JPS6391098A - ポリエーテル抗生物質を使用する細菌の鑑別用組成物並びに分析要素及び鑑別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関し、更に詳しくは生存グラム陽性
菌及び生存グラム陰性菌を鑑別する組成物、要素及び方
法に関する。

以下余白 （従来の技術〕 すべての細菌は、グラム染色反応に基づいて１種又は２
種、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のいずれかに分ける
ことができる。従って、グラム反応は、細菌の同定にお
ける重要な鍵となる試験法である。更に、グラム陽性菌
とグラム陰性菌とは、一般に構造上及び化学的に相違す
るので、一方の種類によって起こる感染を治療するには
、他の種類によって起こる感染を治療するため使用する
のとは異なるスペクトルの抗生物質を使用する。従って
、感染微生物のグラム反応を知っていることは、適切な
治療の決定に重要である。

一般に、グラム染色反応は、熱固定生物学的標本を含む
ガラススライド上で実施される４段階染色操作法である
。この操作は、時間を浪費し、労力を要する。グラム染
色が異なる結果を生じることがあり、正確なタイミング
及び注意深い技法に著しく依存することは周知である。

更に、操作を自動化するのは困難である。

米国特許第４．５２５．４５３号明細書には、アニオン
界面活性剤を使用する、改良された鑑別方法が記載され
ている。この文献によれば、アニオン界面活性剤はある
種の還元性化合物を還元するグラム陽性菌の能力を選択
的に抑制する。上記の文献に好ましいと教示されている
界面活性剤の一つは、ターギトール（ＴＥＲＧＩＴＯＬ
）　　７という商標の下に市販されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記の文献に教示されているアニオン界
面活性剤は、広範な還元性化合物を用いて微生物を有効
に鑑別しないことが判った０例えば、ターギトール７は
、テトラゾリウム塩とともに有用であるが、ある種の還
元性分子内求核置換性化合物（本明細書では、ＲＩＮＤ
化合物と記す）を用いる場合には有用ではない。換言す
れば、アニオン界面活性剤とＲＩＮＤ化合物との組み合
わせを用いては、明瞭なグラム分離は観察されなかった
。

迅速かつ簡単であるばかりでなく、広範囲の還元性物質
を用いる場合でも有用な鑑別方法が望ましい。

〔問題点を解決するための手段〕

公知の鑑別方法に伴う前記の問題点は、（ａ）還元抑制
物質の不存在下に生存グラム陽性及びグラム陰性菌の両
方によって還元されて検出可能な物質（ｓｐｅｃｉｅｓ
）を生成しうる化合物、４たびに（ｂ）グラム陽性閑に
よる還元性化合物の５元を選択的かつ実質的に抑制する
のに充分な量で存在するポリエーテル抗生物質 を含む生存グラム陽性菌及びグラム陰性菌の鑑別用組成
物によって回避される。

本発明は、更に、前記の組成物を含む生存グラム陽性菌
及びグラム陰性菌の鑑別用分析要素を提供する。

史に、／１存グラム陽性菌及びグラム陰性菌の鑑別方法
は、 Δ、生存ダラム陽性菌及びグラム陰性菌を含むと思われ
る液体を前記の組成物と混合し、そして、Ｂ、グラム陰
性菌の存在により生じる検出可能な物質を測定する 工程を含む。

〔実施態様〕

本発明の実施に有用な抗生物質は、ポリエーテル抗生物
質として従来知られているものである。

このような物質は、Ｊ、Ｗ、Ｗｅｓｔｌｅｙ編集、ポリ
エーテル抗生物質（ｈｈ旦厘Ｌし旦旦旦旦■、１巻（Ｍ
ａｒｃｅＩ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、二ｓ−ヨーク
、１９８２）、例えば６頁に詳述されている。ポリエー
テル抗生物質は、−ｍに、多数（２個もしくはそれ以上
）の環状エーテル基を有する抗生物質である。

前記のＷｅｓｔｌｅｙの文献によれば、ポリエーテル抗
生物質は、数種に区分されているが、そのすべてが本発
明の実施に有用である。本発明の実施にはこれらの分類
に限定されるものではないが、代表的抗生物質と共に、
下記の第１表に示す。

以下余白 第上表 １ａ：　１価　　　　アルポリキシン（Ｓ　１４７５０
　Ａ）抗生物質Ｘ−２０６ グリソリキシン ライドロマイシン モネンシンＡ ニゲリシン（Ｘ−４６４、ボリエ ーテリンＡ１アザロマイシン Ｍ１デユアマイシン、Ｋ　１７８） サリノマイシン、 サリノマイシン５Ｙ−４（５ 一ヒドロキシ） ■ｂ：　１価　　　　抗生物質Ａ２０４配本Ｊ９体　　
　力リオマイシン（Ｔ−４２０８２）エテロマイシン（
ＣＰ　−３８２９５、Ｃ２０−１２） セプタマイシン（Ａ　２８６９５Ａ、 Ｂ　１−５８０α） ２ａ：　２価　　　　イオノマイシン ラサロシドＡ　（Ｘ−５３７Ａ） ラサロシドＢ ラサロシドＣ ラサロシドＤ リソセリン（Ｘ　−１４５３７） ２ｂ：２価配糖体　　抗生物ｆｆ　６０１６３：　２価
　　　　抗生物質Ａ　２３１８７　（カリマイビロール
　　　シン又はカルシマイシン）エーテル　　　抗生物
質Ｘ−１４５４７Ａカリマイシン（抗生物質Ａ２３１８
７としても公知）、モネンシン、イオノマイシン、抗生
物質Ａ２０４、セブタマイシン（Ａ２８６９５　Ａとし
ても公知）及びラサロシド抗生物質は、本発明の実施に
好適である。従来公知のように、カリマイシン、イオノ
マイシン及びセプタマイシンは、最適活性を得るためカ
ルシウムイオンと併用される。

本発明に有用な各抗生物質には、グラム陽性菌の還元能
を実質的に抑制し、鑑別するため最適濃度範囲（抗生物
質の純度及び力価に依存）並びに最適環境条件があるこ
とは当業者には理解されるであろう。更に、若干のグラ
ム陽性菌に対するポリエーテル抗生物質の選択的抑制作
用には若干の例外がありうる。しかし、一般に、ポリエ
ーテル抗生物質類は、本明細書に記載する選択的実質的
抑制を示す。

