JPH0286661A - フェナリンイミン蛍光色素並びに該色素の分析組成物、分析要素及び分析方法への利用 - Google Patents

フェナリンイミン蛍光色素並びに該色素の分析組成物、分析要素及び分析方法への利用

Info

Publication number
JPH0286661A
JPH0286661A JP1172105A JP17210589A JPH0286661A JP H0286661 A JPH0286661 A JP H0286661A JP 1172105 A JP1172105 A JP 1172105A JP 17210589 A JP17210589 A JP 17210589A JP H0286661 A JPH0286661 A JP H0286661A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
formula
substituted
alkyl
aryl
unsubstituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP1172105A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2859893B2 (ja
Inventor
Bruce E Babb
ブルース　エドワード　バブ
Fred Terry Oakes
フレッド　テリー　オークス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eastman Kodak Co
Original Assignee
Eastman Kodak Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eastman Kodak Co filed Critical Eastman Kodak Co
Publication of JPH0286661A publication Critical patent/JPH0286661A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2859893B2 publication Critical patent/JP2859893B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/74—Amino or imino radicals substituted by hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/02—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton containing imino groups
    • C07C251/20—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton containing imino groups having carbon atoms of imino groups being part of rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/18—Ring systems of four or more rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B55/00—Azomethine dyes
    • C09B55/009—Azomethine dyes, the C-atom of the group -C=N- being part of a ring (Image)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
    • C07C2603/22—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/28—Phenalenes; Hydrogenated phenalenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、フェーノーリンイミン蛍光化合物及び還元可
能な化合物に関する。更に、本発明は、このような化合
物を利用した分析組成物、要素及び方法に関する。更に
、本発明は、生医学的研究及び種々の分析測定に有効な
蛍光標識並びに蛍光標識化生物学的試薬に関する。
０従来の技術］ 医薬、生医学の研究並びに診断及びしｎ床化学の分野に
おいて、動物若しくはヒトを効果的に検査、診断又は治
療するために、細胞若しくはその成分を可視的に検出す
ることが必要な場合がある。数多くの比色及び蛍光化合
物がこのような検出に使用されてきた。例えば、特願昭
６２−０１８７５３号明Ｔｎｌ書には、細胞の染色及び
微生物の検出等の種々の医療及び診断用途に有用である
新規なフエナリノン及びペンシフ玉ナリノン蛍光化合物
並びに７元可能な前駆体が記載されている。
又、生理学的反応性種（即ち、細胞成分、タンパク質、
ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、核酸、ハプテン及
び当該技術分野において公知の他の物質等の相補的結合
相手との特異的バインディング反応において反応する種
）に関する数多くの研究並びに測定が、低濃度の意図す
る物質の検出又は分剤を容易にする標識を用いて行われ
ている。
このような用途の一つにおいては、異常な状態の診断及
び薬物又は麻薬の検出が、競合性バインディング原理を
用いた特異的バインディングアッセイの際に、標識物質
を用いてしばしば行われている。
標識を使用するときは、検出可能な存在する種のレベル
が一般的に低いため、感度が最も重要となる。放射源、
＝１１には、感度が限られていること、有効寿命が短い
こと及び取扱上の危険があることを（よしめとして、い
くつかの欠点がある。種々の比色標識を、分析法に使用
するためにラテックス粒子に１且み込むことができるが
、色泰は検出が難しく且つ感度５こ［上界がある。
光学分析技法のうちで最も感度が高く且つ汎用性のある
ものの一つである蛍光分光法が、他の標識法の欠点を克
服する方法として最近まずまずポピユラーになってきた
。イムノアッセイ用の蛍光標識が、イムノアッセイに有
効な標識ポリマー粒子の記載がある米国特許第４，２５
９，３１３号及び第４．２８３，３８２号明細書に説明
されている。
物を分析操作において標識として用いることも有効であ
り、適当な化学処理を施したときだけ蛍光性となる前駆
体に組み込む。
Ｃ課題を解決するための手段〕 ６００ｎｍ又はそれを超える波長で検出可能な新規な蛍
光化合物は次式 〔発明が解決しようとする課題〕 適当に励起すると、生物学的方法で使用される数多くの
蛍光化合物が６００ｎｍ未溝の波長で輻射線を放出する
。このような場合、意図する化合物の検出が、生物学的
試料中に通常見出され且つ蛍光化合物の発光波長又はそ
の付近の波長で電磁線を放出する他の成分により妨害さ
れる場合がある。
これを克服するために、種々の濾過工程を行い干渉物を
除去するが、これには、時間を要するとともに費用がか
かる操作が必要となる。従って、６００ｎｍ又はそれを
