JPH02103266A - フェナレノンおよびベンズフェナレノン化合物を含む組成物並びに分析要素および分析方法 - Google Patents

フェナレノンおよびベンズフェナレノン化合物を含む組成物並びに分析要素および分析方法

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JPH02103266A
JPH02103266A JP1215138A JP21513889A JPH02103266A JP H02103266 A JPH02103266 A JP H02103266A JP 1215138 A JP1215138 A JP 1215138A JP 21513889 A JP21513889 A JP 21513889A JP H02103266 A JPH02103266 A JP H02103266A
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ブルース　エドワード　バッブ
Robert Troconis Belly
ロバート　トロコニス　ベリー
Albert J Mura
アルバート　ジョセフ　ムラ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バイオメディカルの研究および臨床化学に有
用な組成物並びに分析要素及び分析方法に関する。
以下余白 〔従来技術〕 一つの型のものを他の型のものと区別するかまたは更に
観察可能にするために、染料（又は色素、以下同じ）、
特に螢光染料で生物学的組織および細胞を染色すること
は当該技術においてよく知られている。電磁スペクトル
の赤領域において螢光を発する染料は特に望ましい。あ
る種のフェナレノン化合物は、Ｃｏｏｋ他によってＴｈ
ｅ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎＪ、Ｃｈｅ＋ａ、　、　１１
　、　ｐｐ、２３０−２３５（１９５８＞に、および５
ｏｌｏｄａｒ他によってＺＩ＋ｕｒｎａｌ　Ｏｒｇａｎ
ｉｃｌ＋ｅｓｋｏｉ　Ｋｈｉ＋ｎｉｉ、１６．ｐｌ）。
１０６２−１０６４（１９８０）に記載されているが、
その化合物の用途は記載されていない。
さらに、水、牛乳および生物学的液体の如き液体の化学
分析が、健康維持および診断上の注意のためにしばしば
望ましいか必要である。このような分析を容易にするた
めの種々の組成物および要素が知られている。このよう
な組成物および要素には、一般に、検体として同定され
る分析における物質を測定するための試薬組成物が含ま
れている。検体は、微生物または酵母細胞の如き生きて
いる有機体または生きていない化学物質であり得る。試
薬組成物は検体との相互作用により、検出し得る変化（
例えば染色生成）を与える。
最近、多くの研究が全血、血清、血漿、尿および類似物
の如き生物学的液体の迅速かつ多量の診断的または臨床
的分析に有用な組成物および要素を開発することを指向
している。
例えば、伝染性疾病の迅速かつ効果的詮所および処置の
なめに、疾病を引き起こすバクテリアを出来るかぎり迅
速に検出できることが望ましい。
泌尿器系の伝染は最も一般的な細菌性疾病の一つであり
、第２はしばしば呼吸器系の伝染である。
多くの泌尿器系伝染は、重大な細菌尿症と見られる状態
で尿ｌＩｎ１当り１００，０００またはそれ以上の有機
体の細菌数を伴なう。
還元剤の存在下で還元されて検出し得る染料を与える多
くの（ヒ合物が知られている。例えは、このような化合
物の多くのものは写真プロセスで有用である。しかしな
がら、このようなプロセスは高いｐＨ５一般に１０より
高いｐＨて行なわれ、そのようなｐＨでは多くの分析的
測定は成功裡に行うことができない。
蛍光染料を使用する分析的測定は、色度染料を使用する
ものよりも高感度であることが一般に知られている。種
々の螢光検定が開発されており、その多くは蛍光染料と
してクマリンまたはアンベリフェロン（ｕ＋ｎｂｅｌ　
ｌ　１ｆｅｒｏｎ）誘導体を使用するものである。いく
つかの蛍光染料は高ｐＨ（９より大）でのみ使用するこ
とができる。これらは、一般により低いｐＨで行なわれ
る生物学的検定では使用することができない。更に、ク
マリンまたはアンベリフェロン染料は、スペクトル干渉
が著しい波長、即ち５００ｎｍより低い波長で螢光を発
する。この特徴は生物学的検定における有用性を更に制
限する。
最近、改良された蛍光アンベリフェロン誘導体が記載さ
れ（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｕ　ｌ　ｌ　、
Ｃｂｅ＋ｎ、５ｏｃＪａｐａｎ、　５８　：　７３１．
１９８５）　、および酸ホスファターゼ検定に使用され
ている　（八ｎａ１．Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、、１４３　：
１４６、１９８４）。これらの染料のあるものは、約６
のｐＫａ値を有し、５９５ｎｍ（ｐＨ９）で蛍光放射を
有すると報告されている。
〔発明が解決すべき問題点〕
しかしながら、従来の染料は、５００　ｎ　＋ｎ　Ｌ′
Ｊ下、即ちヘモグロビンおよびビリルビンの如き成る種
の血清成分が強いスペクトル吸収を有する同し範囲内で
吸収を示す（一つの染料はｐＨ９で５０５で吸収する）
。従って、このような染料を使用する検定はスペクトル
干渉を受ける。
〔問題点を解決する方法〕
これらの問題は、染色剤（ａｔａｉｎｉＢ　ａｇｅｎｔ
）として、式 （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノ又
はそれらの塩である） のいずれかで表わされる置換または非置換蛍光化合物を
有する細胞染色組成物（ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇｃ
ｏ＋ｎｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって克服される。
即ち、本発明に従えば、構造式ＣΔＲ−（−Ｒ’）。
（式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
ノン核であり、Ｒ１は上記の式中Ｒはヒドロキシ、メル
カプトもしくはアミン又はそれらの塩である化き物の一
つから誘導される螢光部分がらなり、ｎは１または２で
ある）によって表わされる還元性化合物からなり、該還
元性化合物がｐＨ９またはそれ以下で還元されて螢光部
分を放出し得るものであり、さらにＲ１がＨて置換され
た時ＣＡＲ＋Ｈ＞。が水中で測定した時少なくとも約＋
１００＋ｎＶのＥ、７□を有するものである組成物も提
供する。本発明に従った、さらに検体を測定するための
乾式分析要素は、上記の還元性化合物を含む。
本発明は、更に、 Ａ、ｐＨ１９またはそれ以下で、検体を含むと思われる
液体の試料を上記還元性化合物と接触させる工程、およ
び、 Ｂ、該化合物が検体の存在の結果として還元された時放
出される蛍光部分を検出する工程からなる検体の分析方
法を提供する。
以下系臼 〔実施態様〕 本発明を実施する際に有用な螢光化合物は、式〔式中、
Ｒはヒドロキシ、メルカプトまたはアミン（ＨＮ（Ｒ１
）−、］　またはそれらの塩（即ち、例えば塩酸塩、硫
酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロゴレートマたＩｄ、
ｐ−トルエンーヌルホネートの如キ酸垣）である〕 のいずれかによって辰わされる置換または非置換の７エ
ナレノンまたはベンズフェナレノン染料である。Ｒ１は
水素、置換もしくは非置換アルキル（好ましくは、例え
ばメチル、インプロピル、ヘキシル、ベンジルモジくハ
クロルベンソルノ如キ炭素原子１〜１０個のもの〕、置
換もしくは非置換シクロアルキル（好ましくは、例えば
、ンクロ被ンチルもしくはシクロヘキシルの如き炭素原
子５〜１２個のもの）、置換もしくは非置換フェニル（
例、ｔＪｆｐ−アルキルフェニル）、または置換もしく
は非置換へテロサイクリック成分（例えばビリノル、チ
エニル）である。好ましくは、ＲはヒドロキシまたはＲ
１が水素または置換もしくは非置換の炭素原子１〜３個
の低級アルキルであるアミンである。
本発明において有用である代表的螢光化合物にが含まれ
、化合物１および■が特に有用である。
これらの化合物全調製する方法を次に述べる。ベンゾ７
工ナレノン化合物■および■は新規な染料である。
これらの化合物は、式中に特に示したもの以外の１個ま
たはそれ以上の置換基を該置換基がその螢光性またはｐ
Ｋａ値に不利に影響しない限り、融合環の１個またはそ
れ以上の位置において有し、その置換基には、置換また