一般に、グラム陽性菌による還元性化合物（下記）の還
元を選択的かつ実質的に抑制するため必要な抗生物質の
量は、１０’細胞／＃＋１のグラム陽性菌（例えば、黄
色ブドウ球菌、Ｓ、　　ａｕｒｅｕｓ）、抗生物質（１
０−’モル濃度）及び還元性化合物（０，００５モル）
をｐ）１７．５で混合することによって容易に測定する
ことができる。還元性化合物が還元されて検出可能な変
化を生じる場合、検出可能な変化が観察されなくなるま
で、更に試験において抗生物質の量を増加する。

本発明の実施に有用な還元性化合物は、酸化された形で
、任意の還元抑制物質の不存在で生存グラム陽性菌及び
グラム陰性菌の両者によって還元されて検出可能な物質
を生じうる物質である。このような物質は、電位差滴定
又は放射能測定装置を含めて任意の適当な装置によって
検出することができる。下記のように、物質を放射能測
定装置によって検出するのが好ましい。

放射能測定装置によって直接検出されうる種々の検出可
能な種を一部分列挙すると、比色法で検出しうる物質、
例えば色原体、輻射線放出物質、例えば螢光助剤、化学
発光性物質、放射性同位元素、燐光性物質等が含まれる
。

検出可能な物質として色素又は色素前駆物質を使用する
のが好ましい。色素又は色素前駆物質の使用は、検出に
関して数種の可能性を示す＝　（１）着色した物質が無
色になるか又は吸収の移動を受ける、（２）無色の物質
、すなわち色素前駆物質が着色した物質を形成すること
ができるか又は（３）移動性の、検出可能な物質を含む
物質は移動性の検出可能な物質を放出する。本発明の実
施には、（３）が好ましい。

還元性化合物として使用しうる色素又は色素前駆物質は
、例えば、メチレンブルー、ジクロロインドフェノール
、レサズリン及び種々のテトラゾリウム化合物、例えば
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムプロミド、２，３．
５−）ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド、テ
トラニトロブルー、テトラゾリウムクロリド及びニトロ
テトラゾリウムバイオレット及びその他、例えば米国特
許第４．５２５，４５３号明細書に記載されているもの
を包含する。

詳述すれば、本発明に有用な還元性化合物は、構造式： ＣＡＲ→Ｒ１）７ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換芳香族又はキノン核を
表し、Ｒ１は本明細書に記載する移動性の、検出可能な
物質を含む基を含み、ｎは１又は２である〕を有する。

用語“移動性の、検出可能な物質”とは、還元性化合物
に結合しているときは第一のスペクトル吸収バンドを有
し、還元性化合物から放出されたときに第二の吸収バン
ドを有する色原体基、又は還元性化合物に結合されてい
るときは第一のスペクトル吸収及び放出バンドを有し、
放出されると、第二のスペクトル吸収及び放出バンドを
有する螢光助剤基と定義することができる。

このような核の例を以下に示す。更に、Ｒ１が■１であ
る場合には、ＣＡＲ→１０．は水中で測定した場合に少
なくとも＋１００＋ｍＶ、アセトニトリル中で測定した
場合に少なくとも一６５０ｍＶの還元電位（Ｅ、／りを
有する。このＥｌ／□値は、還元及び生理学的ｐＨ（す
なわち、９またはそれ以下のｐＨ）での化合物からの検
出可能な物質のその後の放出を容易にする。このような
測定は、示差パルスポーラログラフイー又はサイクリッ
ク・ボルタメトリイー（ｃｙｃｌｉｃ　ｖｏｌｔａｍｅ
ｔｒｙ）を使用して標準電気化学的技法により行う〔例
えば、５ａｈｙｅｒ及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｊｒ、　、Ｆ
、ｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＥＩｅｃｔｒｏｃｈｑｍｉ
ｓ廊Ｌｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｅｙ　＆５ｏｎｓ、　ニューヨーク、１９７４年、参照
〕。Ｅｌ／２（１“αか、水中で測定して＋１００〜＋
４００ｍＶ、或いはアセトニトリル中で測定して−６５
０〜−３００ｍＶであるのが好ましい。若干の還元性化
合物は水中で最も良く測定され、他のものはアセトニト
リル中で最も良く測定されるので、両方の範囲を示す。

Ｅ＋ｚｚの測定に関する更に詳細なことは下記の第■表
の前に記載する。所望のＥ１／２は、ＣＡＲ−核上の適
切な電子吸引性基によって、又は核に結合した歪のある
縮合環及び両者の組み合わせによって達成される。

一実施態様においては、還元性化合物は還元されて、Ｖ
ａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅにより７ｅｍ、　Ｉｎｔ、　Ｅ
ｄ。

展、２２巻１９１〜２０９頁（１９８３）及び米国特許
第４，２３２．１０７号明細書に記載されているのと同
様に、キノンメチド形成により検出可能な種（所望のＥ
ｌ／□特性を存する）を生成することができる。

別の実施態様では、有用な還元性化合物は、Ｖａｎ　ｄ
ｅ　５ａｎｄ１３の前掲文献の２０６頁に記載されてい
るものと同様であるが、所望のＥｌ／□特性を有するス
ルフィルイミド及びスルフェニルスルホンアミＦ類を包
含する。

好ましい実施態様では、還元性化合物は、Ｒ１ＮＤ化合
物、すなわち、好ましくは生理学的ｐＨで分子内求核置
換を受けて、求核基が化合物の少なくとも１電子還元に
よって生成する場合に１種又はそれ以上の検出可能な種
を放出しうる還元性化合物である。換言すれば、このよ
うな置換は、ＲＩＮＤ化合物が必要な電子を提供する適
当な還元剤（以下に詳述する）によって還元される場合
に起こる。検出可能な種の放出は、好ましい化合物のほ
とんどに関して、少なくとも５０％の検出可能な物質が
ｐＨ７で３０分以内に生じる点で極めて効率良く行われ
る。

用語“分子内求核置換（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ｎｕｃｌｅ−ｏｐｈｉｌｉｃ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ）”とは、一つの分子の求核中心がその分子の求電
子中心である別の位置で反応して、求電子中心に結合し
ていた基又は原子を置換する反応である。−最に、本発
明に有用なＲＩＮＤ化合物は、求核基及び求電子基を分
子の三次元構造中に近接して併存し、それにより分子内
反応が起こり、４〜７個、好ましくは５又は６個の原子
を有する環が形成される。