超える波長で検出可能である蛍光化合物が非常に望まし
い。又、このような化合（式中、Ｒ′及びＲ′はそれぞ
れ独立的に水素、アルキル、シクロアルキル、了り−ル
若しくは複素環であり、又はＲ′は核と縮合環を形成す
る炭素若しくはペテロ原子を包含する）で表される構造
を有している。これらの化合物は、ｐＨ値を９以下に調
整した水性組成物の状態で使用することができる。
又、本発明により、不連続相と水性相を有する充填可能
ラテックス由来のポリマー粒子に取り込まれた蛍光化合
物を含む蛍光標識が提供される。
この蛍光標識を使用して、それらと結合した生物学的化
合物を包含する蛍光標識化生物学的試薬が提供される。
更に、帯域の少なくとも一つに、上記した蛍光標識化生
物学的試薬を有する分析又は診断法に有効な乾式分析要
素が提供される。
更に、水性液中の特異的バインデイングリガントの測定
方法であって、前記方法が、 （Ａ）前記リガンドの受容体の存在下で、前記液体試料
を、上記した蛍光標識に結合した特異的バインデイング
リガントを包含する蛍光標識化特異的パインデイングリ
ガント類似体と接触させて、受容体と前記リガンド類似
体との複合体を形成し、（Ｂ）前記複合体を未複合化物
質から分離し、（Ｃ）前記複合体又は未複合化物質のい
ずれか一方を、６００ｒ＋ｎ＋又はそれを超える波長に
おいて蛍光Ｊ、す定的に検出する、工程を含んでなる水
性液中の特異的バインデイングリガントの測定方法が提
供される。
又、本発明の別の方法によれば、特異的バインデイング
リガントが、水性液中で、 （Ａ）ｎｉ記液体試料を、上記した蛍光標識に結合した
前記リガンドの受容体を含む蛍光標識化特異的バインデ
ィング試薬と接触させて、前記受容体とリガンドとの複
合体を形成し、 （Ｂ）前記複合体を６００ｎｍ又はそれを超える波長に
おいて蛍光測定的に検出することにより測定される。
又、（Ａ）生物学的験体を、上記した蛍光化合物を包含
し、ｐＨ値を９以下に調整した組成物と接触させ、 （Ｂ）染色した物質を６００ｎｍ又はそれを超える波長
において検出することを含んごなる、生物学的験体を染
色する方法が提供される。
又、本発明によれば、次式 Ｕ 〔式中Ｒ’−は上記した蛍光化合物由来の一価の蛍光成
分であり、 Ｒ２及びＲ４はそれぞれ独立的に水素、アルキル、アリ
ール又は電子吸引性基であり、Ｒ５は未置換メチレンで
あり、 Ｒ３は−Ｒ５−ＱＣ−Ｒ’、Ｒ２及びＲ４に関して定義
した水素、アルキル、アリール、若しくは電子吸引性基
であり、あるいはＲ：ＩとＲ４が、−緒になって、縮合
炭素環を形成するのに必要な原子を表す〕で表される構
造を有する還元可能な前駆体化合物が提供される。
この還元可能な前駆体化合物は、乾式分析要素の少なく
とも一つの帯域に包含させることができる。
この還元可能な化合物は、 （Ａ）ｐｌ（９以下で、被分析物を含有していると思わ
れる液体試料を、上記した還元可能な前駆体化合物と接
触させて蛍光色素を放出させ、（Ｂ）被分析物が存在す
ることにより放出された蛍光色素を、６００ｎｍ又はそ
れを超える波長において定量する、工程を含んでなる被
分析物の測定方法に使用することができる。
夫施旭様 本発明の蛍光化合物は、次式、 で表される構造を有するツェナリンイミン化合物である
。なお上式中、Ｒ′及びＲ”は、それぞれ独立的に（即
ち、同−又は相異なる）水素、置換若しくは未置換アル
キル（−船釣に、メチル、エチル、イソプロピル、ヘキ
シル、クロロメチル、メトキシメチル、メトキシエチル
、ベンジル、デシル及びヘキサデシル等の炭素原子数１
〜２０のもの、好ましくは炭素原子数１〜ｌＯのもの）
、置換若しくは未置換シクロアルキル（−船釣に、シク
ロペンチル、シクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシ
ル及び２，３−ジクロロシクロへブチル等の炭素原子数
５〜７のもの、好ましくは炭素原子数５若しくは６のも
の）、置換若しくは未置換炭素環式アリール（−船釣に
、フェニル、ナフチル、トリル、キシリル及び４−クロ
ロフェニル等の炭素原子数６〜１４のもの、好ましくは
炭素原子数６〜１０のもの）又は置換若しくは未置換複
素環〔−船釣に、ピリジル、ピリミジル、イミダゾリル
、チエニル、ピロリル、フリル等の炭素原子数５〜７の
芳香族若しくは非芳香族炭化水素及びヘテロ原子（例え
ば、窒素、硫黄及び酸素）、好ましくは炭素原子数５若
しくは６のもの及びヘテロ原子〕である。又、Ｒ′は、
前記化合物の核（−船釣に、５〜７個の炭素原子及びヘ
テロ原子）と縮合環を形成するのに必要な炭素及びヘテ
ロ原子（酸素、硫黄、窒素）を包含していてもよい（縮
合環は、アルキル、シクロアルキル、アリール若しくは
上記した複素環基、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等
のアルコキシ基又はクロロ、フロロ及びブロモ等のハロ
基の一種以上で置換されていてもよい）。
本発明の化合物は、ツェナリンイミン核に、更に１個以
上の電子供与性置換基を有することができる。このよう
な基は、例えば、ステリンク　イフェクト　イン　オー
ガニンク　ケミストり一（Ｓｔｅｒｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ
　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）　、ジ
ョン　ウィリー　アンド　ンンズ　インコーポレーショ
ン（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、
）　、１９５６年、第５７０〜５７４頁及びプログレス
　イン　フ４イジカルオーガニック　ケミストリー（Ｆ
ｉ！９Ｕｒｅｓｓ　１ｎＰｈ　５ｉｃａｌｏｒ　　ａｎ
ｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）　、第２巻、インターサイ
エンス　バブリッシャーズ、１９６４年、第３３３〜３
３９頁に記載の標準法に準じて計算すると、−船釣に、
負のハメントシグマ値を示す。代表的な電子供与性置換
基としては、置換若しくは未置換アルコキシ（好ましく
は炭素数１〜１０）、置換若しくは未置換アラルコキシ
（好ましくは炭素数７〜１４）、第一、第二及び第三ア
ミン（アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、モルホ
リノ、ピペリジノ及び当該技術分野において公知の他の
もの等の環状アミン類を含む）、置換若しくは未置換ア
ルキルアゾ、置換若しくは未置換アリールアゾ、置換若
しくは未置換アルキルカルボニルオキシ、置換若しくは
未置換アリールカルボニルオキシ、未置換アルキル、例
えば、アリル及びアルキニル並びに当該技術分野におい
て公知の他のものが挙げられる。
本発明の好ましい蛍光化合物は、Ｒ′及びＲ″がそれぞ
れ独立的に水素、炭素原子数１〜１０の置換若しくは未
置換アルキル（メチル、エチル及びベンジル若しくはそ
れらのクロロ若しくは同数の炭素原子を有するアルコキ
シ置換体）又は炭素原子数６〜１０の置換若しくは未置
換アリール（フェニル、ナフチル若しくはハロ、アルキ
ル若しくは上記したアルコキシ基で置換された了り−ル
基）が挙げられる。特に有効な蛍光化合物としては、下
記のものが挙げられる。
