JPH01246240A - ベンズフェナレノン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バイオメディカルの研究および臨床化学に有
用な化合物に関する。

〔従来の技術〕

一つの型のものを他の型のものと区別するかまたは更に
観察可能にするために、染料（又は色素、以下同じ）、
特に螢光染料で生物学的組織および細胞を染色すること
は当該技術においてよく知られている。電磁スペクトル
の赤領域において螢光を発する染料は特に望ましい。あ
る種のフェナレノン化合物は、Ｃｏｏｋ他によってＴｈ
ｅ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎＪ、Ｃｈｅｍ、、１１．　ｐ
ｐ、２３０−２３５（１９５Ｂ）に、および５ｏｌｏｄ
ａｒ他によってＺｈｕｒｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃｂｅｓ
ｋｏｉ　Ｋｈｉｍｉｉ、　１６＋ｐｐ、１０６２−１０
６４（１９８０）に記載されているが、その化合物の用
途は記載されていない。

さらに、水、牛乳および生物学的液体の如き液体の化学
分析が、健康維持および診断上の注意のためにしばしば
望ましいか必要である。このような分析を容易にするた
めの種々の組成物および要素が知られている。このよう
な組成物および要素には、−ｉに、検体として同定され
る分析における物質を測定するための試薬組成物が含ま
れている。検体は、微生物または酵母細胞の如き生きて
いる有機体または生きていない化学物質であり得る。試
薬組成物は検体との相互作用により、検出し得る変化（
例えば染色生成）を与える。

最近、多くの研究が全血、血清、血漿、尿および類似物
の如き生物学的液体の迅速かつ多量の診断的または臨床
的分析に有用な組成物および要素を開発することを指向
している。

例えば、伝染性疾病の迅速かつ効果的診断および処置の
ために、疾病を引き起こすバクテリアを出来るかぎり迅
速に検出できることが望ましい。

泌尿器系の伝染は最も一般的な細菌性疾病の一つであり
、第２はしばしば呼吸器系の伝染である。

多くの泌尿器系伝染は、重大な細菌尿症と見られる状態
で尿１−当り１００．０００またはそれ以上の有機体の
細菌数を伴なう。

還元剤の存在下で還元されて検出し得る染料を与える多
くの化合物が知られている。例えば、このような化合物
の多くのものは写真プロセスで有用である。しかしなが
ら、このようなプロセスは高いｐＨ１一般に１０より高
いｐＨで行なわれ、そのようなｐＨでは多くの分析的測
定は成功裡に行うことができない。

螢光染料を使用する分析的測定は、色度染料を使用する
ものよりも高感度であることが一般に知られている。種
々の螢光検定が開発されており、その多くは螢光染料と
してクマリンまたはアンヘリフエロン（ｕｍｂｅｌｌｉ
ｆｅｒｏｎ）誘導体を使用するものである。いくつかの
螢光染料は高ｐＨ（９より大）でのみ使用することがで
きる。これらは、一般により低いｐＨで行なわれる生物
学的検定では使用することができない。更に、クマリン
またはアンベリフェロン染料は、スペクトル干渉が著し
い波長、即ち５０Ｑｎｍより低い波長で螢光を発する。

この特徴は生物学的検定における有用性を更に制限する
。

最近、改良された螢光アンヘリフェロン誘導体が記載さ
れ（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ　ｅＬ　ａｌ、　８ｕ１１．ＣＩ
＋ｅｍ、Ｓｏｃ。

Ｊａｐａロ１冊ニア３１．１９８５）　、および酸ホス
ファターゼ検定に使用されている（＾ｎａ１．Ｂｔｏｃ
ｈｃｍ、、　１４麩１４６゜１９８４）。これらの染料
のあるものは、約６のｐＫａ値を有し、５９５ｎｍ　（
ｐＨ９）で螢光放射を有すると報告されている。

〔発明が解決すべき課題〕

しかしながら、従来の染料は、５００ｎｍ以下、即ちヘ
モグロビンおよびビリルビンの如き成る種の血清成分が
強いスペクトル吸収を有する同じ範囲内で吸収を示す（
一つの染料はｐ１１９で５品を吸収する）。従って、こ
のような染料を使用する検定はスペクトル干渉を受ける
。

〔課題を解決する方法〕

これらの問題は、染色剤（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｇｅｎ
ｔ）として、弐 （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトまたはアミノであ
る）で表わされる新規なベンズフェナレノン化合物を用
いることによって克服される。