特に有用なＲＩＮＤ化合物は、構造式：ＣＡＲ−Ｒ’ 〔式中ＣＡＲ−は を表し、Ｒ１は−＋　Ｒ’−）−Ｔ　Ｎ　−Ｑ　−ＦＲ
ＡＧ（式中ｍはＯ又は１、好ましくは１である）を表す
〕で表される化合物である。Ｒ’Ｃよ、好ましくは骨格
の炭素原子数１又は２の、置換又番ま装置（桑アルキレ
ン基（例えばメチレン基、エチレン基又はアルコキシメ
チレン基）を表す。Ｒ５＆よメチレン基であるのが最も
好ましい。Ｑはカルボニル又はチオカルボニル基であり
、カルボニルるのが好ましい。

Ｒ６は、好ましくは炭素原子数１〜４０の置換若しくは
非置換アルキル基（例えばメチル塞、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、イソプロヒル基、ｔ−ブチル基、ヘキシル基
、デシル基、ラウリル基、ベンジル基又はｎ−プロピル
−ｎ−ブチルエーテル）、好ましくは炭素原子数４〜４
０の置換若しくは非置換シクロアルキル基（例えばシク
ロブチル基、シクロヘキシル基又は４−メチルシクロヘ
キシル基）、好ましくは原子数５〜４０個（炭素原子及
びペテロ原子）の置換若しくは非置換へテロ環（例えば
ピリジル基）、又は好ましくは炭素原子数６〜４０の置
換若しくは非置換アリール基（例えばフェニル基、キシ
リル基、ナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基、アントリ
ルＬｐーｔーブトキシフェニル基又はｐ−カルボキシフ
ェニル基）である。Ｒ６は、前記のような置換若しくは
非置換アルキル基又は置換若しくは非置換了りール基で
あるのが好ましい。

ＦＲＡＧは、前記の移動性の検出可能な物質である。

ＦＲＡＧの特別な組成は、所望の検出可能な物質の種類
及び使用する特定の検出手段に応じて著しく変動する。

検出可能な物質は、適当な手段によって直接検出しうる
物質並びに他の物質、例えば被分析物、酵素又は他の試
薬と反応して検出可能な物質を生じうる物質であってよ
い。

特に有用な検出可能な物質は、色原体及び螢光助剤であ
る。色原体の有用なものは、例えばアゾ色素、アゾメチ
ン色素、ニトロフェノール色素、インドフェノール色素
、インドアニリン色素及びトリアリールメタン色素及び
その他、従来公知のものであり、アゾ色素が好ましい。

螢光助剤の有用なものは、例えばクマリン、ウンベリフ
ェロン、フェナレノン及びヘンシフエナレノン、４−オ
キソ−４　−　Ｈ−ヘンシーＣｄ，ｅ）アントラセン、
フルオレセイン及びローダミン螢光色素及びその他、従
来公知のものである。フェナレノン色素が特に有用であ
る。

有用な燐光性物質は、２°．５°−ジブロモフルオレセ
イン及び４’，５’−ショートフルオレセインのような
燐光性物質である。有用な化″Ｖ°発光性物質はルシフ
ェリンである。

ＦＲＡＧは、Ｆ　Ｒ　Ａ　Ｇの一部である２価の一原子
結合によって単結合によってＱに結合する。１原子結合
は、ＦＲＡＧが色原体である場合にはオキシ、チオ又は
セレノであり、ＦＲＡＧが螢光助剤である場合にはオキ
シ又はチオである。結合がオキシであるのが最も好まし
い。

前記のキノン構造中のＲ２、Ｒ：ｌ及びＲ４は、それぞ
れ独立に水素、炭素原子数１〜４０の置換若しくは非置
換アルキル基（例えばメチル基、エチル基、ヒドロキシ
メチル基、メトキシメチル基又はヘンシル基）、置換若
しくは非置換アリール基（例えばフェニル基、ナフチル
基、メチルナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ−７
トキシフエニル基又はｐ−カルボキシフェニル基）又は
一般に正のハメットシグマ値を有し、好ましくは０、０
６より大きいシグマ値を有する電子吸引性基である。Ｒ
２、Ｒ”及びＲ４のうち少なくとも１個は電子吸引性基
である。ハメットシグマ値は、例えばＳｔｅｒｉｃ　Ｅ
ｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ８ａｎｉｃ　Ｃｔ＋ｅ１ｓｔ
ｒｚ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ
．、１９５６年、５７０〜５７４０及びＰｒｏ　ｒｅｓ
ｓ　ｉｎ　Ｐｈ　ｓｉｃａｌ　ＯｒｐａｎｉｃＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，　２巻、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ　。

１９６４年、３３３〜３３９頁に記載されている標準的
方法によって計算される。正のハメットシグマ値を有す
る代表的電子吸引性基は、シアノ基、カルボキシ基、ニ
トロ基、ハロゲン（例えば弗素、臭素、塩素又は沃素）
、トリハロメチル基（例えば、トリフルオロメチル基又
はトリクロロメチルＭ）、ｌ−リアルキルアンモニウム
基、カルボニル基、カルバモイル基、スルホニル基、ス
ルファモイル基２、エステル及び文献に公知の他のもの
、又はこれらの電子吸引性基の１個以上で置換されたア
ルキル基若しくはアリール基（前記のもの）を包含する
。好ましい電子吸引性基は、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ
−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基及び２，５
−ジクロロフェニル基を包含する。メタ位にメトキシ基
又はアセトアミド基を有するアリール基も、有用である
。

Ｒ３は、Ｒ１であってもよく、これによって２：１のモ
ル比の螢光染料分子：元のＲＩＮＤ化合物分子を生成し
うる。

また、Ｒ３及Ｒ４は、−緒にキノン核に結合した歪のあ
る置換又は非置換の縮合炭素同素環を完成するのに必要
な炭素原子を表すことができる。

歪のある縮合環は、従来知られている（例えばＲ４ｅｋ
ｅ　ら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
％　　５０巻４３８１〜４３８４頁、１９６９年）。例
えば、このような環（単環又は双環式）は、骨格に４〜
８個の炭素原子を存していてよい。環は５員の単環又は
７員若しくは８員の双環式環であるのが好ましい。