は非置換アルキル（好ましくは、例えばメチル、エチル
またはベンノルの如き炭素原子１〜１２個のもの〕、置
換または非置換ヒドロキシアルキル（好ましくは、例え
ばヒドロキシメチルまたは２−ヒドロキシエチルの如き
炭素原子１〜１２個のもの）、置換または非置換アルコ
キシカルボニル（好ましくは、例えばメトキンカルボニ
ルまたはエトキシカルボニルの如き炭素原子２〜１２個
のもの）、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、またはブロ
モ９、シアン、カルビキシ、アンノペ置換または非置換
アリールスルホニル（好マしくは、例えばフェニルヌル
ホニル寸たはトリルヌルホニルの如き炭素原子６〜１０
個のもの９、置換または非置換アルキルヌルホニル（好
ましくは、例えばメチルスルホニルまたはエチルスルホ
ニルの如き炭素原子１〜６個のもの）、および当業者に
知られている他の置換基が含まれる。
上記の化合物ｌおよび■は、例えばＣｏｏｋｅ　ｅｔａ
ｌ、Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、、１１．
ｐｐ、２３０−２３５（１９５８）および５ｏｌｏｄａ
ｒ　ｅｔ　ａＬ　ＺｈｕｒｎａｌＯｒ　ａｎｉｃｈｅｓ
ｋｏｉ　　Ｋｈｉｍｉｉ　　１６（５入ｐｐ、１０６２
−１０６４（１９８０）に記載されたようにして調製で
きる。
上記の新規化合物ｍおよび■は下記実施例２および３に
記載した方法によって調製できる。
本発明において有用である螢光化合物は、非緩衝または
緩衝水溶液中で保存して使用することができる。好まし
い化合物１および■はその水溶性のために緩衝水溶液と
して保存され使用される。
さらに、化合物■および■はそのアミン塩に転換し得、
塩は水溶液として保存し使用することができる。組成物
は一般に、ｐＨ９またはそれ以下で１種またはそれ以上
の適当な緩衝剤によって緩衝される。有用な緩衝剤は、
当業者によって容易に決定され、ホスフェート、ボレー
トおよびＧｏｏｄ　ｅｔａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　５．４６７（１９６６）およびＡｎａｌ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、　１０４．３００（１９８０）に報告され
たような有機緩衝剤を含む。組成物は好ましくはｐＨ６
，５〜８に緩衝される。
本発明の一実施態様において、螢光化合物は生物学的試
料、例えば組織および細胞を染色するために、および細
胞学用に使用し得る。
他の実施態様において、螢光化合物は染料前駆体を形成
するためにブロックされ得る。ブロックされた時、この
化合物は担体（下に記す〕に付着された時と同様に転移
性（ｓｈｉｆｔａｂｌｅ）である。
ブロックされた染料は、検定の間にブロッキング基から
螢光染料を放出するような適当な処理または条件に賦さ
れ得る。例えば染料前駆体は、検体または他の試薬によ
って化学的、加水分解的または酵素的に作用され得る。
更に他の実施態様において、螢光成分は還元性化合物か
ら放出される。還元性化合物に付いている間、螢光部分
は、それが放出された時に示す吸収および放射スペクト
ルとは異なった吸収および放射スペクトルを有する。放
出時の放射スペクトルは一般により長い波長、即ち少く
とも５８０　ｎｍである。
さらに特に、本発明において有用な還元性化合物は、構
造式ＣＡＲ（−Ｒ’　）ｎ（式中、ＣＡＲ−は置換また
は非置換の芳香族またはキノン核を表わし、Ｒ１は上記
螢光部分からなり、ｎは１または２である）を有する、
このような核の例は次に示される。さらに、Ｒ１がＨに
よって置換された時、ＣＡＲ（−Ｈ）ｎは水中で測定し
た時少くとも＋１００ｍＶの還元電位（Ｆ、Ｖ２）を有
する。このＥ１／２値は、生理学的ＰＨ（９またはそれ
以下）での化合物からの転移性検出可能な種の還元およ
び続く放出を容易にする。
この上うなＩｊｌｌ］定は、示差パルスポーラログラフ
ィまたはサイクリックボルタメトリー（ｃｙｃｌｉｃｖ
ｏｌｔａｍｅｔｒｙ）のいずれかを使用する標準の電気
化学的技術によってなされる（例えば、Ｓａｗｙｅｒａ
ｎｄ　　Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊｒ、、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｆ
ｏｒ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５
ｏｎｓ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７４参照〕。好ましくは、Ｅ
ｙ、は水中で測定して＋１００ｍＶ〜＋４００ｍＶであ
る。更に、膓副足の詳細は、第１表の前に記載されてい
る。望ましいＥｙは、ＣＡＲ−核上の適当な電子吸引性
基または核に付いている融合環と電子吸引性基との組合
せによって達成される。
有用な還元性化合物の例を次に示すが、本発明を限定す
るものではない。
本発明の一実施態様において、還元性化合物は、Ｖａｎ
　ｄｅ　５ａｎＬ１．Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎ
ｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ。
２２、　ｐｐ、１９１〜２０９（１９８３）および米国
特許第４．２３２，１０７号に記載されていると同様に
還元されてキノンメチド（ｑｕｉｎｏｎｅｍｅｔｈｉｄ
ｅ）生成の間に検出可能な種を与えるが、望ましいＥ１
／！性質を有する。
他の実施態様において、有用な還元性化合物には、上記
Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅ文献の２０６頁に記載されて
いるものと同様のスルフィルイミｒおよび２ルフェニル
スルホンアミドが含まれるが、望ましいＥｙ性質を有し
ている。
好ましい実施態様において、還元性化合物は生理学的Ｆ
ＩＨで分子内求核置換が起こり、求核基が化合物の少く
とも１個の電子の減少によって発生した時、１個はそれ
以上の螢光部分を放出し得る。
換言すれば、このような置換は化合物が適当な還元剤で
還元される時生じる。写真技術で使用される多くの類似
のベンゾキノン化合物上のこれらの化合物の区別は、本
発明で有用な化合物がより高いＥ１／２値を有しており
それによって化合物の還元とそれに続く螢光部分の放出
を容易にすることである。この放出は非常に効果的であ
り、大部分の化合物にとって、少くとも５０％の螢光部
分は約ＰＨ７において３０分以内に放出される。ここに
記載された化合物は、螢光部分全迅速に放出し、迅速検
定に許容されるため特に有用である。類似の写真用化合
物はより低いＥＶ２値を有しており、高いｐＨ（１３〜
１４）でのみ染料を放出するか、または写真用ＰＨで非
常に非効率的に（即ちゆっくり）染料を放出する。
「分子内求核置換（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｎ
ｕｃｌｅｏ　−ｐｈｉｌｉｃ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎ
す」の語は、分子上の求核中心が分子内の他のサイトで
反応し、そのサイトは求電子中心であり、求電子中心に
付いている基または電子の置換を効果的にする反応を意
味する。
一般に本発明において有用であり、ここではＲＩＮＤ化
合物とされるこのような化合物は、分子の三次元立体配
置に極めて近接して並んでいる求核基と求電子基を有し
、それによって分子内反応が生じ、４〜７原子を有する
環が生成する。
求核置換の速度はＢＩＮＤ化合物の還元の前は実質的に
零である。これによって、ＲＩＮＤ化合物は還元の前は
安定である。
特に有用なＲＩＮＤ化合物は、構造式ＣＡＲ−Ｒ”であ
ｇ、　Ｒ１，は（Ｒ”　才Ｎ−Ｑ−ＦＲＡＧであり、ｍ
はＯまたは１である〕 を有するものである。Ｒは置換または非置換アルキレン
、好ましくは主鎖に炭素原子１または２個のもの（例え
ば、メチレン、エチレンまたはアルコキシメチレン〕で
ある。最も好ましくは、Ｒはメチレンである。Ｑはカル
ボニルまたはチオカルボニルであり、好ましくはカルボ
ニルである。
Ｒ６はメチルである。
ＦＲＡＧは置換または非置換フェナレノンまたはベンズ
フェナレノン化合物から誘導される上記定義の如き螢光
部分である。この種は、存在する還元剤の量に直接関係
し得る量で放出される。
ＦＲＡＧは、ＦＲＡＧの一部である二価の単原子結合に