〔実施態様〕

本発明に係る螢光化合物は、前記した通り、式〔式中、
Ｒはヒドロキシ、メルカプトまたはアミノ（ＩＩＮ（Ｒ
’）　−）またはそれらの塩（即ち、例えば塩酸塩、硫
酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロボレートまたはｐ−
）ルエンースルホネートの如き酸塩）である〕によって
表わされる置換または非置換のベンズフェナレノン化合
物である。Ｒ’　は水素、置換もしくは非置換アルキル
（好ましくは、例えばメチル、イソプロピル、ヘキシル
、ベンジルモしくはクロルベンジルの如き炭素原子１〜
１０個のもの）、置換もしくは非置換シクロアルキル（
好ましくは、例えば、シクロペンチルもしくはシクロへ
キシルの如き炭素原子５〜１２個のもの）、置換もしく
は非置換フェニル（例えばｐ−アルキルフェニル）、ま
たは置換もしくは非置換へテロサイクリック成分（例え
ばピリジル、チエニル）である。好ましくは、Ｒはヒド
ロキシまたはＲ１が水素または置換もしくは非置換の炭
素原子１〜３個の低級アルキルであるアミノである。

本発明に係るベンズフェナレノン化合物のうち生物学的
試料の染色剤として有用である代表的螢光化合物には以
下の化合物ｌ及び■である。

これらの化合物は、式中に特に示したちの以外の１個ま
たはそれ以上の置換基を該置換基がその螢光性またはｐ
Ｋａ値に不利に影害しない限り、融合環の１個またはそ
れ以上の位置において有し、その置換基には、置換また
は非置換アルキル（好ましくは、例えばメチル、エチル
またはベンジルの如き炭素原子１〜１２個のもの）、置
換または非置換ヒドロキシアルキル（好ましくは、例え
ばヒドロキシメチルまたは２−ヒドロキシエチルの如き
炭素原子１〜１２個のもの）、置換または非置換アルコ
キシカルボニル（好ましくは、例えばメトキシカルボニ
ルまたはエトキシカルボニルの如き炭素原子２〜１２個
のもの）、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、またはブロ
モ）、シアノ、カルボキシ、アシル、置換または非置換
了り−ルスルホニル（好ましくは、例えばフェニルスル
ボニルまたはトリルスルホニルの如き炭素原子６〜ＩＯ
個のもの）、置換または非置換アルキルスルホニル（好
ましくは、例えばメチルスルホニルまたはエチルスルホ
ニルの如き炭素原子１〜６個のもの）、および当業者に
知られている他の置換基が含まれる。

上記の化合物■および■は、例えば下記実施例に記載し
た方法によって調製できる。

本発明において有用である螢光化合物は、非緩衝または
緩衝水溶液中で保存して使用することができる。さらに
、化合物■はそのアミン塩に転換し得、塩は水溶液とし
て保存し使用することができる。組成物は一般に、ｐ１
１９またはそれ以下で１種またはそれ以上の適当な緩衝
剤によって緩衝される。有用な緩衝剤は、当業者によっ
て容易に決定され、ホスフェート、ボレートおよびＧｏ
ｏｄ　ｅｔａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　５．４
６７（１９６６）およびＡｎａｌ。

■男班明、、…、　３００（１９８０）に報告されたよ
うな有機緩衝剤を含む。組成物は好ましくはｐＨ６，５
〜８に緩衝される。

本発明の一実施態様において、前記螢光化合物は生物学
的試料、例えば組織および細胞を染色するために、およ
び細胞学用に使用し得る。

他の実施態様において、螢光化合物は染料前駆体を形成
するためにブロックされ得る。ブロックされた時、この
化合物は担体（下に記す）に付着された時と同様に転移
性（ｓｈｉｆｔａｂｌｅ）である。ブロックされた染料
は、検定の間にブロッキング基から螢光染料を放出する
ような適当な処理または条件に賦され得る。例えば染料
前駆体は、検体または他の試薬によって化学的、加水分
解的または酵素的に作用され得る。

更に他の実施態様において、前記螢光成分は還元性化合
物から放出される。還元性化合物に付いている間、螢光
部分は、それが放出された時に示す吸収および放射スペ
クトルとは異なった吸収および放射スペクトルを有する
。放出時の放射スペクトルは一般により長い波長、即ち
少くとも５８０ｎｍである。

さらに特に有用な還元性化合物は、構造式ＣＡＭＲ’）
、　　（式中、Ｃ舗−は、置換または非置換の芳香族ま
たはキノン核を表わし、Ｒ１は本発明に係るベンズフエ
ナレノン化合物から成る螢光部分からなり、ｎは１また
は２である）を有する、このような核の例は次に示され
る。さらに、Ｒ１がＨによって置換された時、ＣＡＲ−
（Ｉ＋）。は水中で測定した持歩くとも＋１００ｍＶの
還元電位（Ｅ１７□）を有する。このＥｌ／□値は、生
理学的ｐＨ（９またはそれ以下）での化合物からの転移
性検出可能な種の還元および続く放出を容易にする。こ
のような測定は、示差パルスポーラログラフィまたはサ
イクリックボルタメトリー（ｃｙｃｌｉｃ　ｖｏｌｔａ
ｍｅｔｒｙ）のいずれかを使用する標準の電気化学的技
術によってなされる（例えば、Ｓａｗｙｅｒ　ａｎｄ　
Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊｒ、＋Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｈｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｓ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ、１９７４参照）。好ましくは、Ｅｌ／□は水中で
測定して＋１００ｍＶ〜＋　４００ｍＶである。更に、
Ｅｌ／□測定の詳細は、第１表の前に記載されている。