特に有用な還元性化合物は、Ｍｕｒａらによって１９８
７年５月２７日に出願された欧州特許出願第８７３０４
６８６．６号明細書に記載されているものである。

代表的ＲＩＮＤ化合物を下記の第１Ｉ表に下記の構造式
に関連して列挙する： 第■表におけるＥｌ／□は、−ＣＲ２Ｎ−Ｃ−ＦＲＡＧ
の代わりに水素原子を有する構造のキノン核、すなわち
、 について測定したものである。Ｉｌｌ、、、２は（得ら
れた場合）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ノニオン
界面活性剤〔トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ−１００）
及び燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉ　７　）に溶解した
キノン化合物の水性エマルジョン中で測定した。標準と
しては、標゛準カロメル電極を使用した。若干のＥｌ／
□値（＊で示した）は、標準として飽和カロメル電極を
使用して、アセトニトリル中で測定した。Ｅｌ／□（直
が得られなかったときは、“ＮＡ”で示した。

（以下余白） ＲＩ　Ｎ　Ｄ化合物ＸＸＸＶは、本発明の実施に好まし
い。

本発明の実施に作用なＲＩＮＤ化合物は、一連の個々に
公知の反応を用いて製造される。これらの化合物の製造
は、特開昭６２−５０１６４８号号公報（１９８７年７
月２日公開）及び特願昭６２−１３００３１号明細書（
１９８７年５月２８日出願）に更に詳細に記載されてい
る。

別の実施態様では、還元性化合物は、欧州特許出願第８
７１１０８６３．５号明細書（１９８７年７月２８日に
出願された米国特許出願第８９０，０５１号明細書に記
載されているようなコバル）（ＩＩＩ）ｆｉｔ体であっ
てよい。

一般に、本発明の組成物は、緩？Ｊｉ剤を９又は以下の
ｐＨを維持するのに有効な計で含む。分散液中の緩衝剤
の濃度は、広範に変動しうるが、一般には、０．０１〜
０．１モルン農度である。代表的緩衝剤は、燐酸塩及び
その他、Ｇｏｏｄらによって旧ｏｃｔ＋ｅｍｌＢ↓阜−
１５巻４６７亘（１９６６）及び、）−與すュＲｉｏｃ
ｈｅｍ、、１０４巻３００頁（１９８０）にｔａ告され
ているものを包含する。

本発明は、廃水、食料品、製造溶液及び生物学的流体を
含めて任意の流体試料中の生存グラム陽性及びグラム陰
性菌の鑑別に有用である。本発明は、ヒトの生物学的流
体、例えば尿、皿清、全面、痰、髄液及び当業者に公知
の他の流体中の細菌及び特にヒトの尿路に一般的に見ら
れる細菌の鑑別に特に有用である。

本発明による生存細菌の鑑別は、電子移動剤の存在で実
施するのが好ましい。電子移動剤を存在させると、色素
の放出が一層迅速になる。電子移動剤は、微生物と還元
性化合物との媒介物として作用する移動性化合物である
。電子移動剤は、−般に還元性化合物の濃度に依存する
濃度、好ましくはｌＸｌ０−”〜ｌＸｌ０−’モル濃度
で存在する。

本発明の実施に有用な電子移動剤は、フェナジンメトス
ルフェート、フェナジンエトスルフェート及び当業者に
公知の類似化合物を包含ずろ。異なる化合物の組み合わ
せを必要に応じて使用することができる。

好適な化合物は、欧州特許出願公開第１９０７４０号公
報に記載されている。一般に、これらの化合物は置換ベ
ンゾキノン類及びナフトキノン類である。

このキノン類は、例えば、２，３−ジメチル−５−ヒド
ロキシメチル−１，４−ベンゾキノン、２゜５−ジメト
キシ−１，４−ベンゾキノン、２．３゜５−トリメチル
−１，４−ベンゾキノン、２．６−シメトキシー１．４
−ベンゾキノン、２．３＝ジメトキシ−５−メチル−１
，４−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメチル−１，４−
ナフトキノン及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１，
４−ナフトキノンを包含する。更に、置換１．２−ベン
ゾキノン類、例えば４．５−ジメトキシ−１，２−ベン
ゾキノンは、本発明の実施に有用である。

生存細胞の鑑別は、しばしばそれらの生存細胞に対する
栄養素の存在で実施されるが、その存在は必須ではない
。有用な炭素源及び場合により窒素源を含む任意の栄養
培地を使用することができる。適切な成分及びｐＨを有
する適当な栄養培地は従来良く知られている。

本発明方法において、ポリエーテル抗生物質の濃度は使
用する抗生物質及び還元性化合物並びに鑑別する特定の
細菌に応じて広範に変動しうる。

しかし、これは、一般に少なくとも１０−ｓモル濃度、
好ましくは１０−４〜１０−”モル濃度で存在する。任
意成分である物質は、当業者が通常の実験により容易に
決定しうる量で存在する。

本発明方法は、実験室用の標準的ガラス器具中で、例え
ば、試験管、微量滴定プレート又はスライドを用いて実
施するのが便利である。細菌を含むと思われる液体試料
を還元性化合物、ポリエーテル抗生物質及び必要に応じ
て他の物質と混合する。微生物の反応及びグラム陰性閑
による還元性化合物の還元のため適切な時間の後、還元
により生じる検出可能な種の量を適当な装置及び操作を
用いて測定する。

若干の場合には、還元性化合物と混合する前の前処理工
程で細菌を含む試験試料及び抗生物質を混合し、培養す
るのが望ましい。この工程は、抗生物質中の不純物の存
在により若干の分析で起こるバックグラウンド濃度の量
を減少させることができる。妨害物質を排除する別の前
処理が望ましいこともある。

本発明方法は、また、試験試料を含む多孔性吸収性物質
、例えば紙ストリップを還元性化合物及びポリエーテル
抗生物質の分散液と接触させることによって実施するこ
ともできる。試験試料中の細菌は分散液と混合し、鑑別
に必要な分析反応を開始する。

一つの実施態様では、溶液分析で針鼠した量の試薬を試
験溶液に運ぶのに便利な方法として試験ストリップ使用
することができる。試験ストリップを、既に測定すべき
被分析物を含む溶液中に置く。試薬は試験ストリップか
ら溶液中に溶解して反応溶液を形成する。本発明の試験
ストリップの好ましい実施態様では、試薬を水溶性結合
剤中に担持させる。試験ストリップを７８液中に浸漬す
ると、結合剤は溶解して試薬を放出する。有用な水？容
１生ポリマーは、ポリ　（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン
）及びポリ　（アクリルアミトーク−Ｎ−ビニル−２−
ピロリドン）（９０：１０重量比）を包含する。