よる一重結合によりＱに結合している。好ましくは、こ
の単原子結合はオキシまたはチオであり、最も好ましく
はオキシである。
上記キノン構造におけるＲ　、ＲおよびＲは、独立に、
水素、炭素原子１〜４０個の置換または非置換アルキル
（例えば、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキ
シメチル捷たはベンジル〕、置換または非置換アリール
（例えば、フェニル、ナフチル、メチルナフチル、ｐ−
ニトロフェニル、ｍ〜メトキシフェニルまたはフェニル
ヌルホンアミド）または、一般に正の７・メットングマ
値（Ｈａｍｍｅｔｔ　ｓｉｇｍａ　ｖａｌｕｅ）、好ま
しくは、００６よりも大きいシグマ値を有する電子吸引
性基である。ハメットシグマ値は、例えば、５ｔｅｒｉ
ｃＥｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、Ｉｎｃ
、、１９５６．ｐｐ、５７０〜５７４およびＰｒｏｇｒ
ｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ。
ｖｏｌ、　２．　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ、１９６４゜ｐｐ、３３３〜３３９に記載
されている標準的方法に従って算出される。正のハメッ
トシグマ値を有する代表的電子吸引性基には、ンアノ、
カルボキシ、ニトロ、ハロ（例エバフルオロ、フロモ、
クロロまたはヨード）、トリハロメチル（例えば、トリ
フルオロメチルまたはトリクロロメチル）、トリアルキ
ルアンモニウム、カルボニル、カルパモイル、スルホニ
ル、ヌルファモイル、エステルおよび当該技術で知られ
ている他のものが含まれる。
好ましい電子吸引性基には、ｐ−ニトロフェニル、ｍ−
ニトロフェニル、ｐ−シアノフェニルおよび２．５−ソ
クロロフェニルが含まれる。メター位にメトキシ基また
はアセタミド基を持つアリール基もまた有用である。
Ｒ３はまたＲ１であり得、それによって、潜在的に２＝
１の螢光部分分子の最初のＲＩＮＤ化合物分子に対する
モル比を与える。
或いは、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、キノン核に付
いた置換または非置換融合力ルゴサイクリック環を完結
するために必要な炭素原子を表わし得る。例えば、この
ような環（モノ−またはビサイクリック〕は、主鎖中に
炭素原子４〜８個、好捷しくけ５〜７個を有し得る。
代表的なＲＩＮＤ化合物は、次の構造式を参照して下記
第１表に表示される。第１表におけるＥＩＡ値は の代わりに水素原子を有するこの構造のキノン核、即ち
、 について測定された。Ｅ１／２値はＮ、Ｎ−ツメチルホ
ルムアミド、ノニオン界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−
１００）およびナトリウムホスフェート緩衝剤（ＰＨ７
，１中に溶解したキノンの水性エマルジョン中で測定し
た。標準水素電極を基準として使用した。
以下金白 本発明において有用なＲＩＮＤ化合物は、一連の個々に
公知の反応を使用して調製される。−船釣に、一連の調
製には、次の一般的工程、即ち、（１）を換ヒドロキノ
ンの調製、（２）オキサノン環の形成、（３）オキサジ
ン環の開環、（４）カルバモイルクロライドの調製、お
よび（５）　ＦＲＡＧ成分とカルバモイルクロライドと
の反応が含まれる。代表的調製は下記ｆｉ例４および５
で与えられる。
本発明の実施に有用な他のＲＩＮＤ化合物には、適当な
ＥＶ２値と構造式ＣＡＲ＋Ｒ’）ｎを有するものが含ま
れる。この構造式において、 （１）　　ＣＡＲ−は１，２−ナフトキノン、１，２−
１．４−または９，１０−アンヌラキノン、４，４′−
ノンェノキノン、アズロキノンまたは１．６−（１０）
アヌレノキノンの置換捷たは非置換核であり、Ｒ１は核
に、炭素原子１個離れて、または核の１個のオキソ基か
らペソ位に付いている。核は、１個またはそれ以上のＲ
２について上記した如き電子吸引性基で置換されるか、
または１個もしくはそれ以上のＲ５およびＲ４について
上記した如き融合環を有していてよい。Ｒは上記定義し
た 数である。
（２）　　ＣＡＲ−は であり、そのいずれかは、Ｒ２、Ｒ３およびＲについて
上記定義した１種またはそれ以上の電子吸引性基で置換
されることができ、Ｒ１は上記定義しま た＋ＲｑＮ−Ｑ−ＦＲＡＧ　であり、ｎは１丑たば２で
ある。
（３）　ＣＡＲ−は構造式 〔式中、Ｒ７は炭素原子１〜２０個の置換捷たは非置換
アルキル（例えば、メチル、エチル、メトキシメチル、
イングロビル、ドデシル、ヘキサデンルまたはオフタデ
シルクである〕 の置換または非置換ニトロベンゼノイド核であり、Ｒ１
は上記定義した＋Ｒ”　＋−Ｎ−Ｑ−ＦＲＡＧであり、
ｎは１である。
一般に、ここに記載した還元性化合物は限定された水溶
解性を有している。このため、これらを水性環境で使用
する時、使用に先立って化合物の分散液を、例えば被覆
配合で調製することが最も良い。このような分散液は、
一般に、還元性化合物、水性緩衝溶液および界面活性剤
かまたは該化金物用の水混和性有機溶剤のいずれかまた
は両者からなる。
本発明を実施するに有用である界面活性剤には、化合物
の還元を抑制しないいかなる界面活性剤も含まれる。一
般に、生きている細胞の検出のために有用な界面活性剤
は、例えばアルキルアリールポリエトキンアルコール、
ｐ−アルキルアリールオキシポリグリ／ドール、および
当業者に公知の他のものを含むノニオン界面活性剤であ
る。
有用な水混和性有機溶剤にはアルコール、Ｎ、Ｎ−ツメ
チルホルムアミド、ツメチルスルホキシド、アセトニト
リル、ヘキサメチレンホスホルアミドおよび当業者に公
知の他のものが含まれる。特定の還元性化合物のために
使用される特定の溶剤は、日常の実験によって容易に決
定できる。
分散液は、下記臭流例４および５で示した様な調製の特
別の詳細を伴なった次の一般的方法によって調製できる
。還元性化合物を、その分子量に依存するが、−船釣に
溶剤１　ｍｉ当り１〜１０Ｃ１９、好筐しくけ５〜８０
ｍ９の濃度で水混和性溶剤に溶解する。得られた溶液を
次いで適当な界面活性剤と、分散液１ｍ／！当り界面活
性剤が一般的にはＯ１〜２４ｍ９、好ましくは０５〜１
０ｍ９である量で混合する。この調製は一般的に室温で
行なわれる。
これらの分散液には、生理学的ｐＨ（９またはそれ以下
）を維持するために有効な量で緩衝剤が含まれる。分散
液中の緩衝剤の濃度は広範囲に変えることができるが、
−船釣には０．０１〜０５モル磯度である。代表的緩衝
剤については前に記載しである。
ここに記載した還元性化合物は、水性および非水性液体
、例えば生物学的流体、製造工程、廃液、食料品等の分
析的測定用の組成物に有用である。
測定は、化合物の還元および螢光部分の放出をもたらす
単独の反応または一連の反応を経て種々の検体について
なされる。種々の検体には、生きている細胞（例えば、
バクテリア、酵母、白血球、または菌類）、酵素（例え
ば、す・ぞ−ゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクテート
オキンダーゼ、クレアチンキナーゼ、α−グリセロホス
フェートオキシダーゼ、ラクテートデヒドロケ゛ナーゼ
、ピ／ｌ／　ヘ−トデヒドログナーゼ、グルコ−クー６
−ホヌフエートデヒ１口グナーセ゛、アラ二ノアミント
ランスファラーゼ、アク−９ルテートアミノトランスフ
アラーゼ、およびデヒドロゲナーゼまたはりダクターゼ
酵素を含む他のＮＡＤＨヘーヌ、ＦＡＤＨベースまたは
オキシダーゼペーヌの検定〕、生きている細胞以外の生
物学的または化学的還元剤（例工ば、アスコルベート、
シヌティン、グルタチオンまたはチオレドキシン）、新
陳代謝性物質（例えば、グルコース、ラクチン酸、トリ
グリセライドまたはコレヌテロール〕、免疫反応剤（例
えば、抗原、抗体またはハプテン〕が含まれる。
該組成物は、（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ）−１（ＦＡＤ−ＦＡ
ＤＨ，）−および（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰＨ片ペーヌの反
応を含むフラビン結合のデヒドロゲナーゼおよびオキシ
ダーゼ全モニターするために使用できる。このような例
においては、還元性化合物は、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨまた
はＮＡＤＰＨの代わりに螢光染料を与えるために使用で
きる。
ここに記載した還元性化合物は、生物学的試料中の生き