望ましいＥ　＋／□は、−ト核上の適当な電子吸引性基
または核に付いている融合環と電子吸引性基との組合せ
によって達成される。

有用な還元性化合物の例を次に示す。

還元性化合物の一例は、Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄ、ハＬ
ム他μＬ匡后則１国吐、η、　ｐｐ、１９１〜２０９　
（１９８３）および米国特許第４，２３２．１０７号に
記載されていると同様に還元されてキノンメチド（ｑｕ
　ｉｎｏｎｅｍｅ　ｔｈ　１ｄｅ）生成の間に検出可能
な種を与えるが、望ましいＥｌ／□性質を有する。

他の実施態様において、有用な還元性化合物には、上記
Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅ文献の２０６頁に記載されて
いるものと同様のスルフィルイミドおよびス以下余白 ルフェニルスルホンアミドが含まれるが、望ま、しいＥ
ｙ、性質を有している。

好ましい実施態様において、還元性化合物は生理学的、
Ｈで分子内求核置換が起こり、求核基が化合物の少くと
も１個の電子の減少によって発生した時、１個はそれ以
上の螢光部分を放出し得る。

換言すれば、このような置換は化合物が適当な還いＥＨ
値を有しておりそれによって化合物の還元とそれに続く
螢光部分の放出を容易にすることである。この放出は非
常に効果的であり、大部分の化合物にとって、少くとも
５０％の螢光部分は約−７において３０分以内に放出さ
れる。ここに記載された化合物は、螢光部分を迅速に放
出し、迅速検定に許容されるため特に有用である。類似
の写真用化合物はより低いＪ値を有しており、高い…（
１３〜１４）でのみ染料を放出するか、または写真用Ｐ
Ｈで非常に非効率的に（即ちゆっ〈９）染料を放出する
。

「分子内求核置換（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｎ
ｕｃｌｅｏ−ｐｈｉ目ｃ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎす」
の語は、分子上の求核中心が分子内の他のサイトで反応
し、そのサイトは求電子中心であシ、求電子中心に付い
ている基または電子の置換を効果的にする反応を意味す
る。

一般に本発明において有用であり、ここではＲＩＮＤ化
合物とされるこのような化合物は、分子の三次元立体配
置に極めて近接して並んでいる求核基と求電子基を有し
、それによって分子内反応が生じ、４〜７原子を有する
環が生成する。

求核置換の速度はＲＩＮＤ化合物の還元の前は実質的に
零である。これによって、ＲＩＮＤ化合物は還元の前は
安定である。

特に有用なりＩＮＤ化合物は、構造式ＣＡＲ−Ｒ’また
ば１である〕 を有するものである。Ｒ５け置換または非置換アルキレ
ン、好ましくは主鎖に炭素原子１または２個のもの（例
えば、メチレン、エチレンまたはアルコキシメチレン９
である。最も好ましくは、Ｒはメチレンである゛。Ｑは
カルｇニルまたはチオカルボニルであり、好捷しくはカ
ル＋ｌ？ニルである。

Ｒ６はメチルである。

ＦＲＡＧは置換または非置換　　　　　゛ベンズフェナ
レノン化合物から誘導される上記定義の如き螢光部分で
ある。この種は、存在する還元剤の量に直接関係し得る
量で放出される。

ＦＲＡＧは、ＦＲＡＧの一部である二価の単原子結合に
よる一重結合によりＱに結合している。好ましくは、こ
の単原子結合はオキシまたはチオであり、最も好ましく
はオキシである。

上記キノン構造におけるＲ２．Ｒ３およびＲ４は、独立
に、水素、炭素原子１〜４０個の置換または非置換アル
キル（例えば、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メ
トキシメチルまたはベンジル）、置換または非置換アリ
ール（例えば、フェニル、ナフチル、メチルナフチル、
ｐ−ニトロフェニル、ｍ−メトキシフェニルまたはフェ
ニルスルホンアミド）または、一般に正のハメットシグ
マ値（Ｈａｍｍｅｔｔ　ｓｉｇｍａ　ｖａｌｕｅ）、好
ましくは、０．０６よりも大きいシグマ値を有する電子
吸引性基である。ハメットシグマ値は、例えば、５ｔｅ
ｒｉｃＥｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、Ｉ
ｎｃ、、１９５６．ｐｐ、５７０〜５７４およびＰｒｏ
ｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｖｏｌ、　　２．　　丁ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９６４゜ｐｐ、　３３３〜３３
９に記載されている標準的方法に従って算出される。正
のハメットシグマ値を有する代辰的電子吸引性基には、
シアノ、カルがキシ、ニトロ、ハロ（ｆＬｔｆｆフルオ
ロ、フロモ、クロロまたはヨード〕、トリハロメチル（
例えば、トリフルオロメチルまたはトリクロロメチル）
、トリアルキルアンモニウム、カルボニル、カルバモイ
ル、スルホニル、スルファモイル、エステルおよび当該
技術で知られている他のものが含１れる。

