JP5959248B2 - 細胞間相互作用を検出する方法 - Google Patents
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Description
CD40、NF−κBおよびルシフェラーゼを強制発現させたマウスミエローマ細胞を第1細胞として用い、CD40リガンドを発現する第2細胞との相互作用を可視化した。その詳細を以下に記す。
系統細胞P3X63Ag8.653細胞(マウスミエローマ細胞、抗体非産生)に対し、ヒトCD40遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子の配列を含むベクターと、TransLucent NFkB(1) Reporter Vector (Panomics)の配列のルシフェラーゼ部分にpEluc−test(東洋紡)のEmerald Luc(以下Eluc)配列部分(配列番号2)を挿入して得られたベクターとを同時に導入した。
ヒトCD40リガンド(CD154)とGFPとの融合タンパク質の遺伝子を含むベクターをCHO細胞に導入した。
第2細胞を培養したガラスボトムディッシュを、発光イメージングシステムLV200(オリンパス株式会社製)にセットした。明視野にて細胞の形態および位置を確認した。GFPによる光およびルシフェラーゼによる光を検出するための条件を設定した。ガラスボトムディッシュに含まれる第2細胞の単層に対して、第1細胞を含む培養液を重層し、さらに発光基質D−luciferinを100uM程度の濃度で添加した。
1.明視野(擬似カラー:グレイ)
2.蛍光(GFP)(擬似カラー:緑)(励起フィルタ BP470−490、蛍光フィルタ 510AF23)
3.発光(擬似カラー:赤)
第1細胞として、P3X63Ag8.653の代わりに、PC12(ラット副腎髄質腫瘍(褐色細胞腫)クローン)を使用して、実施例1と同様の実験を行った。
Claims (3)
- 細胞表面に存在する第1タンパク質と、前記第1タンパク質の活性化に起因して活性化される、細胞内に存在する転写因子と、前記活性化された転写因子が結合する転写因子結合配列およびその下流に位置し前記転写因子の結合に起因して発現誘導される第1発光タンパク質の遺伝子を含む核酸とを含む複数の第1細胞を、前記第1タンパク質と相互作用可能であり、細胞表面に存在する第2タンパク質を含む複数の第2細胞に接触させること、
前記第1タンパク質と前記第2タンパク質との相互作用に起因して発現誘導された第1発光タンパク質によって触媒される発光反応において放射される第1光を検出すること、および
光学顕微鏡を使用して、前記第1細胞と前記第2細胞との接触および/または前記第1光の放射を観察することと、前記光学顕微鏡によって得られる画像を経時的に取得することを含む、細胞間相互作用を検出する方法であって、
前記第2細胞は、前記第1光とは異なる波長の第2光を放射する蛍光タンパク質または前記第2光を放射する発光反応を触媒する第2発光タンパク質を細胞内に更に含む、上記方法。 - 前記第2細胞は接着性の細胞であり、浮遊性の第1細胞と混合することで細胞同士の接触を行う請求項1に記載の方法。
- 前記第2細胞は、前記第1光とは異なる波長の第2光を放射する蛍光タンパク質を細胞内に含む請求項1記載の方法。
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