ている細胞を検出または定量するのに特に有用である。
生きている細胞を持っていると考えられるいかなる生物
学的試料（例えば、食料、組織、地下水、冷却水、製薬
Ｎ品または下水）も本発明によってバクテリア、酵母、
菌等について分析できるけれども、本発明は特に、人お
よび動物の流体（例えば、尿、脳背髄液、血液および便
分泌１（ｓｔｏｏｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）の如き類
似物９および人または動物の細胞の懸濁液の如き水性液
体中のバクテリアの検出に有用である。本発明の実施は
、尿（稀釈または非稀釈）中の尿路病原菌の検出用に特
に重要である。
還元性化合物を使用して生きている細胞を測定する時、
生きている細胞が電子移動剤（ここではＰＴＡとするつ
と作用することが迅速な染料放出のために好ましい。Ｅ
ＴＡの存在は、生きていない検体の分析的θり定のため
に、さらに効果的な染料放出をもたらす。ＥＴＡは決定
される物質（例えば生さている細胞）と還元性化合物と
の間の媒介体として作用する移動性化合物（ｍｏｂｉ　
ｌｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）　　である。
一般に、本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、ＰＡＲ
電位差安定器（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）（Ｐｒｉｎ
ｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐｒ
１ｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）ノ付いた示差
パルヌポーラログラフ技術を使用して水性緩衝剤（ｐＨ
７）中で測定したとき標準水素電極に対して−３２０〜
＋４００ｍＶ　　の範囲のＥ１／２を有する。一般に、
ＥＴＡの電位は検体の電位よりも大きい正であり、ＲＩ
ＮＤ化合物の電位よりも小さい正であるべきである。即
ち、ＥＴＡは検体よりも大きく容易に還元され、還元性
化合物よりも小さく容易に還元されるべきである。ＥＴ
Ａは一般に検体の濃度に依存する濃度で、好ましくはＩ
　Ｘ　１０−３〜１×１０　モル濃度で存在する。
本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物には、ツェナノンメ
トサルフェート、ツェナノンエトサルフェートおよび当
業者に公知の類似化合物が含まれる。
異なったＰＴＡ化合物の組合せが所望に応じて使用され
得る。
さらに低いパックグランドの有利性金与える本発明の実
施に有用な好ましいＥＴＡ化合物は置換べンゾーおよび
ナフトキノン類である。例には、２．３−ツメチル−５
−ヒドロキシメチル−１，４−ベンゾキノン、２．５−
ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３．５−　）
ツメチル−１，４−ベンゾキノン、２．６−ノメトキシ
ー１，４−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメチル−１，
４−ナフトキノンおよび２−（２−ヒドロキンエチル）
　−１，４−ナフトキノンが含まれる。
生きている細胞、特にバクテリア細胞の測定は、しばし
ばこれら細胞の栄養分の存在下で行なわれる。有用な炭
素源および任意に窒素源を含むいかなる栄養媒体も使用
し得る。適当な成分とＰＨを有する適切な栄養媒体は当
該技術においてよく知られている。
本発明は溶液または乾式検定に適用できる。溶液検定に
おいて、還元性化合物と好ましくはＥＴＡとを含む溶液
（または水性懸濁Ｆｌｉ、）を調製し、測定すべき生き
ている細胞または検体を含む液体試験試料と混合によっ
て接触させる。ＥＴＡは、還元性化合物と混合する前に
試験試料と混合することもできる。一般に還元性化合物
は適当な容器（例えば、試験管、ベトリ皿、ビーカー、
キーペットまたは試験装置〕内で、試験試料と混合する
。得られた溶液をゆっくり混合し、４０℃までの温度で
比較的短時間培養する。試験試料は次いで、適当な検出
装置で得られた螢光染料を測定して評価する。
溶液検定は、試験試料を含む多孔吸収材、例えば紙片を
、還元性化合物の分散体と接触させることによって行な
うこともできる。試験試料中の検体は多孔材料から分散
液に移動し、測定のために必要な分析的反応を開始する
。溶液検定において、存在する還元性化合物の量は、少
なくとも０．００１、好ましくは０．０１〜１０ミリモ
ル濃度である。他の反応剤は、当業者によって容易に決
定される量で存在させることができる。
代わりに、本発明の方法は乾式分析要素と共に実施する
ことができる。このような要素は吸収性担持物質、即ち
、濾過紙または片の如き自己支持性吸収材または吸水物
質の薄いシートまたは片であり、これは還元性化合物ま
たは還元性化合物からなる分散媒の乾燥残渣を含有する
。このような要素は、試験片、診断用要素、浸漬棒、診
断試剤および類似物として当該技術で公知である。
乾式分析要素中で使用される時、ここに記載した還元性
化合物は適当な吸収性担持物質に吸収または浸透によっ
て導入するか、または適当な吸収性担持物質上に被覆す
ることができる。その代わりに、これらは検定の間に要
素に導入することもできる。有用な担持物質は、不溶性
であり、水または、尿または血清の如き生理学的液体と
接触させた時その構造的形態を維持している。有用な担
持物質は紙、多孔性微粒子構造体、セルロース、多孔性
重合体フィルム、木材、ガラス繊維、織物および不織物
（合成および非合成りおよび類似物から調製される。
乾式検定は、その上に吸収性担持物質の如き少くとも１
種の多孔性の展開帯域を有する支持体からなる分析的要
素で、特に■利に実施することができる。還元性化合物
は、展開帯域または異なる帯域（例えば反応試剤帯域、
記録帯域または親水性帯域）中にある。展開帯域は、適
当な繊維性または非繊維性物質またはそれらの単独また
は両者の混合物から調製され得る。
該展開帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号に記載
されているような適当な接潴剤物質と混合するか織物に
編織した繊維物質、米国特許第３゜９９２，１５８号、
同第４，２５８，００１号および第４，４３０．４３６
号および日本特開昭５７（１９８２）−１０１７６０号
に記載された接着剤を有するかまたは有しない重合体組
成物または微粒子物質を使用して調製できる。展開帯域
は等方性の多孔性即ち、多孔度は、微粒子、繊維または
重合体ストランド間で連結された空間または孔によって
作られるように該帯域内で各方向において同一であるこ
とが望ましい。
本光明の乾式分析要素は、還元性化合物および特定の用
途のための他の所望の試剤を含む単独の自己支持性吸収
性担持物質であってよいが、好ましくはこのような物質
は適当な非孔性支持体上に担持される。このような支持
体は適当な方向的に安定であり、好ましくは２００〜９
００　ｎｍの範囲の波長の電磁放射線を通す透明のフィ
ルムまたはノート材料である。特定の要素のために選択
される支持体は、検出の指向する方式と適合し、検定に
使用される化学試剤および液体試料に対し不活性である
べきである。有用な支持体材料には、２リスチレン、ポ
リエステル、ポリカービネートおよびセルロースエヌテ
ルが含まれる。
要素は、１個以上の帯域、例えば試薬帯域、記録帯域ま
たは下塗り帯域を有する。これら帯域は一般に互に流体
接触しており、流体、試薬および反応生成物は隣接する
帯域の重なった部分の間を通過し得ることを意味する。
好ましくは、２個またはそれ以上の帯域は単一層内に位
置し得るけれども、帯域は別々に破覆され重層された層
である。
上記の特許の他に、適当な要素形態および成分は、米国
特許第４．０４２，３３５号および米国再発行特許第３
０．２６７号にも記載されている。
本発明の要素において、還元性化合物の量は広範囲に変
えることができるが、−船釣には少くとも０．０１９７
ｍ２、好ましくは０．０５〜０．２９７ｍ２の被覆量で
存在する。任意の試薬は一般的に次の被覆量で存在する
。
ＥＴＡ　ニ一般に少くともＯ，ＯＯ１９／ｍ２、好まし
くは００１〜１り７ｍ２、 栄養分ニ一般に少くとも０．０５９７ｍ２、好ましくは
０．１〜２ノ／ｍ２、 緩衝剤（ＰＨく９）ニ一般に少くとも０．１９７ｍ２、
好ましくは０５〜２り７ｍ２および 界面活性剤ご一般に少くとも０．１９ｉ／ｍ２、好まし
くは０２〜５ノ／ｍ２ １個またはそれ以上の帯域には、特別の検体の検定に必