また、本発明方法を乾式分析要素と共に実施することが
できる。このような要素は、還元性化合物及びポリエー
テル抗生物質又はその乾燥残渣を含む吸収性担体物質、
すなわち、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシート又
はストリップであってよい。このような要素は、試験ス
トリップ、診断要素、ディソプスティソク又は診断剤と
して従来知られている。

乾式分析要素に使用する場合、本明細書に記載する化合
物及び抗生物質を適当な吸収性担体物質中に吸収又は含
浸によって混入させるか、又は適当な吸収性物質上に塗
布することができる。有用な担体物質は不溶性であり、
水又は生理学的液体、例えば尿又は血清にさらされたと
きに、その構造上の一体性を維持するものである。有用
な担体物質は、紙、多孔性粒状構造体、セルロース、多
孔性ポリマーフィルム、ガラス繊維、織布及び不織布（
合成及び非合成）等から製造することができる。このよ
うな要素を作製するため有用な物質及び操作は、例えば
米国特許第３．０９２，４６５号、同第３．８０２，８
４２号、同第３．９１５，６４７号、同第３，９１７，
４５３号、同第３，９３６，３５７号、同第４，２４８
，８２９号、同第４．２５５，３８４号及び同第４，２
７０，９２０号明細書並びに英国特許第２．０５２．０
５７号明細書によって周知である。

一つの実施態様において、分析要素は、吸収性担体物質
として少なくとも１個の多孔性拡散帯域をその上に有す
る非多孔性支持体を含む。還元性化合物又は抗生物質は
、拡散帯域又は異なる帯域（例えば試薬帯域、記録帯域
又は親水性帯域）に存在することができる。拡散帯域は
、任意の適当な繊維若しくは非繊維状物質又はその一方
若しくは両者の混合物から製造することができる。

拡散帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書に
記載されているような、適当な結合剤と混合したか又は
布に織った繊維状物質を使用して、米国特許第３，９９
２，１５８号、同第４，２５８，００１号及び同第４．
４３０，４３６号明細書及び特開昭５７（１９８２）　
−１０１７６０号公報に記載されているようなポリマー
組成物又は粒状物！（結合接着剤を含むか又は含まない
）から製造することができる。

適当な支持体は、任意の適当な寸法安定性で、２００〜
９００ｎｍの波長の電磁線を透過する、好ましくは透明
な（すなわち、輻射線透過性）フィルム又はシート物質
である。有用な支持体物質は、ポリスチレン、ポリエス
テル、ポリカーボぶ一ト、セルロースエステル及び他の
従来公知のものを包含する。

要素は、多数の帯域を有していてよく、帯域は、重ねら
れた層であるか又は同一層中の異なる領域であってもよ
い。還元性化合物、ポリエーテル抗生物質及び他の任意
の試薬は、要素内の同−又は異なる帯域に存在すること
ができる。要素の構造は、例えば前記の特許明細書に記
載されているように、従来良く知られている。

本発明により、異なる種々の要素を製造することができ
る。任意の所望の幅の長いテープ、シート、スライド又
はチップを含めて種々の形で要素を形成することができ
る。

要素を用いて実施する方法は、手操作で又は自動的にす
ることができる。一般に、要素を供給ロール、チップ包
装物又は他の供給源から採取し、試験すべき液体試料（
例えば２００μｌ以下）と、試料が要素中の試薬と混合
するように接触させることによって鑑別を行う。このよ
うな接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中
に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて
一滴以上の試料を手又は機械で要素に落とすことによっ
て達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。生存グラ
ム陰性微生物の検出は、還元性化合物が還元されて、適
当な方法で検出されうる種を放出する場合に達成される
。

〔実施例〕

本発明方法を実施する際には、下記の操作を実施した： 細胞をＢＩＩＩ中で３７℃で一夜培養して停止期にする
ことによって細菌懸？ｒ：Ｊ？ｖ、を製造した。緑膿菌
（Ｐ、　　ｕ皿計匹且）を振盪しながら培養した。

−夜培養した培養成約４Ｑｍｌを遠心分離し、デカント
し、０．０５モル濃度燐酸カリウム緩衝液又は０．０５
モルＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７，８）
で−度洗浄し、緩衝液中に再懸濁した。

前記の第１表のＲＩＮＤ■をＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド中に、溶剤１　ｍｌ当たり化合物１６ｍｇの割合で
溶解させることによってＲＩＮＤ化合物を含む分散液を
製造した。得られた溶液の既知早（２５０μｌ）をトリ
トン（ＴＲ［ＴＯＮ）　　Ｘ　−１００界面活性剤５０
０μｌに添加した。この混合物を次に０．０５モルＩ−
（Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液２５ｍｆに攪拌しながら滴加し
た。水と相溶性のＲＩ　Ｎ　Ｄ化合物ｘｘｘｖを含む？
８液は、該化合物（１６ｍｇ／ｍｅ）を０．１％ｆＪ　
Ｍ　？ｇ液で酸性にしたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
に溶解することによって製造した。

例ｔ：１ｔＪ鋸 この例は、本発明方法を米国特許第４，５２５，４５３
号明細書に記載されている従来方法と比較するものであ
る。

ターギトール（ＴＥＲＧＩＴＯＬ）　７アニオン界面活
性剤を従来方法により生存細菌を鑑別するため使用した
。種々の濃度のターギトール７界面活性剤を１０％グル
コースン容液（５０μｍ）、メタノール中の３−　（４
，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニ
ル−２Ｎ−テトラゾリウムプロミド（５ｍｇ／ｍＺで２
５．ｃｒｌ又はＲＩＮＤ■分散液（１，５ｍｆ）及びフ
ェナジンメトスルフェート（メタノールｌ　ｍｌ当たり
３ｍｇで２５μｍ）とン昆合した。各試験溶液の容量を
ｆｉ酸カリウム緩衝液で３　ｍｌにした。次に、細胞懸
濁液（約１０８細胞／ｍｅで１００μＩりを添加した。

溶液をグラム（−）菌である大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ
）又はグラム（＋）閑である黄色ブドウ球菌（Ｓ、　　
βｕｒｅｕｓ）の存在で３７℃で１５分及び３０分培養
した。形成した色素の量を肉眼で測定し、下記の等級で
評価した：Ｏは色素が形成しなかったことを示し、十／
−は僅かに色素が形成したことを示し、１＋は少し色素
が形成したことを示し、２＋は中程度の色素形成を示し
、３＋は強い色素形成を示し、４＋は極めて強い色素形
成を示す。