本発明の蛍光化合物は、熟練した合成化学者に理解され
る下記の一般的な操作（一般的な濃度及び温度条件を含
む）を用いて製造される。即ち、６−ヒトロキシフエナ
リノンを、ウィリアムソン合成により、即ち、フェノキ
シトをハロゲン化アルキル又は硫酸アルキルでアルキル
化することにより、アルキルエーテル（好ましくはメチ
ルエーテル）中間体に転化する。より詳細には、中間体
は、塩基、例えば、炭酸カリウムを用いてアルコキシド
を生成し、ヨウ化メチルで処理し、１５時間加熱し、冷
却後、６−メドキシフエナリノンを単離することにより
製造される。次に、この中間体を、氷酢酸の存在下で、
全ての出発中間体がイミン生成物に転化するまで、還流
しながら加熱することにより、アミン又はアンモニア（
酢酸アンモニウム）と縮合させる。代表的な具体的製造
例が、下記の例１，２及び３に記載されている。
本発明の蛍光化合物は、非緩衝化又は緩衝化水溶液に保
つことができるとともに、その状態で使用できる。一般
的に、本発明の化合物は、生理学的ｐｌ＋であるとみな
されることのある９以下のｐＨ値、好ましくは５〜９の
ｐＨ値に調節した溶液の状態に保つか又はその状態で使
用される。有効な緩衝液は、当該技術分野において周知
である。
本発明の一実施態様において、生物学的験体、例えば、
Ｍｉ織及び細胞、並びに標準技法を用いた細胞血球計算
に有効である。染色は、例えば、Ｘ４■胞の懸濁液を、
少なくとも１モル濃度で存在する蛍光化合物の緩衝液と
混合することにより行うことができる。次に、染色した
細胞を、適当な装置を用いて、適当に電磁励起にさらし
た後、６００ｎｍ以上で検出及び検視する。
別の実施態様では、本発明の蛍光化合物をキノン核に結
合させて、還元可能な色素前駆体を生成することができ
る。この前駆体を、還元を生じ且つアッセイ中に核から
色素を生成するための蛍光成分を放出する適当な処理に
附するか又は条件下に保つことができる。還元可能な化
合物に結合するとともに、この蛍光成分は、−船釣に、
放出される色素の発光スペクトル（６００ｎｍ以上）と
は異なる発光スペクトルを有している。
より詳細には、この還元可能な前駆体は、次式式中、Ｒ
１は上記した本発明の蛍光化合物由来の蛍光成分である
）で表される構造を有している。
Ｒ１は、水素原子を除去すると、蛍光化合物の７ミン基
を介して一〇〇−基に結合する。
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立的に（即ち、同−若しく
は相異なる）水素、置換若しくは未置換アルキル、置換
若しくは未置換アリール又は電子吸引性基である。
Ｒ５は、置換若しくは未置換メチレン（炭素数１〜２０
のアルキルで置換したもの等）である。
Ｒ３は、−Ｒ”０Ｃ−Ｒ’、Ｒ”及びＲ４に関して定義
した通りの水素、置換若しくは未置換アルギル、置換若
しくは未置換アリール若しくは電子吸引性基であり、あ
るいはＲ３とＲ４は、−緒になって、置換若しくは未置
換縮合炭素環を完成するために必要な原子を表す。
好ましくは、上記した還元可能な化合物構造において、
上記キノン構造におけるＲ２及びＲ４は、それぞれ独立
的に水素、炭素原子数１〜４０の置換若しくは未置換ア
ルキル（例えば、メチル、エチル、クロロメチル、ヒド
ロキシメチル、メトキシメチル、ヘンシル及び当業者に
公知の他の物）、置換若しくは未置換アリール（炭素環
若しくは複素環、例えば、フェニル、ナフチル、メチル
ナフチル、ｐ−ニトロフェニル、ｍ−メトキシフェニル
、フェニルスルホンアミド及び当業者に公知の他の物）
又は−船釣に正のハメットシグマ値、好ましくは０．０
６を超えるシグマ値を有する電子吸引性基である。ハメ
ットシグマ値は、例えば、上記したステリック　イフエ
クツ　イン　オーガニツク　ケミストリー（Ｓｔｅｒｉ
ｃ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃいμ熊旺ヒ
）及びプログレス　イン　フィジカルオーガニック　ケ
ミストリー（Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｈ　−５ｉｃ
ａｌ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）に記載の
標準法に準じて計算される。正のハメットシグマ値を有
する電子吸引性基としては、シアノ、カルボキシ、ニト
ロ、ハロ（フロロ、フロモ若シクハクロロ等）、トリメ
チル（例えば、トリフロロメチル若しくはトリクロロメ
チル）、１〜リアルキルアンモニウム、カルボニル、カ
ルバモイル、スルホニル、スルファモイル、エステル類
及び当該技術分野において公知の他の物）が挙げられる
。電子吸引性基の好ましいものとしては、ｐ−ニトロフ
ェニル、ｍニトロフェニル、ｐ−シアノフェニル＆ヒ２
，５ジクロロフェニルが挙げられる。メタ位にメトキシ
又はアセトアミド基を有するアリール基も有効である。
Ｒ３を−Ｒ”Ｏ（、−Ｒ’として、潜在的に前駆体分子
に対する蛍光成分のモル比を２＝１としてもよいし、又
はＲ３又はＲ２及びＲ４に関して上記で定義したように
、水素、置換若しくは未置換アルキル、置換若しくは未
置換アリール若しくは電子吸引性基であってもよい。
又、Ｒ３とＲ４は、−緒の形態をとって、キノン核に結
合する置換若しくは未置換縮合環を完成するのに必要な
炭素原子であってもよい。例えば、このような環（単環
式又は二環式）は、主鎖に４〜８個、好ましくは５〜７
個の炭素原子を有していてもよい。この縮合環は、Ｒ２
及びＲ４に関して上記で定義した基で置換してよい。
本発明の還元可能な前駆体は、２．６−ルチジンの存在
下で色素をホスゲンで処理して、色素上のアミン基から
クロロホルムアミドを生成し、クロロボルムアミドを２
−ヒドロキシメチルキノンと縮合して還元可能な色素前
駆体を生成することにより製造できる。この操作につい
ては、下記の例４に説明されている。
この還元可能な前駆体化合物は、分析用途で、水溶液又
は懸濁液の状態で使用することができる。
この前駆体が、必要とする水溶性又は水分散性が不十分
の場合には、前駆体の還元可能性及び蛍光色素の放出を
妨害しない少量の水混和性有機溶媒（例えば、メタノー
ル、エタノール、プロパツール、Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ア
セトン若しくはヘキサメチレンホスホルアミド）又は界
面活性剤を用いて可溶化することができる。有効な界面
活性剤としては、前駆体の還元又は微生物等のアッセイ
を妨害しない非イオン性化合物が挙げられる。
必要に応じて、溶液又は懸濁液は、ｐＨ値を９以下に調
節することができる。
本発明の還元可能な前駆体化合物は、水性又は非水性液
、例えば、生物学的流体、製造流出液、廃液、食物及び
他の流体中の化学又は生物学的物質の分析測定（即ち、
定性的、半定性的若しくは定量的検出）用組成物におい
て有効である。測定は、種々の被分析物について、前駆
体の還元及び蛍光成分の放出を生じる単一反応又は一連
の反応を介して行うことができる。種々の被分析物とし
ては、生細胞（例えば、バクテリア、酵母、白血球若し
くはカビ類）、酵素（例えば、リパーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、タレアチンキナーゼ、
α−グリセロホスフェートオキシダーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、ビルヘートデヒドロゲナーゼ、グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ及びデヒドロゲナーゼ若しくはリダクターゼ酵素
を包含する他のＮＡＤＨ、ＦＡＤＩ＋又はオキシダーゼ
を基本としたアッセイ）、生細胞以外の生物学的又は化
学還元体（例えば、アスコルビン酸塩、システィン、グ
ルタチオン若しくはチオレドキシン）、代謝性物質（例
えば、グルコース、乳酸、トリグリセリド若しくはコレ
ステロール）、免疫反応体（例えば、抗原、抗体若しく
はバブテン）が挙げられる。
これらの組成物を使用して、（ＮＡＤ−ＮＭＤｌｌ　）
（ＰＡＤ　−ＦＡＤＩ（）及び（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰｌ
ｌ）を基本とする反応をはじめとするフラビン結合デヒ
ロゲナーゼ及びオキシダーゼをモニターするのに使用す
ることができる。このような場合、還元可能な前駆体を
用いて、ＮＡ叶、ＦＡＤＨ又はＮＡＤＰｌｌの代わりに
蛍光色素を生成させることができる。還元可能な前駆体
を使用して生細胞を測定するとき、色素放出を迅速にす
るためには、生細胞が電子移動剤（本明細書ではｒ　Ｅ
ＴＡＪと称する）と相互作用を起こすことが好ましい。
ＥＴＡは、測定すべき物質（例えば、生細胞）と還元可
能な前駆体との間の媒介として作用する移動性化合物で
ある。
−船釣に、ＥＴＡは、被分析物よりも容易に還元されな
ければならないとともに、還元可能な前駆体よりも還元
しにくくなければならない。又、Ｅ　Ｔ　Ａは、−船釣
にく被分析物の濃度に応じた濃度、好ましくはｌＸｌ０
−３モル濃度〜ｌＸｌ０−’モル濃度で存在する。
本発明を実施する上で有効なＥＴＡ化合物と゛しては、
フェナジンメトサルフェート、フェナジンエトサルフェ
ート、米国特許第４，７４６，６０７号明細書に記載さ
れているような置換ベンゾ及びナフトナフトキノン類並
びに当業者に公知の類似化合物が挙げられる。必要に応
じて、異種のＥＴＡ化合物を組み合わせて用いてもよい
。
生細胞、特にバクテリア細胞の定量は、必須ではないが
、これらの細胞の代謝性栄養分の存在下で行う場合があ
る。有効な炭素及び必要に応じて窒素源を含有するいず
れの栄養培地を用いてもよい。適切な成分及びｐＨを有
する適当な栄養培地については、当業者において周知で
ある。
本発明の還元可能な前駆体は、溶液又は乾式アッセイの
どちらにも使用できる。？容液アッセイにおいては、還
元可能な前駆体を含有する溶液（又は水性分散液）、好
ましくはＥＴＡを調製し、適当な容器中で混合して、測
定すべき生細胞又は被分析物を含有する液状試験試料と
接触させることができる。又、ＥＴＡは、還元可能な前
駆体との混合に先立ち試験試料と混合してもよい。得ら
れる溶液（又は分散液）を、穏やかに混合後、４０°Ｃ
以下の温度で比較的短時間培養する。次に、試験試料を
、適当な検出装置を用いて、蛍光色素の放出により生し
る蛍光のシフトを測定することにより評価する。
又、溶液アッセイは、試験試料を含有する多孔性吸収物
質、例えば、祇ストリンプを、還元可能な前駆体の分散
液と接触させることにより行うこともできる。試験試料
中の被分析物は、多孔性物質から分散液に移動し、測定
に必要な分析反応を開始する。溶液アッセイにおいては
、存在する前駆体の量は、少なくとも０．００１ミリモ
ル濃度である。又、他の試薬が、当業者により容易に決
定できる量で存在していてもよい。
又、本発明の方法は、乾式分析要素を用いて実施するこ
とができる。このような要素は、前駆体又は前駆体を含
んでいる分散液の乾燥した残留物を含有している吸収性
キャリア物質、即ち、濾紙又はスＩ−ＩＪツブ等の自己
支持型吸収材又は吸湿材でよい。このような要素は、当
該技術分野において、試験ストラング、診断要素、デイ
ツプスティック、診断剤等の形態で知られている。
乾式分析要素に使用する場合、還元可能な前駆体は、イ
ンビビション（ｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎ）若しくは含浸に
より適当な吸収キャリア材料に取り込んでも、又は適当
な吸収キャリア材料に塗布してもよい。
又、還元可能な前駆体は、アッセイ中に要素に取り込ん
でもよい。
乾式アッセイは、上に吸収キャリア材料として少な（と
も一つの拡散帯域を有する支持体を包含する分析要素を
用いる場合特に利点がある。還元可能な前駆体は、拡散
帯域又は他の帯域（例えば、試薬、記録若しくは親水性
帯域）に存在していてもよい。
この展開帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号、第
３．９９２．１５８号、第４．２５８，００１号及び第
４，４３０，４３６号明細書並びに特開昭第５７−１０
１７６０号公報に記載されているような、適当なバイン
ダー材と混合した状態又は織物に織った状態の繊維材料
を用いて製造することができる。
要素は、互いに一般的に流体接触状態にある複数の帯域
を有することができる。このことは、流体、試薬及び反
応生成物が、隣接帯域の重なった領域の間を通過するこ
とができることを意味する。
これらの帯域は、２つ以上の帯域を単一層に位置させる
ことができるが、別々の塗布した重なり合った層である
ことが好ましい。
本発明の要素において、還元可能な前駆体の量は広範囲
に異なることができるが、一般的に、少なくとも０．０
１ｇ／ｒｒｒの塗布量で存在する。任意ではあるが好ま
しい試薬（例えば、ＥＴＡ、栄養源及び緩衝剤）は、一
般的に下記の塗布量で存在する。
ＥＴＡ　ニー船釣に少なくとも０．００１ｇ／Ｉイ栄養
ｔＡニ一般的に少なくとも０．０５ｇ／ポ（生細胞の検
出のみに使用される） 援街液（ｐｌ（≦９）ニー船釣に少なくともＯ，ｌ　ｇ
／ｎｒ 界面活性剤ニー船釣に少なくとも０．１　ｇ　／　ｒ＋
ｒ本発明の一実施態様においては、水性液中の微生物（
例えば、酵母、菌類又はバクテリア）の検出用の要素は
、上記した電子移動剤及び還元可能な前駆体（両方とも
上記したもの）を包含している。又、これらの要素は、
生細胞用栄養源及びアッセイ中にｐＨを適当に維持する
緩衝剤を含有することが望ましい。このような要素を使
用して、例えば、尿試料と要素を適当な方法で物理的に
接触させた後、バクテリアの存在により前駆体から放出
した蛍光色素を６００ｎｍ又はそれを超える適当な波長
で検出することにより、尿試料中のバクテリアを検出す
ることができる。
本発明の別の実施態様においては、水性液における生き
ていない生物学的被分析物又は化学的被分析物の測定に
使用され、且つ還元可能な前駆体と反応して、還元して
蛍光色素を生成することのできる相互作用性組成物を含
有している。検出される蛍光色素の量は、液体試料中に
存在する被分析物の量と相関させることができる。アッ
セイの前に、妨害物を除去したり又は細胞を濃縮するた
めの前処理工程を設けることが好ましい。
本発明のアッセイは、手動で行っても、自動で行っても
よい。−船釣に、乾式要素を使用する際、分析物又は生
細胞の測定は、要素を供給ロール、チップパケット又は