要な試薬と同様に、当該技術で公知であるような、活性
化剤、バインダー（−船釣に親水性）、カプラー溶剤等
々を含む種々の他の望ましい、しかし任意成分を含有さ
せることができる。
本発明の一実施態様において、水性液体中での微生物の
検出用の要素は電子移動剤（ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎ
ｓｆｅｒ　ａｇｅｎｔ）と還元性化合物からなり、この
両者は前記した通りである。これらの要素には、また、
生きている細胞のための栄養素および検定の間生理学的
ＰＨを維持する緩衝剤（例えば試験液体の試料１〜２０
０μｌと接触させる時９が含まれることが望ましい。こ
のような要素は、例えば尿試料（還元する妨害物質を除
くために前処理される）中のバクテリアを、試料と要素
を適当な方法で物理的に接触させ、５９０　ｎｍより大
きい適当な波長で、バクテリアの存在の結果として還元
性化合物から放出される螢光染料を検出することによっ
て検出するために使用できる。
本発明の他の実施態様において、要素は水性液体中で生
きていない生物学的または化学的検体の測定のために使
用され、検体との相互作用により螢光染料を与え得る相
互作用組成物からなる。この組成物は、染料を与えるた
めに還元された時螢光染料を放出する還元性化合物およ
び任意的に、ＥＴＡ、ノニオン界面活性剤および検定の
間中生理学的ｐｉ（を維持する緩衝剤からなり、これら
の全ては既に記載した通りである。このような検体の例
は前に記載されている。該要素には、還元性化合物の還
元に有効な適当な試剤を有する相互作用性組成物が含ま
れる。検出される螢光染料の量は、液体試料中に存在す
る検体の量に相互関係している。検定の前の、妨害物質
を除くかまたは細胞を濃縮するだめの前処理が望ましい
。
本発明の要素は、また、アヌコルベート（アスコルビン
酸とアルカリ金属塩）、システィン、グルタチオン、チ
オレドキシンおよび類似物の如き他の還元剤を測定する
ために有用である。
検定の方法に依存して種々の異なった要素が本発明に従
って調製できる。要素は、所望の幅の長いテープ、ノー
ト、スライドまたはチップを含む種々の形に形成できる
。
本発明の検定は手動または自動でできる。一般に、乾式
要素を使用する際に、検体または生きている細胞測定は
、供給ロール、チップ包みまたは他のソースから要素を
＠す、試験すべき液体試料と接触させ要素中で試薬と混
合することによって行なわれる。このような接触は、い
かなる適当な方法、例えば要素を試料中に浸漬するかま
たは適当な調剤器を使用し、１滴またはそれ以上の簡の
の試料で手または機械で要素にスポット付けすることに
よって達成される。
試料を付けた後、要素は培養、加熱または類似の如き条
件下におき、これによって試験結果を迅速化するかまた
は容易にする。
検体または生きている細胞の検出は、還元性化合物が還
元され適当な方法で検出し得る螢光染料を放出した時達
成される。測定は染料の最大波長または最大波長以外の
波長ですることができる。
次の実施例において、中間化合物の同定および純度は、
標準分光光度計で画定される赤外（ＩＲ）スペクトル〔
構造情報を与えるシャーｆ（ｓ）またはブロード（ｂ）
バンドは逆センナメートル（ｃｒｎ−”、ｌで報告され
る〕、または、標準ＩＱ伝分光光度計で画定される。核
磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル〔ブロード（ｂ）、シン
グレット（ｓ）、マルチブレット（ｍ）またはブロード
ンングレット（ｂｓ）ピークにおいて、テトラメナルン
ランに対し、δ値でｐｐｍで報告される化学シフト〕に
よって決定された。最終生成物の同定および純度は、Ｉ
　Ｒ，ＮＭＲ分光学および元素分析によって決定された
。
同定されたＲＩＮＤ化合物は上記第１表に記載した還元
性化合物である。
糞塘例１：螢光染料１の溶液 上に同定した螢光化合物ｌは非緩衝または緩衝水溶液の
いずれかとして保存され使用される。水溶液は、染料（
２ｍ９）を蒸留水（２０＋ｊ）に添加し、混合物を溶液
が得られるまで超音波処理することによって調製した。
緩衝溶液は、この水溶液Ｑ１ｍｌ！ｆ、０．０５モル濃
度のリン酸カリウム緩衝剤（ＰＨ７，８）　２．９ｍｌ
に添加することによって調製した。
９例２：螢光化合物■の調製 工程Ａ：アンスロン（７５））を１２０℃に加熱するこ
とによってトリメチルホスフェート４００ｍ１！に溶解
した。水酸化すｌ−ＩＪウム溶液（５０％溶ｅ、５０ｍ
１）を２ｍｌずつ添加した。最初に、温度を１２５〜１
３０℃に上げ、次いで１０５〜１１０℃に下げた。反応
の終りに激しい沸騰が起きた。
９０℃に冷却すると混合物は固体になった。水を添加し
、薄黄色生成物を集め、水で洗浄し、エチルアルコール
から直接再結晶した。融点９２〜９４℃を有する中間体
Ａ６８９が得られた。質量スペクトル分析で構造を確認
した。
工程Ｂ：中間体Ａ（６））’ｉＮ、Ｎ−ツメチルホルム
アミド（ＤＭＦ、２５ｍｇ）中に溶解した。混合物を冷
却し、オキシ塩化燐Ｃ３，５りで少しずつ攪拌しながら
処理した。得られた溶液１１００℃で２時間加熱し、次
いで栓をしたフラスコ中に放置した。得られた混合物を
酢酸ナト’７ウムを含有する水中に注いだ。黄色生成物
を集めアセトンから再結晶した。中間体Ｂの収量は４夕
であった。
質量スペクトル分析で構造を確認した。
工程Ｃ：ナトリウムメトキシド（１５９）を乾燥メタノ
ール３００７７１１に溶解し、この溶液を０℃に急冷し
た。中間体Ｂ（２４））とトリエチルホスホンアセテー
ト（２５９）との温いＤ■’（３００ｍｌ）中の溶液を
添加し、混合物を還流下に３時間加熱した。次いで水（
１００ｍ／）を添加し、溶液全史に１時間還流した。溶
液を水で１２００ｍ１まで稀釈し、濃塩酸を混合物が酸
性（ｐＨ２）になるまで添加した。次いで混合物を冷却
し、固体を集め、エチルアルコール（，２５０ｒｎｌ）
から再結晶した。中間体Ｃ１８夕が得られた。赤外分析
および核磁気共鳴分析で構造を確認した。
工程Ｄ：中間体Ｃ〔１８）〕を稀稀酸酸トリウム溶液（
５００ｍＪ）に溶解し、溶液を濾過した。
濾液を融媒量の炭素上の１０％・ぐラノウムで処理し、
得られた混合物をノやルシェーカー（Ｐａｒｒ　５ｈａ
ｋｅｒ）中で水素下に振盪した。理論量の水素が吸収さ
れた後、触媒を濾過によって除き、濾液を濃塩酸によっ
て酸性にした。生成物を集め、メタノールから再結晶し
て中間体Ｄ１０９を得た。赤外分析および質量スペクト
ル分析によって構造を確認した。
工程Ｅ：中間体Ｄ（３り）をノクロｏメタン（５０ｍ／
りに溶解したものを五塩化燐（２，５９）で処理し、混
合物を３０分間還流した。次いで塩化アルミニウムを少
量ずつ添加し、この混合物を攪拌し、還流下に５時間加
熱した。混合物を稀塩酸中に注ぎ、この溶液を酢酸エチ
ルで抽出した。
乾燥後、溶剤を減圧下で除去し、赤色の半固体３りを得
た。この物質をトルエン：酢酸エチル４：１中に入れた
。混合物を冷却し、不溶物質を集め、上記定義の化合物
■０．３夕を得た。質量スペクトル分析で構造を確認し
た。
肴鯰例３：螢光化合物■の調製 化合物■は、化合物■から、５ｏｌｏｄａｒ　ｅｔ　ａ
ｉ。
Ｚｈｕｒｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋｏｉ　Ｋｈｉ
ｍｉｉ、１６（５）。
１０６２（１９８０）に記載された方法を使用して調製
できる。
奥無例４　：　ＲＩＮＤ　ｌ　およびこれを含む緩衝組
成物の調製 工程Ａｌｐ−ンアノアニリン（２３，５９，０２モル）
、濃塩酸（Ｆ３Ｑｍｌ）および水（２００Ｍ）の混合物
を溶液が得られるまで加温し、次いで０〜５℃に冷却し
た。水（２５ｍＪ）に溶解した硝酸ナトリウム（１３，
８り、０２モル）を温度の上昇を防ぐためにゆっくり添
加した。０℃で１時間攪拌した後、得られたノアゾニウ
ム塩を、４ノのビーカー中のｐ−ベンゾキノン（２５９
り、０．２３モル〕、酢酸ナトリウム（１００Ｆ、１．
２モル〕および氷水（２３００ｍｌ）の攪拌混合物中に
ゆっく９添加した。金色の不均一混合物を水浴中で４時
間攪拌し、ゆっくり室温に加温した。固体を濾過により
分離し、水で繰返し洗浄し、次いで乾燥し、アセトニト
リルから再結晶し、中間体Ａ２１．７タを得た。
工程Ｂ：中間体Ａ（５０）、０．２１８モル〕、１．３
−シクロへキサジエン（２０９り、０２６モルつおよび
メチレンクロライド（２５０ｍＪ）の混合物を窒素下で
一夜還流下に加熱した。溶剤を除去した。ＫＨＣＯ３（
４２９，０，４２モル〕およびＭｅＯＨ（４００ｍｉ）
を添加することによってグロトヒドロキノンの転位を行