下記の第■表の結果は、ターギトール７界面活性剤は還
元性化合物としてテトラゾリウムプロミドを使用したと
きに適切な鑑別を与えるが、ＲＩＮＤ■を還元性化合物
として使用すると鑑別できないことを示す。

（以下余白） 同様に、細菌の鑑別にＲＩＮＤ■と共にポリエーテル抗
生物質であるカリマイシンを使用した。

１Ｍ塩化カルシウム溶液２５μｌを各試験）８液に添加
し、炭素源としてグルコースの代わりに１０％酵母抽出
液の存在で緑膿菌の応答を測定する以外は、前記のよう
に分析を実施した。各試験でカリマイシンの最終濃度は
１０−３モル濃度であった。

塩化カルシウムだけを含む対照溶液を５元性化合物のぶ
元を抑制しなかった。

下記の第■表に示した結果は、カリマイシンが生存グラ
ム陽性菌による還元性化合物の５元を選択的に実質的に
抑制するが、生存グラム陰性菌の還元能を抑制しないこ
とを示す。

第■表 グラム（−）菌−↓」づ辷　１」−分 大腸菌（対照）　　　　　　　　　４→−４＋大腸菌＋
カリマイシン　　　　　３＋　　４→−肺炎桿菌（Ｋ、
　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　（対照）　　４　＋　　　
４　＋肺炎桿菌＋カリマイシン　　　　４Ｆ　　４←プ
ロテウス・ブルガリス（Ｐ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ）（対
照）　　　　　　　　　　　　　　４＋　　　４＋プロ
テウス・ブルガリス＋ カリマイシン　　　　　　　　　４＋　　４十緑膿菌（
対照）　　　　　　　　　　３＋　　　４＋緑膿菌→カ
リマイシン　　　　　２＋　　４＋グラム（＋）７１　
　　　　　　１１分　Ｊ度分黄色ブドウ球菌（対照）　
　　　　　４＋　　　４＋黄色ブドウ球菌十カリマイシ
ン　ＯＯ ストレプトコッカス・フエカーリス （Ｓ、　ｆａｅｃａｌｉｓ）　（対照）　　　　　　　
４＋　　　４＋ストレプトコツカス・フエカーリス ＋カリマイシン　　　　　　　　＋／−＋／−化膿レン
サ球Ｏ３（Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（対照）　　　　
　　　　　　　　　４＋　　　４＋化化膿フン球菌十カ
リマイシン　００ これらの実施例は、２種のポリエーテル抗生物質、すな
わちモネンシン及びラサロシドを使用して溶液分析で生
存グラム陽性菌及びグラム陰性菌を鑑別することを示す
ものである。

これらの実施例には、下記の物質を使用した。

前記のようなＲＩＮＤ■のストック分散液、グルコース
（水中１０％）、トリメチル−１，４−ベンゾキノン（
１，５ｍｇ／−メタノール）、メタノールｌ−当たり１
ｍｇ、５ｍｇ及びｌｏｍｇの各抗生物質。

微生物細胞を前記のように培養した。概算の最終細胞濃
度は、大腸菌については１．４ＸｌＯ’細胞／　ｍｌ、
黄色ブドウ球菌については２．４Ｘ１０７細胞／　ｍｌ
であった。

１、２ＩＩＩの緩衝液、５０μｌのグルコース溶液、１
．５　ｙｎｌのＲＩＮＤ■分散液、１００μｌの抗生物
質溶液、１００μ２の細胞懸濁液及び２５μｌの電子移
動剤溶液を順次添加することによってム（験溶液を調製
した。細胞対照溶液は、抗生物質を除いてすべての試薬
を含んでいた。ハックグラウンド対照は、緩衝液対照及
び溶液対照とから成る。

緩衝液対照は、抗生物質及び細胞を除いてすべての試薬
を含んでいた。溶液対照は、細胞を除いてすべての試薬
を含んでいた。

すべての溶液について、培養０分及び３７℃で３０分培
養後に６３５ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取り、変化
（ΔＯＤ）を測定した。下記の第７表には、結果をＲＩ
ＮＤ■の還元の補正抑制率として示す。補正抑制率は、
抗生物質を用いない対照試験から得たΔＯＤと試験のΔ
ＯＤとの間の差を抗生￥ＩＡ質を用いない対照のΔＯＤ
で割ることによって算出した。適切なパックグラウンド
対照の読みを減算することによってすべての読みを補正
した。モネンシン及びラサロシドは、還元性化合物とし
てＲＩＮＤ■を使用してグラム陽性菌及びグラム陰性菌
を鑑別するのに有効であった。

第７表 炭１ ラサロシドン状 ０．０３３ｍｇ／ｍＲ６，６３５，２ ０、１６６ｍｇ／ｍｌ　　　　１０．５　　　　　　５
０．９０．３３３ｍｇ／ｍｆ　　　　２５．５　　　　
　　６０．１±ユ 天才し２Ｇ乙１度 ０．０３３ｍｇ／ｍ！　　　　　　　５．１　　　　　
　　　３４．４０、１６６ｍｔｔ、７ｍ１　　　　　抑
制なし　　　４３．００、３３３　ｍｇ／　ｍｌ　　　
　　抑制なし　　　４２．０この例は、水と相溶性の還
元性化合物及びポリエーテル抗生物質を使用して本発明
による細菌の鑑別を説明するものである。

１００μＡのＲＩ　Ｎ　Ｄ　　ＸＸＸＶ溶液（酸性ニシ
タＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドｌ　ｍｌ当たり１６ｍ
ｇ）、２００μｐのグルコース溶液（水中１０％）、２
００μｌのトリメチル−１，４−ペンヅキノンン容液（
メタノールｌ　ｍｌ当たり１．５ｍｇ）及びｔ表ｆｆｉ
　？１″１１０ｍ１から溶液を製造した。

５０μｌの緩衝液、５０μｌのポリエーテル抗生物質Ａ
　２３１８７　（遊離酸、メタノール９０．０１モル）
、１０μβの塩化カルシウム溶液（１モル）（緩衝液及
び抗生物質の希釈列を作って種々の抗生物質／震度を得
た）、５０μｌの適切な細胞懸濁液（大腸菌、約１０’
細胞／　ｍｌ及び黄色ブドウ球菌、約１０８細胞／　ｍ
ｌ　）及び２００μ／のＲＩＮＤ溶液から試験溶液を製
造した。例２及び例３に記載したように対照溶液を製造
した。