好ましい電子吸引性基には、ｐ−ニトロフェニル、ｍ−
ニトロフェニル、ｐ−シアノフェニルおよび２．５−ノ
クロロフェニルが含まれる。メター位にメトキシ基また
はアセタミド基を持つアリール基もまた有用である。

Ｒ３は才たＲ１であり得、それによって、潜在的に２：
１の螢光部分分子の最初のＲＩＮＤ化合物分子に対する
モル比を与える。

或いは、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、キノン核に付
いた置換または非置換融合カルボサイクリック環を完、
結するために必要な炭素原子を表わし得る。例えば、こ
のような環（モノ−またはビサイクリック）は、主鎖中
に炭素原子４〜８個、好−ましくけ５〜７個を有し得る
。

以下余白 本発明において有用なりＩＮＤ化合物は、一連の個々に
公知の反応を使用して調製される。−殻内に、一連の調
製には、次の一般的工程、即ち、（１）置換ヒドロキノ
ンの調製、（２）オキサジン環の形成、（３）オキサジ
ン環の開環、（４）カルバモイルクロライドの調製、お
よび（５）　ＦＲＡＧ成分とカルバモイルクロライドと
の反応が含まれる。　　　°　　　５シ　　！− 本発明の実施に有用な他のＲＩＮＤ化合物には、適当な
ＥＨ値と構造式ＣＡＲ（−Ｒ’）ｎを有するものが含ま
れる。この構造式において、 （１）　　ＣＡＲ−は１，２−ナフトキノン、１，２−
１１．４−または９．１０−アンスラキノン、４，４′
−ノフエノキノン、アズロキノンまたは１．６−（１０
１アヌレノキノンの置換または非置換核であり、Ｒ１は
核に、炭素原子１個離れて、または核の１個のオキソ基
からベリ位に付いている。核は、１個またはそれ以上の
Ｒについて上記した如き電子吸引性基で置換されるか、
または１個もしくはそれ以上のＲおよびＲについて上記
した如き融合環を有していてよい。Ｒ１は上記定義した 数である。

（２）　　ＣＡＲ−は であり、そのいずれかは、Ｒ、ＲおよびＲについて上記
定義した１種またはそれ以上の電子吸引性基で置換され
ることができ、Ｒ１は上記定義した＋Ｒ５會Ｎ−Ｑ−Ｆ
ＲＡＧであり、ｎは１または２である。

（３）　ＣＡＲ−は構造式 〔式中、Ｒ７は炭素原子１〜２０個の置換または非置換
アルキル〔例えば、メチル、エチル、メトキシメチル、
インプロビル、ドデシル、ヘキサデシルまたはオクタデ
シル〕である〕 の置換または非置換ニトロベンゼノイド核であり、Ｒ１
は上記定義した＋Ｒ５チーＮ−Ｑ−ＦＲＡＧであり、ｎ
は１である。

一般に、ここに記載した還元性化合物は限定された水溶
解性を有している。このため、これらを水性環境で使用
する時、使用に先立って化合物の分散液を、例えば被覆
配合で調製することが最も良い。このような分散液は、
一般に、還元性化合物、水性緩衝溶液および界面活性剤
かまたは該化合物用の水混和性有機溶剤のいずれかまた
は両者からなる。

本発明を実施するに有用である界面活性剤には、化合物
の還元を抑制しないいかなる界面活性剤も含まれる。一
般に、生きている細胞の検出のために有用な界面活性剤
は、例えばアルキルアリールポリエトキシアルコール、
ｐ−アルキルアリールオキシポリグリシドール、および
当業者に公知の他のものを含むノニオン界面活性剤であ
る。

有用な水混和性有機溶剤にはアルコール、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニト
リル、ヘキサメチレンホスホルアミドおよび当業者に公
知の他のものが含まれる。特定の還元性化合物のために
使用される特定の溶剤は、日常の実験によって容易に決
定できる。

って調製できる。還元性化合物を、その分子量に依存す
るが、一般的に溶剤１ｍｔ当り１〜１００ｍ９、好まし
くは５〜ｓｏｍｙの濃度で水混和性溶剤に溶解する。得
られた溶液を次いで適当な界面活性剤と、分散液１　ｍ
ｔ！当り界面活性剤が一般的には０．１〜２４ｍノ、好
ましくは０．５〜１０ｍ９である量で混合する。この調
製は一般的に室温で行なわれる。