い、窒素下で還流下に３０分間加熱した。混合物を冷却
し、濾過し、ｐ液を稀ＨＣｉ／氷水中に注いだ。濾過お
よび乾燥（真空オープン中５０℃で〕して粗中間体Ｂを
得た。これは次の工程に使用するために十分な純度であ
った。
工程Ｃ：中間体Ｂ（２２，８）、７３ミリモル）をノＥ
ルシェーカーボトル（Ｐａｒｒ　５ｈａｋｅｒ　ｂｏｔ
ｔｌｅ）中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　（７５０
ｍｌ　）に溶解し、炭素上１０％パラノウム触媒を窒素
雰囲気下に添加した。この混合物を４０　ｐｓｉ　（２
，７５バール９の水素下で市販の・ぐルシェーカー装置
上に置き、１０〜１１分間振盪した。次いで反応混合物
を窒素雰囲気下で濾過し、真空下に溶剤を除去し中間体
Ｃを得た。メチレンクロライドから再結晶して純粋な中
間体Ｃを得た。
工程Ｄ：中間体Ｃ（３，５７，１１２ミリモル）、Ｎ、
Ｎ　（ノイソブトキシメテレン〕メチルアミン（４５）
、２２．４ミリモル〕およびトルエン（１５ｍｌ　）の
混合物を窒素下に１１５℃で一夜加熱した。
窒素のガヌ流を溶剤全部が蒸発するまで反応混合物中を
通した。ヘキサン（２５ｍＡ’）を添加し、混合物全加
熱しながら得られた固体をくずした。冷却後濾過して中
間体りを固体として得た。
工程Ｅ：中間体Ｄ（４９，１０，９ミリモル〕、ＦｅＣ
ノ、−６Ｉ（２０（４，４９，１６３ミリモル）、ｆｉ
Ｈｃｆｆｌ（６ｍｌ　）、水（ｆ３ｍｇ）およびメタノ
ール（３０ｒｎｌ）の混合物を還流下に一夜加熱した。
水（：ｔｓｏｍｚ）を添加し、混合物をメチレンクロラ
イドで３画抽出した。有機層を一緒にし、乾燥（Ｎａ　
２　Ｓ　Ｏ４）　Ｌ、溶剤を除去して中間体Ｅを得た。
工程Ｆ：中間体Ｅ（３，３Ｆ、８４８ミリモル〕を冷メ
チレンクロライド（５０１ｒＬｌ）に溶解し、この溶液
にトリエチルアミン（２，４ｍｌ、　　１６．９ミリモ
ル）を添加した。次いで、この混合物を少しずつ１５分
間で、メチレンクロライド（１００ｍＩり中ホスゲンの
冷飽和溶液に添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪
拌し、次いで、２時間で２５℃にゆっくり加温した。混
合物を真空下に一夜維持して全ての溶剤を除去した（ホ
ヌグンを捕集するためにＮａＯＨトラップを使用したつ
。得られた固体をテトラヒドロフラン（２５０ｍＪ）中
でくずし攪拌した。アミン塩を除くために濾過した後、
ｐ液から溶剤を除去し、中間体Ｆｉ得た。
工程Ｇ：中間体Ｆ（１７，３）、４３．７ミリモノリを
４５分間で少しずつ、化合物］（６，６９，３３，６ミ
リモル〕および４−ノメチルアミノビリノン（触媒量）
のピリジン（１７５ｍ／？）中の溶液に添加した。反応
混合物を２５℃で１５時間窒素雰囲気下で攪拌した。得
られた混合物を塩酸および氷水（３１）に注ぎ黄色固体
を沈殿させた。この固体を濾過により捕集し、水で洗浄
し真空下で乾燥した。クロマトグラフィー（シリカ、９
０：１０゜ノクロロメタン：アセトン〕で黄色泡が得ら
れ、これはエーテル（１００７７１Ｊ）中で１５分間攪
拌することによって固誦ヒた。この固体を集め乾燥して
、融点２１０〜２１３℃のＲＩＮＤ　ｌ　１３．８９（
７４条収率ンを得た。分析、Ｃ３５Ｈ２６Ｎ２０５とし
ての計算値：Ｃ，？５．８、Ｈ１４７、Ｎ、５１、実測
値二Ｃ７５１、Ｃ１４９、Ｎ１　５０゜ 工程Ｈ：ＲＩＮＤＩ化合物の緩衝組成物を次のようにし
て調製した。ＲＩＮＤＩをＮ、Ｎ−ツメチルホルムアミ
ド（１ｍｌ当９１６ｍ９）に溶解した。この溶液ノ０゜
２５ｍｇ分をＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性剤０、
５　ｍｌ！と混合した。得られた溶液を、次いで、緩衝
剤を室温で攪拌しながら、００５モル濃度の燐酸カリウ
ム緩衝剤（ｐＨ７，５）　２５ｍｌに滴加した。
透明な分散液を得た。
奥栴例５　：　ＲＩＮＤ　ＩＩおよびこれを含む緩衝組
成物の調製 ＲＩＮＤ　ＩＩを次の一連の工程によって調製した。
工ａＡ　：　２．５−ジメトキシ−４−フェニルベンズ
アルデヒド（５２，５り、０．２２モル〕、マロン酸（
５１，８）、０５モル〕およびピペリノン（２５ｍｌ　
）のピリジン（ＩＯＣＩＡ’）中の混合物を８０℃で１
５時間加熱した。冷却後、混合物を塩酸／氷水（２，５
Ｊ）中に注いだ。沈殿した黄色固体を濾過により捕集し
、水で洗浄し、フィルター上で乾燥した。生成物をアセ
トニトリル（６００７７１Ｊ）中で３０分間還流し、混
合物を冷却し、黄色固体を集め、アセトニトリルで洗浄
し、フィルター上で乾燥した。この生成物（４３，３Ｆ
）をエタノール（１，２５１）中に懸濁させ、木炭上１
０％・ゼラノウム触媒を有するパルシェーカーボトル中
に置き、水素下で３日間振盪した。触媒を戸別し、ｐ液
を濃縮して融点１４３〜１４６℃を有する中間体Ａ３５
９を得た。
工程Ｂ：中間体Ａ（３５ｙ、０．１２モル）および゛芽
キサリルクロライド（２３３）、０１８モル〕のジクｏ
ロメタン（４００ｍｌ）中の混合物を２５℃で８時間攪
拌した。溶液を減圧下で濃縮して、オレンジ色の油を得
た。ノクロロメタン（約５０ｍ１　）を二つに分けて添
加し、次いで減圧下に除去した。得られた油（約３７ｙ
、中間体Ｂ）を直接次の工程に使用した。
工程Ｃ：中間体Ｂ（約３７）、０１２モル）をノクロロ
メタン（４００ｍＡ’ンに溶解した。こ）溶液を水浴中
で冷却し、塩化第二錫（３８）、０．１５モル〕を添加
した。反応混合物を２５℃で３０時間放置し、次いで塩
酸／氷水（３１）中に注き、１５分間攪拌した。層分離
し、水層をノクロロメタンで２回洗浄した。オレンジ色
の層を一緒にし、乾燥し、減圧下で濃縮して固体生成物
を得た。シリカ上、ソクロロメタン、エーテル（９８：
２）でのクロマトグラフィーで融点９７〜９９℃の黄色
中間体Ｃ２８／を得た。
工程Ｄ：中間体Ｃ（２８Ｆ、０．１０４モル）のの酢酸
Ｃ，６００ｍ１）および過塩素酸（１２ｍ１り中の溶液
を木炭上１０係・モラノウム触媒を有する・ぞルシェー
カーヒトル中に置き、水素下に１週間振盪した。酢酸カ
リウム（約１０９）を添加し、次いで混合物を１０分間
攪拌し、次いで濾過して触媒を除去した。Ｐ液を減圧下
で濃縮して半固体の生成物を得た。この生成物をテトラ
ヒドロフラン中に溶解し、溶液を氷水中に注いだ。水を
ソクロロメタンで抽出し、溶剤を乾燥し、洟縮した。ト
ルエンを２回に分けて添加し、減圧下で除去した。
中間体８２３．５９が得られた。
工程Ｅ：硝酸セリウムアンモニウム（ｃｅｒｒｉｃａｍ
ｍｏｎｉｕｍ　ｎ１ｔｒａｔｅ）　（１５２９，０，２
８モル〕を水（３２５ｍ／’）に溶解し、中間体りのア
セトニトリル（３２５ｍ（）の溶液中に攪拌しながら４
５分間かけて滴加した。反応混合物を更に３０分間攪拌
した。水Ｃ，３００ｍ１）を添加し、混合物をノクロロ
メタン（４ｘｌＯＯｍｊ）およびエナルエテル（ＩＸｌ
ｏｏｍＪ）で抽出した。オレンジ色層を一緒にし、乾燥
し、濃縮してオレンジ色の油２４夕を得た。この油の精
製した試料は固化し、融点８１〜８２．５℃であった。
工程Ｆ：中間体Ｅ（２４り、０．１１モル）をテトラヒ
ドロフラン（２００ｍＡり中に溶解し、木炭上１０％パ
ラノウムを有するパルシェーカーボトル中に置き、水素
下で７５分間振盪した。触媒を窒素下で戸別し、Ｐ液を
濃縮して中間体Ｆ２３９を得た。この生成物は次の工程
で直接使用した。
工程Ｇ：中間体Ｆ（２３９，０，１モルつおよびＮ、Ｎ
−（ノイソブトキシメテレン）メチルアミン（３０，９
り、０１５モル）のトルエン（５０ｍｇ）中の混合物を
９０℃で窒素雰囲気下に３時間加熱した。薄層クロマト
グラフィ（シリカ、ジクロロメタン：エーテル、９５：
５）で出発物質の存在が示された。溶剤を除去し、Ｎ、
Ｎ−（ノイソブトキシメナレン）メチルアミン（１ｍｌ
りを添加し、混合物を更に３時間加熱した。メタノール
（５０ｍｇ　）を添加し、混合物を還流させた。混合物
を０℃で一夜冷却した。生成物を集め、冷メタノールで
洗浄し、乾燥した。融点２１２〜２１３℃の中間体Ｇ１
１．９Ｆが得られた。
工程Ｈ：中間体Ｇ（１１，９）、０．０４モル〕および
塩化第二鉄（１７，Ｉ９．０．０６３モル）の塩酸（３
５ｍｌ）、水（３５ｍＪ）お、ｌ：びメｌ／　−／ｌ／
（１００ｍＪ）中の混合物を８時間還流した。反応混合
物を０℃で数時間冷却し、濾過した。戸液を水（１ｏｏ
ｍｔ）で処理し、テトラヒドロフラン／ツクｏｏｒタン
（１：　１　）、３Ｘ１００ｍＪｆ抽出した。抽出物を
一緒にして乾燥し、木炭で処理し、濾過した。Ｐ液を濃
縮して、中間体）（１０，３）を得た。
工程工：中間体Ｈ（１０，３Ｆ、０．０３４　モル）お
よびトリエチルアミン（６゜９２．０．０６８モル〕を