５４０ｎｍの励起及び６２０ｎｍの発光時で読み取るよ
うに変形した標阜分光光度計を使用して相対酌量光度を
測定した。若干のン届度水阜の抗生物質について３７°
Ｃで３０分後に相対螢光度の変化（Δ）を測定した。結
果を下記の第■表に示す。

これらの結果は、本発明の組成物がグラム（＋）菌の還
元能を選択的に実質的に抑制するが、グラム（−）菌の
それを抑制しないことを示す。

（以下余白） 第■表 抗生物質　　　−別包う辷後ｐしＹ」プわｎりしし度−
濃度　　　溶液　　　大腸菌　　黄色ブドウ球−〇ソと
Ｌ−−」几ｑ”　　（ゲーム−）　−１ｋＣ九友土）１
×１０〜’１７　　２８０４　　　　４０９２Ｘ１０−
’２４　　２５４０　　　　３６２４Ｘ１０−’２６　
　２３３８　　　　２９０８Ｘ１０−’２６　　２４１
１　　　　３４５＊細胞を含まない 例５：　テトラゾリウム塩を部Ｊ［１１１７）Ｊ””１
１１３！１ごの例は、ポリエーテル抗生物質及び還元性
化合物としてテトラゾリウム塩を使用して本発明の詳細
な説明するものである。

３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフェニル−２ＩＩ−テトラゾリウムプロミド（メタノ
ールｌ　ｍｌに対して５ｍｇのもの２００μ／）、２０
０μ！のグルコース）容液（水中１０％）、２００μｌ
のトリメチル−１，４−ヘンゾキノン（メタノールｌ　
ｍｌ当たり１．５ｍｇ）及びＩ２ｍ１の緩衝液（０，０
５モル濃度、ｐＨ７，８）を用いて還元性化合物溶液を
製造した。

５０μｌの緩衝液、５０μｌのポリエーテル抗生物質Ａ
　２３１８７　（ｆ１離酸、メタノール中０．０１モル
フ農度）、１０μｌの塩化カルシウム（１モル濃度）（
緩衝液及び抗生物質の希釈列を作って種々の抗生物質濃
度を得た）、５０μｌの適切な細胞懸濁液、大腸菌（約
１０８細胞／　ｍｌ　）又は黄色ブドウ球菌（約１０８
細胞／ｍ１）、及び２００１！のブロミトメ容液を用い
て試験溶液を調製した。対照溶液は前記の例に記載した
ようにして調製した。

標阜分光光度計を使用して、５４０ｎｍで光学濃度を測
定し、３７℃で３０分後に光学７農度の変化（ΔＯＤ）
をθ、り定した。若干の濃度の抗生物質について得られ
た結果を下記の第■表に示す。このデータから、この例
の組成物が！ｌｌ菌の洛別に有用であることは明らかで
ある。

以下７ｉ７白 第■表 ３０光災■Ａ旦旦−一−−− 抗生物質　　　　　　　　　　　　　　黄色ブト濃度　
　　　溶液　　　大腸菌　　　ウ球菌（モル）　　　対
照＊　　（グラム−）（ゲラムコつ−００，０６５０，
６４３０，５０５ ＩＸＩＯ−’０．０５５　　０．５０３　　０．０８９
２Ｘ１０−’０．０４９　　０．５２９　　０．０９６
４ｘｌＯ−’　　０．０７９　　０．５１２　　０．０
６５８Ｘ１０−’　　　＊＊　　　　０．４１３　　０
．０２８＊細胞を含まない ＊＊沈殿、見える着色はない 例６：　端むソ１皿−３２Ｊｌ」社宣−別この例は、本
発明の乾式分析要素を用いて本発明の詳細な説明するも
のである。

市販の３　ｍｓのクロマトグラフィーペーパーのストリ
ップをアセトンで２回洗浄し、５　ｍｌのメタノール、
ｌ　ｍｌのＲｒＮＤ　　ＸＸＸＶ？容液（ＡＨ生にした
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドｌ　ｍｌ　％’ｌたり１
６鼾）、１ｍｌの２．３−ジメトキシ−５−メチルー１
．４−ベンゾキノン（メタノール１−当たり１．８２ｍ
ｇ）　、１　ｍｌのグルコース溶液（水中１０％）及び
ｌ　ｍｌのポリエーテル抗生物質Ａ　２３１８７　（ジ
メチルスルホキシドｌ　ｍｌ当たり２５ｍｇ）を含む試
験溶液中に浸漬した。対照溶液は、抗生物質を省いた以
外は同様にして調製した。祇ストリップを同様に対照？
８液中に浸漬した。全部のストリップを暗所で２５℃で
１時間乾燥した。

祇ストリップから標準紙パンチを使用して円形要素（直
径約０．６　ｃｍ　）を裁断し、要素を微量滴定プレー
ト中に置いた。

大腸菌（約５Ｘ１０’細胞／　ｍｌ）又は黄色ブドウ球
菌（約５Ｘ１０Ｉ′細胞／ｍ１）の細胞懸濁液の試料（
１０μりを要素に施した。他の要素にはｆｆｔｆＪｉ液
（１０μｌ）を施してバックグラウンドを測定した。ポ
リエーテル抗生物質Ａ２３１８７は活性を発揮するため
にカルシウムイオンを必要とするので、各細胞懸濁液又
は緩衝液のｌ　ｍｌに対して１Ｍ塩化カルシウム溶液２
５μｌを、要素に施す前に添加した。

標準分光光度計を用いて相対酌量光度（励起５４０ｎｍ
、発光６２０ｎｍ）を測定し、３７℃で３０分後に相対
酌量光度の変化を測定した。下記の第〜１表には、結果
を前記の例２及び例３に記載したようにして算出したＲ
ｒＮＤＸＸＸＶの還元の補正抑制率として示す。本発明
の乾式要素が、細菌の鑑別に有用であることは明らかで
ある。

第４表 細１　　　　　　　　−補ｆ迎」町率ユ大腸菌（グラム
−）　　　　　　　　１１．５黄色ブドウ球菌（グラム
＋）７０ ＲＩＮＤ化合物をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに？８
解する（濃硫酸０．１％で酸性にしたン容剤１ｍ１当た
り１６ｍｇ）ことによってＲ［ＮＤ］Ｘ化合物の分散液
を調製した。既知量（２５０μ７りの分散液をトリトン
Ｘ−１００ノニオン界面活性剤５００μρに添加した。