これらの分散液には、生理学的ｐＨ（９またはそれ以下
）を維持するために有効な量で緩衝剤が含まれる。分散
液中の緩衝剤の濃度は広範囲に変えることができるが、
一般的には０．０１〜０．５モル濃度である。代表的緩
衝剤については前に記載しである。

ここに記載した還元性化合物は、水性および非水性液体
、例えば生物学的流体、製造工程、廃液、食料品等の分
析的測定用の組成物に有用である。

測定は、化合物の還元および螢光部分の放出をもたらす
単独の反応または一連の反応を経て種々の検体について
なされる。種々の検体には、生きている細胞（例えば、
バクテリア、酵母、白血球、または菌類〕、溝素（例え
ば、す・母−ゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクテート
オキシダーゼ、クレアチンキナーゼ、α−グリセロホス
フェートオキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、
ピルベートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフ
エートデヒドロゲナーゼ、アラニンアミントランスファ
ラーゼ、アスパルテートアミノトランス７アラーゼ、お
よびデヒドロゲナーゼまたはりダクターゼ酵素を含む他
のＮＡＤＨベース、ＦＡＤＨベースまたはオキシダーゼ
ベースの検定〕、生きている細胞以外の生物学的または
化学的還元剤（例、ｔば、アヌコルベート、システィン
、グルタチオンまたはチオレドキシン〕、新陳代謝性物
質（例えば、グルコース、ラクチン酸、トリグリセライ
ドまたはコレヌテロール９、免疫反応剤（例えば、抗原
、抗体または／・ブテン〕が含まれる。

該組成物は、（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ）−１（ＦＡＤ−ＦＡ
ＤＨ）−および（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰＨ）−ベースの反
応を含むフラビン結合のデヒドロゲナーゼおよびオキシ
ダーゼをモニターするために使用できる。このような例
においては、還元性化合物は、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨまた
はＮＡＤＰＨの代わりに螢光染料を与えるために使用で
きる。

ここに記載した還元性化合物は、生物学的試料中の生き
ている細胞を検出または定量するのに特に有用である。

生きている細胞を持っていると考えられるい力）なる生
物学的試料（例えば、食料、組織、地下水、冷却水ｙ薬
製品または下水〕も本発明によってバクテリア、酵母、
菌等について分析できるけれども、本発明は特に、人お
よび動物の流体（例えば、尿、脳背髄液、血液および便
分泌液（５ｔｏｏｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）の如き類
似物〕および大または動物の細胞の懸濁液の如き水性液
体中の・ぐクチリアの検出に有用である。本発明の実施
は、尿（稀釈または非稀釈り中の尿路病原菌の検出用に
特に重要である。

還元性化合物を使用して生きている細胞を測定する時、
生きている細胞が電子移動剤（ここではＥＴＡとする）
と作用することが迅速な染料放出のために好ましい。Ｅ
ＴＡの存在は、生きていない検体の分析的測定のために
、さらに効果的な染料放出をもたらす。ＥＴＡは決定さ
れる物質（例えば生きている細胞〕と還元性化合物との
間の媒介体として作用する移動性化合物（ｍｏｂｉｌｅ
　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）　　である。

一般に、本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、ＰＡＲ
電位差安定器（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）（Ｐｒｉｎ
ｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐｒ
１ｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）の付いた示差
・ぞルヌポーラログラフ技術を使用して水性緩衝剤（ｐ
Ｈ７）中で測定したとき標準水素電極に対して−３２０
〜＋４００　ｍＶ　　の範囲のＥ１／２を有する。一般
に、ＰＴＡの電位は検体の電位よジも大きい正であり、
ＲＩＮＤ化合物の電位よりも小さい正であるべきである
。即ち、ＥＴＡは検体よりも大きく容易に還元され、還
元性化合物よりも小さく容易に還元されるべきである。

ＥＴＡは一般に検体の濃度に依存するｕ度で、好ましく
はＩ　Ｘ　１０−５〜Ｉ　Ｘ　１０””モル濃度で存在
する。

本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物には、ツェナノンメ
トサルフェート、フェナジンエトサルフェートおよび当
業者に公知の類似化合物が含まれる。

異なったＥＴＡ化合物の組合せが所望に応じて使用され
得る。

さらに低いバックグランドの有利性を与える本発明の実
施に有用な好ましいＥＴＡ化合物は置換ベンゾ−および
ナフトキノン類である。例には、２，３−ジメチル−５
−ヒドロキシメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−
ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３．５−　）
リフチル−１，４−ベンゾキノン、２．６−ジメトキシ
−１，４−ペングキノン、２−ヒドロキシメチル−１，
４−ナフトキノンおよび２−（２−ヒドロキシエチル）
　−１，４−ナフトキノンが含まれる。

