JPS62190142A - フエナレノンおよびベンズフエナレノン化合物を含む組成物および要素ならびにそれらの用途 - Google Patents

フエナレノンおよびベンズフエナレノン化合物を含む組成物および要素ならびにそれらの用途

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JPS62190142A
JPS62190142A JP62018753A JP1875387A JPS62190142A JP S62190142 A JPS62190142 A JP S62190142A JP 62018753 A JP62018753 A JP 62018753A JP 1875387 A JP1875387 A JP 1875387A JP S62190142 A JPS62190142 A JP S62190142A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バイオメディカルの研究および臨床化学に有
用な化合物、組成物および要素に関する。
〔従来技術〕
一つの型のものを他の型のものと区別するかまたは更に
観察可能にするために、染料（又は色素、以下同じ〕、
特に螢光染料で生物学的組織および細胞を染色すること
は当該技術においてよく知られている。晃磁スペクトル
の赤領域において螢光を発する染料は特に望ましい。あ
る種の７工ナレノン化合物は、Ｃｏｏｋ他によってＴｈ
ｅ　Ａｕ＋１ｔｒａｌｉａｎＪ、Ｃｈ＠ｍ、、　１１．
ｐｐ、２３０−２３５（１９５８）に、および５ｏｌｏ
ｄａｒ他によってＺｈｕｒｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｅｈｅ
ｓｋｏｉＫｈｉｍｉｉ、１６．ｐｐ、１０６２−１．０
６４（１９８０）に記載ちれているか、その化合物の用
途は記載されていない。
嘔らに、水、牛乳および生物学的液体の如き液体の化学
分析か、健康維持および診断上の注意のためにしばしば
望ましいか必要である。このような分析全容易にするた
めの種々の組成物および要素が知られている。このよう
な組成物および要素には、一般に、検体として同定され
る分析における物質’（＋−測定するための試薬組成物
が含まれている。検体は、微生物または酵母細胞の如き
生きている有機体または生きていない化学物質であり得
る。試薬組成物は検体との相互作用により、検出し得る
変化（例えば染色生成）を与える。
最近、多くの研究が全血、血清、血漿、尿および類似物
の如き生物学的液体の迅速かつ多量の診断的ま７’（は
臨床的分析に有用な組成物および要素を開発することを
指向している。
例えば、伝染性疾病の迅速かつ効果的診断および処置の
ために、疾病を引き起こすバクテリアを出来るかぎゃ迅
速に検出できることが望ましい。
泌尿器系の伝染は最も一般的な細菌性疾病の一つでめｐ
、第２はしばしば呼吸器系の伝染である。
多くの泌尿器系伝染は、重大な細菌尿症と見られる状態
で尿ＩＲＩ！当り１００，０００またはそれ以上の有機
体の細菌数を伴なう。
還元剤の存在下で還元されて検出し得る染料を与える多
くの化合物が知られている。例えば、このような化合物
の多くのものは写真プロセスで有用である。しかしなが
ら、このようなプロセスは制い−、一般に１０より高い
−で行なわれ、そのような−では多くの分析的測定は成
功げに行うことができない。
螢光染料を使用する分析的測定は、色度染料を使用する
ものよりも高感度であることか一般に知られている。抛
々の螢光検定が開発されており、その多くは螢光染料と
してクマリンまたはアンペリフェロン（ｕｍｂ＊１１１
ｆｅｒｏｎ）　　誘導体を使用するものである。いくつ
かの螢光染料は高−（９よｐ大〕でのみ使用することが
できる。これらは、一般により低い−で行なわれる生物
学的検にでは使用することかできない。更に、クマリン
またはアンペリ７エロン染料は、スペクトル干渉が著し
い波長、即ち５００　ｎｍよシ低い波長で螢光を発する
。
この特徴は生物学的液体における有用性を更に制限する
。
最近、改良された螢光アンペリ７エロン染料体が記載さ
れ（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ　ａｔ　ａｌ、　Ｂｕｌｌ、Ｃｈ
ｅｍ、Ｓｏａ。
Ｊａｐａｎ、５８ニア３１，１９８５）、および酸ホス
ファターゼ検定に使用されている（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈ＠ｍ、。
工：１４６．１９８４）、、これらの染料のあるものは
、約６のｐＫａ値を有し、５９５ｎｍ（ｐ）１９）で螢
光放射を有すると報告されている。
〔茜明が解決すべき問題点〕
しかしなから、従来の染料は、５００　ｎｍ以下、即チ
ヘモグロビンおよびビリルビンの如き成る種の血清成分
か強いヌベクトル吸収を有する同じ範囲内で吸収を示す
（一つの染料はＰ）１９で５０５で吸収する〕。従って
、このような染料を使用する検定はスペクトル干渉を受
ける。
〔問題点を解決する方法〕
こｎらの問題は、染色剤（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｇｅｎ
りとして、式 （式中、ｆｌヒドロキシ、メルカプトまたはアミンであ
る） のいずれかで表わされる置換または非置換螢光化合ｅａ
ｗ有する細胞染色組成物（ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって見服される。
本発明はまた、構造式ＣＡＲ−（Ｒ）□（式中、ＣＡＲ
−は置換または非直換の芳香族またはキノン核であり、
Ｒは上記の式中Ｒがヒドロキシまたはメルカプトでめる
化合物の一つから誘導される螢光部分からなり、ｎ　Ｖ
ｉ１咬たは２である）によって表わされる還元性化合物
からなり、該還元性化合物かｐＨ９またはそれ以下で還
元さｔして螢光部分を放出し得るものでおり、さらにＲ
がＨで置換された時ＣＡＲ＋）ｌ）ｎか水中で枳１」定
した時少ンヨくとも約＋１００ｍＶの％ｆ有するもので
ある組成物も提供する。本発明に従った、ざらに一検体
を測定するための乾式分析水素は、上記の還元性化合物
を含む。
本発明は、更に、 Ａ０μｍ９−９たはそれ以下で、検体を含むと思われる
液体の試料を上記還元性化合物と接触させる工程、およ
び、 Ｂ、該化合物が検体の存在の結果として還元された時放
出される螢光部分を検出する工程からなる検体の測定方
法を提供する。
本％明はまた、生物学的試料を上記螢光化合物と接触さ
せることからなる染色力法を提供する。
置換１πは非直換化合物は、構造式 （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
たはそれらの塩である〕 によって宍わされる。
〔実施態様〕
本発明を実施する際に有用な螢光化合物は、式〔式中、
Ｒはヒドロキシ、メルカプトまたはアミノ（ＨＮ（Ｒ）
−）またはそれらの塩（即ち、例えば塩酸塩、硫酸塩、
過塩素酸塩、テトラフルオロデレー）１＆ハｐ　−トル
エン−スルホネートの如き酸塩）である〕 のいずれかによって衣わされる置換または非置換の７エ
ナレノンまたはベンズフェナレノン染料である。Ｒは水
素、置換もしくは非置侠アルキル（好ましくは、例えば
メチル、イソプロピル、ヘキシル、ベンジルもしくはク
ロルベンジルの如キ炭素原子１〜１０個のもの）、置換
もしくは非置換シクロアルキル（好ましくは、例えば、
シクロペンチルもしくはシクロヘキシルの如き炭素原子
５〜１２個のもの）、置換もしくは非置換フェニル（例
えばｐ−フルキルフェニル〕、または置換もしくは非置
換へテロサイクリ、り成分（例えばピリジル、チェニル
〕である。好ましくは、ＲはヒドロキシまたはＲが水素
または置換もしくは非ｒＩＸ換の炭素原子１〜３個の低
級アルキルであるアミノでめる。
本兄明において有用である代表的螢光化合物にが含まれ
、化合物１および■が特に有用である。
これらの化合物を調製する方法を次に述べる。ベンゾフ
ェナレノン化合柳川および■は新規な染料である。
こｎらの化合物は、式中に特に示したもの以外の１個ま
たはそれ以上の置換基を該直換基がその螢光性またｆ、
ｔｐＫａ値に不利に影響しない限り、融合環の１個また
はそれ以上の位置において有し、その置換基には、置換
または非置換アルキル（好ましくは、例えばメチル、エ
チルまたはベンジルの如き炭素原子１〜１２個のもの）
、置換または非直換ヒドロキシアルキル（好ましくは、
例えばヒドロキシメチルまたは２−ヒドロキシエチルの
如き炭素原子１〜１２個のもの〕、置換または非置換ア
ルコキシカルボニル（好ましくは、例えばメトキシカル
ボニルまたはエトキシカルブニルの如き炭素原子２〜１
２個のもの）、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、または
ブロモ）、シアノ、カル−キシ、アシル、直換または非
置換アリールヌルホニル（好ましくは、例えはフェニル
スルホニルまたはトリルヌルホニルの如き炭素原子６〜
１０個のもの）、置換または非置換アルキルスルホニル
（好ましくは、例えばメチルヌルホニルまたはエチルヌ
ルホニルの如き炭素原子１〜６個のもの）、および当業
者に知られている他の置換基が含まれる。
上記の化合物１および１は、例えばＣｏｏｋｅ　ｅＬｍ
ｌ、　　Ａｕ＠ｔｒａｌｉａｎ　Ｊ、　Ｃｈ＠ｍ、、１
１．ｐｐ、２３０−２３５（１９５８）および５ｏｌｏ
ｄａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｚｈｕｒｎａｌ叶ａｎｉｃｈｅ
ｓｋｏｉ　Ｋｈｉｍ目亜（５）、ｐｐ、１０６２−１０
６４（１９８０）Ｖｃｈ己載されたようにしてＮ製でき
る。
上記の新規化合物■および■は下記実施例２および３に
記載した方法によって調製できる。
本発明において有用である螢光化合物は、非緩衝または
緩衝水溶液中で保存して使用することができる。好まし
い化合物１および■はその水溶性のために緩衝水浴液と
して保存され使用される。
さらに、化合物■および■はそのアミン塩に転換し得、
塩は水浴液として保存し使用することができる。組成物
は一般に、ｐａ−１９またはそれ以下で１８１ｉまたは
それ以上の適当な緩衝剤によって緩衝される。有用な緩
衝剤は、当業者によって容易に決定され、ホスフェート
、ボレートおよびＧｏｏｄ　ｅｔａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　５．４６７（１９６６）およびＡｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、、　１０４．３００（１９８０）に
翰告されたような有機緩衝剤を含む。組成物は好ましく
は−６，５〜８に緩衝される。
本発明の一実施態様において、螢光化合物は生物学的試
料、例えば組織および細胞を染色するために、および細
胞学用に使用し得る。
他の実施態様において、螢光化合物は染料薊駆体を形成
するためにプロ、りされ得る。プロ、りされた時、この
化合物は担体（下に記す）に付着された時と同様に転移
性（ａｈｉｆｔａｂｌｅ）である。
ブロックされた染料は、検定の間にブロッキング基から
螢光染料を放出するような適当な処理または条件に賦さ
れ得る。例えは染料前駆体は、検体または他の試薬によ
って化学的、加水分解的または酵素的に作用され得る。
史に他の冥り態様において、螢光成分は還元性化合物か
ら放出される。還元性化合物に付いている間、螢光部分
は、それが放出された時に示す吸収および放射スペクト
ルとは異なった吸収および放射スペクトルを有する。放
出時の放射スペクトルは一般により長い波長、即ち少く
とも５８０　ｎｍである。
さらに特に、本発明において有用な還元性化合物は、構
造式〇ＡＲ＋Ｒ１）ｎ（式中、ＣＡＲ−は置換または非
置換の芳香族またはキノン核を表わし、Ｒ１は上記螢光
部分からなり、ｎは１または２である〕を有する、この
ような核の例は次に示される。さらに、Ｒ１がＨによっ
て置換された時、ＣＡＲ（−Ｈ）ｎは水中で測定した時
少くとも＋１００　ｍＶの還元電位（Ｅｙ２）をゼする
。このＥ竹値は、生理学的…（９また社それ以下）での
化合物からの転移性検出可能な種の還元および続く放出
を容易にする。
このような測定は、示差・やルスポーラログラフィまた
はサイクリックデルタメトリー（ｃｙｅｔｔｃｖｏｌｔ
ａｍ＠ｔｒｙ）のいずれかを使用する標準の電気化学的
技術によってなされる（例えば、Ｓａｗｙｅｒａｎｄ　
　Ｒｏｂ＠ｒｔｓ、Ｊｒ、、Ｅｘｐｅｒｉｒｎｅｎｔａ
ｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｈ＊ｍ１ｓｔｒｙ　ｆｏｒ　
Ｃｈｓｍｉｓｔｇ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７４参照）。好ましくは、Ｅ
ｌには水中で測定して＋１００ｍＶ〜＋４００ｍＶであ
る。更に、へ測定の詳細は、第１表の前に記載されてい
る。望ましいＥｙは、ＣＡＲ−核上の適当な電子吸引性
基または核に付いている融合環と電子吸引性基との組合
せによって達成される。
有用な還元性化合物の例を次に示すが、本発明を限定す
るものではない。
本発明の一実施態様において、還元性化合物は、Ｖａｎ
　ｄ＠５ａｎｄ％Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｕｍ、　Ｉｎｔ、
　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ。
旦、ｐｐ、１９１〜２０９（１９８３）および米国特許
第４．２３２，１０７号に記載されていると同様に還元
さｎてキノンメチド（ｑｕｉｎｏｎ＠ｍｅｔｈｉｄｅ）
生成の間に検出可能なａを与えるが、望ましいＥＨ性質
を有する。
他の実施態様において、有用な還元性化合物には、上記
Ｖａｎ　ｄｏ　５ａｎｄｅ文献の２０６．Ｑに記載され
ているものと同様の２ルフイルイミドおよびヌルフェニ
ルスルホンアミドが含まれるが、望ましいＥｙ性質を有
している。
好祉しい実施態様において、還元性化合物は生理学的−
で分子内求核置換が起こり、求核基が化合物の少くとも
１個の電子の減少によって発生した時、１個はそれ以上
の螢光部分を放出し得る。
換言すれば、このような置換は化合物が適当な還元剤で
還元される時化じる。写真技術で使用される多くの類似
のベンゾキノン化合物上のこれらの化合物の区別は、本
発明で有用な化合物かより高い％値を有しておシそれに
よって化合物の還元とそれに続く螢光部分の放出を容易
にすることでるる。この放出は非常に効果的であり、大
部分の化合物にとって、少くとも５０チの螢光部分は約
ｐｉ（７において３０分以内に放出される。ここに記載
された化合物は、螢光部分を迅速に放出し、迅速検知に
許容されるため特に有用である。類似の写真用化合物は
より低いＥＨ値を有しており、高いｐＨ（１３〜１４）
でのみ染料を放出するか、または写真用−で非常に非効
率的に（即ちゆっくり〕染料を放出する。
「分子内求核置換（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｎ
ｕｅｌｅｏ−ｐｈｌｌｉｅ　ｄ１ｓｐｌａｅｅｍ＠ｎす
」の飴は、分子上の求核中心が分子内の他のサイトで反
応し、そのサイトは求電子中心であり、求電子中心に付
いている基または電子の置換を効果的にする反応を意味
づ゛る。
一般に本発明において有用であり、ここではＲＩＮＤ化
合物とされるこのような化合物は、分子の三次元立体配
置に極めて近接して並んでいる求核基と求′電子基を有
し、それによって分子内反応が生じ、４〜７原子を有す
る環が生成する。
求核置換の速度はＲＩＮＤ化合物の還元のｎ１■は実質
的に零である。これによって、ＲＩＮＤ化合物は還元の
−ｒ１１１は安定である。
特に上用なＲＩＮＤ化合物は、構造式ＣＡＲ−Ｒ’また
は１である〕 を有するものである。Ｒ５は置換または非置換アルキレ
ン、好ましくは主鎖に炭素原子１または２個のもの（例
えば、メチレン、エチレンまたはアルコキシメチレン）
である、最も好ましくは、Ｒ５はメチレンでおる。Ｑは
カルボニルまたはチオカルボニルでおり、好ましくはカ
ルボニルである。
Ｒ６はメチルである。
ＦＲＡＧは置換または非置換フェナレノンまたはベンズ
フェナレノン化合物から誘導される上記定義の如き螢光
部分である。この糧は、存在する還元剤の址に直接関係
し得る■で放出される。
ＦＲＡＧ　Ｕ、ＦＲＡＧの一部である二価の単原子結合
による一重結合によりＱに結合している。好ましくは、
この単原子結合はオキシまたはチオであり、最も好まし
くはオキシである。
上記キノン構造におけるＲ　、ＲおよびＲは、独立に、
水素、炭素原子１〜４０個の置換または非置換アルキル
（例えば、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキ
シメチルまたはペンジルン、置換または非置換アリール
（例えば、フェニル、ナフチル、メチルナフチル、ｐ−
ニトロフェニル、ｍ−メトキシフェニルまたはフェニル
スルホンアミド）または、一般に正のハメットシグマ値
（Ｈａｍｍｅｔｔ　ｓｉｇｍａ　ｖａｌｕｅ）、好まし
くは、０．０６よりも大きいシグマ値を有する電子吸引
性基である。ハメットシグマ値は、例えは、５ｔｅｒｉ
ｃＥｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、Ｉｎｃ
、、１９５６．ｐｐ、５７０〜５７４およびＰｒｏｇｒ
ｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ。
ｖｏｌ、　２．　Ｉｎｔ＠ｒｇｃｉｅｎｅｅ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ、１９６４゜ｐｐ、３３３〜３３９に記載
されている標準的方法に従って算出される。正のハメッ
トシグマ値を有する代衣的電子吸引性基には、シアノ、
カル？キシ、ニトロ、ハロ（例、ｔＨフルオロ、ブロモ
、クロロまたはヨード〕、トリハロメチル（例えは、ト
リフルオロメチルまたはトリクロロメチル〕、トリアル
キルアンモニウム、カルボニル、カルパモイル、スルホ
ニル、スルファモイル、エステルおよび当該技術で矧ら
れている他のものが含まれる。
好ましい電子吸引性基には、ｐ−ニトロフェニル、ｍ−
ニトロフェニル、ｐ−シアノフェニルおよび２．５−ジ
クロロフェニルか含まれる。メター位にメトキシ基また
はアセタミド基を持つアリール基もまた有用である。
Ｒ５はｌたＲ１であり得、それによって、溜在的に２：
１の螢光部分分子の最初のＢＩＮＤ化合物分子に対する
モル比を与える。
或いは、ＲおよびＲは−緒になって、キノン核に付いた
置換または非虹換融合カルボサイクリ、り環を完結する
ために必要な炭素原子を表わし寿る。例えは、このよう
な環（七ノーまたはピザイクリック〕は、主鎖中に炭素
原子４〜８個、好ましくは５〜７個をＭし得る。
代弐的なＲＩＮＤ化会物は、次の構造式を参照して下記
第１表に表示される。第１表における８強値は の代わりに水素原子を有するこの構造のキノン核、即ち
、 について測定された。ＥＡ値はＮ、Ｎ−ツメチルホルム
アミド、ノニオン界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１０
０）およびナトリウムホス２エート緩１繭Ｍ！Ｉ（ｐｆ
１７）中に溶解したキノンの水性エマルジョン中で測定
した。標準水素１！極を基準として使用した。
以下仝白 本発明において有用なＲＩＮＤ化合物は、一連の個々に
公知の反応を使用してｎａｇれる。一般的に、一連の！
ＭＩ製には、次の一般的工程、即ち、（１）置換ヒドロ
キノンの調製、（２ノオキサジン環の形成、（３）オキ
サノン環の開環、（４）カルバモイルクロライドの調製
、および（５）ＦＲＡＧ成分とカルバモイルクロライド
との反応が含まれる。代表的調製は下記実施例４および
５で与えられる。
本発明の実施に有用な他のＲＩＮＤ化合物には、適当な
Ｅｙ値と構造式ＣＡＲ＋Ｒ１）ｎを有するものが含まれ
る。この構造式において、 （１）　　ＣＡＲ−は１，２−ナフトキノン、１．２−
１１．４−または９．１０−アンスラキノン、４．４′
−ジフェノキノン、アズロキノンまたは１．６−（１０
）−アヌレノキノンの置換筐たは非置換核でろり、Ｒ１
は核に、炭素原子１個離れて、または核の１個のオキソ
基からべり位に付いている。核は、１個またはてれ以上
のＲについて上記した如き電子吸引性基で置換されるか
、または１個もしくはそれ以上のＲおよびＲについて上
記した如き融合環を有していてよい。Ｒは上記定義した 数である。
（２）ＣＡＲ−は であり、そのいずれかは、Ｒ２、Ｒ５およびＲ４につい
て上記定義した１ねまたはそれ以上の電子吸引性基で置
換されることができ、Ｒ１は上ｉＬ定義した＋Ｒ１Ｎ−
Ｑ−ＦＲＡＧで、ｂｐ、ｎは１または２である。
（３Ｊ　　ＣＡＲ−は構造式 〔式中、Ｒ７は炭素原子１〜２０個の１Ｎ換または非置
換アルキル（例えば、メチル、エチル、メトキシメチル
、イングロビル、ドデシル、ヘキサデシルまたはオクタ
デシル）である〕 の置換または非置換ニトロベンゼノイド核でめシ、は１
である。
一般に、ここに記載した還元性化合物は限定された水溶
解性を南している。このため、これらを水性環境で使用
する時、使用に先立って化合物の分散液を、例えば被覆
配合で調製することが最も良い。このような分散液は、
一般に、還元性化合物刀、水性緩＠溶液および界面活性
剤がまたは該化合物用の水混和性有機溶剤のいずれかま
たは両者からなる。
本発明を実施するに有用である界面活性剤には、化合物
の還元を抑制しないいかなる界面活性剤も含まれる。一
般に、生きている細胞の検出のために有用な界面活性剤
は、例えばアルキルアリールポリエトキシアルコール、
ｐ−フルキルアリールオキシポリグリシドール、および
当業者に公知の他のもの會含むノニオン界面活性剤であ
る。
有用な水混和性有機溶剤にはアＡ・コール、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニ
トリル、ヘキサメチレンホスホルアミドおよび当業者に
公知の他のものが含まれる。特定の還元性化合物のため
に使用される特定の溶剤は、日常の実験によって容易に
決冗できる。
分散ｇ、は、下記実施例４および５で示した様な調製の
特別の詳細を伴なった次の一般的方法によって調製でき
る。還元性化合物を、その分子針に依存するか、一般的
に溶剤１１当５１〜１００■、好ましくＶｉ５〜８０９
の碇度で水混和性解削に溶割する。得られた酸液を次い
で適当な界面活性剤と、分散ｇＩＩＬｔ当シ界面活性剤
か一般的には０．１〜２４　ｍｙ、好ましくは０．５〜
１０１ｎ９でめるｔ）で混合する。この調製は一般的に
室温で行なわれる。
これらの分散液には、生理学的Ｐｌ″Ｉ（９またはそれ
以下〕を維持するために有効な量で緩衝剤か含まれる。
分散液中の緩衝剤の濃度は広範囲に変えることができる
が、一般的には０．Ｏ１〜０．５モル龜度である。代表
的緩衝剤については前に記載しである。
ここに記載した還元性化合物は、水性および非水性液体
、例えば生物学的流体、製造工程、廃液、食料品等の分
析的測定用の組成物に有用でめる。
測定は、化合物の還元および螢光部分の放出をもたらす
単独の反応または一連の反応を経て種々の検体について
なされる。種々の検体には、生きている細胞（例えば、
バクテリア、醇母、白血球、または菌＠）、酵素（抄り
えば、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクテート
オキシダーゼ、クレアチンキナーゼ、α−グリセロホス
７エートオキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、
ピルベートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホス７
エートデヒドログナーゼ、アラニンアミノトランヌ７ア
ラーゼ、アヌノヤルテートアミノトランスファラーゼ、
およびデヒドロゲナーゼまたはりダクターゼ耐素を含む
他のＮＡＤＨベース、ＦＡＤＨペースまたはオキシダー
ゼペースの検定）、生キている細胞以外の生物学的また
は化学的還元剤ＣｆＬｔｔｆ、アスコルベート、シヌテ
ィン、グルタチオンまたはチオレドキシン）、新陳代謝
性物質（例えば、グルコース、ラクチン酸、トリグリセ
ライドまたはコレステロール〕、免疫反応剤（例えば、
抗原、抗体またはハゲテン〕が含まれる。
該組成物は、（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ）−１（Ｆ’ＡＤ−Ｆ
ＡＤ）ｌ）−および（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰＨ）−ベース
の反応を含むフラビン結合のデヒドロゲナーゼおよびオ
キシダーゼをモニターするために使用できる。このよう
な例においては、還元性化合物は、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨの代わりに螢光染料を与えるために使
用できる。
ここに記載した還元性化合物は、生物学的試料中の生き
ている細胞を検出または定量するのに特に有用である。
生きている細胞を持っていると考えられるいかなる生物
学的試料（例えば、食料、組織、地下水、冷却水ｙ薬製
品または下水）も本発明によってバクテリア、酪母、菌
等について分析できるけれども、本発明は特に、人およ
び動物の流体（例えは、尿、脳背髄液、血液および便分
泌液（ｓｔｏｏｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｓンの如き類似
物）および大または動物の細胞の懸濁液の如き水性液体
中のバクテリアの検出に有用である。本発明の実施は、
尿（稀釈または非稀釈）中の尿路病原菌の検出用に特に
重をである。
還元性化合物を使用して生きている細胞を測定する時、
生きている細胞が電子移動剤（ここではＥＴＡとする〕
と作用することが迅速な染料放出のために好ましい。Ｅ
ＴＡの存在は、生きていない検体の分析的測定のために
、さらに効果的な染料放出會もたらす。ＥＴＡは決定さ
れる物質（例えば生きている細１ｔｌｌ！Ｉ）と還元性
化合物との間の媒介体として作用する移動性化合物（ｍ
ｏｂｉｌｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）　　でろ・る。
一般に、本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、ＰＡＲ
ｔ位差安定器（ｐｏｔ＠ｎｔｉｏａｔａｔ）（Ｐｒｉｎ
ｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐｒ
１ｎｃ＠ｔｏｎ＋Ｎｅｗ　Ｊ＠ｒａｅｙ）の付いた示差
パルスポーラログラフ技術を使用して水性緩衝剤（Ｐ’
−１７）中で測定したとき標準水素電極に対して一３２
０〜＋４００ｍＶ　　の範囲のＥＨを有する。一般に、
ＥＴＡの電位は検体の電位よりも大きい正であり、ＲＩ
ＮＤ化合物の電位よりも小さい正であるべきである。即
ち、ＥＴＡは検体よりも大きく容易に還元され、還元性
化合物よυも小さく容易に還元されるべきである。ＥＴ
Ａは一般に検体の濃度に依存する磁度で、好ましくはＩ
　Ｘ　１０−３〜１×１０　モル設度で存在する。
本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物には、７エナジンメ
トサル７エート、７エナジンエトサルフエートおよび当
業者に公知の類似化合物が宮まれる。
異なったＥＴＡ化合物の組合せがＩｙｒ望に応じて使用
され得る。
さらに低いパックグランドの有利性を与える本発明の実
施に有用な好ましいＥＴＡ化合物は随換べンゾーおよび
ナフトキノン類である。例には、２．３−・ツメチル−
５−ヒドロキシメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５
−ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３．５−ト
リメチル−１，４−ベンゾキノン、２．６−シメトキシ
ー１．４−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメチル−１，
４−ナフトキノンおよび２−（２−ヒドロキシエチル）
　−１，４−ナフトキノンが営まれる。
生きている細胞、特にバクテリア細胞の測定は、しばし
ばこれら細胞の栄養分の存在下で行なわれる。有用な炭
素源および任意に窒素源を含むいかなる栄誉媒体も使用
し得る。適当な成分と−１を有する適切な栄養媒体は自
核技術においてよく知られている。
本発明は溶液または乾式検定に適用できる。溶液検定に
おいて、還元性化合物と好ましくはＥＴＡとを含む溶液
（または水性懸濁ａ）を調製し、測定すべき生きている
細胞または検体を含む液体試験試料と混合によって接触
させる。ＥＴＡは、還元性化合物と混合する前に試験試
料と混合することもできる。一般に還元性化合物は適当
な容器（例えば、試験管、ベトリ皿、ビーカー、キュベ
ツトまたは試験装置ｋ）内で、試験試料と混合する。得
られた溶液をゆっくり混合し、４０℃までの温度で比較
的蜆時間培養する。試験試料は次いで、適当な検出装賑
で得られた螢光染料を測定して評価する。
溶液検定は、試験試料を含む多孔吸収材、例えば紙片上
、還元性化合物の分散体と接触させることによって行な
うこともできる。試駆試料中の検体は多孔材料から分散
液に後動し、測定のために必要な分析的反応を開始する
。溶液検定において、存在する還元性化合物の値は、少
なくとも０．００１、好ましくＦｉ、ｏ、０１〜１．０
ミリモル碗度である。他の反応剤は、商業者によって容
易に決定される址で存在させることができる。
代わりに、本発明の方法は乾式分析要素と共に実施する
ことかできる。このような要素は吸収性担持物質、即ち
、濾過紙または片の如き自己支持性吸収材または吸水物
質の薄いシートまたは片であり、これは還元性化合物ま
たは還元性化合物からなる分散媒の乾燥残渣全含有する
。このような要素は、試験片、診断用要素、浸漬棒、診
断試剤および類似物として当該技術で公知である。
乾式分析要素中で使用される時、ここに記載した還元性
化合物は適当な吸収性担持資質に吸収または浸透によっ
て導入するか、または適当な吸収性担持物買上に被覆す
ることができる。その代わりに、これらは検定の間に要
素に導入することもできる。有用な担持物質は、不溶性
であり、水または、尿または血清の如き生理学的液体と
接触させた時その構造的形態を維持している。有用な担
持物質は紙、多孔性微粒子構造体、セルローヌ、多孔性
重合体フィルム、木材、ガラス繊維、織物および不織’
！ＩＪ（合成および非合成〕および類似物から調製され
る。
乾式検定は、その上に吸収性担持物質の如き少くとも１
種の多孔性の展開帯域を有する支持体からなる分析的要
素で、特にＭ利に実施することかでさる。還元性化合物
は、ＩＩＪｃ開帯域または異なる帯域（例えば反応試剤
帯域、記録帯域または親水性帯域）中にある。展開帯域
は、適当な繊維性または非繊維性物質またはそれらの単
独または両者の混合物から調製され得る。
該展開帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号にｂピ
載されているような２ｉＩ！ｉ当な接尤剤吻質と混合す
るか織物に編織した繊維物質、米国特許第３，９９２，
１５８号、同第４，２５８，００１号および第４，４３
０．４３６号および日本特開昭５７（１９８２）−１０
１７６０号に記載された接着剤を有するかまたは有しな
い重合体組成物まｆｃは微粒子物質を使用して調製でき
る。展開帯域は叫方性の多孔性即ち、多孔度は、微粒子
、繊維または重合体ストランド間で連結された全問まｆ
ｃは孔によって作られるように該帯域内で谷力向におい
て同一でるることが望ましい。
本発明の乾式分析要素は、還元性化合物および特定の用
途のだめの他のＢ［望の試剤を含む単独の自己支持性吸
収性担持物質で勘ってよい〃二、好ましくはこのような
物質は適当な非孔性支持体上に担持される。このような
支持体は適当な方向的に安定であり、好ましくは２００
〜９００　ｎｍの範囲の波長の電磁放射線を通す透明の
フィルムまたはシート材料である。特定の要素のために
選択される支持体は、検出の指向する方式と適合し、検
定に使用される化学試剤おまひ液体試料に対し不活性で
あるべきである。有用な支持体材料には、ポリスチレン
、ポリエステル、ポリカーゴネートおよびセルロースエ
ステルか含−ｉれる。
要素は、１個以上の帯域、例えば試薬帯域、記録帯域ま
たは下塗り帯域を有する。これら帯域は一般に互に流体
接触しておシ、流体、試薬および反応生成物は隣接する
帯域の重なった部分の間を通過し得ることを意味する。
好ましくは、２個またはそれ以上の帯域は単一層内に位
置し得るけれども、帯域は別々に被覆され重層された層
である。
上記の特許の他に、適当な要素形態および成分は、米国
特許第４，０４２，３３５号および米国再発行特許第３
０，２６７号にも記載されている。
本発明の要素において、還元性化合物の童は広範囲に変
えることができるが、一般的には少くとも０．０１り７
ｍ”、好ましくは０．０５〜０．２り／−の被櫃ザで存
在する。任意の試薬は一般的に次の被板ｔ′Ｌで存在す
る。
ＥＴＡニ一般に少くともＯ，ＯＯ１９／ｍ２、好ましく
は００１〜１９７ｍ”、 栄養分ニ一般に少くとも０．０５り７ｍ”、好ましくは
０、１〜２　Ｐ／ｍ”、 緩衝剤（ＰＨ≦９）ニ一般に少くとも０．１り７ｍ２、
好ましくは０．５〜２り７ｍ”および 界面活性剤；一般に少くとも０．１９７ｍ”　、好まし
くは０．２〜５　Ｆ／？７！” １個またはそれ以上の帯域には、特別の検体の検定に必
要な試薬と同様に、当該技術で公知でるるような、活性
化剤、バインダー（一般的に親水性）、カプラー溶剤等
々を含む株々の他の望ましい、しかし任意成分を官有さ
せることができる。
本発明の一実ＭＭ態様において、水性液体中での微生物
の検出用の要素は′電子移動剤（ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒ
ａｎｓｆｅｒ　ａｇｅｎりと還元性化合物からなジ、こ
の両者は前記した通りである。これらの要素には、また
、生きている細胞のための栄養累および検定の間生理学
的−を維持する緩衝剤（例えば試験液体の試料１〜２０
０μ〕と接触させる時）が含まれることが望ましい。こ
のような要素は、例えば尿試料（還元する妨害物質を除
くために前処理される〕中のバクテリアを、試料と要素
を適当な方法で物理的に接触させ、５９０　ｎｍより大
きい適浩な波長で、バクテリアの存在の結果として還元
性化合物から放出される螢光染料を検出することによっ
て検出するために使用できる。
本発明の他の実施態様において、要素は水性液体中で生
きていない生物学的または化学的検体の測定のために使
用され、検体との相互作用によｐ螢光染料を与え得る相
互作用組成物からなる。この組成物は、染料を与えるた
めに還元された時螢元染料七放出する還元性化合物およ
び任意的に、ＥＴＡ、ノニオン界面活性剤および検定の
間中生理学的ｆ”ｆｆｉ維持する緩衝剤力・らなり、こ
れらの全ては既に記載した通りである。このような検体
の例は前に記載されている。該要素には、還元性化合物
の還元に有効な適当な試剤を有する相互作用性組成物が
含まれる。検出される螢光染料の針は、液体試料中に存
在する検体の９に相互関係している。検定の前の、妨害
物實を除くかまたは細胞を鎖線するための前処理が望ま
しい。
本発明の要素は、また、アヌコルベート（アスコルビン
酸とアルカリ金属塩〕、システィン、グルタチオン、チ
オレドキシンおよび類似物の如き他の還元剤を測定する
ために有用でるる。
検定の方法に依存して種々の六なった要素が本発明に従
って調製できる。要素は、所望の幅の長いテープ、シー
ト、スライドまたはテ、７６を含む種々の形に形成でき
る。
２ｆ１：発明の検定は手動または自動でできる。一般に
、乾式要素を使用する際に、検体または生きている細胞
３１１１定は、供給ロール、テ、７″包みまたは他のソ
ースから要素を取り、試験すべき液体試料と接触させ、
ｐ素中で試薬と混合することによって行なわれる。この
ような接触は、いかなる適凸な方法、例えば要素を試料
中に浸漬するかまたは適当な調剤器を使用し、１滴また
はそれ以上の滴のの試料で手または機械で要素にスボ、
ト付けすることによって達成される。
試料を付けた後、要素は培養、加熱または類似の如き条
件下におき、これによって試験結果を迅速化するかまた
は容易にする。
検体または生きている細胞の検出は、還元性化合物が還
元され適当な方法で検出し得る螢光染料を放出した時達
成される。画定は染料の最大波長または最大波長以外の
波長ですることができる。
次の実施例において、中間化合物の同定および純ＩｉＫ
は、橡準分光光度計で側足される赤外（ＩＲ）２ベクト
ル〔構造情報を与えるシャープ（ｓ）またはブロード（
ｂ）バンドは逆センナメートル（ｃＩｎ）で報告される
〕、または、標準ＮＦｉｌＲ分党光度計で沖」定される
。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル〔ブロード（ｂ）　
、シンダレ、ト（ｓ）、マルチプレ、ト（ハ）またはブ
ロードシングレット（ｂｌＩ）ピークにおいて、テトラ
メチルシランに対し、６社でｐｐｒｏで報告される化学
シフト〕によって決定宴れた。最終化成物の同定および
純度は、Ｉ　Ｒ、ＮＭＲ分光学および元素分析によって
決定された。
同定されたＲＩＮＤ化合物は上記第１衣に記載した還元
性化合物である。
実施例１：螢光染料ｌの溶液 上に同定した螢光化合物１は非緩衝または緩衝水溶液の
いずれかとして保存され使用される。水溶液は、染料（
２１４９）を蒸留水（２０ｍＪ）に添加し、混合物を溶
液が得られるまで超音波処理することによって調製した
。緩ｗＪ溶液は、この水溶液０．１−を、０．０５モル
濃度のリン酸カリウム緩衝剤（％（７，８）　２．９１
１１に添加することによりて調製した。
実施例２：１ｊ＆光化合物川の調製 工程Ａ：アンスロン（７５Ｆ）’１１２０℃に加熱する
ことによってトリメチルホヌ７エート４００ゴに溶解し
た。水酸化ナトリウム溶液（５０チ溶液５０ｍ１）を２
紅すり添加した。最初に、温度を１２５〜１３０℃に上
げ、次いで１０５〜１１０℃に下げた。反応の終９に識
しい沸騰か起きた。
９０℃に冷却すると混合物は固体になった。水を添加し
、薄黄色生成物を集め、水で洗浄し、エチルアルコール
から直接再結晶した。融点９２〜９４℃を有する中間体
Ａ２Ｂノが得られた。質量スペクトル分析で構造を確認
した。
工程Ｂ：中間体Ａ（６ｊ’）をＮ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ、２５耐）中に溶解した。混合物を冷却
し、オキシ塩化燐（３，５Ｆ）で少しすり攪拌しながら
処理した。得られた溶液を１００℃で２時間加熱し、次
いで栓全したフラスコ中に放置した。得られた混合物を
酢酸ナトリウムを含有する水中に注いた。黄色生成物を
集めアセトンから再結晶した。中間体Ｂの収ｔは４ｐで
ありた。
質量スペクトル分析で構造を確認した。
工程Ｃ：ナトリウムメトキシド（１５９）を乾燥メタノ
ール３００ｍ／ｒ＜：溶解し、この溶液を０℃に急冷し
た。中間体Ｂ（２４））とトリエテルホ２ホンアセテー
ト（２５ｐ）との温いＤＭＦ　（３００１１Ｌ／、）中
の溶液を添加し、混合物を還流下に３時間加熱した。次
いで水（１００１！１／）ｔ−添加し、溶液を更に１時
間還流した。溶液を水で１２０（ｌｌまで稀釈し、濃塩
酸を混合物か酸性（Ｆｋ１２）になるまで添加した。次
いで混合物を冷却し、固体を集め、エテルアルコール（
２５０ｍ）から再結晶した。中間体Ｃｌ８ｊｌが得られ
た。赤外分析および核磁気共鳴分析で構造を確認した。
工程Ｄ：中間体Ｃ（１８ｊ＋）を稀炭酸ナトリウム溶液
（５００ＩＬ／）に溶解し、溶液をｄ（遇した。
濾液を触媒景の炭素上の１０％・中ラジウムで処理し、
得られた混合物をパルシェーカー（Ｐａｒｒ　５ｈａｋ
ｅｒ）中で水素下に振蝿した。理論弥の水素が吸収され
た後、触媒を濾過によって除き、懐液を碗塩酸によって
酸性にした。生成物を集め、メタノールから再結晶して
中間体ＤＩＯ夕を得た。赤外分析および＊社ヌベクトル
分析によって構造を確認した。
工程Ｅ：中間体Ｄ（３り）′ｔ−ジクロロメタン（５０
＋＋ｊ）に溶解したものを五塩化燐（２，５ｊｉ）で処
理し、混合物を３０分間還流した。次いで塩化アルミニ
ウムを少景ずつ添加し、この混合物を攪拌し、還流下に
５時間加熱した。混合物を稀塩酸中に注ぎ、この溶液を
酢酸エチルで抽出した。
乾燥後、溶剤を減圧下で除去し、赤色の半固体３Ｐ’を
得た。この物質をトルエン：酢酸エテル４：１中に入れ
た。混合物を冷却し、不溶物質ｂ上記定義の化合物ｎｌ
Ｏ，Ｂｊｌを得た。質鎗スペクトル分析で福運を確認し
た。
実施例３：螢光化合物■の調製 化合物■は、化合物■から、５ｏｌｏｄａｒ　ａｔ　ａ
ノ。
Ｚｈｕｒｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｅｈｅｓｋｏｉ　Ｋｈｉ
ｍｉｉ、１６（５）。
１０６２（１９８０）に記載された方法を使用して調製
できる。
実施例４　：　ＲＩＮＤ　ｌおよびこれを含む緩衝組成
物の調製 工程Ａ：ｐニル−シアノアニリン３．５り、０．２モル
）、濃塩酸（８０！／）および水（２００Ｍりの混合物
を溶液が得られるまで加温し、次いで０〜５Ｃに冷却し
た。水（２５１１Ｌｌ）に溶解した硝酸ナトリウム（１
３，８ｊｌ、　０．２モル）を温度の上昇を防ぐために
ゆりくり添加した。０℃で１時間攪拌した後、得られた
ジアゾニウム塩を、４１のビーカー中のｐ−ベンゾキノ
ン（２５，９９，０，２３モル〕、ｆｆ１：＃＋ｉＪウ
ム（１００９，１，２モル）および氷水（２３００７７
１／）の攪拌混合物中にゆっくり添加した。金色の不均
一混合物を水浴中で４時間攪拌し、ゆっ＜！ｌｌ室温に
加温した。固体を濾過により分離し、水で繰返し洗浄し
、次いで乾燥し、アセトニトリルから再結晶し、中間体
Ａ２１．７ｊ’を得た。
工程Ｂ：中間体Ａ（５０Ｆ、０．２１８モル〕、１．３
−シクロヘキサツエン（２０９り、０．２６モル〕およ
びメチレンクロライド（２５（ＨＬ／ンの混合物を窒素
下で一夜還流下に加靜した。溶剤を除去した。ＫＨＣＯ
，（４２９，０，４２モル）およびＭｅＯＨ（４００１
１／）を添加することによってプロトヒドロキノンの転
位を行い、窒素下で還流下に３０分間加熱した。混合物
を冷却し、Ｆ遇し、Ｐ液を稀ＨＣｊ　／氷水中に注いだ
。濾過および乾燥（真空オープン中５０℃で〕して粗中
間体Ｂを得た。これは次の工程に使用するために十分な
純度であった。
工程Ｃ：中間体Ｂ（２２，８り、７３ミリモル〕をパル
シェーカーボトル（Ｐａｒｒ　５ｈａｋ＠ｒ　ｂｏｔｔ
ｌｅ）中でテトラヒドロ７ラン（ＴＨＦ）　（７５０Ｉ
Ｌ／　）に溶解し、炭素上１０係パラジウム触媒を窒素
雰囲気下に添加した。この混合物’（ｉ７４０ｐｓｌ　
（２，７５パールンの水素下で市販のパルシェーカー装
置上に置き、１０〜１１分間振盪した。次いで反応混合
物を鼠累雰囲気下で濾過し、真空下に溶剤を除去し中間
体Ｃを得た。メチレンクロライドから再結晶して純粋な
中間体Ｃを得た。
工程Ｄ：中間体Ｃ（３，５ｊ’、　１１．２ミリモル八
Ｎ、Ｎ　（ジイソプトキシメテレン〕メチルアミン（４
，５９，２２，４ミリモル〕およびトルエン（１５１１
Ｌｌ！〕の混合物を窒素下に１１５℃で一夜加熱、した
。
窒素のガヌ流を溶剤全部が蒸発するまで反応混合物中を
通した。ヘキサン（２５ｔ／）を添加し、混合物を加熱
しながら得られた固体をくずした。冷却後濾過して中間
体りを固体として得た。
工程Ｅ：中出」体Ｄ（４９，１０，９ミリモル）、Ｆｅ
Ｃノ、−６Ｈ２０（４，４９，１６，３ミリモル）、Ｉ
Ｈｃノ（６献）、水（６１つおよびメタノール（３０罠
ｌ）の混合物を還流下に一夜加熱した。水（１５０ゴ）
を添加し、混合物をメチレンクロライドで３回抽出した
。有機層を一緒にし、乾燥（Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４月−溶
剤を除去して中間体Ｅｉ得た。
工程Ｆ：中間体Ｅ　Ｃ３，３Ｆ、　８．４８ミリモル）
を冷メチレンクロライド（５０１Ｌｌ）に溶解し、この
溶液にトリエチルアミン（２，４ｔ／、１６．９ミリモ
ル）を添加した。次いで、この混合物を少しずつ１５分
間で、メチレンクロライド（１００ｍ）中ホスゲンの冷
飽和溶液に添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌
し、次いで、２時間で２５℃にゆりくり加温した。混合
物を真空下に一夜維持して全ての溶剤を除去した（ホヌ
グンを捕集するためにＮａＯＨ）う、プを使用したン。
得られた固体をテトラヒドロ７ラン（２５０ｍ１）中テ
＜１し攪拌した。アミン埴を除くために濾過した後、ｐ
液から溶剤を除去し、中１６３体Ｆ（ｚ得た。
工程Ｇ：中間体Ｆ（１７，３り、４３．７ミリモル〕を
４５分間で少しずつ、化合物１（６，６り、３３．６ミ
リモル）および４−ジメナルアミノビリジン（触媒は〕
のピリジン（１７５ゴ）中の溶液に添加した。反応混合
物を２５℃で１５時間窒素雰囲気下で攪拌した。得られ
た混合物を塩酸および氷水（３１）に注ぎ黄色固体を沈
殿させた。この固体を濾過によｐ捕集し、水で洗浄し真
空下で乾燥した。クロマトグラフィー（シリカ、９０：
１０、ジクロロメタン：アセトン〕で黄色泡が得られ、
て、融点２１０〜２１３℃のＲＩＮＤ　Ｉ　１３．８９
（７４チ収率）を得た。分析、Ｃ３５Ｈ２６Ｎ２０５と
しての計算値：　Ｃ，７５，８、Ｈ，４，７、Ｎ、　　
５．１、実測値：Ｃ７５，１、Ｃ，４，９、Ｎ１　５．
０゜工程Ｈ：　ＲＩＮＤ　Ｉ化合物の緩衝組成物を次の
ようにして調製した。ＲＩＮＤＩをＮ、Ｎ−ジメナルホ
ルムアミド（１プ当！５１６１ｖ）に溶解した。この溶
液の０．２５に／分をＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活
性剤０．５ｄと混合した。得られた溶液勿、次いで、緩
衝剤を室温で攪拌しながら、０．０５モル練度の燐酸カ
リウム緩衝剤（ｐｉ−１７゜５　）　２５ｍに簡加した
。
透明な分散液をイＧた。
実力ａ例５　：　ＲＩＮＤ　ＩＩおよびこれを含む緩衝
組成物の調製 ＲＩＮＤ　ｎ　ｋ次の一連の工程によって調製した。
工８Ａ：２．５−ジメトキシー４−フェニルベンズアル
デヒド（５２，５９，０，２２モル）、マロン酸（５１
，８Ｆｌｏ、５モルンおよびピペリジン（２，５ｄ）の
ピリジン（ｔｏｏｍｊ）中の混合物を８０℃で１５時間
加熱した。冷却後、混合物を塩酸／氷水（２，５）〕中
に注いだ。沈殿した黄色固体を濾過により捕集し、水で
洗浄し、フィルター上で乾燥した。生成物をアセトニト
リル（ｓｏＯｍ／）中で３０分間還流し、混合物を冷却
し、黄色固体を集め、アセトニトリルで洗浄し、フィル
ター上で乾燥した。この生成物（４３，３５＋）をエタ
ノール（１，２５７）中に懸濁させ、木炭上１０％パラ
ジウムＭＮを有するご９ルシエーカーボトル中に置き、
水素下で３日間振盪した。触媒を戸別し、ｐ液を碌縮し
て融点１４３〜１４６℃を有する中ｍ１体Ａ３５Ｆを得
た。
工程Ｂ：：間体Ａ（３５）、０．１２モル〕および゛オ
キサリルクロライド（２３，３り、０．１８モル〕のジ
クロロメタン（４０（１４’）中の混合物を２５℃で８
時間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮して、オレンジ色の
油を得た。ジクロロメタン（約５０ｍ１　）を二つに分
けて添加し、次いで減圧下に除去した。得られた油（約
３７２、中間体Ｂ）”ｆｒ、直接状の工程に使用した。
工程Ｃ；中間体Ｂ（約３７５１．０．１２モル）をジク
ロロメタン（４００ｍ／）に溶解した。この溶液を水浴
中で冷却し、塩化第二錫（３８ｐ、　ｏ、１ｓモル〕を
添加した。反応混合物を２５℃で３０時間放ｔｌグし、
次いで塩酸／氷水（３））中に注き、１５分間攪拌した
。層分離し、水層をジクロロメタンで２回洗浄した。オ
レンジ色の層を一緒にし、乾燥し、減圧下で談縮して固
体生成物を得た。シリカ上、ジクロロメタン、エーテル
（９８：２）でのクロマトグラフィーで融点９７〜９９
℃の黄色中間体Ｃ２Ｂ夕を得た。
工程Ｄ：中出出１体（２８，ｐ、０．１０４モル〕のの
酢酸（６００ゴ）および過塩素酸（１２ゴ〕中の溶液を
木炭上１０チノ平ラジウム触媒を有するパルシェーカー
ｙｊ？）ル中に置き、水素下に１週間振鑞した。酢酸カ
リウム（約１ｏｐ）ｆ：添加し、次いで混合物を１０分
間攪拌し、次いで濾過して触媒を除去した。ろ液を減圧
下で濃縮して半固体の生成物を得た。この生成物をテト
ラヒドロフラン中に溶解し、溶液を氷水中に注いだ。水
をジクロロメタンで抽出し、溶剤を乾燥し、鍼縮した。
トルエンを２回に分けて添加し、減圧下で除去した。
中間体Ｄ２３．５５’が得られた。
工程Ｅ：：酸セリウムアンモニウム（ｃｅｒｒｉｅａｍ
ｍｏｎｉｕｍ　ｎ１ｔｒａｔ＠）　（１５２ｆｉ、０．
２８モル）を水（３２５１Ｒ１）に溶解し、中間体りの
アセトニトリル（３２５１Ｌｌ）のが液中に攪拌しなが
ら４５分間かけて滴加した。反応混合物を更に３０分１
１１」攪拌した。水（３００ｍ）を添加し、混合物ｔジ
クロロメタン（４Ｘ１００Ｍ／）および工１ルエーテル
（１ｘｌＯＯｍＪ）で抽出した。オレンジ色層を一緒に
し、乾燥し、濃縮してオレンジ色の油２４タを得た。こ
の油の精製した試料は固化し、融点８１〜８２．５℃で
あった。
工程Ｆ：中間体Ｅ（２４Ｆ、０．１１モル）をテトラヒ
ドロフラン（２００ｍＪ）中に溶解し、木炭上１０％パ
ラジウムを有する／やルシェーカーボトル中に置き、水
素下で７５分間振盪した。触媒を窒素下で戸別し、Ｐ液
を濃縮して中間体Ｆ２３ｊｌを得た。この生成物は次の
工程で直接便用した。
工程Ｇ：中間体Ｆ（２３ｊｌ、０．１モル）およびＮ、
Ｎ−（ジイソプトキシメナレン〕メ１ルアミン（３０，
９Ｆ、　０．１５モル〕のトルエン（５（１１）中の混
合物を９０℃で窒素雰囲気下に３時間加熱した。薄層ク
ロマトグラフィ（シリカ、ジクロロメタン：エーテル、
９５　：　５）で出発物質の存在が示された。溶剤を除
去し、Ｎ、Ｎ−（ジイソプトキシメナレン）メチルアミ
ンＣＩＩＩＬ／）を添加し、混合物を更に３時間加熱し
た。メタノール（５０ゴ）を添加し、混合物を還流させ
た。混合物を０℃で一夜冷却した。生成物を集め、冷メ
タノールで洗浄し、乾燥した。融点２１２〜２１３℃の
中間体Ｇ１１．９Ｆが得られた。
工程ｌ■＝中間体Ｇ（１１，９り、０．０４モル〕およ
び塩化第二鉄（１７，１ｙ、０．０６３モルンの塩酸（
３５１１Ｌｔり、水（３５ｍ）およびメタノール（１０
０ｍ）中の混合物を８時間還流した。反応混合物を０℃
で数時間冷却し、濾過した。Ｐ液を水（１０Ｑｍ／ンで
処理し、テトラヒドロンラン／ジクロロメタン（１：１
．）、３Ｘ１００ｍｌで抽出した。抽出物を一緒にして
乾燥し、木炭で処理し、戸遇した。ｐ液を濃縮して、中
間体Ｈ１０，３Ｆを得た。
工程Ｉ：中間体Ｈ（１０，３ｊｌ’、０．０３４モル〕
およびトリエテルアミン（６，９ｙｌｏ、０６８モル〕
をジクロロメタン（ｔｏｏｌＲｌ）中に溶解した。この
溶液を、あらかじめホスゲンガスで飽和させたジクロロ
メタン（３００１１１１）に攪拌しなから０℃で少しず
つ添加した。反応混合物を０℃で１５分間攪拌し、次い
で２時間２５℃に加温した。溶剤全減圧下に除去し、エ
チルエーテル／テトラヒドロフラン（ｌ：１．１００１
１１りを添加した。この混合物を楕押し、固体を戸別し
、エチルエーテル／テトラヒドロフランで洗浄した。Ｐ
液を濃縮して生成物、中間体１１１．１ｊｌを得た。
工程Ｊ：染料Ｉ（２，４ｊｌ、０．０１３モル〕のピリ
ジン（１００ゴ〕中の懸濁液を窒素雰囲気下で触媒籟の
４−　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよび中間体Ｉ
（５）、０．０１５モル）で処理し、次いで暗所で５時
間攪拌した。反応混合物を塩酸／氷水（２１）中に注ぎ
、固体生成物を捕集し、水で洗浄し、暗所で１５時間真
空中で乾燥した。クロマトグラフィー（シリカ、ジクロ
ロメタン／アセトン、９：１）で生成物ＲＩＮＤ　ＩＩ
　１．３ノが得られた。分析：Ｃ３，Ｈ２３ＮＯ５とし
ての計算値、Ｃ１７６，１、Ｈ１４，７、Ｎ、　２．９
、実測値Ｃ，７４，１，）ｉ、　４．８、Ｎ、２．８゜ ＲＩＮＤ　ｎからなる組成物を、央〃龜例４に記載した
と同じ方法によって調シした。
実施例６：７エナレノン染料忙使用した白血球の沿色 本実施例は、白血球地色のためのフェナレノン染料化合
物１およびＨの有用性を示す。
白血球富化層を、健康な大人の供血者の血液（ＡＣＤ　
＋エーゾ（ＡＣＤ（ｉ、クエン酸塩、デキストローズＢ
−Ｄ４６０６）か予め入れられた血液捕集管）中に採血
〕から、１０１血液管にＤｅｘｔｒａｎＴ７０（平衡塩
溶液中６％）１．５ｍＪを添加することによって精製し
た。これらのチューブを１時間静１ｔｔシ、次いで血漿
）−を無相の１５ｍ／遠心分離管に移し、該ｇ全燐酸塩
緩衝溶液（０，０５モル温度の燐酸カリウム緩衝剤中に
塩化ナトリウム８．５９、ｐ）１７．５　）で７．５　
ｘｉまで充満した。次いで管を１１０００ＲＰで１０分
間遠心分離し、イむられた細胞ペレッ）−ｉ１０＋１１
７の溶解溶液（ｌｙｓｉｎｇ　５ｏｌｕｔｌｏｎ）（水
１００Ｊｆｆｊ中に、塩化アンモニウム０．８３り、重
炭酸ナトリウム０．ＩＰおよび（エチレンジニトリロ）
テトラ酢酸ジナトリウム塩０．００３Ｆを含む。−７，
２）中に懸濁させ、管を溶液か透明になるまで静置した
。管を再び遠心分諭し、ベレットを洗浄し、緩衝溶液中
に再懸した。細胞を数え、約１０６細刀包／ｄに調節し
た。
２００マイクロリツトルの細胞懸濁液を最高速度で１０
分間遠心分離した。固定化＃胞プレパレーシ５ンを空気
乾燥し、化合物！および■（１〜／ゴメタノール）で１
〜２分間泊色し、蒸溜水で洗浄した。
着色細胞をエビ螢光顕微鐘（励起５４６　ｎｍ、発光５
９０　ｎｍ）下で横置した。白血球の明るい橙赤色の螢
光か、最小のパックグランド螢光と共に観察された。
この検定では次の溶液を使用した：メタノール中０．０
１モル次度の電子移動剤（ＥＴＡ）およびプラインヒー
トイン７具−ジ冒ン培地中で生長し、Ｉ×１０細胞／′
ＩＬｌの振度を有するシェードモナスアエルギノーサ（
Ｐｍｅｕｄｏｍｏｎ口ａｅｒｕｇ１ｎｏｓａ）。
次の成分から該溶液をｖｔ４製した：実施例４に記載し
たようにしてｖ！４製したＲＩＮＤ　１１分散液１．５
コ、ｖ４ｍ力！ｊ　’）　ム緩ｆｉｌｊ剤（ＰＨ７，５
）　１．５ｍ、　Ｉ”ルｓ　−ス原液（１（１）２５μ
！およびシェードモナスアエルギノーサ溶液２５μ１０
　次いで、適当なＥＴＡ２５μノを添加した。　対照に
はＥＴＡを含有させなかった。次いで、螢光を２５℃で
標準ヌペクトロフルオロメーター（励起５４０　ｎｍ、
発光６２０　ｎｍ）を使用して、開始時（溶液を最初に
混合した時）および５．１５および３０分後に測定した
。
下記紀１１表に示す結果は、ＲＩＮＤ　ＩＩが、２ｈＡ
の異なる電子移動剤を使用するシェードモナスアエルギ
ノーサの溶液検定に使用できることを示している。
第１１表 対照　０．０５８　０．０６２　０．０６６０．０７８
ＴＭＢＱ”　　０．０５９　　０．０８１　　０．１４
４　０．２９０ＤＭＨＢＱ＊＊０．０５８　　　０．０
８７　　０．１７７　０．３６０＊　２，３．５−トリ
メチル−１，４−ベンゾキノン＊＊　２，３−Ｊｌｆル
ー５−ヒドロキシメチル−１，４−ベンゾキノン 以下余白 実施例８：ＲＩＮＤ　］を使用したグルコース−６−ホ
原液を次の試剤から調製した： Ｍ溜水中ｏｙルコース−６−ホス７エー）（０，１モル
浪度）、 蒸溜水中のニコチンアミドアデニンソヌクレオチドホス
フェー）（０，００６モル函度）、蒸Ｕ　水２　ｍｌ　
中ｏ　グルコース−６−ホス７エートデヒドログナーゼ
（０，２７〜）、および０．０５５モル濃度のトリス・
Ｉ（Ｃ）（ＰＩ（７，８）および０．００３３モル碌度
の塩化マグネシウムから調製されたトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン−Ｍｇ緩衝剤（ＴＲｌ５−Ｍｇ緩
衝剤）。
ＲＩＮＤ　ｌの分散液Ｖよ、ＲＩＮＤ　ｌ　４９（ｚＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０μｌに＃解し、　Ｔ
ＲＩＴＯＮＸ−１００界面活性剤０．５Ｎを添加し、こ
の溶液を攪拌しなからゆっくり、ＴＲｌ５−Ｍｇ緩ｉ／
ｌＪ剤ＣＰ’７．８）溶液２５１Ｌｌに添加することに
よって調製した。
試に浴液を次の成分から調製した：　ＲＩＮＤ　］分散
液１．５１Ｒｔ、ＴＲｌ５−Ｍｇ緩衝剤１．２ｍ、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートのスト
、り溶液１００μ１１グルコース−６−ホスフェート１
００μ！およびフェナジンメトスルフェート溶液（３ｍ
ｙ／ｍｌメタノール）２５１１Ｌ次いで、飄々のＴＡ度
（１０μ！１２５μｌおよび１００μｌ）のグルコース
−６−ホスフエートデヒドログナーゼ溶液を上記溶液に
添加し、夫々、溶液Ａ、ＢおよびＣ？！−形成した。対
照溶液には′ｆＩ！ｆ、素を含有させなかった。
次いで２５℃で螢光を測定した。
１分画シの相対螢光の変化は図面に示きれ、ＢＩＮＤ　
ｌ　ｄ”ルコース−６−ホス７エートデヒドログナーゼ
の迅連検定に使用でさることを示している。
本実施例は、生物学的還元剤ニコチンアミドアデニンヌ
クレオチド、還元体（ＮＡＤ）りおよびアヌコルビン酸
を検定するためのＲＩＮＤ　ｌの使用を示す。
次の試剤原液を使用した： 蒸溜水１０に／中のＮＡＤＨ（７，０９ｍｆｌ）および
蒸溜水１０ｍ１中の７ヌコルビン１袈ナトリウム（１，
９８７ダ）。
０．０５モル＠度の燐酸カリウム緩衝剤を使用した他は
実り例８に記載したようにして、ＢＩＮＤ　］の分散液
を調製した。
試秋溶液を次の成分から調製した：　ＲＩＮＤ　１分散
液１．５ｍ１．０．０５モル磁度の燐酸カリウム緩衝剤
（ＰＨ７，５）　１．５ｍｌ、およびフェナジンメトス
ルフェート溶液（３ダ／ｄメタノール９２５μ１０第１
ｉｔ宍および第■に示す種々の疫度の還元剤をこれらの
溶液に添加した。次いで、２５℃で５分後に、各還元剤
系列（還元剤の無い対照を含む）について螢光上測定し
た。下記第１１１表および第■表に示す結果は、ＢＩＮ
Ｄ−１がＮＡＤ）Ｉおよびアスコルベートの決定に夫々
有用′ｔ′るることを示す。
以下余白 第ｎ１表 対　　照　　　　　　　　　　　０．０４２３．３Ｘ１
０＝モル濃度　　　　　０．０４６３．３　Ｘ　１０−
’モル磁度　　　　　０．０４３３．３　Ｘ　１０””
モル濃度　　　　　０．０９６３．３　ｘ　１０−５モ
ルｍＷ　　　　　　０．３７０第■表 対　　照　　　　　　　　　　　０．０４４３．３Ｘ１
０″″８モル練度　　　　　０．０４９３．３　Ｘ　１
０−’モル濃度　　　　　０．０４９３．３　Ｘ　１０
−６モル鼠度　　　　　０．０９６３．３　Ｘ　１０−
５モル扶度　　　　　０．４５０次の原液を使用した：
メタノール中の電子移動剤（ＥＴＡ）（０，０１モル碌
度〕および大腸菌濃度は３×１０細胞／Ｖであった。
溶液を次の成分から調製した：　ＲＩＮＤ　ｎ分散液１
、５１１Ｌｌ、燐酸カリウム緩衝剤１．５１１、グルコ
ース溶液（ｘ０１２５μ！および大腸菌細胞２５μｌ。
次いで適当なＥＴＡ２５μｌｉｔ添加した。対照溶液に
はＥＴＡを含有させなかった０次いで、螢光を一始時お
よび５，１５および３０分後に測定した。
第ｖ表に記載した結果は、ＲＩＮＤ　Ｉｔか種々のＥＴ
Ａを使用した大腸菌の３０分検定に適していることを示
している。
第Ｖ表 対照　０．０３９０．０４５０．０４００．０４５ＰＭ
Ｓ＊Ｌ１．０２２　　Ｕ、０４２　０．１１　　０．２
８ＴＭＢＱ＊＊０．０２３　０．０３８　０．０９０　
０．２６ＤＭＨＢＱ””　　０．０２４　０．０３９　
０．０９６　０．２６＊フエナジンメトサルフエート ＄＄　２．３．５−トリメチル−１，４−ベンゾキノン
＊＊＊　２，３−ジメチル−５−ヒドロキシメチル−１
，４−ベンゾキノン実施例１１：乾式要素中のＢＩＮＤ
Ｉによる大腸狛の検出 本実施例で下記７オーマ、ト金有する乾式要素を使用し
た。
ポリ（ビニルトルエン−共−ｐ− １−ブチルスチレン−共−メタク リルば〕ビーズ　　　　　　　　　　　１２９シ４−ポ
リ（ｎ−ブチルアクリレート−共 試薬層　ム塩）　　　　　　　　　　　　　　　　４９
／ｍ”ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性剤　　　　４
シーグルコース　　　　　　　　　　　　０．１シーＲ
ＩＮＤ　ｌ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１９／ｍ
”２．３．５−トリメチル−１，４−ベンゾ千ノン　０
．８シ４−ゼラチン（硬化）１．１シー Ｌ）ＡＸＡＤ　３０界面活性剤　　　　　０．０３Ｆ／
ｍ”ゼラチン←硬化）　　　　　　　　　　ＩＶ−ＺＯ
ＮＹＬ　ＦＳＮ界面ｌａ性剤　　　　　０．２９／ｌｎ
”ポリ（エチレンテレフタレート）支持体この衆累を評
価するために、燐酸カリウム緩衝剤（μｍ７．５．）中
の種々の大腸１細胞−就の溶液と緩衝剤のみを含有する
対照とを調製した０次いでこの溶液を１０μｌ　７８便
用して該要素上に点滴し、要素を３７℃で６０分間培養
した。標準フルオロメーター（励起５４０ｎ亀発光６２
０ｎｍ）中で培養期間の３分後および６０分後に螢′：
／ｌを測定した。
下記第■表に記載した結果は、３分および６０分での相
対螢光における差（△）ｔ−示し、この要素を使用して
約１ｏ　ｓＭ／”ｋ検出で＠ることｔ示している。
第Ｍ表 １、Ｏｘｌ　０　　　０．２７２　　　０．００７　　
　２．６４、ｌＸ１０　　　０．２４９　　　　０．０
０７　　　２．８０　　　　０．２２１　　　　０．０
１０　　　４．５＊ＣＶ＝変化の係数 央廁例１２：螢九染料の安定性 賦販浴液ｔ、０．０５モル限嵐燐はカリウ、ム駿剥剤中
ｏ大ｍｍａｌＪｓ　（約１ｘ１０８＋ＩｔｉＪ胞１５１
７）　２５　μｌ、グルコース浴ａ２５μ１１７エナシ
ンメトスル７エート（３〜／耐メタノール）２５μノお
よびメタノール中の染料化合＊１２５μｌから調製した
。標準分光光度計で５４５　ｎｍで２０分間光学訣就を
測定した時、良度変化は見られなかった。この試験は、
染料ｌは安定でるる、即ち、大腸菌細胞、′電子移動剤
およびグルコースの存在下で還元芒れないことを示して
いる。
同様な試験で、対照ＲＩＮＤ　Ｄ　（、下記夾ん例１３
参照ンから放出された染料は、大腸菌細胞（ＴＲＩＴＯ
ＮＸ−１００界面活性剤と燐酸カリウム緩衝剤の分散液
）、７エナジンメトスルフエートおよびグルコースの存
在下で４分未満で先金に還元された。九字眼嵐を６５０
　ｎｍで読んだ。
本災２Ａｆ１例似、本発明で有用なりＩＮＤ化合物（Ｒ
ＩＮＬ３１）と、本発明の範囲外の螢光部分、それらの
いくつかは、生物学的検定に通常使用さ扛、即ち、４−
メチルアンペリ７エロンおよびフルオレ、セインを含有
する対照ＲＩＮＤ化合物との光分解安定性を比較する。
対照化合物Ａは４−メチルアンペリ７エロン部分を含有
するＲＩＮＤ化合物である。
対照ＲＩＮＤ　ＢおよびＲＩＮＤ　Ｃは螢光部分を含有
する。対照ＲＩＮＤ　Ｄは螢光アクリジン染料部分’に
含有する。
谷ＲＩＮＤ化合物の分散液は、ＲＩＮＤ化合物（４μり
）”ｆ　Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０μりに
溶解し、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性坤ｊ（０，
５μｌ）を添加し、この混合物全攪拌しなから０．０５
モル績度の燐酸カリウム（ｐｉ−１７，５，）２５μｌ
にゆっくジ添加することによってｐＡｍｔ、た、これら
の分散液調製は黄色光の下で行なった。これらの組成物
に還元剤は添加しなかった。
次いで、各分散ｇ、（１，５μｌ）および緩′９ＩＪ剤
（１，５μｌ’に水晶セルに入れ、螢光を２５℃で標準
スペクトル光度計で、各放出染料の、励起最大値で励起
し、先光最大値で検出することによって決定した。理崗
的には、還元剤か存在しないのでこれらの波長では螢光
は検出されない。
結果（第■表ンは、開始時と１５分後での読みの差（Δ
相対螢光）として振わす。対照ＲＩＮＤＢは、その高い
不安定性のために１分後に読んだ。
本発明のＢＩＮＤ−１と対照ＲＩＮＤＤのみ、　このよ
うな条件下で安定でめった。しかしなから、対照ＲＩＮ
ＤＤから放出された染料は、生きて−いる細胞、ＥＴＡ
およびグルコースの存在下で急速に蕪元された。ＢＩＮ
Ｄ　Ｉから放出された染料は、同様の条件下で還元され
ない、促って、ＲＩＮＤ　ｌおよびその放出染料のみ、
共に、一般に分析創建に使用される生物学的条件下で安
定でわる。
第Ｖｌ１株 ＲＩＮＤ−Ｉ　　　５４０　　　　６２０　　　０．Ｉ
ＲＩＮＤ−Ａ　　　３７０　　　　４５０　　　２４０
ＲＩＮＤ−Ｂ　　　４９５　　　　５２０　　　８６５
＊ＲＩＮＤ−Ｃ４９５５２０１０，８ ＲＩＮＤ−Ｄ　　　６００　　　　６６６　　　　０．
１本１分後の読み 〔発明の効果〕 本発明の検定は、低濃度においても検体に対して迅速で
高感度である。使用される螢光染料は公知の検定の螢光
染料よりも一般に長い波長で吸収し放射するため、本発
明の検定は、生物学的検体で一般に遭遇するスペクトル
干渉を避けて、生きている有機体を測定するために生理
学的−で使用できる。
これらの有利性は、５３０　ｎｍ以上の最大吸収と少く
とも５８０　ｎｍの最大放射を有するある柚の７エナレ
ノンおよびベンズフェナレノン化合物ヲ使用することに
よって達成される。これらの化合物はベンゾキノン化合
物の如き担体に谷筋に付着でき、放出性化合物を提供で
きる。担体に付九した時、染料は転移性で必ジ、即ち、
これらは、放出された時とは異なる付層された時の波長
で螢光を発する。更に、これらの化合物は、細胞または
組織の如き生物学的検体ヲ層色するために有利に使用さ
れる。本発明で使用される好ましい染料は、有利には約
６以下であり、かくして６〜９の一範囲で最大螢光を示
すｐＫａ全治する。
【図面の簡単な説明】
第１し］は、実ｈｔａ例８で記載したグルコ−クー６−
ホヌフエーヘｒヒドロゲナーゼの検定のために、時間（
分つに対する相対螢光の変化をプロットしたグラフであ
る。 特肝出顧人 イーヌトマン　コダック　カンパニー 特許出願代理人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、染色剤として式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
    式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） のいずれかによって表される置換または非置換蛍光化合
    物を含む細胞染色組成物。 ２、構造式ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
    式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシもしくはメルカプトまたはそれ
    らの塩である） のいずれかによって表される置換または非置換化合物か
    ら誘導された螢光部分からなり、ｎは１または２である
    〕 の還元性化合物を含み、該還元性化合物がｐＨ９または
    それ以下で還元されて螢光部分を放出し得るものであり
    、さらに、Ｒ＾１がＨで置換された時ＣＡＲ−（Ｈ）＿
    ｎが水中で測定した時少なくとも約＋１００ｍＶのＥ＿
    １＿／＿２を有するものである組成物。 ３、構造式ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
    式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシもしくはメルカプトまたはそれ
    らの塩である） のいずれかによって表わされる置換または非置換化合物
    から誘導された螢光部分からなり、ｎは１または２であ
    る〕 の還元性化合物を含み、該化合物がｐＨ９またはそれ以
    下で還元されて螢光部分を放出し得るものであり、さら
    に、Ｒ＾１がＨで置換された時ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎが水
    中で測定した時少なくとも約＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである乾式分析要素。 ４、Ａ、検体を含有すると思われる液体試料を、構造式
    ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキ
    ノン核であり、Ｒ＾１は式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
    式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシもしくはメルカプトまたはそれ
    らの塩である） のいずれかによって表わされる置換または非置換化合物
    から誘導された螢光部分からなり、ｎは１または２であ
    る〕 の還元性化合物であり、該化合物が該ｐＨで還元されて
    螢光部分を放出し得るものであり、さらにＲ＾１がＨで
    置換された時ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎが水中で測定した時少
    なくとも約＋１００ｍＶのＥ＿１＿／＿２を有するもの
    である還元性化合物と接触させる工程、並びにＢ、検体
    の存在の結果としてその還元により該化合物から放出さ
    れた螢光部分を検出する工程からなる検体の測定方法。 ５、生物学的試料を、式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
    式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） のいずれかによって表わされる置換または非置換螢光化
    合物と接触させることからなる生物学的試料を染色する
    方法。 ６、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはヒドロキシ、メルカプトもしくはアミノま
    たはそれらの塩である） によって表わされる置換または非置換化合物。
JP62018753A 1986-01-31 1987-01-30 フエナレノンおよびベンズフエナレノン化合物を含む組成物および要素ならびにそれらの用途 Pending JPS62190142A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5045477A (en) * 1985-02-07 1991-09-03 Eastman Kodak Company Analytical methods utilizing reducible components
US5037762A (en) * 1986-05-30 1991-08-06 Eastman Kodak Company Water-compatible reducible compounds and their use in analytical compositions and methods
US5093239A (en) * 1988-05-02 1992-03-03 Eastman Kodak Company Reagents for detecting oxidase positive microorganisms
WO1989010972A1 (en) * 1988-05-02 1989-11-16 Eastman Kodak Company Novel reagent and method for assaying hydrogen peroxide
US5055414A (en) * 1988-07-05 1991-10-08 Eastman Kodak Company Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical methods
US5095099A (en) * 1990-12-10 1992-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent compounds for absorption and re-emission of radiation
EP0606296B1 (en) * 1991-09-19 1999-03-03 Boehringer Mannheim Corporation Reagents and assay methods including a phenazine-containing indicator
US5707820A (en) * 1991-09-19 1998-01-13 Boehringer Mannheim Corporation Reagent and assay methods including a phenazine-containing indicator
EP0841403A3 (en) * 1996-11-08 1998-07-29 Idemitsu Kosan Company Limited Coloring composition for microorganisms, filter tool for entrapping bacteria, and kit for measuring the number of bacteria
GB2337530A (en) * 1998-05-22 1999-11-24 Henkel Kgaa Direct hair-colouring compositions based on phenalenone derivatives
JP5669123B2 (ja) * 2009-03-17 2015-02-12 国立大学法人 東京大学 発光によるビタミンｃ検出法及び定量法
JP6463005B2 (ja) 2013-05-30 2019-01-30 キヤノン株式会社 マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7302561A (ja) * 1972-03-01 1973-09-04
CA1095819A (en) * 1977-01-14 1981-02-17 Eastman Kodak Company Element for analysis of liquids
US4307188A (en) * 1979-09-06 1981-12-22 Miles Laboratories, Inc. Precursor indicator compositions
US4485164A (en) * 1983-07-06 1984-11-27 Eastman Kodak Company Oxidants for reducing post-process D-min increase in positive redox dye-releasing image transfer systems
US4746607A (en) * 1985-02-07 1988-05-24 Eastman Kodak Company Use of substituted quinone electron transfer agents in analytical determinations

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