他の源から取り、それを要素中において試薬と混合する
試験すべき液体の試料（例えば、１〜２００μ））と接
触させることにより行うことができる。このような接触
は、いずれかの適当な方法、例えば、要素を試料に浸漬
するか、又は好ましくは要素に手若しくは機械により、
適当な分配手段を用いて、−滴以上の試料をつけること
により行うことができる。
被分析物又は生細胞は、前駆体を還元して、６００ｎｍ
又はそれを超える適当な波長において、適当な方法によ
り検出することのできる蛍光色素を放出することにより
検出できる。
本発明の蛍光標識は、種々の生医学的研究並びに臨床及
び診断測定用のプローブ又は標識材料としても用いるこ
とができる。これらの蛍光標識を利用して、タンパク質
、核酸及びヌクレオチド、酵素、酵素基質、補助因子、
ウィルス、白血球、成長因子、レクチン、抗原、抗体、
ハプテン、ビタミン、中間代謝物、ホルモン、トキシン
、放射性同位元素並びに当業者に公知の他の物等の細胞
又は他の生物学的化合物を標識することができる。
多くのこのような生物学的化合物は、対応する受容体分
子と特異的に複合体を生成する特異的バインデイングリ
ガントである。標識は、下記するような適当な方法でこ
のような生物学的化合物に結合させる。特に有用な生物
学的化合物としては、アビジン、ビオチン、酵素及び免
疫反応性化合物（抗体及び抗原等）が挙げられる。
標識は、対応する受容体分子、例えば、抗体に対する抗
原と特異的バインディング能を有する種（即ち、特異的
バインデイングリガント）を測定する特異的パインディ
ングアッセイに特に有用である。一実施態様においては
、被測定種を標識に結合させ、結合した種を、試験試料
からの未標識種と競合状態として、共通受容体と反応さ
せる。
又、標識は、種の存在を、種が集塊を起こす標識不溶化
受容体分子を用いて検出する、擬集アッセイとして当該
技ｊ本ｊ分野において知られているものにも使用するこ
とができる。標識は、受容体分子を結合する、（本発明
の蛍光化合物で標識した）不溶性粒子でよい。別の実施
態様としては、検出すべき種の２種以上の受容体を用い
たサンドイッチ又はイムノメトリックアッセイとして知
られているものが挙げられる。この場合、受容体のうち
の一つは、本発明の蛍光標識に結合する。
本発明の好ましい実施態様においては、特異的バインデ
イングリガントは抗原又は抗体であり、特異的バインデ
ィングアッセイは免疫学的検定である。
本発明の蛍光標識は、本発明の蛍光化合物を含有するラ
テンクスボリマー粒子である。有効なポリマー粒子は、
下記により詳細に説明する手法を用いて、蛍光化合物を
、予め形成した粒子に取り込み又は吸収及び分布するこ
とのできることを意味する「充填可能」なものである。
本発明の蛍光化合物等の疎水性化合物を充填可能なポリ
マーラテックス粒子に分配する手法として、いくつか知
られている。このような手法は、例えば、米国特許第４
．１９９，３６３号及び第４，３６８，２５８号明細書
並びに特願昭６３−２２８８７７号明細書に記載されて
いる。
好ましい充填方法としては、充填可能なラテ・７クス（
下記する）を準備し、一種以上の水混和性有機溶媒に溶
解した蛍光化合物の溶液をｌ０ＴｆＬ、充填可能なラテ
ックスを３０〜９５°Ｃに加熱し、有機溶液を加熱した
ラテックスに徐々に添加して、ポリマー粒子と蛍光化合
物を均一に接触させる。水混和性溶媒を水で希釈して、
化合物の水への溶解度を減少させることにより、化合物
の平衡分配を、水からポリマー粒子へと移動させる。
充填可能ラテックス対蛍光化合物の割合は、般的に、３
０：１〜１：１の容積比に維持される。
有機溶液中の蛍光化合物対ポリマー粒子の重量比は、一
般的に１：３０−１：１である。
−ａ的に、充填可能なポリマー粒子は、下記の試験を満
足するものである。（ａ）２５°Ｃで、粒子は、総ラテ
ックス重量に対して、０．２〜２０％の粒子濃度で、水
とラテックスを形成するものでなければならない。（ｂ
）ラテックスの試料１００ｄを、充填ラテックスを形成
するのに用いられる水混和性有機溶媒の等容量と混合し
、攪拌後、１０分間静置したとき、ポリマー粒子の凝集
が観察されないこと。
充填ラテックスが調製されると意図する生物学的化合物
（上記したもの）が吸着又は共有結合により粒子に付着
することができる。但し、これは、粒子が生物学的化合
物のフリーアミン又はスルフヒドリル基と反応すること
ができる表面反応性基を有することが前提であることは
言うまでもない。
必要に応じて、粒子又は生物学的化合物は、化学的に変
性して付着を容易にすることができる。吸着は、公知の
手法、通常、粒子と化合物を適当な温度で適当な時間混
合することにより達成できる。
共有結合は、より複雑で好ましいものであるが、多くの
このような手法は、当該技術分野において公知である。
得られる蛍光生物学的試薬は、競争パインディングイム
ノアンセイ及びイムノメトリノクアンセイをはじめとす
る上記した種々の分析法に有効である。例えば、これら
の試薬は、特異的パインデイングリガントのイムノアッ
セイにおいて、蛍光標識化特異的パインデイングリガン
トまｎ似体として使用することができる。又、これらの
試薬は、凝集又はイムノメトリックアンセイに、不溶性
粒子に付着した意図するリガンドに対する受容体を有す
る標識化試薬として使用することもできる。
これらのアッセイは、必要に応じて、溶液、乾式分析要
素、試験プレート又は装置の形態で用いることができる
。このようなものについては、がなりの技術及び特許文
献に記載されており、設計及び使用については、当業者
の技術範囲内である。
〔実施例〕
以下の例により、本発明の実施について説明する。
例１　：ず　覧ヒム　　■の」す′告 上記した構造を有する蛍光化合物Ｉを、下記の手法で製
造した。
工程１： 中間体である６−ヒトロキシフエナリノン（２０ｇ）を
、アセトン（２００ｍｆ）に溶解した。この中間体は、
クーテ（Ｃｏｏｋｅ）等、オーストラル　ジェイケム（
八ｕｓｔｒａ１．Ｊ、ｃｈｅｍ、）　、第１１巻、２３
０〜２３５（１９５８）、特に製造（ａ）、又はソロダ
ー（Ｓｏｌｏｄａｒ）等、ザーナル　オーガニケスコイ
　キミイ（Ｚｈｕｒｎａｌ　Ｏｒ　ａｎｉｃｈｅｓｋｏ
ｉ　Ｋｈｉｍｉｉ）　、用利立と。
１０６２〜１０６４　（１９８０）に記載されている手
法に準じて製造される。炭酸カリウム（２０ｇ）、ヨー
ドメタン（ＩＯｍＲ）及び水（ｌｄ）をアセトン溶液に
添加し、得られる溶液を、還流下で約１５時間加熱した
。
冷却後、水を添加し、沈澱した黄色の生成物を濾過で集
めた。
生成物をアコールに溶解し、ａ・！退役、濾液を水で希
釈し冷やした。得られた結晶質固体を濾過で集め、水で
洗浄後、窒素下で２５°Ｃの温度で乾燥した。その結果
、生成物である６−メドキシフエナリノンを約６ｇ得た
。赤外及び核磁気共鳴分光分析法により構造を確認した
。
工程２： ６−メトキシフェナリノン（６，３ｇ）と酢酸アンモニ
ウム（６０ｇ）を、薄層クロマトグラフィー（シリカ；
メタノール：酢酸エチル−３：２）で測定して出発物質
が存在しなくなるまで、氷酢酸（１５０ｍｌ）中におい
て還流下で加熱した。反応には、約１時間を要した。混
合物を、熱水で希釈して５００ｍＲとし、溶液を濾過し
た。濾液を飽和塩化ナトリウム溶液で処理後、メタノー
ル／水浴で冷却した。沈澱した色素を集め、アセトンを
