JPH11160313A - ユニバーサル・ラベルとしてのポルフィリン類の使用法 - Google Patents

ユニバーサル・ラベルとしてのポルフィリン類の使用法

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JPH11160313A
JPH11160313A JP29860897A JP29860897A JPH11160313A JP H11160313 A JPH11160313 A JP H11160313A JP 29860897 A JP29860897 A JP 29860897A JP 29860897 A JP29860897 A JP 29860897A JP H11160313 A JPH11160313 A JP H11160313A
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porphyrin
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particle
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Roeland Chris
ロエラント クリス
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 目標粒子に結合する架橋剤を必要としない
で、種々のアッセイと他の定量技術のためのユニバーサ
ル・ラベルとして、ポルフィリン或いはポルフィリン誘
導化合物を用いる方法を提供する。 【解決手段】架橋剤なしで、ポルフィリンを検出粒子
と、該ポルフィリンが該粒子と結合するに十分な時間混
合し:そのラベルされたポルフィリン粒子を非結合ポル
フィリンから分け;そして、該ポルフィリンラベルされ
た粒子を検出する工程を特徴とする該粒子の検出方法。
ラベルされた粒子には、ビーズ、微生物、細胞及び分子
を含むものである。目標粒子に不可逆的に結合したポル
フィリンラベルをその後検出し、ケミルミノ測定、螢光
測定或いは放射線測定のような種々の方法により、定量
できる。その測定量は、ラベルされた粒子の数に比例す
るものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、粒子(例えば、分
子、ビーズ、微生物及び細胞)をラベル化、検出し、及
び定量する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】典型的には、分子、ビーズ、微生物及び
細胞を含む粒子を、顕微鏡、ネフェトメトリック或いは
電子計数により直接的に検出しそして定量し、或いは、
微生物或いは細胞代謝活性の測定により、クロモゲニッ
ク或いは螢光生成染料を使用して、或いは放射活性先駆
物質(例えば、放射線金属アイソトープ含有の化合物)
を含有させることにより、間接的に検出し、定量しす
る。検出及び定量のために用いる場合、クロモゲニック
或いは螢光生成の染料及び放射活性先駆物質が、検出さ
れ、定量されるべき粒子に結合される。そうであるか
ら、検出され、定量されるべきクロモゲニック或いは螢
光生成の染料及び放射活性先駆物質は、目標の粒子の検
出のためのラベルとして役立つ。
【0003】然し乍ら、クロモゲニック或いは螢光生成
の染料及び放射活性先駆物質により、粒子をラベル化す
ることは、分子或いは官能基と架橋する中間体、或いは
目標粒子をラベルに結合する代謝処理を必要とする。こ
れらの方法は、架橋剤を用いるもので、労働力を必要と
して、よく長期の培養と処理時間を必要とする。
【0004】種々のアッセイのためのラベルとして、ポ
ルフィリン(或いはポルリン)及びその多くの誘導体を
使用することは、先行技術で知られている。ポルフィリ
ンは、テトラピロール顔料マクロサイクルであり、天然
で遊離で見いだされるが、金属イオン、典型的には2価
金属イオンとの錯体として、よりよく生じる。塩基ポル
フィリン構造は、式1に示される。数(1〜8)は、官
能基が結合し、異種ポルフィリン誘導体を形成できる位
置を示す。
【0005】式1
【化1】
【0006】種々の誘導体において、個々の基は、数字
を添えた置換点各々に存在できる。このような誘導体の
例は、各ピロール基のベーター水素がメチル及びエチル
基で置換された4種の異性体として存在するアエチオポ
ルフィリンを含むものである。ウロポルフィリンは、酢
酸及びプロピオン酸基をメチル及びエチル基の代わりに
用いる点を除いて同様である。コプロプロピレン ホモ
及びコポリマーは同様に4つのメチルと4つのプロピオ
ン酸基を含む。最後の例示の基はプロトポルフィリンで
あり、4つのメチル基、2つのビニル基と2つのプロピ
オン酸基を1〜8の位置に有する15の異性体の群であ
る。
【0007】式2
【化2】
【0008】他の誘導体において、単一置換基が、各ピ
ロール基が数えた位置の両方を占有させる。フタロシア
ニンは、このタイプの典型的なポルフィリン誘導体であ
る。フタロシアニンもポルフィリン核の4つのピロール
基の間を架橋する4つの窒素の存在により特徴づけられ
る。前記の元のポルフィリン及びその誘導体において、
各炭素原子に結合する単一の末端水素原子を有する炭素
原子により、この架橋が行われる。式3に示されるもの
は、フタロシアニンである。
【0009】式3
【化3】
【0010】前記のように、ポルフィリン及びその種々
の誘導体は、金属と錯体塩である。これが生じる場合、
ピロール基の対角に位置する2つの窒素原子に結合する
2つの水素原子が、単一金属原子により置換される。M
は、式4に示される。
【0011】式4
【化4】
【0012】典型的な金属、Mは、ポルフィリン構造中
に含有できるものは、鉄(Fe)、コバルト(Co)、
ガリウム(Ga)、錫(Sn)、亜鉛(Zn)、クロム
(Cr)、マグネシウム(Mg)及びランタン系の種々
の元素である。
【0013】ポルフィリン及びその誘導体(以下ポルフ
