコースにおいて誘導時間に強い影響が見られた。これらの物質は、活性酸素種の消去などの作用により誘導時間に影響を及ぼしていると考えられる。
還元剤としてL−アスコルビン酸を、化学発光基質としてFe−PTSを、酸化剤として過酸化水素を使用した場合の各条件(L−アスコルビン酸濃度、過酸化水素濃度、pH、DMSO(溶媒)の体積、Fe−PTS濃度)の最適化を行った。
L−アスコルビン酸濃度の影響を図4に示す。過酸化水素濃度が4.8×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%、pHが10、銅イオン濃度が4.0×10−8Mの条件下において、L−アスコルビン酸濃度を0〜2.0×10−3Mの範囲において添加した結果、L−アスコルビン酸濃度が高くなるに従い誘導時間が延長された。この理由としては、L−アスコルビン酸濃度がFe−PTSあるいは過酸化水素に影響を与え、誘導時間が延長されためと考えられる。ブランクとCu2+濃度4.0×10−8Mとにおける誘導時間差が大きいことから、L−アスコルビン酸の濃度は1.6×10−3Mに設定した。
過酸化水素濃度の影響を図5に示す。L−アスコルビン酸が1.6×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%、pHが10、銅イオン濃度が4.0×10−8Mの条件下において、過酸化水素濃度を1.2×10−3〜7.3×10−3Mの範囲で検討した結果、過酸化水素濃度が高くなるに従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、共存するL−アスコルビン酸に対し過酸化水素濃度が高くなることにより、化学発光反応が起こりやすくなり誘導時間が短縮されたと考えられる。ブランクとCu2+濃度4.0×10−8Mとにおける誘導時間差が大きいことから、過酸化水素の濃度は2.4×10−3Mに設定した。
pHの影響を図6に示す。L−アスコルビン酸が1.6×10−3M、過酸化水素濃度が4.8×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%、銅イオン濃度が4.0×10−8Mの条件下において、pH1〜12までの範囲で検討した結果、pH1〜8までの範囲において化学発光は観測されなかった。また、この範囲は、L−アスコルビン酸を添加していないFe−PTS化学発光系においても化学発光はほとんど観測されない。一方、pH9〜12の範囲においてはpHが高くなるに従い、誘導時間が短縮した。L−アスコルビン酸水溶液は、アルカリ性が強くなるほど還元性が強くなり、酸素分子(O2)などの水素受容体によって酸化されやすくなる。従って、化学発光反応を抑制していたL−アスコルビン酸が酸化され、Fe−PTSの酸化分解反応がおこりやすくなったためと考えられる。ブランクとCu2+濃度4.0×10−8Mとにおける誘導時間差が大きいことから、pHを10に設定した。
DMSOの体積変化による影響を図7に示す。L−アスコルビン酸が1.6×10−3M、過酸化水素濃度が4.8×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、pH10、銅イオン濃度が4.0×10−8Mの条件下において、DMSOの体積を変化させた。DMSOの体積の増加に従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、アルカリ性溶液中においてDMSO、O2、OH−の反応からスーパーオキシドラジカル(・O2 −)が生成されるため、DMSO体積の増加に伴い・O2 −の生成率が高くなり、Fe−PTSの酸化分解がおこりやすくなるためであると考えられる。ブランクとCu2+の濃度4.0×10−8Mにおける誘導時間差が大きいことから、DMSOの体積は20体積%に設定した。
Fe−PTSの濃度変化に伴う影響を図8に示す。L−アスコルビン酸濃度が1.6×10−3M、過酸化水素濃度が4.8×10−3M、DMSOが20体積%、pH10、銅イオン濃度が4.0×10−8Mの条件下において、Fe−PTS濃度を2.0×10−5〜6.0×10−5Mの範囲で検討した結果、Fe−PTSの濃度が高くなるに従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、Fe−PTSの濃度増加に伴い化学発光反応を抑制しているL−アスコルビン酸の影響が小さくなるため、Fe−PTSの酸化分解がより速く起こるためであると考えられる。ブランクとCu2+濃度4.0×10−8Mとにおける誘導時間差が大きいことから、Fe−PTSの濃度は4.0×10−5Mに設定した。
鉄フタロシアニンスルホン酸濃度が4.0×10−5M、過酸化水素濃度が2.4×10−3M、L−アスコルビン酸濃度が1.6×10−3M、DMSOが20体積%、pH10の条件下において、LUMICOUNTER NU−600によりCu2+の濃度と誘導時間との相関グラフ(検量線)を作成した(図9)。また、同様の条件において、GENELIGHT GL−200Sにより作成した検量線を図10に示す。その結果、図9では1.2×10−10〜1.2×10−5M、図10では1.2×10−10〜6.0×10−6Mの濃度範囲において良好な直線が得られた。検量線の相関係数は図9では0.9871、図10では0.9153であった。Cu2+の濃度4.0×10−8Mにおいて、5回測定での変動係数は図9では2.02%、図10では2.27%であった。また、検出限界(3σ)は図9では1.66×10−11M、図10では9.52×10−11Mであった。これらはルミノール/OH−/H2O2/Cu化学発光系の検出限界である6×10−6Mの他、1,10−phen/OH−/H2O2/Cu2+/ヘキサデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド(HEDAB)化学発光系を利用したCu2+の定量法の2×10−10M、H2O2/フラビンモノヌクレオチド(FMN)/リン酸緩衝液化学発光系を利用したCu2+の定量法の2×10−8Mのいずれの定量法よりも高感度である。