用いて粉砕して副生成物である６−アミツフエナリノン
を除去する。残存する固形物を、メタノールで再結晶し
て化合物１（５ｇ）を得る。質量分光分析、核磁気共鳴
及び赤外分光分析法により構造を確認した。化合物■は
、蛍光効率０．１３でメタノール中において５７３ｎｍ
で励起したとき、約６２３ｎｍの波長で最大蛍光発光を
示した。
例２：１′　　ヒ人　■の−１「浩 上記した構造を有する蛍光化合物■を以下のようにして
製造した。
例１で説明した方法により製造した６−メドキシフエナ
リノン（５ｇ）の試料を、氷酢酸（５０ｄ）及びメチル
アミン（３０ｍｆ）を入れた開放容器中で加熱した。水
及び酢酸を、温度が１５０”Ｃに達するまで煮沸除去し
た。ビーカーにふたをした後、１７０°Ｃで約３時間加
熱を継続した。冷却後、水を添加して、粗生成物を沈澱
させ、その後、少量の氷酢酸を含有する熱水に溶解した
。得られた溶液を濾過し、濾液を塩溶液で処理して生成
物を沈澱させ、それを集めて、酢酸エチルにスラリー化
した。固形物を集め、メタノールで再結晶して化合物［
１（２，１ｇ）を得た。赤外及び核磁気共鳴分光分析法
により構造を確認した。化合物■は、蛍光効率０．４６
でエタノール中において５９６ｎｍで励起したとき、約
６１５ｎｍの波長で最大蛍光発光を示した。
例３：曾上入多■の一′【告 上記した構造を有する蛍光化合物■を以下のようにして
製造した。
６−メドキシフエナリノンの試料（２，１ｇ）、氷酢酸
（１０ｍｌ）及びベンジルアミン（１０ｇ）を、フラス
コ中で混合後、蒸気浴で２４時間加熱した。
薄層クロマトグラフィー（シリカ；メタノール：酢酸エ
チル−３：２）で測定してたところ、出発物質の存在は
認められなかった。
反応混合物を希水酸化アンモニウムで処理後、１−ルエ
ンで抽出した。１−ルエン溶液を、希薄食塩水で３回洗
浄後、乾燥濃縮した。得られた油状物をメタノールに溶
解し、２０％（ｖ　／　ｖ　）の水を添加後、溶液を冷
却した。その結果、生成物がロウ質固形物（２ｇ）の形
態で沈澱した。この物質を、メタノールで再結晶して、
化合物１１１（０，５ｇ）を得た。赤外、核磁気共鳴及
び質量分光分析により、化合物の構造を確認した。化合
物■は、蛍光効率０．４２でｐｌ＋７．５のリン酸緩衝
液中において５８９ｎｍで励起したとき、約６３４ｎｍ
の波長で最大蛍光発光を示した。
蛍光化合物■を、下記の方法でキノンキャリア成分に付
着させることにより、本発明の還元可能な化合物を製造
した。
（エエ） ６−メチルアミノ−Ｎ′〜メチル−１−ツェナリンイミ
ン（２，２ｇ）及び２，６−ルチジン（５ｍｆｌ）と乾
燥アセトニトリル（２００ｄ）との混合物を、０°Ｃに
冷却した。トルエン（１５ｄ）にホスゲンを１モル濃度
で溶解して調製した溶液を、迅速に添加し、混合物を室
温まで暖めながら、窒素下で６０分間攪拌した。混合物
を冷水で洗浄して過剰のホスゲンとルチジン塩酸塩を除
去後、硫酸マグネシウムで乾燥した。
３−（４−シアノフェニル）−２−ヒドロキシメチル−
５，６，７，８−テトラヒドロ−５，８−エクノナフト
キノン（３，２ｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（
０，１３ｇ）を、乾燥溶液に添加した。得られた混合物
を０°Ｃに冷却し、２．３゜４．６，７，８，９．１０
−オクタヒドロピリミド（１，２−ａ）−アゼピン（１
，６ｇ）で処理後、Ｏ′Ｃで２５分間攪拌した。次に、
少量の酢酸を添加し、氷冷加水で塩を洗い流し、溶液を
硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をロータリーエバポレ
ータで除去した。粗製還元可能な化合物をアセトニトリ
ルで再結晶して約１ｇの収量を得た。
約１７．２３％の固形物を含存するポリ（スチレンコー
ビニルベンジルクロリドーコーメタクリル酸）（モル比
：　５０／３０／２０）を製造した。メタノール（５ｇ
）に蛍光色素■をＯ，１２ｇ溶解して調製した色素溶液
を製造し、上記ラテックス（水９２ｇで希釈した）６ｇ
に添加した。混合物を１５分間攪拌後、メタノールを真
空下において６０°Ｃで除去して、１％色素／ポリマー
安定充填ラテックス分散液を製造した。
〔発明の効果〕
本発明の化合物は、被分析物が低濃度でしか存在しない
場合でも、迅速・高感度アンセイに使用することができ
る。本発明の化合物は、生物学的験体に見られるほとん
どの妨害物よりも一般的に非常に高い６００ｎｍ又はそ
れを超える波長で蛍光を発するので、分光妨害が避けら
れる。蛍光化合物は、キノンキャリアに容易に付着して
、被分析物の存在下で還元されると色素を放出する前駆
体を生成することができる。更に、蛍光化合物は、生物
学的験体染色するのにも使用でき、充填可能ポリマー粒
子に充填又は取り込んで、蛍光標識及び生物学的試薬生
成することができる。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. １．次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物．
  2. ２．不連続層及び水性層を有する充填可能ラテックス由
    来のポリマー粒子に組み込んだ次式▲数式、化学式、表
    等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を含
    んでなる蛍光標識。
  3. ３．不連続層及び水性層を有する充填可能ラテックス由
    来のポリマー粒子に組み込んだ次式▲数式、化学式、表
    等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を含
    む蛍光標識に結合した生物学的化合物を含んでなる蛍光
    標識化生物学的試薬。
  4. ４．　帯域の少なくとも一つに、不連続層及び水性層を
    有する充填可能ラテックス由来のポリマー粒子に組み込
    んだ次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を含
    む蛍光標識に結合した生物学的化合物を含んでなる蛍光
    標識化生物学的試薬を有する、分析及び診断法に有効な
    乾式分析要素。
  5. ５．　水性液中の特異的バインディングリガンドの測定
    方法であって、前記方法が、 （Ａ）前記リガンドの受容体の存在下で、前記液体試料
    を、不連続層及び水性層を有する充填可能ラテックス由
    来のポリマー粒子に組み込んだ次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を含
    む蛍光標識に結合した特異的バインディングリガンドを
    含んでなる蛍光標識化特異的バインディングリガンド類
    似体に接触させて、受容体と前記リガンド類似体との複
    合体を形成し、 （Ｂ）前記複合体を未複合化物質から分離し、（Ｃ）複
    合体又は未複合化物質のいずれか一方を、６００ｎｍ又
    はそれを超える波長において蛍光測定的に検出する、工
    程を含んでなる方法。
  6. ６．　水性液中の特異的バインディングリガンドの測定
    方法であって、前記方法が、 （Ａ）前記液体試料を、不連続層及び水性層を有する充