ィリンと称する)は、免疫アッセイ、核酸プルーブアッ
セイ、免疫ブロット、ハイブリッド化アッセイ、顕微鏡
観察、イメージ化、流動シトメトリ、DNA配列、及び
フォトダイナミックの中のラベル(或いはマーカー)と
して、よく用いられてきた。然し乍ら、ポルフィリン及
びその誘導体を、これらの種々のアッセイ及び技術にお
いて、粒子のケミルミノ測定法、放射線測定或いは螢光
測定のためのラベルとして、用いるには、架橋剤の使用
が必要である。当業界において、架橋剤の使用は、種々
の用語で示されるが、それに限定されなく、例えば、架
橋(化)、カップル(化)、共有化、結合及びチトラ(t
ether)すると云われる。分子の反応剤或いは官能基のい
ずれかである架橋剤は、ポルフィリンラベルを、検出す
べき粒子に結合させ、定量できる。ポルフィリンと架橋
剤の選択は、目標粒子の特性、目標粒子がある媒体及び
用いる検出手段を含む多数の基準に依存して著しく変わ
る。架橋を与える架橋剤は、例えば、ピロール基のベー
ター位置の1つを含む可能な位置でポルフィリン上で置
換できるものである。そして、それは、ピロール基での
置換され基の位置上の末端位置(例えば、フタロシアニ
ンの6−員環の炭素に結合している水素を置換する)、
或いはピロール基と結合する炭素での端末位置である。
架橋装置がポルフィリン上で置換された位置であるが、
結合が生じない位置では溶解度を高めるものである。本
当に、置換基は、溶解度高めるためのみにポルフィリン
上に提供するものである。
【0014】多数の架橋剤(例えば、官能基)が、既知
である。これらには限定されないが、スルフォン酸基
(−SO3H)、スルフォン酸塩基(−SO3 -+)、カ
ンボン酸基(−CO2H)、カルボキシレート基(−C
32-,X+)、燐酸基(−PO42)、フォスフォネー
ト(−PO32-,X+或いは−PO3H)、ヒドロキシ或い
はフェノキシ基(−OH)、アミノ基(−NH2)及び
アンモニウム及びピリジニウム基(−NR4 +、X-)があ
る。更に、架橋を供するに最も普通の方法の1つは、ポ
ルフィリンの水溶性カルボジイミド誘導体を形成するこ
とである。任意に、架橋剤は、ポルフィリンラベルにさ
らす前に目標粒子に結合できるものである。
【0015】核酸プルーブアッセイのような、他の検出
方法においては、ポルフィリンラベルを核酸プライマー
或いはプルーブに結合する必要がある。架橋剤は、ポル
フィリンラベル、プライマー或いはプルーブ或いは目標
粒子のいずれかと先ず結合するもので、ポルフィリンと
プライマー或いはプルーブとを結合するために用いられ
る。従って、プライマー或いはプルーブはそれ自体が目
標粒子に結合する。ポルフィリンラベルを目標粒子に結
合するための架橋剤を必要としないポルフィリンラベル
を利用する検出方法の必要がある。
【0016】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたもので、それ自体で、そし
て、架橋剤なしで、分子ビーズ、微生物及び細胞を含む
目標粒子に不可逆的に結合し、その後、ケミルミノメト
リック、螢光測定或いは放射線測定のいずれかにより、
ラベルされた粒子の数と比較する量で検出できるユニバ
ーサル・ラベルを提供することを目的とする。
【0017】
【課題を解決するための手段】上記の技術的な課題の解
決のためになされたもので、本発明において、目標粒子
に結合する架橋剤を必要としないで、種々のアッセイと
他の定量技術のためのユニバーサル・ラベルとして、ポ
ルフィリン或いはポルフィリン誘導化合物を用いる方法
である。そして、ラベルされた粒子には、ビーズ、微生
物、細胞及び分子を含むものである。目標粒子に不可逆
的に結合したポルフィリンラベルをその後検出し、ケミ
ルミノ測定、螢光測定或いは放射線測定のような種々の
方法により、定量できる。その測定量は、ラベルされた
粒子の数に比例するものである。
【0018】ユニバーサル・ラベルのための探求は、ケ
ミルミネセント、螢光或いは放射線活性組成物中のポル
フィリンの使用により満足される。特に、本発明は、次
式5(式4と同じ構造を示す)のポルフィリンを有する
ケミルミネセント、螢光或いは放射線活性組成物に関す
る。
【0019】式5
【化5】
【0020】式中、R 〜R は、−CH3、−CH2-
CH3、−CH=CH2、−COCH3、−CHO、−CH
2-CH2OH、−CH=CHOOH或いはフェニルであり
得、Mは、鉄(Fe)、コバルト(Co)、ガリウム
(Ga)、錫(Sn)、亜鉛(Zn)、クロム(C
r)、マグネシウム(Mg)及びランタン系の種々の元
素であり得る。
【0021】1つの面に従うと、本発明は、粒子をラベ
ル化し、検出しそして定量する方法を目的として、その
粒子は限定なく、分子、ビーズ、微生物或いは細胞を含
み、その工程は次のようである。 (a)ポルフィリンを架橋剤なしでポルフィリンが粒子に
結合するに十分な時間混合し; (b)ポルフィリンラベルされた粒子を非結合のポルフィ
リンから分離し;そして (c)該ポルフィリンラベルされた粒子を定量する。
【0022】異種の検出と定量の方法のために、基本的
な方法フレームワークは、技術の一般的な処理法に従っ
て変える。ケミルミノメトリック法のために、ポルフィ
リンラベルされた粒子を、粒子と結合したポルフィリン
を不安定化すると螢光を発する、螢光プルーブと酸化剤
(或いは酸化薬)の安定化混合物に接せしめる。螢光プ
ルーブ及び酸化剤の安定化混合物からの発光を検出す
る。発光量は、ポルフィリンラベルされた粒子の数に比
例する。
【0023】放射線測定法のため、粒子に結合したアイ
ソトープ・ラベルされたポルフィリンの放射線発光を検
出する。放射線発光の量は、ポルフィリンラベルされた
粒子の数に比例する。
【0024】螢光測定法のため、ポルフィリンラベルさ
れた粒子の光励起の後の螢光を検出する。発光量は、ポ
ルフィリンラベルされた粒子の数に比例する。
【0025】他の面では、本発明は、次の工程からなる
接着或いは結合アッセイを提供することを目的にする。 (a)試験すべき粒子の懸濁物を供し; (b)懸濁物とポルフィリンを架橋剤なしで混合し; (c)遠心分離、磁気分離或いはロ過処理のような方法に
より過剰のポルフィリンを除去し; (d)ポルフィリンラベルされた粒子を目標表面に接種
し; (e)非−接着或いは非−結合のラベルされた粒子を除去
し;そして (f)放射線測定、螢光測定或いはケミルミノ測定法のよ
うな方法により、表面接着された、或いは結合ラベルさ
れた粒子を定量する。
【0026】他の面では、本発明は、次の工程からな
る、粒子直径或いは表面サイズ分析法を提供することを
目的にする。 (a)試験すべき粒子の予め決めた数の懸濁物を供し; (b)懸濁物とポルフィリンを架橋剤なしで混合し; (c)遠心分離、磁気分離或いはロ過処理のような方法に
より過剰のポルフィリンを除去し; (d)予め決めた数の粒子から生じる放射線測定、螢光測
定或いはケミルミノ測定信号を得; (e)粒子の直径或いは表面サイズの表示物として粒子当
りの信号を計算する。
【0027】他の面では、本発明は、次の工程からな
る、試験管内或いは生体内採取研究を提供することを目
的にする。 (a)試験すべき粒子の懸濁物を供し; (b)懸濁物とポルフィリンを架橋剤なしで混合し; (c)遠心分離、磁気分離或いはロ過処理のような方法に
より過剰のポルフィリンを除去し; (d)ポルフィリンラベルされた粒子を適当な媒体中に再
懸濁し; (e)ポルフィリンラベルされた粒子を、生物学的な目標
中に注入し;そして (f)注入された粒子を検出する。
【0028】他の面によると、本発明は、粒子、ビー
ズ、微生物或いは細胞を定量するためのアッセイキット
を提供する。アッセイキット中に含有される元素は、用
いるべき検出及び定量方法に依存して;ケミルミノ測定
法、放射線測定或いは螢光測定により変わる。すべての
場合、アッセイキットは、少なくともポルフィリンラベ
ルを含有する第1の容器よりなる。ケミルミノ測定検出
のため、アッセイキットは、ポルフィリンラベルを含有
する第1の容器と螢光プルーブと酸化剤の安定化混合物
を含有する第2の容器とを含む。放射線測定検出のため
に、アッセイキットは、アイソトープ・ラベルされたポ
ルフィリンを含有する第1の容器とシンチレイションカ
クテイル或いはSPA(シンチレイションプロキシミテ
イアッセイビーズ)のいずれかを含有する第2の容器を
含む。螢光測定検出にために、アッセイキットは、ポル
フィリンラベルを含有する容器を含む。
【0029】1具体例において、目標表面に結合され
た、分子、ビーズ、微生物或いは細胞を含む多数のポル
フィリンラベルされた粒子を、検出し或いは定量するた
めの方法を提供する。この具体例によると、フェリポル
フィリンの効果的量を、目標粒子の水性懸濁物に混合す
る。遠心分離、磁気分離或いはロ過のいずれかにより、
過剰のポルフィリンラベルを除去した後、ラベルされた
粒子を、選択した水溶液中に必要な密度に懸濁する。
【0030】ラベルされた粒子を次に目標表面に添加
し、結合或いは接着するに十分な時間必要な反応状態下
に維持する。この後に、用いた条件で、通常に知られる
ように、変えて、非−結合或いは非−接着のラベルされ
た粒子を除去する。接着或いは結合されたラベルされた
粒子を、ケミルミノ測定法、放射線測定或いは螢光測定
を含む所望の検出方法により検出しそして定量する。
【0031】ケミルミノ測定法のために、選択の望まし
い水溶液は、十分な量の、螢光プルーブ(先駆物質)及
び酸化剤の安定化混合物を含有する。得られたケミルミ
ネセンスを、検出しそして定量する。ケミルミネセンス
は、ポルフィリンラベルされ、接着され或いは結合され
た粒子の数に比例する。
【0032】本発明に用いるケミルミネセンス先駆物質
は、式6で一般的に示される2,3−ジヒドロ−1,4
−フタラジンエジオン類である。
【0033】式6
【化6】
【0034】式6中で、R1は、アミノ基で、R2
3、R4基は、任意で置換される。特に、ケミルミネセ
ンス先駆物質として好適なものは、5−アミノ−2,3
−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン(ルミノール)
である。
【0035】ケミルミノ測定検出方法と組合せた本発明
の具体例を行うための変更例において、固体表面(例え
ば、隔膜、ヂップステックス)上に位置されたポルフィ
リンラベルされた接着或いは結合され、透明な容器中に
含まれ、或いは、透明なウエル底でマイクロメッキあれ
た粒子は、ポラロイドフィルムカ−トリッヂのような高
スピ−ド写真フィルム上に配置される。免疫化のラベル
された粒子は、容器内の螢光プルーブ及び酸化剤の安定
化混合物を注入することにより検出される。安定化混合
物は、螢光プルーブ、酸化剤及びポルフィリンラベルさ
れた粒子の混合物の間での反応により、発光する接着或
いは結合の粒子に接着させられる。替わりに、生じた光
は、フォトマルチプライヤ管(PMT)或いはCCDカ
メラのような既知の技術により検出できる。
【0036】ケミルミノ測定検出が望ましい場合、酸化
剤は、ポルフィリンに反応して、ケミルミネセンス先駆
物質を励起させ、それにより、螢光反応で発光すること
を、本発明により利用する。特に好適な酸化剤は、例え
ば、過酸化水素及びパ−ボレイトイオンのような過酸化
物、或いは酵素反応によりそれ自体で生成するようなも
のである。
【0037】ケミルミノ測定法において、緩衝物質を用
いることが更に、望ましい。用いることができる適する
緩衝物質は、燐酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン、カ−ボネイト及びボレイトである。更に、螢
光先駆物質及び酸化剤の混合物の安定化は、デフェリオ
キサミン或いはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDT
A)のようなキレート剤の添加により得られる。
【0038】螢光先駆物質、安定剤及び酸化剤の次の薬
剤組成物は、特に、ケミルミノ測定検出方法を用いて、
6.5mMのパ−ボレイト、3.4mMのEDTA及び
0.1mMのルミノールを含有する0.1Mボレイト緩
衝剤、pH9.50を用いる具体例用に特に適する。
【0039】効果的な検出量のポルフィリンは、計数す
べき粒子の数に比例する検出の螢光信号を提供するに必
要なポルフィリン量である。効果的な検出量は、粒子の
数と特性と及びポルフィリン特性の中で変化する。
【0040】粒子、ビーズ、微生物或いは細胞の数は、
約0〜約109/mlであり、螢光プルーブがルミノー
ルである場合、ラベルのために用いるポルフィリンの効
果的検出量は、約10-3〜約10-5Mである。
【0041】ラベル化及び検出の条件は;温度、pH
値、オスモラリテイ、トニシテイ等である。典型的に
は、温度は、約5℃〜約50℃の範囲で、好適には、約
20℃〜約40℃の範囲である。ラベル化のためのpH
は、約6〜約8.5で、好適には約6.5〜約7.5の
範囲である。検出pHは、約7.5〜約12.5であ
り、好適には約8〜約10.5の値の範囲である。ポル
フィリンラベル化の保持時間は、約5〜約20分間であ
り、好適には約10分間である。
【0042】放射線測定方法のために、粒子に結合した
アイソトープ・ラベルされたポルフィリンの放射線発光
を、検出し、定量する。発した放射線量は、ポルフィリ
ンラベルされた粒子の数に比例する。選択の所望の水溶
液は、十分な量の適するシンチレイションカクテルを含
有する。目標粒子が、ポルフィリンラベルを含有するア
イソトープ(ベーター線マ−カー)に結合している。発
した放射線を、PMT或いはCCDカメラにより検出す
る。代替的に、アイソトープ・ラベルされたポルフィリ
ンでラベルされた、そして、適する固体シンチレイター
で被膜した表面に接着され、或いは、結合された粒子
の、発した放射線は、直接的にPMTにより検出され
る。
【0043】放射線測定技術に用いられる適当なベータ
ー線発光のアイソトープには、炭素−14、塩素−3
6、コバルト−(57、58、60)、ガドリウム−1
53、鉄−(55、59)、ニッケル−63、トリチウ
ム、沃素−125、錫−113或いは亜鉛−65があ
る。
【0044】螢光測定法にために、接着性のラベルされ
た粒子を、波長がポルフィリンラベルの励起波長に合致
する光線にさらす。ポルフィリンラベルの励起の後或い
はその間に、励起されたポルフィリンによる発光が、C
CDカメラ或いはPMTにより検出される。発光量は、
ポルフィリンラベルされた粒子の数と比例する。
【0045】本発明の具体例により、目標粒子として利
用できるビーズの非限定的な例は、ナイロン、プラスチ
ック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ガ
ラスにより作られた粒子或いはビーズを含む。ビーズ
は、リポソ−ム(細胞内脂肪粒子)を含む固体球体或い
は空洞球体のいずれかを意味し、その大きさは、サブミ
クロスコ−プから約1cmの範囲である。更に、これら
の粒子或いはビーズは、リガンド、ハプテン或いはビオ
チン、ビオチン−N−ヒドロキシサクシニミド或いは抗
体、アビジン及びストレプタビジン等の結合蛋白質のよ
うな架橋分子を有するものである。本発明の具体例によ
り、目標粒子として利用できる細胞の例として、限定さ
れないが、プロカリオテック及びエウカリオテック及び
哺乳動物細胞タイプを含むものである。ここで使用でき
るように、粒子は、不定形の粒子相を意味し、分子、ミ
セラス及びコロイドを含み、粒子の大きさは、サブミク
ロンから約1cmまでの範囲である。
【0046】前記の方法の適用は非常に広いことは明ら
かになった。ポルフィリンが以前からラベルとして使用
された粒子は、前記の方法により利用できる。例えば、
米国特許第5,494,793号を参照。この指標とし
て、次のものがあるが、それに限定されなく、その検出
され得る、粒子のリストには、薬剤、薬剤代謝物、ホル
モン類、ペプチド、ヌクレオチド、神経伝達物質、コレ
ステロール、成長因子、オリゴヌクレオチド、抗体、坑
原−結合フラグメント、血清蛋白質、酵素、ポリヌクレ
オチド、細胞内オルガネラ、細胞表面坑原、アビジン、
ビオチン、結合蛋白質、核酸、隔膜プルーブ及び核酸プ
ルーブがある。
【0047】この方法は、多数の目的のために、従来の
用いたラベルの検出技術のために利用できる。例えば、
米国特許第5,494,793号、第5,340,71
4号、第5,306,624号、第4,994,373
号、第4,659,676号、第4,614,723号
及び第4,485,086号を参照。方法に使用できる
技術は、これに限定されないが、競合的、置換法或いは
サンドウイッチ免疫アッセイ、核酸プルーブアッセイ、
免疫ブロット法、ハイブリットアッセイ、顕微鏡観察;
イメ−ジ法、流動シトメトリイ、DNA配列及びフォト
ダイナミック治療法がある。
【0048】本発明の具体例で利用できるポルフィリン
の限定しない例は、金属錯体化したプロトポルフィリン
を含む。好適な金属プロトポルフィリンは、フェリ−ポ
ルフィリン、特にフェロプロトポルフィリンIXであ
り、これから誘導されたポルフィリン類である。このポ
ルフィリン−誘導の構造は、式7に示され、ヘモグロビ
ン、ミオグロビン、エリトロクルオリン、カタラーゼ、
ペルオキシダーゼ及びクラスBのシルクロームである。
【0049】式7
【化7】
【0050】特に、フェロプロトポルフィリン例えば、
クロロヘミン(式8)或いはヘマチン(式9)は、目標
粒子に非常に効率よく添加され、そして、非常に効率よ
く螢光発光させ、或いは、説明のように、ケミルミネセ
ントを発する例である。
【0051】式8
【化8】
【0052】式9
【化9】
【0053】他の具体例において、SPA(シンチレイ