生きている細胞、特にバクテリア細胞の測定は、しばし
ばこれら細胞の栄養分の存在下で行なわれる。有用な炭
素源および任意に窒素源を含むいかなる栄養媒体も使用
し得る。適当な成分とＰＩ３を有する適切な栄養媒体は
当該技術においてよく知られている。

本発明は溶液または乾式検定に適用できる。溶液検定に
おいて、還元性化合物と好ましくはＥＴＡとを含む溶液
（または水性懸濁液）を調製し、測定すべき生きている
細胞または検体を含む液体試験試料と混合によって接触
させる。ＥＴＡは、還元性化合物と混合する前に試験試
料と混合することもできる。一般に還元性化合物は適当
な容器（例えば、試験管、ペトリ皿、ビーカー、キュベ
ツトまたは試験装置）内で、試験試料と混合する。得ら
れた溶液をゆっくり混合し、４０℃までの温度で比較的
短時間培養する。試験試料は次いで、適当な検出装置で
得られた螢光染料を測定して評価する。

溶液検定は、試験試料を含む多孔吸収材、例えば紙片を
、還元性化合物の分散体と接触させることによって行な
うこともできる。試験試料中の検体は多孔材料から分散
液に移動し、測定のために必要な分析的反応を開始する
。溶液検定において、存在する還元性化合物の量は、少
なくとも０．００１、好ましくは０．０１〜１．０ミリ
モル濃度である。他の反応剤は、当業者によって容易に
決定される量で存在させることができる。

代わシに、本発明の方法は乾式分析要素と共に実施する
ことができる。このような要素は吸収性担持物質、即ち
、濾過紙または片の如き自己支持性吸収材または吸水物
質の薄いシートまたは片であｐ、これは還元性化合物ま
たは還元性化合物からなる分散媒の乾燥残渣を含有する
。このような要素は、試験片、診断用要素、浸漬棒、診
断試剤および類似物として当該技術で公知である。

乾式分析要素中で使用される時、ここに記載した還元性
化合物は適当な吸収性担持物質に吸収または浸透によっ
て導入するか、または適当な吸収性担持物質上に被覆す
ることができる。その代わりに、これらは検定の間に要
素に導入することもできる。有用な担持物質は、不溶性
であり、水または、尿または血清の如き生理学的液体と
接触させた時その構造的形態を維持している。有用な担
持物質は紙、多孔性微粒子構造体、セルロース、多孔性
重合体フィルム、木材、ガラス繊維、織物および不織物
（合成および非合成）および類似物から調製される。

乾式検定は、その上に吸収性担持物質の如き少くとも１
種の多孔性の展開帯域を有する支持体からなる分析的要
素で、特に有利に実施することができる。還元性化合物
は、展開帯域または異なる帯域（例えば反応試剤帯域、
記録帯域または親水性帯域）中にある。展開帯域は、適
当な繊維性または非繊維性物質またはそれらの単独また
は両者の混合物から調製され得る。

該展開帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号に記載
されているような適当な接着剤物質と混合するか織物に
編織した繊維物質、米国特許第３，９９２，１５８号、
同第４，２５８，００１号および第４，４３０．４３６
号および日本特開昭５７（１９８２）−１０１７６０号
に記載された接着剤を有するかまたは有しない重合体組
成物または微粒子物質を使用して調製できる。展開帯域
は等方性の多孔性即ち、多孔度は、微粒子、繊維または
重合体ヌトランド間で連結された空間または孔によって
作られるように該帯域内で各方向において同一であるこ
とが望ましい。

本発明の乾式分析要素は、還元性化合物および特定の用
途のための他の所望の試剤を含む単独の自己支持性吸収
性担持物質であってよいが、好ましくはこのような物質
は適当な非孔性支持体上に担持される。このような支持
体は適当な方向的に安定であり、好ましくは２００〜９
００　ｎｍの範囲の波長の電磁放射線を通す透明のフィ
ルムまたはシート材料である。特定の要素のために選択
される支持体は、検出の指向する方式と適合し、検定に
使用される化学試剤および液体試料に対し不活性である
べきである。有用な支持体材料には、ポリスチレン、ポ
リエステル、ポリカーボネートおよびセルロースエステ
ルが含まれる。

要素は、１個以上の帯域、例えば試薬帯域、記録帯域ま
たは下塗り帯域を有する。これら帯域は一般に互に流体
接触しており、流体、試薬および反応生成物は隣接する
帯域の重なった部分の間を通過し得ることを意味する。

好ましくは、２個またはそれ以上の帯域は単一層内に位
置し得るけれども、帯域は別々に被覆され重層された層
である。

上記の特許の他に、適当な要素形態および成分は、米国
特許第４，０４２，３３５号および米国再発行特許第３
０．２６７号にも記載されている。

本発明の要素において、還元性化合物の量は広範囲に変
えることができるが、−殻内には少くとも０．０１９７
ｍ２、好ましくは０．０５〜０．２９７ｍ２の被覆量で
存在する。任意の試薬は一般的に次の被覆量で存在する
。