    填可能ラテックス由来のポリマー粒子に組み込んだ次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を含
    む蛍光標識に結合した前記リガンドの受容体を含んでな
    る蛍光標識化特異的バインディング試薬に接触させて、
    受容体と前記リガンドとの複合体を形成し、 （Ｂ）前記複合体を６００ｎｍ又はそれを超える波長に
    おいて蛍光測定的に検出する、工程を含んでなる方法。
  7. ７．　次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を包
    含し、ｐＨ値を９未満に緩衝化した水性組成物。
  8. ８．　（Ａ）生物学的験体を、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物を包
    含し、ｐＨ値を９以下に調整した組成物と接触させ、 （Ｂ）染色した物質を６００ｎｍ又はそれを超える波長
    において検出することを含んでなる生物学的験体を染色
    する方法。
  9. ９．　次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物由来
    の一価の蛍光成分であり、 Ｒ＾２及びＲ＾４はそれぞれ独立的に水素、置換若しく
    は未置換アルキル、置換若しくは未置換アリール又は電
    子吸引性基であり、 Ｒ＾５は置換若しくは未置換メチレンであり、Ｒ＾３は
    ▲数式、化学式、表等があります▼、水素、置換若しく
    は未置 換アルキル、置換若しくは未置換アリール、又は電子吸
    引性基であり、あるいはＲ＾３とＲ＾４が、一緒になっ
    て、置換若しくは未置換縮合炭素環を形成するのに必要
    な原子を表す〕で表される構造を有する還元可能な前駆
    体化合物。
  10. １０．　帯域の少なくとも一つに、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物由来
    の一価の蛍光成分であり、 Ｒ＾２及びＲ＾４はそれぞれ独立的に水素、置換若しく
    は未置換アルキル、置換若しくは未置換アリール又は電
    子吸引性基であり、 Ｒ＾５は置換若しくは未置換メチレンであり、Ｒ＾３は
    ▲数式、化学式、表等があります▼、水素、置換若しく
    は未置 換アルキル、置換若しくは未置換アリール、若しくは電
    子吸引性基であり、あるいはＲ＾３とＲ＾４が、一緒に
    なって、置換若しくは未置換縮合炭素環を形成するのに
    必要な原子を表す〕で表される構造を有する還元可能な
    前駆体化合物を有する、被分析物測定用乾式分析要素。
  11. １１．　（Ａ）ｐＨ９以下で、被分析物を含有している
    と思われる液体試料を、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ独立的に水素、アルキ
    ル、シクロアルキル、アリール若しくは複素環であり、
    又はＲ′は核と縮合環を形成する炭素若しくはヘテロ原
    子を包含する）で表される構造を有する蛍光化合物由来
    の一価の蛍光成分であり、 Ｒ＾２及びＲ＾４はそれぞれ独立的に水素、置換若しく
    は未置換アルキル、置換若しくは未置換アリール又は電
    子吸引性基であり、 Ｒ＾５は置換若しくは未置換メチレンであり、Ｒ＾３は
    ▲数式、化学式、表等があります▼、水素、置換若しく
    は未置 換アルキル、置換若しくは未置換アリール、若しくは電
    子吸引性基であり、あるいはＲ＾３とＲ＾４が、一緒に
    なって、置換若しくは未置換縮合炭素環を形成するのに
    必要な原子を表す〕で表される構造を有する還元可能な
    前駆体化合物と接吐させ、（Ｂ）被分析物が存在するこ
    とにより放出された蛍光色素を、６００ｎｍ又はそれを
    超える波長において定量する、工程を含んでなる被分析
    物の測定方法。
JP1172105A 1988-07-05 1989-07-05 フェナリンイミン蛍光色素並びに該色素の分析組成物、分析要素及び分析方法への利用 Expired - Fee Related JP2859893B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US215478 1988-07-05
US07/215,478 US5055414A (en) 1988-07-05 1988-07-05 Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0286661A true JPH0286661A (ja) 1990-03-27
JP2859893B2 JP2859893B2 (ja) 1999-02-24

Family

ID=22803140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1172105A Expired - Fee Related JP2859893B2 (ja) 1988-07-05 1989-07-05 フェナリンイミン蛍光色素並びに該色素の分析組成物、分析要素及び分析方法への利用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US5055414A (ja)
EP (1) EP0353868A3 (ja)
JP (1) JP2859893B2 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5055414A (en) * 1988-07-05 1991-10-08 Eastman Kodak Company Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical methods
JPH07509245A (ja) * 1992-07-20 1995-10-12 デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 新規化学発光化合物およびその使用方法
US6002000A (en) * 1992-07-20 1999-12-14 Dade Behring Marburg Gmbh Chemiluminescent compounds and methods of use
US7322927B2 (en) 1993-09-24 2008-01-29 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US6251687B1 (en) 1993-09-24 2001-06-26 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer and intramolecular energy transfer in particles using novel compounds
US5824799A (en) * 1993-09-24 1998-10-20 Biosite Diagnostics Incorporated Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US6238931B1 (en) * 1993-09-24 2001-05-29 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer in particles