ション プロキシミテイ アッセイ)ビーズ、接着物或
いは懸濁物中で検出し、そして定量する方法は、次の工
程を有する。 (a)アイソトープ・ラベルされたポルフィリンを、検出
され、定量されるに必要なSPAビーズがある水性懸濁
物と混合し; (b)放射線発光の上昇を測定する。 この場合の放射線発光の上昇は、懸濁物中に存在するビ
ーズの数に比例する。
【0054】また他の具体例において、ビーズ、微生
物、細胞及び分子を含む、粒子を検出しそして定量する
ためのアッセイキットを提供する。アッセイキット内容
物は、用いる検出方法に依存して変えるが、一般的に、
ポルフィリンラベルを含有する第1容器を含む。放射線
測定検出が望ましい場合、ポルフィリンは、適当なベー
タ発光アイソトープでラベルされるべきである。ポルフ
ィリンラベルは、適当な媒体中に懸濁でき、或いは溶解
でき、或いは、乾燥形にできる。処方物上のみの制限
は、特定処方物がラベルに安定性を与え、ラベルが貯蔵
中に化学的に変更しないようにするものである。
【0055】更に、アッセイキットは、用いるべき検出
方法に依存して変化する内容物を有する第2容器もあ
る。ケミルミノ測定検出が望ましい場合、第2の容器
は、少なくとも1つの定量アッセイを行うに十分な量
の、螢光先駆物質と酸化剤の安定化混合物を含有する。
安定化混合物は、ビーズ、微生物、分子及び細胞を含む
粒子と干渉し、粒子の数に比例する量の第1容器のポル
フィリンラベルでラベルされる。螢光先駆物質及び酸化
剤の安定化混合物が、懸濁物、溶液として、乾燥形で
(例えば、錠剤)として存在できる。適当な緩衝剤或い
はキレート剤もまた存在できる。
【0056】放射線測定のために、第2の容器は、ベー
ター線発光物でアイソトープ・ラベルされたポルフィリ
ンを検出するための適当なシンチレイションカクテイル
を含有する。シンチレイションカクテイルは、少なくと
も1つの定量アッセイを行うに十分な量で存在する。
【0057】具体例により、ケミルミノ測定のために適
する、例示のキットは、ジメチルスルフォキシド(DM
SO)中の1.5mMのヘマチン(ポルフィリンラベ
ル)1mlを含有する第1容器と、6.5mMのナトリ
ウムパ−ボレイト(酸化剤)110ml、安定化剤とし
て3.5mMのEDTA及びpH9.5の0.1Mボレ
イト緩衝剤中の0.1mMのルミノール(螢光先駆物
質)を含有する第2容器を有するものである。約4℃で
適当に貯蔵されると、これらの溶液は、数ケ月安定にあ
る。
【0058】好適な具体例によると、第1及び第2の容
器は、含有する成分の特性、量或いは濃度及び効果的量
を示す指標でラベルされる。
【0059】他の具体例において、説明される、ケミル
ミノ測定、放射測定及び螢光測定技術は、目標粒子の粒
子直径或いは表面サイズを測定するために用いることが
できる。これは、既知の量の粒子を、前記の技術の1つ
により用いることにより達成される。粒子当りの検出信
号の量は、粒子の直径或いはサイズを指標するものであ
る。
【0060】他の具体例において、説明される、ケミル
ミノ測定、放射測定及び螢光測定技術は、試験管内及び
生体内研究のために用いることができる。この目的のた
めに、ポルフィリンラベルされた粒子は、過剰のポルフ
ィリンから分離され、適当な媒体中に再懸濁され、目標
の生物学的目標中に注入する。ラベルされたラインを、
次に、ケミルミノ測定、放射線測定及び螢光測定技術に
より調べる。
【0061】次に、本発明を本発明の特定の具体例によ
り説明するが、本発明はそれらによって限定されるもの
ではない。
【0062】
【実施例1】[細胞数(連続細胞ライン)の定量] 材料と方法 UCHT1、P815、ジャカットT−細胞、P815
B7及びOKT3細胞は、回収され、遠心分離にかけら
れ、そして、ドルベッコ(Dulbecco)のPBS中に、1.
106細胞/mlの密度で標準的15mlファルコン管
中で再懸濁化された。
【0063】他の柔かに混合した後、細胞を室温で更に
5分間法と放置した。150gで、10分間遠心分離に
かけた後に、細胞ペレットを更なる4mlのPBS中に
再懸濁し、そして、再び、洗浄し、すべての過剰のヘマ
チンラベルを除去できた。
【0064】最後に、細胞ペレットを106/mlの密
度で再懸濁した。次に、細胞を、白色マイクロタイター
皿の個々の壁中に置いて、細胞数は、約100μlのP
BS/壁の全量で、約0細胞/壁〜約100,000細
胞/壁の範囲である。
【0065】ケミルミネセントの検出 次に、100μlの安定化ルミノ/パーボレイト組成物
(6.5mMパーレイト、3.4mMのEDTA及び
0.1mMのルミノールを含有する0.1Mボレイト緩
衝剤pH9.5を各々の壁に添加した。10分後に生成
されたケミルミネセンス(フラッスス/mm2/10秒)
が、電荷された結合器(CCD)カメラを使用して、室
温で記録された。結果は図1に示される。
【0066】
【実施例2】[細胞数(単離細胞)の定量] マウスのブロシアルラバゲにより単離されたマクロファ
ージをプ−ルし、105/mlの密度でダルベッコのP
BS中で洗浄した後に濃縮した。次に、10μlのヘマ
チン(DMSO中の1mg/ml)を、1mlのマクロ
ファ−ジ懸濁物に添加した。細胞を培養し、上記のよう
に、洗浄した。
【0067】100μlの安定化ルミノール/酸化剤組
成物の細胞に接触させた10分後に発射されたケミルミ
ネセンス(フラックス/mm2/10秒)を検出した。結果
を図2に示す。
【0068】図1及び2は、ヘマチンラベルされた細胞
で観察されるケミルミネセンスは、細胞の数に比例す
る。図はまた、連続細胞ラインのラベル化及び単離細胞
のラベル化が可能であることを示している。
【0069】
【実施例3】[不活性粒子の定量] 不活性粒子の例として、Dynal A.S.,N-0210 Oslo,ノル
ウエイから、2.108ビーズ/mlの懸濁物として市
販される非被膜のダイナビーズDynabeads M-450を洗浄