ジクロロメタン（１０（１／’）中に溶解した。この溶
液を、あらかじめホヌグンガスで飽和させたジクロロメ
タン（３００ｍｌ）に攪拌しなから０℃で少しずつ添加
した。反応混合物を０℃で１５分間攪拌し、次いで２時
間２５℃に加温した。溶剤を減圧下に除去し、エチルエ
ーテル／テトラヒドロフラン（１：１．１００ｍ１）を
添加した。この混合物を攪拌し、固体を戸別し、エチル
エーテル／テトラヒドロフランで洗浄した。ｐ液を濃縮
して生成物、中間体ｒｘｔｘりを得た。
工程Ｊ：染料ＩＣ２，４９，０，０１３モル）のピリノ
ン（１００ｍｌ）中の懸濁液を窒素雰囲気下で触媒量の
４−　Ｎ、Ｎ−ツメチルアミノビリノンおよび中間体Ｂ
５Ｆ、０．０１５モル）で処理し、次いで暗所で５時間
攪拌した。反応混合物を塩酸／氷水（２１）中に注ぎ、
固体生成物を捕集し、水で洗浄し、暗所で１５時間真空
中で乾燥した。クロマトグラフィー（ソリ力、ジクロロ
メタン／アセトン、９：１）で生成物ＲＩＮＤ　ＩＩ　
１．３９が得られた。分析：Ｃ３１Ｈ２３ＮＯ５として
の計算値、Ｃ１７６，１、Ｎ１４．７、Ｎ、２９、実測
値Ｃ１７４，１、Ｎ１４８、Ｎ１２８゜ ＲＩＮＤ　Ｉｔからなる組成物を、嘴襖例４に記載した
と園じ方法によって調製した。
一１４例６：フェナレノン染料を使用した白血球の着色 本実施例は、白血球着色のための７工ナレノン染料化合
物１およびＨの有用性を示す。
白血球富化層を、健康な大人の供血者の血液ＣＡＣＤチ
ューブ（ＡＣＤ（酸、クエン酸塩、デキヌトローズＢ−
Ｄ４６０６）が予め入れられた血液捕集管〕中に採血〕
から、１０ｍ１血液管にＤｅｘｔｒａｎＴ７０（平衡塩
溶液中６％）１．５ｍＡ’を添加することによって精製
した。これらのチューブを１時間静置し、次いで血漿層
を無菌の１５ｍＪ遠心分離管に移し、肢管を燐酸塩緩衝
溶液（０，０５モル濃度の燐酸カリウム緩衝剤中に塩化
ナトリウム８５り、ｐＨ７，５）で７．５　ｍｌまで充
満した。次いで管を１１０００ＲＰで１０分間遠心分離
し、得られた細胞ベレットを１０ｍ７の溶解溶液（ｌｙ
ｓｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（水１００ｍＩ！中に、
塩化アンモニウム０．８３５Ｅ、重炭酸ナトリウム０．
１：ｉ！および（エチレンノニトリロ〕テトラ酢酸ジナ
トリウム塩０．００３２を含む。ＰＨ７，２）中に懸濁
させ、管を溶液が透明になるまで静置した。管を再び遠
心分離し、被レットを洗浄し、緩衝溶液中に再懸した。
細胞を数え、約１０６細胞／ｍｌに調節した。
２００マイクロリツトルの細胞懸濁液を最高速度で１０
分間遠心分離した。固定化細胞ブレ・ぐレーションを空
気乾燥し、化合物１およびＩＩ（１ｍｇ７ｍｌメタノー
ル〕で１〜２分間着色し、蒸溜水で洗浄した。
着色細胞をエビ螢光顕微鏡（励起５４６　ｎｍ、発光５
９０ｎｍ）下で検査した。白血球の明るい橙赤色の螢光
が、最小のパックグランド螢光と共に観察された。
この検定では次の溶液を使用した：メタノール中０．０
１モル濃度の電子移動剤（ＥＴＡ）およびプライノハー
トインフユー・ノヨン培地中で生長し、１×１０細胞／
ｍｌ！の濃度を有するシュードモナスアエルギノーサ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）。
次の成分から該溶液を調製した：奥曇例４に記載したよ
うにして調製したＲＩＮＤ　ＩＩ分散液１．５　ｍｌ、
燐酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７，５）　１．５ｍｇ、グル
コース原液（１０％）２５μｌおよびシュードモナスア
エルギノーサ溶液２５μ１０　次いで、適当なＥＴＡ２
５μｌを添加した。　対照にはＥＴＡを含有させなかっ
た。次いで、螢光を２５℃で標準スペクトロフルオロメ
ーター（励起５４０　ｎｍ、発光６２０　ｎｍ）を使用
して、開始時（溶液を最初に混合した時）および５．１
５および３０分後に測定した。
下記筒■表に示す結果は、ＲＩＮＤ　ＩＩが、２種の異
なる電子移動剤を使用するシーードモナスアエルギノー
サの溶液検定に使用できることを示している。
第１表 対照　０．０５８　０．０６２　０．０６６０．０７８
＊ ＴＭＢＱ　　　　　Ｏ，０５９０，０８１０，１４４０
，２９０ＤＭＨＢＱ＃０．０５８　　　０．０８７　　
０．１７７　０．３６０＊　２．３．５−）ツメチル−
１，４−ベンゾキノン＊＊２．３−ツメチル−５−ヒド
ロキンメチル−１，４−ベンゾキノン 以下余白 奥鴫例８：ＲｒＮＤ　Ｉを使用したグルコース−６−ホ
原液を次の試剤から調製した二 蒸溜水中のグルコース−６−ホヌフエート（０１モル濃
度〕、 蒸溜水中のニコチンアミドアデニンソヌクレオチドホヌ
フェー）（０，００６モル濃度）、Ｍ　溜水２　ｍｔ！
中のグルコ−クー６−ホスフエートデヒｒロケ９ナーゼ
（０，２７ｍ９）、および００５５モル濃度のトリス・
ＨＣノ（ｐＨ７，８）および０．００３３モル濃度の塩
化マグネシウムから調製されたトリス（ヒドロキシメチ
ル〕アミノメタンーＭｇ緩衝剤（ＴＲｌ５−Ｍｇ緩衝剤
〕。
ＲＩＮＤ　ｌの分散液は、ＲＩＮＤ　］　４４ｍをＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０μｌに溶解し、ＴＲＩ
ＴＯＮＸ−１００界面活性剤０．５　ｍｉを添加し、こ
の溶液を攪拌しながらゆっくり、ＴＲｌ５−Ｍｇ緩衝剤
（ｐＨ７，８）溶液２５ｍ１に添加することによって調
製した。
試験溶液を次の成分から調製した；　ＲＩＮＤ　Ｉ分散
液ｌ、　５　ｍｌ、ＴＲｌ５−Ｍｇ緩衝剤１．２ｍＪ、
　＝−ｚチンアミドアデニンノヌクレオチドホヌフエー
トのストック１ｉｌＯＯμＬグルコーヌ−６−ホヌフエ
ート１００μｌおよびフェナジンメトスルフェート溶液
Ｃ３ｍ９／ｍｌメタノール）２５μｌ。次いで、種々の
濃度（１０μｌ、２５μｌおよび１００μｌ）のグルコ
ース−６−ホスフエードプヒドロケ゛ナーゼ溶液を上記
溶液に添加し、夫々、溶液Ａ、ＢおよびＣを形成した。
対照溶液には酵素を含有させなかった。
次いで２５℃で螢光を測定した。
１分当りの相対螢光の変化は図面に示され、ＲＩＮＤ　
Ｉ　カグルコース−６−ホスフェートデヒド口グナーゼ
の迅速検定に使用できることを示している。
本ＷＵは、生物学的還元剤ニコチンアミドアデニンヌク
レオチド、還元体（ＮＡＤＨ）およびアヌコルビン酸を
検定するためのＲＩＮＤ　］の使用を示す。
次の試剤原液を使用した： 蒸溜水１０ｍＩ！中のＮＡＤＨ（７，０９ｍ？）および
蒸溜水１０ｍ１中のアスコルビン酸ナトリウム（１，９
８ｍ？）。
０．０５モル績度の燐酸カリウム緩衝剤を使用した他は
Ｉｎ例８に記載したようにして、ＲＩＮＤ　１の分散液
を調製した。
試験溶液を次の成分から調製した：　ＲＩＮＤ　］分散
液１５ｍ１．０．０５モル績度の燐酸カリウム緩衝剤（
ＰＨ７，５）　１．５ｍｌ、およびツェナノンメトスル
フェート溶液（３ｍｙ　／　ｍＩ！メタノール）　２５
　μｉｊ。
第ｍ表および第■に示す種々の濃度の還元剤をこれらの
溶液に添加した。次いで、２５℃で５分後に、各還元剤
系列（還元剤の無い対照を含む）について螢光を測定し
た。下記第ｍ表および第■表に示す結果は、ＲＩＮＤ刊
がＮＡＤＨおよびアクリレ−トの決定に夫々有用である
ことを示す。
以下余白 第ｍ表 対　　　照 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 第■表 対　　　照 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 ３．３　Ｘ　１０　　モル濃度 ３．３　Ｘ　１０−６モル績度 ３．３Ｘ１０　　モル濃度 ０．０４２ ０．０４６ ０．０９６ ０．３７０ ｏ４４ ０．０４９ 次の原液を使用した：メタノール中の電子移動剤（ＥＴ
Ａ）（０，０１モル績度）および大腸菌濃度は３×１０
細胞／ｍｉであった。
溶液を次の成分から調製した：　ＲＩＮＤ　Ｉｔ分散液
１．５ｍ／、燐酸カリウム緩衝剤１，５ｍＪ、グルコー
ス溶液（１０係）２５μｌおよび大腸菌細胞２５μ１０
次いで適当なＥＴＡ２５μｌを添加した。対照溶液には
ＥＴＡを含有させなかった。次いで、螢光を開始時およ
び５．１５および３０分後に測定した。
第Ｖ表に記載した結果は、ＲＩＮＤ　Ｉｔが種々のＥＴ
Ａを使用した大腸菌の３０分検定に適していることを示
している。
第Ｖ表 ｍ例１１：乾式要素中のＲＩＮＤ　］による大腸菌の検
出 本実施例で下記フォーマツＨ−有する乾式要素全使用し
た。