鉄フタロシアニンスルホン酸濃度が4.0×10−5M、過酸化水素濃度が2.4×10−3M、L−アスコルビン酸濃度が1.6×10−3M、DMSOが20体積%、pH10の条件下において、LUMICOUNTER NU−600によりペルオキシダーゼの濃度と誘導時間との相関グラフ(検量線)を作成した(図10)。その結果、図11に示すように、ペルオキシダーゼ濃度0.1ppm〜30ppmの範囲において良好な直線を得ることができた。検量線の相関係数は、図11において0.947であった。ペルオキシダーゼ濃度10ppmにおいて、5回測定したときの変動係数は1.07%であり、標準偏差は1.15であった。また、検出限界は4.30×10−2ppm(43.0ppb)であった。
Cu2+の濃度4.0×10−8Mに対して、金属、糖類、アミノ酸、ビタミン類といった各物質を共存させたときの誘導時間への影響を検討した。結果をそれぞれ表4〜表7に示す。妨害物質無添加時の誘導時間に対し±5%の誤差を与える妨害物質の濃度を、Cu2+の濃度(4.0×10−8M)とのモル比により比較した。
これらの結果から、本系において特に大きな影響を及ぼす物質は確認されなかったことから、Cu2+が選択的に作用していると推測される。
実サンプルへの応用として、ウシ血清中のCu2+の定量を行った。まず、除タンパク処理を施したウシ血清アルブミンをサンプルとして、L−アスコルビン酸を添加したFe−PTSの化学発光系に適用し、化学発光が観測されるまでの誘導時間を測定した。なお、L−アスコルビン酸が1.6×10−3M、過酸化水素濃度が2.4×10−3M、Fe−PTS濃度が4.0×10−5M、DMSOが20体積%、pH10の条件下でおこなった。次に、測定された誘導時間(139sec)=Yを検量線の式に代入し、Cu2+の濃度を算出した。なお、下式はGENELIGHT GL−200Sの検量線のものである。
2 有機溶媒
3 pH緩衝液
4 還元剤
5 試料液
6 発光基質
7 酸化剤
Claims (10)
- 試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定する方法であって、
前記試料液と、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを溶媒中で混合することにより化学発光が生じる工程と、
前記混合直後から前記化学発光の発光強度がピークとなる時までの時間を測定する工程と、
前記測定した時間から前記被検出物質の濃度を計算する工程と
を含み、
前記発光基質が鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンである測定方法。 - 前記鉄ポルフィリン錯体が鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体である請求項1に記載の方法。
- 前記酸化剤が過酸化水素である請求項1または2に記載の方法。
- 前記還元剤がL−アスコルビン酸またはL−システインである請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、L−チロシン、L−トリプトファン、L−システイン、D−グルコース、L−アスコルビン酸、過酸化水素、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中に含まれる被検出物質の濃度を測定するためのキットであって、
前記キットは、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを含み、
溶媒中で前記被検出物質と前記発光基質と前記酸化剤と前記還元剤とを混合すると前記被検出物質の濃度に応じた時間の経過後に化学発光が生じ、
前記発光基質が鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンであるキット。 - 前記鉄ポルフィリン錯体が、鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体である請求項6に記載のキット。
- 前記酸化剤が過酸化水素である請求項6または7に記載のキット。
- 前記還元剤がL−アスコルビン酸またはL−システインである請求項6〜8のいずれか一項に記載のキット。
- 前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、L−チロシン、L−トリプトファン、L−システイン、D−グルコース、L−アスコルビン酸、過酸化水素、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体である請求項6〜9のいずれか一項に記載のキット。
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