し、ダルベッコのPBS中の107ビーズ/mlの密度
で懸濁した。10μlのハマチン貯蔵溶液(DMSO中
の1mg/ml)を添加した後に、ロトラック上でゆっ
くりと混合しながら、ビーズを室温で10分間培養し
た。培養10分の後に、ビーズを磁気分離法により培養
混合物から分離し、PBSで2回洗浄し、最後に、PB
S中の107ビーズ/mlの密度に再懸濁した。
【0070】最後に、ラベルされたビーズを、白色96
ウエルマイクロタイター皿の個々のウエル中にメッキし
た、ビーズ数は、約100μlのPBS/ウエルの全量
において、約0ビーズ/ウエル〜約106ビーズ/ウエ
ルの範囲である。
【0071】次に、ケミルミネセンス(フラックス/mm
2/10秒)が、前記のように、100μl安定化ルミ
ノール/酸化剤溶液を添加することにより、検出され
た。この実験の結果は、図3に示される。
【0072】
【実施例4】[微生物の定量] 108のスタフィロコッシアウレウア(Staphylococci au
reus)の懸濁物をダルベッコのPBS中に、Trypcase So
ya Brothトリペキャ−スソヤブロス中に、一昼夜成長さ
せたスタフィロコッシアウレウアの粗製懸濁物から、調
製した。
【0073】洗浄後、1mlのスタフィロコッシアウレ
ウアの懸濁物を、10μlのヘマチン貯蔵溶液(DMS
O中の1mg/ml)添加により実施例3のようにラベ
ル化した。
【0074】室温で10分間した後に、スタフィロコッ
シアウレウアの懸濁物を遠心分離((450g/5分)
し、バクテリアペレットを5mlのPBSで洗浄した。
この洗浄処理を2回して、その後ラベルされたバクテリ
アのペレットを108バクテリア/mlPBSの密度に
再懸濁した。
【0075】次に、バクテリア希釈液を、100μlP
BSの全量での0〜108バクテリアの範囲の白色マイ
クロタイター皿のウエル中に調製した。
【0076】ケミルミネセンス(フラックス/mm2/1
0s)が開始され、上記の実施例3のように検出され
た。結果を図4に示す。
【0077】
【実施例5】[ナ−ザル細胞モノレイヤに異なる株の結
合バクテリア] 2種株のスタフィロコッシアウレウアの懸濁物(A,
B)を、PBS中の109/mlの密度で製造し、実施
例4のように、ヘマチンでラベルされた。100μlの
全量中で、108、5×107、2.5×107及び0の
バクテリアを含有する4つの試料を、合同の成長の接着
ヒト ナーザルエピテリアル細胞モノレイヤで培養し
た。湿化した培養器(空気、5%CO2)中で37℃
1.5時間培養した後、非接着のバクテリアを、ゆっく
り洗浄することにより除去した。次に、100μlの、
ダルベッコのPBSを、測定すべきウエルに添加した。
ケミルミネセンス(フラックス/mm2/10s)を開始
し、実施例4のように測定した。結果を図5に示す。そ
れは、異なるスタフィロコッシアウレウア株の異なる接
着性があることを示す。図5に示すように、スタフィロ
コッシアウレウアA或いはBのいずれか100%を含有
する試料のケミルミネセンスがある。
【0078】
【実施例6】[フィブロネチン被膜マイクロタイターウ
エル上のPMA刺激CD4+T−細胞の結合] CD4+T−細胞を、最初にフィコリ−ハイパック(Fic
oli-Hypaque)傾斜物の上で先ず遠心分離をしたヒト全血
試料からの標準処理法により、T−細胞調製物から単離
した。CD4+T−細胞を、ダイナビーズを用いて磁気
分離により単離した。
【0079】最後に、CD4+T−細胞を、PBS中の
106/mlの最終濃度に懸濁させる。10μlのヘマ
チン(DMSO中の1mg/ml)を添加し、実施例2
に示すようにT−細胞をラベル化した。
【0080】ラベル化し、洗浄した後に、CD4+T−
細胞を、50%(V/V)PBS/ハンクス アルブミ
ン(0.1%)中で106/mlの密度で再懸濁した。
【0081】平行して、CD4+T−細胞の他のアリコ
ットを、標準的プロトコールにより51Crラベルされ
た。
【0082】次に、フィブロネクチン被膜(FC)或い
は非−フィロネクチン被膜(NFC)のどちらかである
白色マイクロチアター皿のウエルを3倍化するために、
50μlのPBS/HSAを添加し、或いは、10-6
ォルボール ミリステート酢酸塩(PMA)を含有する
50μlのPBA/HSAのいずれかを添加した。便宜
のために、4つの可能な状態は、PMAが存在しない場
合、FC及びNFCと称され、PMAが存在する場合P
Cw/PMA及びNFCw/PMAと称される。
【0083】次に、50μlヘマチンラベルされたT−
細胞或いは51CrラベルされたT−細胞を異なるウエル
組成物に添加した。2時間37℃(湿気空気、5%CO
2)培養した後、非−接着細胞を徐々に除去した。
【0084】次に、51Crラベルされた細胞を、100
μlのトリトンX−100溶解溶液を用いて、溶解せし
め、ガンマ計数により放射線活性を測定した。
【0085】非−接着のヘマチンラベルされたCD4+
T−細胞を除去した後、100μlのPBSをウエルに
添加し、そして、100μlの前記の安定化ルミノール
/酸化剤溶液を添加した後に、ケミルミネセンス(フラ
ックス/mm2/10s)を10分間測定した。その結果
は図6に示す。
【0086】
【実施例7】[ヘマチンラベル化及びビールス生産細胞
ライン] DSN非ビールス生成及びDSNpJD214MDRI
感染及び細胞モノマー生成細胞が、ペトリ皿(ファルコ
ンFalcon)中で合流して成長され、10mlのダルベッ
コ(Dulbecco)のPBS中に10分間含有した100μg
のヘマチンでラベルされた。ラベル化した後、細胞を2
回、過剰PBSで洗浄した。対照物は、PBSがヘマチ
ンラベルを含有しないで、同様に製造された。
【0087】次に、10mlのIMDM(胎牛血清なし
で)を、皿に添加し、次に、一昼夜培養した。
【0088】次の日に、10μlの上澄み液を各皿から
採用し、白色のマイクロタイター皿のウエルに移転し
た。100μmの前記の安定化ルミノール/酸化剤の溶
液を添加し、ケミルミネセンスを10分後に記録した。
【0089】結果は、図7に示される。
【0090】顕著な信号は、対照液(ラベルなし)の上
澄み液では生成されない。然し乍ら、ケミルミネセンス
での顕著な鎖が、ラベルされたが非−ビールス生成ライ
ンから得た上澄み液、及び、ラベルされたビールス−生
成モノレイヤーからの上澄み液で見られた。
【0091】後者から誘導された上澄み液で見られたケ
ミルミネセンスの上昇から、本発明がビールス発芽方法
を検出することを可能にすることが示唆される。
【0092】最後に、ラベルされなく、非−生成のDS
N細胞のモノレイヤーを、ラベルされたpjD214ビ
ールス生成細胞モノレイヤーの上澄み液で培養した場
合、ルミノ/酸化剤の溶液の添加の後に、ケミルミネセ
ンスの上昇が、最初のラグ相の後の洗浄のpjD214
細胞モノレイヤーで観察された。
【0093】図8に示されるこれらの結果から、安定化
のルミノール/酸化剤の溶液が、ヘマチン−ラベルされ
たビールスをDSN細胞内で検出することが示唆され
る。約10分間の観察されたラグー相により、ルミノ/
酸化剤の溶液が、ビールスにより運ばれたヘマチンによ
り徐々に不安定化される前に、ゆっくりと細胞内に浸透
することが示唆される。
【0094】
【発明の効果】本発明の検出方法は、次のごとき技術的
効果があった。即ち、第1に、目標粒子に結合する架橋
剤を必要としないで、種々のアッセイと他の定量技術の
ためのユニバーサル・ラベルとして、ポルフィリン或い
はポルフィリン誘導化合物を使用できる。
【0095】第2に、ラベルされた粒子には、ビーズ、
微生物、細胞及び分子についても検出でき、定量でき
る。第3に、目標粒子に不可逆的に結合したポルフィリ
ンラベルをそのまま、検出でき、ケミルミノ測定、螢光
測定或いは放射線測定のような種々の方法により、定量
できる方法が提供する。そして、第4に、本発明の測定
量は、ラベルされた粒子の数に比例するものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の検出方法による細胞数の定量したグラ
フである。
【図2】本発明の検出方法による単離細胞数とフラック
ス密度と関係を示すグラフである。
【図3】本発明の検出方法による不活性粒子数とフラッ
クス密度と関係を示すグラフである。
【図4】本発明の検出方法による微生物数とフラックス
密度と関係を示すグラフである。
【図5】本発明の検出方法による、モノレイヤに接着し
た微生物数とフラックス密度と関係を示すグラフであ
る。
【図6】本発明の検出方法による、T−細胞数とフラッ
クス密度と関係を示すグラフである。
【図7】本発明の検出方法による、ビールス数とフラッ
クス密度と関係を示すグラフである。
【図8】本発明の検出方法により、ラベルされたビール
スで感染した細胞を時間にプロットしたグラフである。

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (a)架橋剤なしで、ポルフィリンを検出
    粒子と、該ポルフィリンが該粒子と結合するに十分な時
    間混合し: (b)ラベルされたポルフィリン粒子を非結合ポルフィリ
    ンから分け;そして、 (c)該ポルフィリンラベルされた粒子を検出する工程を
    特徴とする該粒子の検出方法。
  2. 【請求項2】 該ポルフィリンラベルされた粒子は、
    ケミルミノ測定、放射線測定或いは螢光測定により検出
    することを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
  3. 【請求項3】 該ポルフィリンは、プロトポルフィリ
    ンIXであることを特徴とする請求項1に記載の検出方
    法。
  4. 【請求項4】 該ポルフィリンは、フェロポルフィリ
    ンであることを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
  5. 【請求項5】 該フェロポルフィリンは、ヘマチン或
    いはヘミンであることを特徴とする請求項4に記載の検
    出方法。
  6. 【請求項6】 該ポルフィリンラベルされた粒子の定
    量は、ケミルミノメトリック法により行われ、螢光プル
    −ブと酸化剤を、分離されたポルフィリンラベルされた
    粒子と混合することを特徴とする請求項1に記載の検出
    方法。
  7. 【請求項7】 該螢光プルーブは、2,3−ジヒロロ
    −1,4−フタラジンジオンであることを特徴とする請
    求項6に記載の検出方法。
  8. 【請求項8】 該酸化剤は、パーボレイト、水素過酸
    化物、ヒドロパーオキシド及び酸化剤生産酵素よりなる
    群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の検
    出方法。
  9. 【請求項9】 該ケミルミノメトリック方法を更に、
    キレ−ト剤とpH保持のための緩衝剤の存在下で行うこ
    とを特徴とする請求項6に記載の検出方法。
  10. 【請求項10】 キレート剤は、EDTA或いはデス
    フェリオキサミンであることを特徴とする請求項9に記
    載の検出方法。
  11. 【請求項11】 該緩衝剤は、ボレート、カーボネー
    ト、トリス(ヒドキシメチル)アミノメタン或いは燐酸
    塩緩衝剤であることを特徴とする請求項9に記載の検出
    方法。
  12. 【請求項12】 該ポルフィリンは、アイソトープ・
    ラベルされたポルフィリンであり、ポルフィリンラベル
    された粒子の検出は、放射線測定方法で行うことを特徴
    とする請求項1に記載の検出方法。
  13. 【請求項13】 該ポルフィリンは、炭素−14、塩
    素−36、コバルト−(57、58、60)、ガドリニ
    ウム−153、鉄−(55、59)、ニッケル−63、
    沃素−125、錫−113、亜鉛−65、燐(32、3
    3)からなる群から選択される原子でアイソトープ・ラ
    ベルされたことを特徴とする請求項12に記載の検出方
    法。
  14. 【請求項14】 検出は、放射線測定で行い、SPA
    ビーズは、沃素−125でラベルされたポルフィリンと
    組合せたものであることを特徴とする請求項1に記載の
    検出方法。
  15. 【請求項15】 該ポルフィリンラベルされた粒子
    は、ポルフィリンラベルの螢光の助けにより検出される
    ことを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
  16. 【請求項16】 ラベルのために使用されたポルフィ
    リンの量は、約103M〜105Mであることを特徴とす
    る請求項1に記載の検出方法。
  17. 【請求項17】 該検出粒子は、分子、ビーズ、微生
    物或いは細胞であることを特徴とする請求項1に記載の
    検出方法。
  18. 【請求項18】 (a)検出すべき粒子の懸濁液を供給
    し: (b)架橋剤なしで、ポルフィリンを検出粒子の懸濁液と
    混合し: (c)ラベルされたポルフィリン粒子を非結合ポルフィリ
    ンから分け; (d)該ポルフィリンラベルされた粒子を目標表面で培養
    し; (e)非−結合のポルフィリンラベルされた粒子を除去
    し;そして、 (f)結合ポルフィリンラベルされた粒子を検出する工程
    を特徴とする結合アッセイ。
  19. 【請求項19】 該ポルフィリンラベルされた粒子
    を、非結合のポルフィリンから、遠心分離、磁気分離或
    いはロ過により、分離することを特徴とする請求項18
    に記載の結合アッセイ。
  20. 【請求項20】 該結合のポルフィリンラベルされた
    粒子は、放射線測定、螢光測定或いはケミルミノ測定法
    により検出されることを特徴とする請求項18に記載の
    結合アッセイ。
  21. 【請求項21】 (a)検出すべき粒子の予め決めた数
    の懸濁液を供給し: (b)架橋剤なしで、ポルフィリンを、該懸濁液と混合
    し: (c)ポルフィリンラベルされた粒子を非結合ポルフィリ
    ンから除去し; (d)予め決めた数の粒子により生成した信号を検出し; (e)粒子の直径或いは表面サイズを表示するものとし
    て、粒子当りの信号を計算する工程を特徴とする表面サ
    イズアッセイの粒子直径。
  22. 【請求項22】 該ポルフィリンラベルされた粒子
    を、非結合のポルフィリンから、遠心分離、磁気分離或
    いはロ過により、除去することを特徴とする請求項21
    に記載の表面サイズアッセイの粒子直径。
  23. 【請求項23】 予め決めた数の粒子により生成され
    た信号を、放射線測定、螢光測定或いはケミルミノ測定
    法により検出することを特徴とする請求項21に記載の
    表面サイズアッセイの粒子直径。
  24. 【請求項24】 (a)研究すべき粒子の懸濁液を供給
    し: (b)架橋剤なしで、ポルフィリンを、該懸濁液と混合
    し: (c)ポルフィリンラベルされた粒子から、非結合ポルフ
    ィリンを除去し; (d)適当な媒体中にラベルされた粒子を再懸濁し; (e)ラベルされた粒子及び適当な媒体を生物学的な目標
    に注入し;そして、 (f)注入された粒子を検出する工程を特徴とする粒子採
    用研究法。
  25. 【請求項25】 該ポルフィリンラベルされた粒子か
    ら、非結合のポルフィリンを、遠心分離、磁気分離或い
    はロ過により、除去することを特徴とする請求項24に
    記載の粒子採用研究法。
  26. 【請求項26】 該注入された粒子を、放射線測定、
    螢光測定或いはケミルミノ測定法により検出することを
    特徴とする請求項24に記載の粒子採用研究法。
  27. 【請求項27】 架橋剤なしで、ポルフィリン含有の
    第1の容器及びケミルミノ測定、放射線測定、あるいは
    螢光測定法によるためのセットを有することを特徴とす
    る粒子検出用アッセイキット。
  28. 【請求項28】 該ポルフィリンは、多重検出アッセ
    イを行う十分な量存在することを特徴とする請求項27
    に記載のアッセイキット。
  29. 【請求項29】 螢光先駆物質及び酸化剤の安定化混
    合物を含有する第2の容器を有することを特徴とする請
    求項27に記載のアッセイキット。
  30. 【請求項30】 該第2の容器は更に、緩衝剤物質及
    びキレート剤を含有するすることを特徴とする請求項2
    9に記載のアッセイキット。
  31. 【請求項31】 該ポルフィリンは、ベーター放射線
    でアイソトープ・ラベルされ、そのアッセイキットは更
    に、シンチレイションカクテル含有の第2の容器を有す
    ることを特徴とする請求項27に記載のアッセイキッ
    ト。
  32. 【請求項32】 ポルフィリン結合粒子を有し、ポル
    フィリンを該粒子に結合する架橋剤がないことを特徴と
    する組成物。
  33. 【請求項33】 該粒子は、薬剤、薬剤代謝物、ホル
    モン、ペプチド、ヌクレオチド、ニュロトランスミッ
    タ、コレステロール、成長因子、オリゴヌクレオチド、
    抗体、坑原−結合のフラグメント、血清蛋白質、酵素、
    ポリヌクレオチド、細胞内オルガネラ、細胞表面坑原、
    アビデン、ビオチン、結合蛋白質、核酸、隔膜プル−ブ
    或いは核酸プル−ブであることを特徴とする請求項32
    に記載の組成物。
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