ＥＴＡニ一般に少くとも０．００１９７ｍ２、好ましく
は０．０１〜１９７ｍ２、 栄養分ニ一般に少くとも０．０５ノ／ｍ２、好ましくは
０゜１〜２９／ｒｒＬ２、 緩衝剤（ＰＨく９）ニ一般に少くとも０．１り７ｍ２、
好ましくは０．５〜２９７ｍ２および 界面活性剤；一般に少くとも０１ノ／ｍ２、好ましくは
０２〜５９７ｍ２ １個またはそれ以上の帯域には、特別の検体の検定に必
要な試薬と同様に、当該技術で公知であるような、活性
化剤、バインダー（−殻内に親水性９、カブラ−溶剤等
々を含む種々の他の望ましい、しかし任意成分を含有さ
せることができる。

本発明の一実施態様において、水性液体中での微生物の
検出用の要素は電子移動剤（ｅｌｅｃｔ、ｒｏｎｔｒａ
ｎｓｆｅｒ　ａｇｅｎｔ）と還元性化合物からなり、こ
の両者は前記した通りである。これらの要素には、また
、生きている細胞のだめの栄養素および検定の間生理学
的ＰＨを維持する緩衝剤（例えば試験液体の試料１〜２
００μｇと接触させる時〕が含まれることが望ましい。

このような要素は、例えば尿試料（還元する妨害物質を
除くために前処理される〕中のバクテリアを、試料と要
素を適当な方法で物理的に接触させ、５９０　ｎｍより
大きい適当な波長で、バクテリアの存在の結果として還
元性化合物から放出される螢光染料を検出することによ
って検出するために使用できる。

本発明の他の実施態様において、要素は水性液体中で生
きていない生物学的または化学的検体の測定のために使
用され、検体との相互作用により螢光染料を与え得る相
互作用組成物からなる。この組成物は、染料を与えるた
めに還元された時螢光染料を放出する還元性化合物およ
び任意的に、ＥＴＡ、ノニオン界面活性剤および検定の
間中生理学的−を維持する緩衝剤からなり、これらの全
ては既に記載した通ジである。このような検体の例は前
に記載されている。該要素には、還元性化合物の還元に
有効な適当な試剤を有する相互作用性組成物が含まれる
。検出される螢光染料の量は、液体試料中に存在する検
体の量に相互関係している。検定の前の、妨害物質を除
くかまたは細胞を濃縮するだめの前処理が望ましい。

本発明の要素は、また、アスコルベート（アヌコルビン
酸とアルカリ金属塩〕、システィン、グルタチオン、チ
オレドキシンおよび類似物の如き他の還元剤を測定する
ために有用である。

検定の方法に依存して種々の異なった要素が本発明に従
って調製できる。要素は、所望の幅の長いテープ、シー
ト、スライドまたはチップを含む種々の形に形成できる
。

本発明の検定は手動または自動でできる。一般に、乾式
要素を使用する際に、検体または生きている細胞測定は
、供給ロール、テラ！包みまたは他のソースから要素を
＠す、試験すべき液体試料と接触させ要素中で試薬と混
合することによって行なわれる。このような接触は、い
かなる適当な方法、例えば要素を試料中に浸漬するかま
たは適当な調剤器を使用し、１滴またはそれ以上の滴の
の試料で手または機械で要素にスポット付けすることに
よって達成される。

試料を付けた後、要素は培養、加熱または類似の如き条
件下におき、これによって試験結果を迅速化するかまた
は容易にする。

検体または生きている細胞の検出は、還元性化合物が還
元され適当な方法で検出し得る螢光染料を放出した時達
成される。測定は染料の最大波長または最大波長以外の
波長ですることができる。

次の実施例において、中間化合物の同定および純度は、
標準分光光度計で測定される赤外（ｒＲ）ヌベクトル〔
構造情報を与えるシャー７’（３）−またはブロード（
ｂ）バンドは逆センナメートル（ｃｒｎ−’）で報告さ
れる〕、または、標準小化分光光度計で画定される。核
磁気共鳴（ＮＭＲ）ス被りトル〔ブロード（ｂ）、シン
グレット（ｓ）、マルチプレットに）またはブロードシ
ングレット（ｂｓ）　ピークにおいて、テトラメチルシ
ランに対し、δ値でｐｐｍで報告される化学シフト〕に
よって決定された。最終生成物の同定および純度は、Ｉ
Ｒ，ＮＭＲ分光学および元素分析によって決定された。

尖隻別土士量洸北治勘−ロ生冊製 工程へ：アンスロン（７５ｇ）を１２０°Ｃに加熱する
ことによってトリメチルホスフェート４００ｍｆｌに溶
解した。水酸化ナトリウム溶液（５０％溶液５０ｍｊり
を２　ｒｔｄｌずつ添加した。最初に、温度を１２５〜
１３０°Ｃに上げ、次いで１０５〜１１０　’Ｃに下げ
た。反応の終りに激しい沸騰が起きた。

９０°Ｃに冷却すると混合物は固体になった。水を添加
し、薄黄色生成物を集め、水で洗浄し、エチルアルコー
ルから直接再結晶した。融点９２〜９４°Ｃを有する中
間体Ａ６８ｇが得られた。質量スペクトル分析で構造を
確認した。

工程旦：中間体Ａ（６ｇ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ、　２５ｄ）中に溶解した。混合物を冷却
し、オ、キシ塩化燐（３，５ｇ）で少しずつ攪拌しなが
ら処理した。得られた溶液を１００°Ｃで２時間加熱し
、次いで栓をしたフラスコ中に放置した。得られた混合
物を酢酸ナトリウムを含有する水中に注いだ。黄色生成
物を集めアセトンから再結晶した。中間体Ｂの収量は４
ｇであった。質量スペクトル分析で構造を確認した。

工程フ：ナトリウムメトキシド（１５ｇ）を乾燥メタノ
ール３００ｍ１に溶解し、この溶液をＯ″Ｃに急冷した
。中間体Ｂ（２４ｇ）とトリエチルホスホンアセテート
（２５ｇ）との温いＤ　Ｍ　Ｆ　（３００ｄ　＞中の溶
液を添加し、混合物を還流下に３時間加熱した。次いで
水（１００ｍｆｆｉ）を添加し、溶液を更に１時間還流
した。溶液を水で１２００ｍｆまで稀釈し、濃塩酸を混
合物が酸性（ｐＨ２）になるまで添加した。

次いで混合物を冷却し、固体を集め、エチルアルコール
（２５０Ｉｎｌ）から再結晶した。中間体Ｃｌ８ｇが得
られた。赤外分析および核磁気共鳴分析で構造を確認し
た。

工遣」し中間体Ｃ（１８ｇ）を稀炭酸ナトリウム溶液（
５００ｄ）に溶解し、溶液を濾過した。濾液を触媒量の
炭素上の１０％パラジウムで処理し、得られた混合物を
パルシェーカー（Ｐａｒｒ　５ｈａｋｅｒ）中で水素下
に振盪した。理論量の水素が吸収された後、触媒を濾過
によって除き、濾液を濃塩酸によって酸性にした。生成
物を集め、メタノールから再結晶して中間体Ｄ１０ｇを
得た。赤外分析および質量スペクトル分析によって構造
を確認した。

工■旦：中間体Ｄ（３ｇ）をジクロロメタン（５０ｍｊ
りに溶解したものを五塩化燐（２，５ｇ）で処理し、混
合物を３０分間還流した。次いで塩化アルミニウムを少
量ずつ添加し、この混合物を攪拌し、還流下に５時間加
熱した。混合物を稀塩酸中に注ぎ、この溶液を酢酸エチ
ルで抽出した。

乾燥後、溶剤を減圧下で除去し、赤色の半固体３ｇを得
た。この物質をトルエン：酢酸エチル４：１中に入れた
。混合物を冷却し、不溶物質を集め、上記定義の化合物
Ｉ［１０，３ｇを得た。質量スペクトル分析で構造を確
認した。

−１１２：、−ヒ入〉■の云。−１１ 化合物■は、化合物Ｉから、５ｏｌｏｄａｒ　ｅｔ　ａ
ｌ。

ハ肛匣［敗Ｌ１的並触り肋」旦１則（５）、　１０６２
（１９８０）に記載された方法を使用して調製できる。

本発明に係るベンズフェナレノン化合物は、低濃度にお
いても検体に対して迅速で高感度であり、螢光染料とし
て、公知の検定の螢光染料よりも一般に長い波長で吸収
し放射するため、生物学的検体で一般に遭遇するスペク
トル干渉を避けて、生きている有機体を測定するために
生理学的ｐＨで使用できる。

これらの有利性は、５３０ｎｍ以上の最大吸収と少くと
も５８０ｎｍの最大放射を有するある種のベンズフェナ
レノン化合物を使用することによって達成される。これ
らの化合物はベンゾキノン化合物の如き担体に容易に付
着でき、放出性化合物を提供できる。担体に付着した時
、染料は転移性であり、即ち、これらは、放出された時
とは異なる付着された時の波長で螢光を発する。更に、
これらの化合物は、細胞または組織の如き生物学的検体
を着色するために有利に使用される。本発明で使用され
る好ましい染料化合物は、有利には約６以下であり、か
くして６〜９のｐｌ＋範囲で最大螢光を示すｐｅａを有
する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
   たはそれらの塩を示す）で表わされるベンズフェナレノ
   ン化合物。