この混合物を撹拌しなから０．０５Ｍｆｆｊ衝液（ｐＨ
１？、　８　）　　２５　ｒｒｌに滴加した。

緩衝液（１，２ｄ）、塩化カルシウム溶液（２５μ！、
０．１モル）、グルコース？容？夜（５０μｌ、水中１
０％）、ＲＩＮＤ分散液（１，５ｍ１）　、イオノマイ
シン（７５μ１１約１．７Ｘ１０−’モルの最終濃度と
した）、１００μｌの細胞（約１０’細胞／−の最終ン
震度）及びトリメチル−１，４−ベンゾキノン（２５μ
１１メタノール中０．０１モル濃度）を順次添加して試
験溶液を調製した。前記の例に記載したようにして対照
溶液を製造した。

光学潤度を（ｉ３５ｎｍで３７°Ｃで読み取り、３０分
後の４度の変化を測定した。下記の第■表には、結果を
ＲＩＮＤ化合物の１＝元の補正抑制率として示す。この
例は、抗生物質イオノマイシンを使用してグラム陽性菌
及びグラム陰性菌を鑑別しうろことを示す。

第■表 一一坦菌　　　　　　　　」１１０亜且キユ大腸菌（グ
ラム−）　　　　　　　抑制なし黄色ブドウ球菌（グラ
ム＋）　　　　５９．７以下金白 例８及び９　：　　ＲｒＮＤ　ＸＸＸＶ　　び′１１　
Ａこれらの例は、例７と同様であるが、２種の他のポリ
エーテル抗生物質、すなわち、抗生物質Ａ２０４及びセ
ブタマイシンを使用した。両方の抗生物質は、グラム陽
性菌及びグラム陰性菌の鑑別に有用である。

ＲＩＮＤ化合物溶液（酸性にしたＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド μｌ）及びトリトンＸ−１００ノニオン界而活性剤（２
００，ｃｒｔりの溶液を緩衝剤溶液（９．１ｍｌ）、グ
ルコース溶液（２００μｌ、水中１０％）及びトリメチ
ル−１．４−ベンゾキノン（メタノールｌ　ｍｌ当たり
１．５ｍｇの）８液２　０　０　ｐ　１　）　ニ攪拌シ
ｉ；がら添加することによってＲＴＮＤＸＸＸν化合物
の分散液を調製した。

抗生物質を細胞と下記のように予備混合した：抗生物質
溶液（ジメチルスルボキシト用ｍ１当たり１０ｍｇのン
容液５０μｎを］　ｍｌの細ｌ包（ｉ表街液１−当たり
細胞５Ｘ１０’）に添加し、得られた混合物を約２５℃
で５分間培養した。更に、塩化カルシウム溶？ｆｆ１（
１０μｌ、１モル濃度）をセプタマイシンを含む溶液に
添加した。バックグラウンド対照溶液は、細胞の代わり
にｌ　ｍｌの緩衝液を含むものとした。

微量滴定ウェル中の試験溶液は、緩衝液（５０μβ）、
抗生物質及び細胞溶液（５０μｌ）及びＲＩＮＤ分散液
（２００μｌ）を含む。細胞対照は抗生物質を含まない
ものとした。

グイナテソク（ＤＹＮＡＴＥＣＩ＋）マイクロフルオル
リーダー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ　Ｒｅａｄｅｒ）を使
用して５４０ｎｍで励起の後、６２０ｎｍの発光で相対
酌量光度を測定し、３７°Ｃで３０分後の螢光の変化（
Δ相対酌量光度）を２回の反復試験の平均値として測定
した。下記の第Ｘ表は、これらの試験の結果をｍｆ記の
例に定義したような補正抑制率として示す。

（以下余白） 第Ｘ表 抗生春、、　　　　　ｍ菌　　　　　　　補正抑市１率
Ａ２０４　　大腸菌（グラ１、−）　　　　　　　３．
６黄色ブドウ球菌（グラム＋）３５．８ セプタマイシン 大腸菌（グラム−）　　　　　　５２．３黄色ブドウ球
菌（グラム＋）？４．９ （発明の効果〕 本発明は、生存細胞のグラム型を鑑別するため迅速、簡
単で、かつ比較的に安価な手段を提供する。本発明によ
れば、標準グラム染色技法の不所望に時間のかかる性質
が回避される。更に、広範な還元性化合物を使用するこ
とができ、これにより分析に著しい柔軟性が与えられる
。例えば、このような柔軟性により、感度が高く、細１
ηに対して毒性が低いか又は生物学的流体中に見られる
）替在的妨害物質によって影響されないスペクトル領域
で検出することができる色素を使用することが可能にな
る。

これらの利点は、１元抑制物質の不存在で細菌によって
還元されうる化合物と組み合わせてポリエーテル抗生物
質を使用することによって達成される。抗生物質は、グ
ラム陽性菌の還元能を選択的かつ実質的に抑制するが、
グラム陰性菌の能力は、実質的に影響されない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）還元抑制物質の不存在下に生存グラム陽性及
   びグラム陰性菌の両方によって還元されて検出可能な物
   質を生成しうる化合物、並びに（ｂ）グラム陽性菌によ
   る還元性化合物の還元を選択的かつ実質的に抑制するの
   に充分な量で存在するポリエーテル抗生物質 を含む生存グラム陽性菌及びグラム陰性菌の鑑別用組成
   物。 ２、（ａ）還元抑制物質の不存在下に生存グラム陽性及
   びグラム陰性菌の両方によって還元されて検出可能な物
   質を生成しうる化合物、並びに（ｂ）グラム陽性菌によ
   る還元性化合物の還元を選択的かつ実質的に抑制するの
   に充分な量で存在するポリエーテル抗生物質 を含む生存グラム陽性菌及びグラム陰性菌の鑑別用分析
   要素。 ３、Ａ、生存グラム陽性菌及びグラム陰性菌を含むと思
   われる液体を（ａ）還元抑制物質の不存在下に生存グラ
   ム陽性及びグラム陰性菌の両方によって還元されて検出
   可能な物質を生成しうる化合物並びに（ｂ）グラム陽性
   菌による還元性化合物の還元を選択的かつ実質的に抑制
   するのに充分な量で存在するポリエーテル抗生物質と混
   合し、そして Ｂ、グラム陰性菌の存在により生じる検出可能な物質を
   測定する 工程を含む生存グラム陽性菌及びグラム陰性菌の鑑別方
   法。