試薬層 ポリ（ビニルトルエン−共−ｐ− ｔ−プチルヌチレンー共−メタク リル酸）ビーズ ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−共 ム塩〕 ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性剤 グルコース ＲＩＮＤ　］ ２．３．５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンゼラチ
ン（硬化〕 １２９ｖζ２ ４に猟２ ４９／ｍ２ ｏ、ｌｐ７保２ ０．１９／ζ２ ０．８９／ｍ２ １．１７７ｍ２ 対照　０．０３９ ＰＭＳ＊　　　　０．０２２ ＊＊ ＴＭＢＱ　　　　　　Ｏ，０２３ ＤＭＨＢＱ＊＊＊０．０２４ ０．０４５　　０．０４０ ０．０４２　　０．１１ ０．０３８　　０．０９０ ０．０３９　　０．０９６ ０．０４５ ０．２８ ０．２６ ０．２６ ＊ツェナノンメトサルフェート ＊＊　２，３．５−　トリメチル−１，４−ベンゾキノ
ン＊＊＊　２，３−ツメチル−５−ヒドロキシメチル−
１，４−ベンゾキノンＤＡＸＡＤ　３０界面活性剤 ゼラチン（硬化〕 ＺＯＮＹＬ　ＦＳＮ界面活性剤 ０．０３９／ｍ２ １９／ｒｒＬ２ ０２ｖ気２ この要素を評価するために、燐酸カリウム緩衝剤（ｐｌ
（７，５）中の種々の大腸菌細胞濃度の溶液と緩衝剤の
みを含有する対照とを調製した。次いでこの溶液を１０
μｌ滴使用して該要素上に点滴し、要素を３７℃で６０
分間培養した。標準フルオロメーター（励起５４０ｎｍ
、発光６２０ｎｍ）中で培養期間の３分後および６０分
後罠螢光を測定した。
下記第■表に記載した結果は、３分および６０分での相
対螢光における差（Δ〕を示し、この要素を使用して約
１０細胞／　ｍｉ　ｆ検出でさることを示している。
第■表 １．０Ｘ１０　　　　　０．２７２　　　　　　０．０
’０７　　　　２．６４、ｌＸ１０　　　　　０．２４
９　　　　　　０．００７　　　　２．８０　　　　　
　　０．２２１　　　　　　０．０１０　　　　４．５
試験溶液を、０．０５モル礎度燐ばカリウム緩衝剤中の
大腸菌細胞（約ｌＸｌ０細胞／ｍｔ！　）　２５μムグ
ルコース溶液２５μＡ、　　フエナノンメトスルフエ−
ト（３ｍ９７ｍ１メタノール）２５μノおよびメタノー
ル中の染料化合物１２５μｌから調製した。標準分光光
度計で５４５　ｎｍで２０分間光学績度を測定した時、
改変変化は見られなかった。この試験は、染料ｌは安定
である、即ち、大腸菌細胞、電子移動剤およびグルコー
スの存在下で還元されないことを示している。
同様な試験で、対照ＲＩＮＤ　Ｄ　（下記実施例１３参
照）から放出された染料は、大腸菌細胞（ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００界面活性剤と燐酸カリウム緩衝剤の分散液〕
、ツェナノンメトヌルフェートおよびグルコースの存在
下で４分未満で完全に還元された。元学績度を６５０　
ｎｍで読んだ。
本妻頃咥りは、本発明で有用なりＩＮＤ化合物（ＲＩＮ
Ｄｌ）と、本発明の範囲外の螢光部分、それらのいくつ
かは、生物学的検定に通常使用され、即ち、４−メチル
アンベリフエロンおよびフルオレッセインを含有する対
照ＲＩＮＤ化合物との光分解安定性を比較する。対照化
合物Ａは４−メチルアンベリフェロン部分を含有するＲ
ＩＮＤ化合物である。
対照ＲＩＮＤ　ＢおよびＲＩＮＤ　Ｃは螢光部分を含有
する。対照ＲＩＮＤ　Ｄは螢光アクリジン染料部分を含
有する。
各ＲＩＮＤ化合物の分散液は、ＲＩＮＤ化合物（４μ２
）をＮ、Ｎ−ツメチルホルムアミド（２５０μｌ）に溶
解し、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性剤（０，５μ
りを添加し、この混合物を攪拌しながら０．０５モル濃
度の燐酸カリウム（ｐＨ７，５）２５μｌにゆっくり添
加することによって調製した。これらの分散液調製は黄
色光の下で行なった。これらの組成物に還元剤は添加し
なかった。
次いで、各分散液（１，５μｌ）および緩衝剤（１，５
μｌ）を水晶セルに入れ、螢光を２５℃でｉｓス−”ク
トル光度計で、各放出染料の、励起最大値で励起し、発
光最大値で検出することによって決定した。理論的には
、還元剤が存在しないのでこれらの波長では螢光は検出
されない。
結果（第■表９は、開始時と１５分後での読みの差（Δ
相対螢光つとして辰わす。対照ＲＩＮＤＢは、その高い
不安定性のために１分後に読んだ。
本発明のＲＩＮＤ−１と対照ＲＩＮＤＤのみ、　このよ
うな条件下で安定であった。しかしながら、対照ＲＩＮ
ＤＤから放出された染料は、生きて←いる細胞、ＥＴＡ
およびグルコースの存在下で急速に還元された。ＢＩＮ
ＤＩから放出された染料は、同様の条件下で還元されな
い。従って、ＲＩＮＤ　Ｉおよびその放出染料のみ、共
に、一般に分析測定に使用される生物学的条件下で安定
である。
第■辰 ＲＩＮＤ−Ａ　　　　３７０ ＲＩＮＤ−Ｂ　　　　４９５ ＲＩＮＤ−Ｃ４９５ ＲＩＮＤ−Ｄ　　　　６００ ＊１分後の読み ５２０　　　　８６５＊ ５２０　　　　　　１０．８ ６６６　　　　　　　０、１ 〔発明の効果〕 本発明の検定は、低濃度においても検体に対して迅速で
高感度である。使用される螢光染料は公知の検定の螢光
染料よりも一般に長い波長で吸収し放射するため、本発
明の検定は、生物学的検体で一般に遭遇するスペクトル
干渉を避けて、生きている有機体を測定するために生理
学的ＰＨで使用できる。
これらの有利性は、５３０　ｎｍ以上の最大吸収と少く
とも５８０　ｎｍの最大放射を有するある種の７エナレ
ノンおよびベンズフェナレノン化合物ヲ使用することに
よって達成される。これらの化合物はベンゾキノン化合
物の如さ担体に容易に付着でき、放出性化合物を提供で
きる。担体に付着した時、染料は転移性であり、即ち、
これらは、放出された時とは異なる付着された時の波長
で螢光を発する。更に、これらの化合物は、細胞または
組織の如き生物学的検体を着色するために有利に使用さ
れる。本発明で使用される好ましい染料は、有利には約
６以下であり、かくして６〜９０ＰＨ範囲で最大螢光を
示すｐＫａを有する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、６例８で記載したグルコ−ノー６−ホスフエ
ーヘデヒ１口グナーゼの検定のために、時間（分〕に対
する相対螢光の変化をプロットしたグラフである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 　１．構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） のいずれかによつて表わされる置換または非置換化合物
    から誘導された螢光部分を含み、ｎは１または２である
    〕 の還元性化合物を含み、該還元性化合物がｐＨ９または
    それ以下で還元されて螢光部分を放出し得るものであり
    、さらに、Ｒ＾１がＨで置換された時▲数式、化学式、
    表等があります▼が水中で測定した時少なくとも約 ＋１００ｍｖのＥ＿１＿／＿２を有するものである組成
    物。
  2. 　２．楕造式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） のいずれかによって表わされる置換または非置換化合物
    から誘導された螢光部分を含み、ｎは１または２である
    〕 の還元性化合物を含み、該化合物がｐＨ９またはそれ以
    下で還元されて螢光部分を放出し得るものであり、さら
    に、Ｒ＾１がＨで置換された時▲数式、化学式、表等が
    あります▼が水中で測定した時少なくとも約＋１００ｍ
    ＶのＥ＿１＿／＿２を有するものである乾式分析要素。
  3. 　３．Ａ．検体を含有すると思われる液体試料を、構造
    式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） のいずれかによって表わされる置換または非置換化合物
    から誘導された螢光部分を含み、ｎは１または２である
    〕 の還元性化合物であり、該化合物が該ｐＨで還元されて
    螢光部分を放出し得るものであり、さらにＲ＾１がＨで
    置換された時▲数式、化学式、表等があります▼が水中
    で測定した時少なくとも約＋１００ｍＶのＥ＿１＿／＿
    ２を有するものである還元性化合物と接触させる工程、
    並びにＢ．検体の存在の結果としてその還元により該化
    合物から放出された螢光部分を検出する工程からなる検
    体の分析方法。
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