US7083984B2 (en) 1993-09-24 2006-08-01 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US5605812A (en) * 1995-05-19 1997-02-25 Charm Sciences, Inc. Test kit and method for the quantitative determination of coliform bacteria and E. coli
CN106279184A (zh) * 2016-08-11 2017-01-04 长春海谱润斯科技有限公司 一种哒嗪类衍生物及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4283382A (en) * 1977-12-28 1981-08-11 Eastman Kodak Company Fluorescent labels comprising rare earth chelates
US4259313A (en) * 1978-10-18 1981-03-31 Eastman Kodak Company Fluorescent labels
NL8003141A (nl) * 1980-05-30 1982-01-04 Akzo Nv Biologisch aktieve tricyclische aminen.
US4592361A (en) * 1982-06-28 1986-06-03 The Johns Hopkins University Electro-optical device and method for monitoring instantaneous singlet oxygen concentration produced during photoradiation using pulsed excitation and time domain signal processing
US4803161A (en) * 1986-01-31 1989-02-07 Eastman Kodak Company Biological and analytical uses of phenalenone and benzphenalenone compounds
US5055414A (en) * 1988-07-05 1991-10-08 Eastman Kodak Company Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical methods

Also Published As

Publication number Publication date
JP2859893B2 (ja) 1999-02-24
EP0353868A3 (en) 1990-12-05
EP0353868A2 (en) 1990-02-07
US5055414A (en) 1991-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3098545B2 (ja) ビス−ジカチオンアリールフラン類を用いる核酸および細胞骨格成分の蛍光検出方法
US5238808A (en) Luminescent metal chelate labels and means for detection
FI93997B (fi) Homogeenisia fluorimetrisiä määritysmenetelmiä, joissa käytetään fluoresoivan taustan poissulkemista ja fluoroforeina vesiliukoisia harvinaisten maametallien kelaatteja
US4859777A (en) Terpyridine chelating agents
US5221605A (en) Luminescent metal chelate labels and means for detection
US8383830B2 (en) Cyanine compounds and their use in staining biological samples
EP1684808B1 (en) A reagent system and method for modifying the luminescence of lanthanide(iii) macrocyclic complexes
CA2118891A1 (en) Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
JPH0137693B2 (ja)
US5667975A (en) Method of fluorescent detection of nucleic acids and cytoskeleton elements using bis-dicationic aryl furans
JPH0286661A (ja) フェナリンイミン蛍光色素並びに該色素の分析組成物、分析要素及び分析方法への利用
JP4659213B2 (ja) エネルギー転移色素
CA2753596A1 (en) Non separation assays with selective signal inhibitors
KR20040105759A (ko) 신규 형광 표식 화합물
JPS62291549A (ja) 光安定性還元性化合物並びにそれを使用する分析組成物、要素及び方法
JPS62501648A (ja) 分析用組成物、分析要素及び分析方法
EP1038939B1 (en) Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same
JPH02501749A (ja) 電気化学的ルミネッセンス性レニウム　モイエティ及びそれらの使用方法
US5154887A (en) Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical compositions, elements and methods
CN111675674A (zh) 一种aie分子及其合成方法
JPS61138163A (ja) 発色性カップラー及び過酸化水素又は他の被分析物の測定へのその使用
JPH02103266A (ja) フェナレノンおよびベンズフェナレノン化合物を含む組成物並びに分析要素および分析方法
JPS62223147A (ja) 螢光染料ならびにその生物学的および分析学的使用
Song et al. Recent progress of crystalline porous organic frameworks as ratiometric fluorescence biosensing platforms
JP4465121B2 (ja) 新規のアミドピリリウム蛍光染料

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees