JP3098545B2

JP3098545B2 - ビス−ジカチオンアリールフラン類を用いる核酸および細胞骨格成分の蛍光検出方法

Info

Publication number: JP3098545B2
Application number: JP07529154A
Authority: JP
Inventors: ダイクストラ，クリスティン・シー; ティドウェル，リチャード・アール; ボイキン，デイヴィッド・ダブリュー; ウィルソン，ダブリュー・デイヴィッド; スピカラ，ヤロスラフ; ダス，バイヤン・ピー; クマール，アルヴィンド
Original assignee: ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル; ジョージア・ステイト・ユニヴァーシティ・リサーチ・ファンデイション，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 2000-10-16
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: JPH10501615A; EP0758453A1; US5723288A; CA2189125A1; AU2436995A; HU9603078D0; AU699223B2; CN1151209A; NZ285309A; US5594138A; WO1995030901A1; BR9507616A; HUT76440A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は国立予防衛生研究所（NIH）助成金第UO1−AI
−3363号による政府援助のもとに行われたものである。
したがって、政府は本発明に対して権利の一部を所有し
ている。

技術分野本発明は核酸および細胞骨格成分を結合検出する方法
に関する。より具体的には、ビス−ジカチオンアリール
フラン化合物を用いて核酸と細胞骨格成分を蛍光により
検出する方法に関する。

背景技術多くの種類のサンプルが染色の蛍光特性によって分析
されている。一つの分子がある波長の光で励起される
と、より長い波長の光が発光して、励起していない（基
底）状態に戻る。この時に蛍光が観察される。励起光と
分子の発光とは、波長が異なるので、光学フィルターを
使えば互いに分離することができる。蛍光はこれまで多
年にわたって光学顕微鏡である種の分子（したがって、
構造）を観察するのに用いられて来たが、フロー・サイ
トメトリー（flow cytometry）など他の分析技術にも利
用されている。

蛍光分析で使用されている蛍光プローブの種類は、他
のプローブ（抗体である場合が多い）とラベルを共有す
るものと、分布あるいは蛍光が細胞の環境、したがって
特定の特性を反映しているものとの、二つのカテゴリー
に大別することができる。後者のうち、核酸や細胞骨格
の構造あるいは成分に特異的に結合する蛍光化合物が特
に重要である。

各種の蛍光プローブが知られており、例えばプロピジ
ウム（propidium）やエチジウム（ethidium）染料があ
る。しかしながら、これらの化合物はデオキシリボ核酸
（DNA）と、二重鎖リボ核酸（RNA）の両方に結合してし
まう。したがって、DNAを測定するときには、RNAを除か
なくてはならない。

４′,6−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAP
I）も、細胞学、核酸の生物物理分析やフロー・サイト
メトリーの無数の用途においてDNA染料として使用され
ている。DAPIは、AT−リッチDNA配列中のDNAの小さな溝
（DNA minor groove at AT−rich DNA sequences）に優
先的に結合するが、そればかりでなく、GCおよび混合GC
/AT配列にインターカレートし、さらに顕著にRNAとも結
合する。（W.D.Wilson,et al.,“The Effects of Ligan
d Structure on Binding Mode of Unfused Aromatic Ca
tions with DNA"in Molecular Basis of Specificity i
n Nulcleic Acid−Drug Interactions,Klumar Academic
Publishers,Amsterdam（1990）,pps.331−353;W.D.Wil
son,et al.,Biochemistry32,4098−4104（1993）を参照
されたい）。DAPIはチューブリンなど他の細胞成分にも
結合して、RNAやチューブリンを染色する。

これまでに、多数のアリールジアミジン類が価値の
ある抗原虫剤として合成されてきた。（B.P.Dasおよび
D.W.Boykin,J.Med.Chem.20,531−536（1977）を参照さ
れたい）。DAPIと同様に、2,5−ビス（４−アミジノフ
ェニル）フラン（2,5−ビス（４−グアニルフェニル）
フランとも呼ばれている）もまた、AT−リッチDNA配列
中にあるDNAの小さな溝と結合するが、そればかりでな
く、GCおよび混合GC/AT配列と相互作用する。（上記W.
D.Wilson,et al.,（1990），上記W.D.Wilson,et al.,
（1993）を参照されたい）。

蛍光分析の用途で使用されているもう一つの染料に、
ビス−ベンゾイミドHoechst 33258がある。しかしなが
ら、Hoechst 33258は密接に関連する化合物であるた
め、DNAの大きな溝にある自己結合錯体（self−associa
tion complex）を介して、GC−リッチ配列に結合する
と、Loontiens et al.が述べている。（F.G.Loontiens,
et al.,Biochemistry29,9029−9039（1990）を参照され
たい）。この薬剤はRNAとも、著しい結合力（associati
on）を持っている（上記Wilson,et al.,（1993）を参照
されたい）。したがって、DAPIや2,5−ビス（４−アミ
ジノフェニル）フランの場合と同様に、Hoechst 33258
によっても、DNAでない成分（non−DNA elements）が顕
著に染色される。

発明の要旨本発明の第一の態様は、次の式（Ｉ）の新規な化合物
を提供することである。

式中、R₁とR₂とはＨ、低級アルキル、シクロアルキ
ル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、
またはアルキルアミノアルキルからなる群から各々別個
に選ばれるか、R₁とR₂とでC₂からC₁₀のアルキレンを表
し、あるいはR₁とR₂の二つで次の基を形成する。

式中、ｎは１から３までの数で、R₁₀はＨであるか、
またはR₁₅とR₁₆とがＨおよび低級アルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆である。

R₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、
ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキル
アミノアルキルである。

Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基
である。

式中、R₄、R₅およびR₆は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲ
ン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシア
リールアルキルからなる群から各々別個に選ばる。

R₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、アミノアル
キル、またはアルキルアミノアルキルである。

本発明の一実施例において、R₁とR₂の二つで次の基を
形成している。

式中、ｎは１から３までの数を表し、R₁₀はＨである
か、あるいはR₁₅とR₁₆がＨと低級アルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆である。

R₃、R₄とR₅とは各々Ｈである。本発明の他の実施例に
おいては、R₁、R₃、R₄とR₅はＨであり、R₂は低級アルキ
ルである。

本発明の第二の実施態様は、核酸の蛍光による検出方
法である。この方法は、核酸に式（Ｉ）の化合物を接触
させること、および核酸を光に暴露して式（Ｉ）の化合
物から蛍光を発光をせることからなる。

本発明の第三の実施態様は、DNAとRNAとを含有する核
酸混液から蛍光によりDNAのみを選択的に検出する方法
である。この方法は、（ａ）核酸混液を式（Ｉ）の化合
物に接触させること、および（ｂ）の核酸混液を光に暴
露して、式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることか
らなる。

本発明のさらに他の態様は、微小管構造の蛍光による
検出方法である。この方法は、微小管構造に式（Ｉ）の
化合物を接触させること、および微小管構造を光に暴露
して式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることからな
る。

本発明のさらに他の態様は、第一の細胞構造と第二の
細胞構造とが互いに異なる細胞から、該第一の細胞構造
と該第二の細胞構造とを蛍光により同時検出する方法で
ある。この方法では先ず、（ａ）細胞に第一の蛍光化合
物と第二の蛍光化合物に接触させる。第一および第二の
蛍光化合物は、互いに構造が異なってはいるが、蛍光化
合物各々は式（Ｉ）の構造を持っている。第一の蛍光化
合物は選択的に第一の構造と結合し、第二の蛍光化合物
は選択的に第二の構造と結合する。さらに、第一と第二
の蛍光化合物の蛍光発光スペクトルが異なっている。細
胞と第一および第二の蛍光化合物とを接触させた後、
（ｂ）細胞を光に暴露して、第一および第二の蛍光化合
物の両方から蛍光を発光させ、したがって第一の細胞構
造と第二の細胞構造から異なる蛍光発光スペクトルの蛍
光が発光する。

本発明のさらに他の態様は、細胞構造の蛍光検出用キ
ットを提供する。このキットは、（ａ）式（Ｉ）の化合
物、および（ｂ）（Ｉ）の化合物が核酸を含有するサン
プルと接触するとき、この化合物のラベルを付けた核酸
混液を形成するのに充分な量の溶媒からなっている。

本発明のさらに他の態様は、式（Ｉ）、（I a）また
は（I b）の化合物、あるいはこれらの化合物の生理的
に許容できる塩類によって構成されるキットである。

以下に記述する明細書によって、本発明の上記その他
の目的および態様を詳細説明する。

発明の詳細な説明蛍光による核酸の検出方法に有用な化合物類を開示す
る。この化合物は、次の式（Ｉ）の化合物類からなる。

R₁とR₂とはＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリ
ール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはア
ルキルアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれ
るか、または、R₁とR₂の二つで直鎖または枝分かれ、飽
和させたまたは不飽和のC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、
あるいはR₁とR₂の二つで次の基を形成する。

式中、ｎは１から３までの数であり、R₁₀はＨである
か、またはR₁₅とR₁₆がＨおよび低級アルキルからなる群
から各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆である。好ま
しくはR₁₀はＨである。R₁₀はリングのＣ−２、Ｃ−３、
Ｃ−４、またはＣ−５のどの位置に置かれていても良
い。好ましくは、R₁₀はＣ−３の位置に位置する。

本発明の一実施例においては、R₁とR₂の二つで次の基
を形成している。

式中、ｎおよびR₁₀は上記の定義と同様である。

本発明の他の実施例においては、R₁とR₂の二つでC₂〜
C₁₀、直鎖状、飽和させたアルキレンを表している。よ
り好ましくは、R₁とR₂の二つでC₂〜C₅直鎖状、飽和させ
たアルキレンを表す。

本発明のさらに他の実施例においては、R₁はＨであ
り、R₂は低級アルキル、好ましくはイソプロピルであ
る。

R₃は、Ｈ、低級アルキル、シクロアルキル、アリー
ル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルか
らなる群から選ぶことができる。好ましくは、R₃はＨで
あるか、またはR₁₄が低級アルキルである式−R₁₄OHのア
ルキルヒドロキシである。好ましくは、R₁₄は−（CH₂）
_２−である。

Ａは次の基からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族
の基である。

Ａを表している上記の基は、R₄とR₅で置換したオルト
（ortho）、メタ（meta）、またはパラ（para）であっ
ても良い。

R₄は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキ
ル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルか
らなる群から選ぶことができる。好ましくは、R₄はＨま
たは低級アルキルである。

R₅は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキ
ル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルか
らなる群から選ぶことができる。好ましくは、R₅はＨで
ある。

R₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、アミノアル
キル、またはアルキルアミノアルキルからなる群から選
ぶことができる。

一実施例においては、Ａは次の基である。

式中、R₄とR₅とは上記の定義と同様であるが、好まし
くは、R₄がＨであり、R₅はOCH₃であるか、またはＲがＨ
または低級アルキルであるＯ（C₆H₄）Ｒである。より好
ましくは、Ｒが低級アルキル、好ましくはメチルであ
る。

本明細書で用いる「低級アルキル」なる語は、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、sec−
ブチル、およびtert−ブチルなど、C₁〜C₄直鎖状または
枝分かれアルキルを指す。本明細書で用いる「シクロア
ルキル」なる語は、シクロプロピル、シクロブチル、シ
クロペンチル、およびシクロヘキシルなど、C₃〜C₆環状
アルキルを指す。本明細書で用いる「アリール」なる語
は、フェニル、ナフチル、などC₃〜C₁₀環状芳香族の基
を指し、且つトリルなどの置換アリール基を含むものと
する。本明細書で用いる「ヒドロキシアルキル」なる語
は、C₁〜C₄直鎖状または枝分かれヒドロキシ−置換アル
キル、すなわち−CH₂OH、−（CH₂）₂OH、などを指す。
本明細書で用いる「アミノアルキル」なる語は、C₁〜C₄
直鎖状または枝分かれアミノ−置換アルキルを指す。こ
の場合、「アミノ」なる語は、−NH₂、−NHCH₃、Ｎ（CH
₃）_２など、Ｒ′とＲ″とが上記定義と同様にＨまたは
低級アルキルから別個に選ばれるNR′Ｒ″基である。本
明細書で用いる「オキシアルキル」なる語は、C₁〜C₄酸
素−置換アルキル、すなわち例えば、−OCH₃を指し、本
明細書で用いる「オキシアリール」なる語は、C₃〜C₁₀
酸素−置換環状芳香族の基を指す。

式（Ｉ）の代表的な新規の化合物であり、且つ本発明
の方法に好ましい化合物としては、 2,5−ビス（４−アミジノフェニル）フラン； 2,5−ビス［４−（4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾイル−
２−イル）フェニル］フラン； 2,5−ビス［４−1,4,5,6−テトラヒドロピリミジン−２
−イル）フェニル］フラン； 2,5−ビス［４−（4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−1,3−
ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン； 2,5−ビス［４−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニ
ルフラン；およびこれらの化合物の生理的に許容できる塩類が擧げられるが、これらのみに限定はされない。

本発明の方法は、核酸の実質的に純粋な溶液、または
核酸を含有する生物サンプルを上記式（Ｉ）の化合物と
接触または混合した後、生物サンプルを光に暴露して、
式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることよって実施
する。生物サンプルを光に暴露して、式（Ｉ）の化合物
から蛍光を発光させるステップによって、サンプルの分
析、すなわちサンプル中に含有されている核酸成分の存
在を検出することができる。本発明の方法は、例えば、
光学顕微鏡による観測、フロー・サイトメトリー、核型
の分析、核酸の検出と定量、電気泳動などで有用であ
る。

本発明の化合物は、サンプル中の核酸と結合するの
で、核酸を含有していると推測される生物サンプルを染
色するのに好適である。本明細書で用いる「核酸」なる
語は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）
の両方を指すものとする。クロモソーム核酸やクロモソ
ーム外核酸（chromosomal and extrachromosomal nucle
ic acids）（例えば、プラスミド、RNAウイルスなど）
を含み、どのような核酸でも染色することができる。そ
の結果、光学顕微鏡、共焦点光学顕微鏡、フロー・サイ
トメトリーなどを始めとして、サンプルと化合物とを結
合させ、この化合物を蛍光検出することによりサンプル
中の核酸を検出する当業者に公知の技術によって、生物
サンプル中に存在している核酸を観察することができ
る。

本発明による染色に好適な代表的サンプルは、典型的
には生物体液または生物組織の形で得ることができる。
当業者はサンプルは無数の生物源から採取して有用な診
断情報を得ることができることを理解している。好適な
生物体液としては、血液、唾液、尿、乳汁、リンパ液、
および口腔、鼻や気管支の粘膜が擧げられるが、これら
のみに限定されない。好適な組織サンプルとしては、腎
臓、肝臓、リンパ節、その他の臓器の組織バイオプシー
サンプル、および皮膚、その他の軟組織サンプル（例え
ば、筋肉）などが擧げられるが、これらには限定されな
い。検査対象からの標本は直接染色することもできる
し、また標本を増殖培養することができる。生物標本を
正しく選別することや、正しく培養する技術は、当業者
が明白に知っていることである。またサンプルが検出す
べき核酸の実質的に純粋な溶液、すなわち、上記の標本
から単離した細胞内成分の溶液であっても良い。

サンプルは、植物種と動物種両方から採取することが
できる。動物種はヒトでも、非ヒトの種（例えば、犬、
猫、ラット、牛、馬、羊、猿など）でも、どちらでも良
い。バクテリア、真菌、原虫、その他の単細胞生物など
の細胞も、本発明によって処理することができる。した
がって、本発明では真核生物と原核生物両方の細胞を使
用することができる。

典型的には、細胞は式（Ｉ）の蛍光化合物と共に、適
当な条件下でインキュベートすることにより染色する。
例えば、式（Ｉ）の化合物の染色は、O.Miller,Princip
les and Practices in Medical Genetics（Longman Gro
up Limited,New York1983）およびD.Silvonen,ACT Cyto
genetic Lab Manual（University of California,San F
rancisco1980）が記述している公知の、DAPI染色標準プ
ロトコルにしたがって行うことができる。これとは別
に、これもまた公知である、ビス−ベンズイミド染色標
準プロトコルによってサンプルを染色することができる
（例えば、Human Cytogenetics,Volume1,Constitutiona
l Analysis,pg113（D.RooneyおよびB.Czepulkowski,Ed
s.,IRL Press at Oxford University Press）を参照さ
れたい）。

サンプルは、充分量の式（Ｉ）の化合物と接触、また
は混合して、化合物とサンプル中の核酸とを結合する。
一般的に式（Ｉ）の化合物分子は二重鎖核酸の四塩基対
と結合するので、検出可能なシグナルを造り出せるに充
分などのような量でも使うことができる。したがって、
式（Ｉ）の化合物と検出すべきターゲットとの量の割
合、すなわち比率は、特に検ターゲットの検出方法次第
で、約1:4、1:8、1:16、1:32以上となる。所望される場
合には、染色後選択的に過剰の化合物を洗い流しても良
い。当業者がよく理解しているところであるが、サンプ
ルが上記のように実質的に純粋な核酸溶液であって、例
えば蛍光計を使用して分析する分析法である場合には洗
うことは必要ではない。

化合物から水溶液を造り、サンプルを単に水溶液に浸
すことにより接触ステップを実施することができる。し
かしながらこの場合、DAPIでは必要であると報告されて
いるような、溶液を暗所に貯蔵して化合物の安定性を維
持する必要はない。溶液の最終濃度は約0.01〜５、10、
または25マイクロモル（μＭ）以上であるが、最小最終
濃度は約0.01マイクロモルである。サンプルと化合物と
の接触時間は接触技術によって大きく異なるが、サンプ
ルを上記濃度の溶液に浸漬する場合一般には約30秒〜２
時間、好ましくは約１〜15分間である。

また、フルオロクロム（fluorochromes）を併用して
サンプルを染色することもできる。こうすることによ
り、式（Ｉ）の化合物からと他の化合物からとの、異な
る波長の蛍光を同時に検出することができる。当業者が
理解しているところであるが、複数のラベルを使用する
場合、最大発光波長または重複しないスペクトルを持つ
フルオロクロムを選択するように注意しなければならな
い。さらに、フルオロクロムの組合せを選択して、蛍光
エネルギー移動法により蛍光シグナルを増幅できるよう
にすることもできる。これも当業者が理解しているとこ
ろであるが、複数のフルオロクロムを使用する場合、互
いに、あるいは式（Ｉ）の化合物と相互作用しないよう
なフルオロクロムを選択するように注意する。

本発明の方法を適用する場合には、他の化合物（othe
r entities）が付着するのに便利な共役部位（conjugat
ion site）を除かないようにしながら、DNA結合親和力
は除くように式（Ｉ）の化合物を改質（modify）すると
有利である。式（Ｉ）の化合物と共役するのに好適な化
合物としては、DNA、RNA両方のオリゴヌクレオチドが擧
げられる。式（Ｉ）の化合物に対するこのような共役体
は、DNA−タンパク錯体のハブリダイゼーション研究、
バンドシフト分析（bandshift assays）のアンチセンス
試薬（anti−sence reagents）、すなわちプローブとし
て、あるいは蛍光DNAシークエンシングやPCR適用のプラ
イマーとして有用である。式（Ｉ）の化合物はin situ
ラベル研究に用いる非常に多くの試薬とも共役すること
ができる。典型的な試薬としては、免疫組織化学用抗体
や、容積測定用サイズ・マーカー化合物が擧げられる。
さらに、式（Ｉ）の化合物は、例えばプロテアーゼ、ホ
スファターゼ、キナーゼ、抗生物質失活（antibiotic i
nactivation）、ヌクレアーゼや炭水化物などの試薬と
共役して、酵素活性によって増加または減衰する蛍光発
光について、酵素活性を測定するための基質を形成する
ことができる。式（Ｉ）の化合物と共役した化合物が蛍
光を発光するためには、in situで共役を解いても良い
し、解かなくても良い。つまり、式（Ｉ）の共役化合物
は、共役したままでも蛍光を発光できるし、また共役か
ら分離しても蛍光を発光することができる。

本発明の暴露ステップは、式（Ｉ）の化合物から検出
可能なシグナルを出させるのに好適な公知の方法によっ
て実施する。この方法は一般的には、先ず生物サンプル
を、式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光できる波長（例え
ば、210〜380nm）の紫外線に暴露する。この場合、検出
すべき細胞内成分、つまり核酸が光の波長および／また
は密度によって破壊されないようにすることだけを注意
する。

当業者に理解されているように、化合物から蛍光を発
光させるために選択する波長は、「励起極大（excitati
on maximum）」、すなわち化合物に吸収されると、この
化合物が励起されて、電子状態が高くなる波長として当
業者にとり公知である。上記したように、本発明の励起
波長は紫外線範囲である。化合物が高い電子状態から低
い電子状態に遷移する際、一種の可視放射光、つまり
「発光極大（emission maximum）」と呼ばれている波長
の蛍光を発光する。本発明で検出するのはこの蛍光なの
である。化合物が発光する検出可能シグナルは、例え
ば、一般化した波長（generated wavelength）を検出す
る電子手段を用いてヒトの目で観察するなど、公知の方
法で検出する。

好都合なことに、蛍光の波長は励起光の波長から充分
に取り除くことができるので、これら二つの波長は光学
フィルターによって良く分離することができる。光をフ
ィルターに通して、例えば、インプット側で所望する励
起光の波長を選択したり、および／または蛍光のピー
ク、すなわち極大を測定するのに適当な範囲の発光波長
を選択する。

本発明の他の態様は、サンプル中の細胞の細胞骨格成
分を結合して、その存在を検出する方法である。本発明
の方法のこの態様では、上記の式（Ｉ）の化合物または
その生理的に許容できる塩を、実質的に純粋な細胞骨格
成分の溶液、または細胞骨格成分を含有する生物サンプ
ルと接触するか、あるいは混合する。上記したように、
式（Ｉ）の化合物を細胞骨格成分と混合した後、サンプ
ルを式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光できる波長の光に
暴露して、サンプルの分析、つまりサンプルに含有され
ている細胞骨格成分を検出する。本発明のこの態様は、
例えば共焦点の光学顕微鏡を含む光学顕微鏡による分析
や、生化学検定などに有用である。本発明の方法のこの
態様は上記で詳細説明した核酸の蛍光検出と同様にして
実施することができる。

本明細書で用いる「細胞骨格成分」なる語は、細胞の
骨格（framework）からなるタンパク繊維を指す。本発
明は、この方法に特に感受性が高い、細胞骨格成分とし
ての微小管構造に用いることが特に好ましい。当業者が
理解しているように、チューブリンが微小管の主なタン
パクである。したがって、本発明のこの態様は、微小管
構造が形成される際にチューブリン重合が分裂するのを
測定する技術を提供する。

光学顕微鏡では、本発明の化合物（染色試薬に）を導
入する前に、サンプルを固体の支持体に固定することが
好ましい。どのような固体の支持体でも使用することが
できるが、典型的な支持体としては顕微鏡スライド、反
応ウェルの壁面、試験管やキュベット、およびビーズが
擧げられる。固体の支持体の構成材料は、ガラス、ポリ
スチンレン、ポリエチレン、ポリプロピレンや、架橋ポ
リサッカライドなど当業者にとり好適な、どの公知の材
料でも良い。好ましくは、ガラスの顕微鏡スライドに固
定する。サンプルを固体の支持体に固定する方法は、自
然乾燥や、化学または熱処理など好適などのような方法
でも良いが、後になってサンプルの観察に干渉するもの
は避けなければならない。スライドは、光学顕微鏡で観
察できるように固定することが好ましい。

光学顕微鏡では、上記した当業者に公知の次のDAPIま
たはビス−ベンズイミド染色標準プロトコルにより、サ
ンプルを式（Ｉ）の化合物で染色する。染色後過剰の式
（Ｉ）の化合物を洗って取り除き、バックグラウンド干
渉（background interference）を排除して、サンプル
の解像度を高めると好都合である。染色法は先ず、例え
ば、サンプルを式（Ｉ）の化合物の水溶液に浸漬して、
サンプル中の核酸または細胞骨格成分を結合するに充分
な量の化合物にサンプルを接触させる。式（Ｉ）の化合
物の量と、接触時間は上記した通りとする。

このようにして準備したサンプルのスライドを、蛍光
顕微鏡などの公知の蛍光法を用いて分析する。例えば、
水銀ランプまたはキセノンランプなどの紫外線（UV）光
源と適当なフィルターを備えた写真用顕微鏡で観察し
て、従来法により画像を撮影する。細胞にはUV光源から
照射する。このUV光源は、励起の根源であって、本発明
の蛍光化合物を励起する特定の波長を発生できるもので
なければならない。

本発明の方法は、フロー・サイトメトリーなどの他の
分析方法にも使用することができる。フロー・サイトメ
トリーは、粒子や細胞を液体の流れに載せ、一つづつ検
出点を通過させて迅速に測定する技術である。円滑な流
れを乱したり、管や孔を塞ぐことなく系を通過できるよ
うな、特異的な方法で粒子を染色し、この粒子を分散さ
せた懸濁液をサンプルとして準備する。

このサンプルは、公知のフロー・サイトメトリー法に
より準備する。サンプルの染色は、濃度および接触時間
について上記したプロトコルに従って、サンプルを式
（Ｉ）の化合物に接触させて行う。すなわち、サンプル
をフロー・サイトメトリー系の液体流れに注入あるいは
載せる前に、サンプルを式（Ｉ）の化合物に接触させ
て、分散粒子の懸濁液を調製する。当業者が理解してい
るように、個々の細胞を含有する血液などの体液は、流
動細胞計（flow cytometer）上で直接染色加工して、測
定対象である高分子の絶対細胞含量（absolute cellula
r content）を測定することができる。固形組織は、単
に臓器を細断したり、あるいは掻き裂いた後、ふるい分
けして、密度勾配遠心法を実施する直接的方法で準備す
ることができる。酵素消化が必要な組織もある。

一般に、サンプル懸濁液を液体が流れている密閉チャ
ンネルの中央に注入すると、ランダム三次元懸濁液（ra
ndom three dimentional suspension）中の粒子の一つ
づつを照射光線が交差する空間の特定点に載せることが
できる。細胞が検出点を通過すると、この細胞が照射さ
れる。光学顕微鏡の場合と同様に、光が励起の根源であ
って、本発明の蛍光化合物を励起できる特定波長を発生
させることができる光源でなくてはならない。細胞から
蛍光が散乱して発光されるが、照射光線を通過する際に
光検出器が蛍光を集めて、フォトン・パルスを電子シグ
ナルに転換する。さらにこれを電子加工およびコンピュ
ーター加工して、グラフィック・ディスプレーを作成し
たり、あるいは統計分析を行う。

本発明の実施に使用される化合物は、当業者にとり公
知の技術に従い（例えば、B.P.Das and D.W.Boykin,J.M
ed.Chem.20,531−536（1977）を参照されたい。この開
示全体を参照することにより本明細書の一部とする）、
下記の実施例１〜４および６〜８で例示している技術、
もしくは当業者にとり明白な変法により調製することが
できる。さらに、下記の実施例５で例示している、上記
B.P.Das and D.W.Boykinの方法の変法によっても、これ
らの化合物を合成することができる。

式（Ｉ）の化合物は一般に、下記の反応式と同様にし
て調製する。すなわち、（ａ）R.E.Lutz,et al.,J.Am.C
hem.Soc.56,2698（1934）が記述している方法により、
1,4−ジケトン（１）を脱水環化によりフラン化して（c
yclodehydrative furanization）、2,5−ビス−（４−
ブロモフェニル）フラン（２）を形成する。（ｂ）Cu₂
（CN）_２を用いて2,5−ビス−（４−ブロモフェニル）
フラン（２）をニトリル化（nitrilization）し、対応
するビス−ニトリル2,5−ビス−（４−シアノフェニ
ル）フラン（３）を造る。その上で（ｃ）下記の実施例
で例示しているように、ビス−ニトリル（３）を先ず、
中間体であるイミダート・エステルに転換した後、この
中間体とアンモニアまたは適当なジアミン、例えばエチ
レンジアミン、1,3−プロパンジアミンなどと反応させ
て、式（Ｉ）のビス−ジカチオンアリールフラン（４）
に転換する。ステップ（ａ）と（ｂ）の詳細は実施例１
で、ステップ（ｃ）の詳細は実施例２〜８で説明する。

この代わりに、上記ステップ（ｃ）を熱分解ステップ
に置き換えて、下記の実施例５で例示しているように、
熱を用いてジアミン、すなわち塩酸アミンとビス−ニト
リルとを直接融合させて、ビス−ニトリル（３）を式
（Ｉ）の化合物に転換することもできる。この方法転換
は、R₁とR₂の二つで環状成分（cyclic moiety）を形成
している式（Ｉ）の化合物を調製する場合に限る。

既に述べた通り、本発明で使用する化合物は、生理的
に許容できる塩類（例えば、サンプルを著しく分裂させ
て、化合物の検出が不可能となることがない塩類）でも
良い。このような塩類としては、海緑石（glauconit
e）、乳酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイ
ン酸塩、フマル酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、硫
酸塩、および塩酸塩を擧げることができる。本発明の塩
類は、一般的に溶液中でアミジン系化合物の等価体二つ
（two equivalents of the amidine base compound）
と、所望の酸とを反応させて調製する。反応完了後、塩
が不溶の溶媒適量を加えて溶液中で結晶化させる。

式（Ｉ）の化合物の蛍光染料としての分光分析特性と
有用性は、DAPIやHoechst 33258に類似している。しか
しながら、式（Ｉ）の化合物は、二重鎖DNAと強く結合
し、特異性も高く、RNAとは本質的に結合しない。例え
ば、2,5−ビス［４−（4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−1,
3−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フランは、検出
できるようなRNAとの親和力を本質的に持っていない。
さらにまた、式（Ｉ）の化合物は、DAPIとは僅かに異な
る波長の青色光を発光し、また光の散乱度もDAPIで観察
されるものより低い。これにより、輪郭をより詳しく観
察することができる（delineation of more detail）。

利用者の便宜を考慮して、本発明のキットを提供す
る。この染色キットは典型的には、上記のステップを実
施するのに充分な量の試薬、すなわち式（Ｉ）の化合物
からなる。試薬の剤形は一般には、長期貯蔵に好適な結
晶状粉末または水溶液である。さらに、一般的にキット
中には、とりわけ、試薬貯蔵用バイアル、混合用容器、
および上記のステップを実施するためのマニュアルを入
れる。試薬には、緩衝剤などの補助剤を添付してもよ
い。必要な場合には、キットにテスト中のバックグラウ
ンド緩衝を減衰させる薬剤、コントロール試薬、テスト
用具なども入れても良い。

以下、本発明を実施例を参照してさらに説明するが、
本発明はこれらの実施例によって限定されない。実施例
中、「ｇ」はグラムを指す、「mg」はミリグラムを指
す、「μｇ」はマイクログラムを指す、「mmol」はミリ
モルを指す、「ｈ」は時間を指す、「ml」はミリリット
ルを指す、「Ｍ」はモルを指す、「mM」はミリモルを指
す、「μＭ」はマイクロモルを指す、「UV」は紫外線を
指す、「HCl」は塩化水素を指す、「mp」は融点を指
す、「HCN」はシアン化水素酸を指す、および「℃」は
摂氏温度を指す。特に注釈を付けている場合を除き、式
（Ｉ）の化合物の合成実験の詳細事項は、B.P.Das and
D.W.Boykin,J.Med.Chem.20,531−536（1977）が記述し
ている合成法に従った。

実施例１先駆化合物の調製 2,5−ビス（ｐ−ブロモフェニル）フラン。ブロモベ
ンゼンとフマリルクロリドからtrans−ジ−ｐ−ブロモ
ベンゾイルエチレンを調製する公知の製法を、文献から
引用して使用した（J.B.Conant and R.E.Lutz,J.Am.Che
m.Soc.47,881（1925）を参照されたい）。エチレン化合
物をZn−HOAcで還元して、1,4−ジ−ｐ−ブロモフェニ
ル−1,4−ブタンジオンを造った（E.Campaigne and W.
O.Foye,J.Org.Chem.17,1404（1952）を参照された
い）。飽和1,4−ジケトン（7.9g,0.02モル）を、AC₂O
80mL中に懸濁し、混合液を熱して還流させた。濃縮H₂SO
₄（４〜５滴）を添加して、還流を５分間続けた。溶液
をウオターアイス（1L）中に注ぎ入れて、良く攪拌し
て、濾過した。粗収量7g（93％）。酢酸で再結晶して、
表記の化合物5.6g（75％）を得た。mpは198〜199℃であ
った（文献では、R.E.Lutz and W.M.Eisner,J.Am.Chem.
Soc.56,2698（1934）mp200〜201℃）。

2,5−ビス（ｐ−シアノフェニル）フラン。2,5−ビス
−（４−ブロモフェニル）フラン7.5g（0.02モル）と、
Cu（CN）4g（0.045モル）をキノリン45mL中で混合した
混合物を、2h還流した。混合物を希釈HCL液300mLに注ぎ
入れて（注意:HCNが遊離する）濾過した。固体をH₂O、
希釈NaOH、希釈HCLで洗った後、再びH₂Oで洗った。固体
ビス−ニトリルをアセトンで溶解し、濾過して無機残滓
を除き、短いアルミナ・カラムを通過させて、微量の銅
塩を取り除いた。銅塩はビス−アミジン類に移転すると
精製が困難になるので、この時点で取り除いておかなく
てはならない。銅塩は簡便な燃焼テストで存在を検出す
ることができる。アルミナ・カラムから出る溶離液を蒸
発させてから、エタノールで再結晶して、表記の化合物
3.5g（65％）を得た。mpは294〜295℃（dec.）であっ
た。

実施例２二塩酸2,5−ビス（４−アミジノフェニル）フランの調
製ジオキサン100mLと、アブソリュートエタノール25mL
との混液中に2,5−ビス（４−シアノフェニル）フラン
（3g、0.011モル）を入れ、５℃で乾性HClガスによって
飽和させた。溶液を耐圧瓶に入れ、３日間（室温）振盪
した。中間産物として、塩酸イミダートエステルの黄色
の固体が沈澱し、これを濾過して、室温により一晩真空
乾燥した。塩酸イミダートエステルのIRスペクトルにニ
トリルによる吸収を認めなかったので、この塩酸イミダ
ートエステルはキャラクタリゼーションを行うことなく
直接使用した。塩酸イミダートエステル（3.5g）をアブ
ソリュートエタノール100mL中に懸濁して懸濁液を造
り、５℃で無水アンモニアにより飽和させた。懸濁液
（耐圧瓶）を室温で３日間振盪した。この反応混液を濾
過し、固体を乾燥した後、保湿（warm）アブソリュート
エタノール（約1.5L）中に溶解した。溶液を５℃で無水
HCLによって酸性とし、室温の真空下で濃縮して、黄色
の結晶2.5g（60％）を得た。アブソリュートエタノール
で再結晶して、mpを400〜401℃（dec.）にした。

実施例３ 2,5−ビス［４−（4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−
２−イル）フェニル］フランの調製実施例２の記述にしたがって合成した塩酸イミダート
エステル2.1g（0.005モル）と、エチレンジアミン0.6g
（0.01モル）とを、アブソリュートエタノール50mL中に
溶解した溶液を一晩還流した。形成された固体を濾過
し、無水HCLで飽和したアブソリュートエタノールによ
って再結晶して、2,5−ビス［４−（２−イミダゾリニ
ル）フェニル］フラン1.9g（90％）を得た。mpは409〜4
10℃（dec.）であった。

実施例４ 2,5−ビス［４−（1,4,5,6−テトラヒドロ−ピリミジン
−２−イル）フェニル］フランの調製上記の実施例２の記述にしたがって合成した塩酸イミ
ダートエステルを、実施例３の記述と同様にして、1,3
−プロパンジアミンと反応させて、2,5−ビス［４−
（1,4,5,6−テトラヒドロピリミジン−２−イル）フェ
ニル］フラン（90％）を得た。mpは430〜431℃（dec.）
であった。

実施例５ 2,5−ビス［４−（4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−
２−イル）フェニル］フラン二塩酸二水和物の調製この化合物は製法を変えて2,5−ビス（４−シアノフ
ェニル）フランから調製した。この反応では、ジニトリ
ル（0.5g、1.9ミリモル）、二塩酸エチレンジアミン
（4.9g、37ミリモル）およびエチレンジアミン（2.5m
l、37ミリモル）を使用した。ジニトリル、二塩酸エチ
レンジアミンおよびエチレンジアミンの混合物を造り、
300〜310℃で10分間保持した後、温水に溶解した。形成
した黄色の結晶を冷却して分離した。この化合物を熱湯
で再結晶した。表記の化合物の収量は208mg（24％）で
あった。TLC（CHCl₃:CH₃OH:25％NH₄OH＝11:4:1、スポッ
ト一個）、mp＞360℃。C₂₂H₂₀N₄O・2H₂O（465.37）の計
算値:C、56.78;H、5.60;N、12.04。測定値:C、56.69;
H、5.63;N、12.07。¹H−NMR（DMSO−d₆、TMS）、δ4.01
（ｓ、8H）、7.45（ｓ、2H）、8.08（ｄ、4H、Ｈ＝8.3H
z）、8.15（ｄ、4H、Ｊ＝8.3Hz）、8.15（ｄ、4H、Ｊ＝
8.3Hz）、10.50（brs、4H）。¹³C−NMR（DMSO−d₆、TM
S）、δ45.5、113.2、121.6、125.3、130.1、135.8、15
3.4、165.8。IR（KBr）:v 3412、3123、2971、1608、1
580、1491、1367、1287、1033、850、745、673。MS、m/
z:356（遊離塩基（free base））。

実施例６ 2,5−ビス［４−（4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−１、３
−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン二塩酸半七
水和物（hemiheptahydrate）の調製ビス−メトキシエタノールイミダートエステル（1g、
0.002モル）と、1,4−ジアミノブタン（0.5g、0.0057モ
ル）を、１、２−ジメトキシエタン10ml中に入れて、２
日間還流した。真空中で溶媒を取り除き、水を加えた。
沈澱物を濾過し、水で洗い、真空オーブン中で乾燥させ
た（mp＞300℃）。ピス−メトキシエタノールイミダー
トエステルと1,4−ジアミノブタンとの遊離塩基反応産
物（free base reaction product）は、塩化水素のメタ
ノール溶液（hydrogen choride in methanol）で塩酸塩
に転換した（mp＞300℃）。2N水酸化ナトリウムを用い
て濾液を中和して、遊離塩基の半分を得た。遊離塩基の
総収率は51％であった。C₂₆H₂₈N₄O・2HCl・3.5H₂O（54
8.50）の計算値:C、56.93;H、6.80;N、10.22。測定値:
C、56.99;H、6.80;N、10.26。¹H−NMR（DMSO−d₆）、δ
2.02（ｓ、8H）、3.71（ｓ、8H）、7.38（ｓ、2H）、7.
86（ｄ、4H、Ｊ＝8.3Hz）、8.04（ｄ、4H、Ｊ＝8.3H
z）、9.77（ｓ、4H）。¹³C−NMR（D₂O（CH₃）₃SiCH₂CH₂
CO₂Na）、δ28.0、47.0、113.9、126.5、129.7、131.
2、137.0、154.5、167.1。IR（KBr）,v 687、747、81
4、930、1331、1364、1459、1597、3008、3164。MS（E
I）、m/z（％rel.int.）412（100）（遊離塩基）、384
（23）、354（９）、340（13）、298（11）、284（2
3）。

実施例７ 2,5−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）−アミジノ］
フェニル｝フランの調製乾性イソプロピルアミン（0.47g、0.008モル）を、実
施例２で説明したイミダートエステル（1.3g、0.003モ
ル）をアブソリュートエタノール45mlに懸濁した懸濁液
に加えた。0.5時間以内に、イミダートエステルは溶解
して、イミダートエステルとイソプロピルアミンの混合
物が発色した。約３時間後、白色の固体が沈澱した。ス
ラリーを室温で一晩振盪した。減圧下で溶媒を除き、水
で希釈、濾過して水で洗った。固体を乾燥後、エタノー
ル／エーテル混液で再結晶して、白色の固体0.9g（78
％）を得た。mpは233〜４℃であった。¹H NMR（DMSO−d
₆/60℃）7.79（brs、8H）、7.11（ｓ、2H）、6.25（b
r、4H）、3.81（br、2H）、1.14（ｄ、6H、Ｊ＝5.9）。
¹³C NMR（DMSO−d₆/60℃）152.4、142.0、136.6、130.
4、126.8、122.8、108.7、43.5、22.8。

実施例８二塩酸2,5−ビス［４−Ｎ−イソプロピル）アミジノ）
−フェニル］フランの調製実施例７で説明した通りに調製した遊離塩基0.78g
（0.002モル）を、アブソリュートエタノール10mlに溶
解して、塩化水素で飽和したエタノール10mlによって処
理した後、２時間加温した。この混合物の容積を5mlま
で減少させた。乾性エーテル20mlを加えて、鮮やかな黄
色の沈澱物を沈澱させ、これを濾過、乾性エーテル３×
5mlで洗い、65℃で２時間真空乾燥させて、表記の化合
物0.8g（87％）を得た。mpは276〜７℃（dec.）であっ
た。IR（KBr）、¹H NMR（DMSO−d₆）9.72（ｓ、1H）9.6
9（ｓ、1H）、9.57（ｓ、2H）、9.24（ｓ、2H）、8.06
（ｄ、4H、Ｊ＝8.1）、7.86（ｄ、4H、Ｊ＝8.1）、7.42
（ｓ、2H）、4.14（ｓ、2H、Ｊ＝6.6）、1.29（ｄ、12
H、Ｊ＝6.6）。¹³C NMR（DMSO−d₆）161.1、152.3、13
3.6、129.2、127.7、123.5、111.3、45.1、21.1。

C₂₄H₂₈N₄O・2HCl・1.25H₂Oの計算値:C、59.57;H、6.7
9;N、11.57。測定値:C、60.00;H、6.80;N、11.52。

実施例９ 2,5−ビス［（４−（4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール
−２−イル）フェニル）］−３−（４−トリルオキシ）
フランの調製１−（４−トリルオキシル）−1,2−ビス（４−ブロ
モベンゾイル）エチレン。1,2−ジブロモ−1,2−ジ（４
−ブロモベンゾイル）エタン（11.1g、0.02モル）をTHF
35ml中に溶解した溶液に、ナトリウム４−メチルフェノ
キシド懸濁液［Na0.92g（0.04モル）と、４−メチルフ
ェノール4.32g（0.04モル）とを、THF30mlに懸濁し、４
〜５時間還流させて調製］を添加した。この黄色の混合
物を２〜３時間還流（続いてTLCを実施）した後、減圧
下でTHFを取り除いた。残滓を水で処理して、固体を濾
過し、水で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、クロロホルムに溶
解した。クロロホルム溶液をシリカ・カラム（エーテル
の２〜５％ヘキサン溶液で溶出）に通した。その結果、
薄い灰色の結晶状固体4.95g（50％）を得た。mpは137〜
８℃であった。IR（KBr）3087、3035、2868、1687、164
6、1587、1572、1557、1502、1399、1364、1194、106
8、1009、971、876、815、772、526。¹H NMR（CDCl₃/35
℃）7.92（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、7.65（ｄ、2H、Ｊ＝8.
8）、7.55（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）7.48（ｄ、2H、Ｊ＝8.
8）、7.27（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、7.11（ｄ、2H、Ｊ＝8.
3）、6.32（ｓ、1H）、2.4（ｓ、3H）。¹³C NMR（CDCl₃
/35℃）189.4、187.6、168.4、150.9、136.6、136.0、1
33.4、132.3、131.8、130.9、130.3、129.6、129.2、12
8.2、120.6、101.8、20.95。MSm/e500（M⁺）。

2,5−ビス（４−ブロモフェニル）−３−（ｐ−トリ
ルオキシ）フラン。１−（４−トリルオキシ）−1,2−
ビス−（４−ブロモベンゾイル）エチレン5.0g（0.01モ
ル）を三塩化リン10mlに溶解した溶液を還流しながら３
〜４時間加熱した（続いてTLC）。蒸留して過剰のPCl₃
を除き、残滓を氷／水で粉砕した（発熱反応）。溶液を
ジクロロメタン（75ml）で抽出して、ジクロロメタン層
を飽和重炭酸ナトリウム溶液と水とで洗い、乾燥した
（Na₂SO₄）。減圧して溶媒を除いた。残滓の固体をシリ
カゲル上で、溶離液としてエーテル：ヘキサン（2:8〜
1:1）を用いるクロマトフラフィを行った。その結果、
薄い灰色の結晶状の固体2.78g（56％）が得られた。mp
は92〜３℃であった。IR（KBr）2939、2851、1560、150
6、1467、1390、1209、1072、1066、945、825、707、48
6。¹H NMR（CDCl₃/35℃）7.69（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、7.
46〜7.43（ｍ、6H）、7.12（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、7.0
（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、6.47（ｓ、1H）、2.31（ｓ、3
H）。¹³C NMR（CDCl₃/35℃）150.8、150.1、142.8、13
9.3、133.0、131.9、131.7、130.3、129.1、128.6、12
5.1、125.0、121.8、120.5、117.1、102.7、20.6。MSm/
e484（M⁺）。

2,5−ビス（４−シアノフェニル）−３−（４−トリ
ルオキシ）フラン。上記で調製したジブロモ化合物（2.
5g、0.0051モル）とシアン化第一銅（1.81g、0.02モ
ル）とを、乾性Ｎ−メチル−２−ピロリドン8ml中で混
合して、窒素雰囲気下約200℃で2.5時間加熱し（続いて
TLC）、冷却して、水200ml中に注ぎ入れた。沈澱してき
た固体を濾過し、水100ml中に再懸濁して、10％NaCN100
mlを加えて、混合物を３〜４時間攪拌した。このように
して得た固体を濾過し、水で洗い、アセトンを用いてい
るソックスレー抽出器（soxlate device）に約24時間置
いた。アセトン抽出によって容積を減らし、中性アルミ
ニウムの短いカラムを通過させ、溶離液を蒸発し、それ
によって得た固体をCHCl₃:エーテル（2:8）で再結晶し
て、黄色の結晶状固体1.2g（62％）を得た。mpは198〜
９℃であった。IR（KBr）3067、2223、1618、1303、150
5、1402、1220、1169、1008、926、840、820、668、546
cm^-1。¹H NMR（CDCl₃/35℃）7.98（ｄ、2H、Ｊ＝8.
8）、7.75（ｄ、2H、8.3）、7.68（ｄ、2H、Ｊ＝8.
8）、7.65（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、7.19（ｄ、2H、Ｊ＝8.
3）、7.05（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、6.66（ｓ、1H）、2.36
（ｓ、3H）。¹³C NMR（CDCl₃/35℃）154.3、150.3、14
5.8、139.1、134.0、133.6、133.3、132.7、132.6、13
0.5、124.2、123.8、119.0、118.6、117.8、111.5、11
0.0、104.5、20.7。C₂₅H₁₆N₂O₂の計算値:C、79.76;H、
4.28;N、7.44。測定値:C、79.68;H、4.31;N、7.39。MSm
/e376（M⁺）。

2,5−ビス［（４−（4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾー
ル−２−イル）フェニル）］−３−（４−トリルオキ
シ）フラン。上記で調製したビス−ニトリル［1g（0.00
26モル）］を、アブソリュートエタノール20mlおよび０
℃で乾性HCLガスにより飽和したアブソリュートジオキ
サン50ml中に置いた。混合物を室温で攪拌しながら４日
間放置した（allowed）。このようにして濃密な黄色の
沈澱物を形成し、乾性エーテル100mlを加え、固体を濾
過し、乾性エーテル100mlで洗い、25℃で５時間真空乾
燥して、塩酸イミダートエステル0.78g（66％）を得
た。イミダートエステルを乾性エタノール25ml中に再懸
濁し、エチレンジアミン0.31g（0.0053モル）と共にゆ
っくりと還流させながら12時間加熱した。蒸留して過剰
のエタノールを除き、残滓を水で処理して、1M NaOHを
加え（攪拌冷却して）アルカリとした。黄色の沈澱物を
濾過し、水で洗い、沸騰しているエタノールで再結晶し
て、表記の化合物0.6g（74％）を得た。mpは156〜７℃
であった。IR（KBr）3218、2927、2862、1609、1506、1
398、1218、1105、987、848、669cm^-1。¹H NMR（DMSO−
d₆/50℃）7.94〜7.84（ｍ、8H）、7.21（ｄ、2H、Ｊ＝
8.3）、7.12（ｓ、1H）、7.08（ｄ、2H、Ｊ＝8.79）、
3.63（ｓ、4H）、3.62（ｓ、4H）、2.28（ｓ、3H）。¹³
C NMR（DMSO−d₆/50℃）163.0、162.9、154.3、150.4、
142.8、139.0、132.4、130.8、130.4、130.1、129.7、1
28.5、127.5、127.4、123.2、122.6、116.5、104.0、4
9.3、49.2、19.9。MSm/e462（M⁺）。

HClのエタノール溶液（ethanolic HCl）10ml中に遊離
塩基［0.5g（0.001モル）］を入れて、還流しながら３
時間加熱した後、希釈した乾性エーテル50mlに添加し
た。このようにして得た黄色の沈澱物を濾過し、乾性エ
ーテルで洗い、80℃で24時間真空乾燥して、C₂₉H₂₆N₄O₂
・2HCl0.48g（90％）を得た。mpは＞300℃であった。C
₂₉H₂₆N₄O₂・2HClの計算値:C、65.04;H、5.27;N、10.4
6。測定値:C、64.83;H、4.99;N、10.22。IR（KBr）342
2、3235、2964、2775、1609、1506、1370、1289、120
6、848、667cm^-1。¹H NMR（DMSO−d₆/D₂O/TSP/60℃）7.
98〜7.86（ｍ、8H）、7.19（ｄ、2H、Ｊ＝8.79）、7.09
（ｓ、1H）、7.03（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、3.88（ｓ、4
H）、3.76（ｓ、4H）、2.24（ｓ、3H）。¹³C NMR（DMSO
−d₆/D₂O/TSP/60℃）165.3、165.3、154.7、151.2、14
5.7、139.5、134.3、134.2、135.1、131.2、129.6、12
9.5、124.8、124.1、123.3、121.6、117.7、106.0、45.
8、45.6、20.7。

実施例 10 2,5−ビス［４−（２−テトラヒドロ−ピリミジニル）
フェニル］３−（４−トリオキシ）フランの調製イミダートエステル（1.08g、0.002モル）と新しく蒸
留した1,3−ジアミノプロパン（0.43g、0.006モル）
を、アブソリュートエタノール30mL中で攪拌した混合物
を、還流しながら（湿気を防ぎ）12時間ゆるやかに加熱
した。減圧して過剰のエタノールを除き、残滓を蒸留水
50mLで滴定した。混合物を冷やして攪拌しながら1M NaO
H（pH10）を加えてアルカリとし、沈澱した遊離塩基を
濾過し、水で洗って乾燥し、加熱エタノールで再結晶し
て、目的の化合物0.80g（81.6％）を得た。mpは190〜19
1℃であった。IR（KBr）:3267、2931、2858、1609、150
5、1369、1216、846、666cm^-1。¹H NMR（DMSO−d₆/50
℃）7.88〜7.78（ｍ、8H）、7.2（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、
7.12（ｓ、1H）、7.07（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、3.38
（ｔ、8H、Ｊ＝5.1）、2.28（ｓ、3H）、1.75（tt、4
H、Ｊ＝5.1）。¹³C NMR（DMSO−d₆/50℃）154.4、153.
8、153.4、150.5、142.8、139.0、134.5、132.9、132.
4、130.6、130.3、130.3、126.8、126.7、123.1、122.
5、116.6、104.1、41.0、40.8、20.0、19.8;MSm/e
（M⁺）。

遊離塩基0.5g（0.001モル）をアブソリュートエタノ
ール5mLに懸濁した懸濁液を、HClのエタノール溶液（et
hanolic HCl）10mLで処理して、ゆるやかに還流させな
がら２時間加熱し、乾性エタノール50mLを加えた。この
ようにして得た黄色の沈澱物を濾過し、乾性エーテルで
洗って、60℃で12時間真空乾燥した。黄色の固体の収量
は0.46g（82％）であった。Mpは＞320℃であった。IR
（KBr）:3423、3117、3002、1638、1609、1507、1375、
1315、1202、846、669cm^-1。¹H NMR（DMSO−d₆/D₂O/TSP
/65℃）8.12（ｄ、2H、Ｊ＝7.8）、8.08（ｄ、2H、Ｊ＝
7.3）、7.88（ｄ、4H、Ｊ＝8.3）、7.32（ｄ、2H、Ｊ＝
8.3）、7.22（ｓ、1H）、7.16（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、3.
6（br、ｍ、8H）、2.37（ｓ、3H）、2.1（br、ｍ、4
H）。¹³C NMR（DMSO−d₆/D₂O/TSP/65℃）159.5、154.
8、151.1、145.1、140.9、139.6、134.1、133.9、133.
5、133.2、128.7、128.5、127.2、124.8、117.6、105.
9、41.5、41.4、20.6、18.2。C₃₁H₃₀N₄O₂・2HClの計算
値:C、66.06;H、5.36;N、9.94。測定値:C、65.91;H、5.
21;N、9.88。

実施例 11 2,5−ビス［４−（２−イミダゾリニル）フェニル−３
−メトキシ−フランの調製 1,2−ビス（４−ブロモベンゾイル）−１−メトキシ
エタン。1,2−ジブロモ−1,2−ジ（４−ブロモベンゾイ
ル）エタン（11.1g、0.02モル）を乾性メタノール150mL
に溶解した溶液に、ナトリウムメトキシドのメタノール
溶液（メタノール50mLにナトリウム0.92g）を添加し
た。黄褐色の混液を１〜1.5時間還流した。蒸留して溶
媒を除き、残滓を水に懸濁して、混液をクロロホルム10
0mLで抽出した。クロロホルム抽出物を水で洗って、乾
燥し（Na₂SO₄）、濃縮した。このようにして得た残滓を
乾性メタノール−エーテル（3:1）で滴定して、目的の
化合物である薄い灰色の結晶状固体6.6g（78％）を得
た。mpは153〜154℃であった。IR（KBr）:3106、3062、
2932、1689、1649、1583、1556、1403、1223、1202、11
82、1086、1010、1000、857、814、738、618、472c
m^-1。¹H（DMSO−d₆/40℃）:7.95（ｄ、2H、Ｊ＝7.8）、
7.77（4H、Ｊ＝8.8）、7.72（ｄ、2H、Ｊ＝7.8）、6.89
（ｓ、1H）、4.03（ｓ、3H）。¹³C（DMSO−d₆/40℃）:1
89.9、187.2、168.8、139.9、135.9、133.1、132.2、13
1.8、130.3、128.1、127.4、98.6、58.5。MSm/e424
（M⁺）。

2,5−ビス−［４−ブロモフェニル］−３−メトキシ
−フラン。上記で調製したメトキシメタンをPCl₃5mLに
溶解して、還流しながら３時間加熱した。蒸留して過剰
のPCl₃を除いた。氷と水で処理すると、残滓がゴム状の
塊となった。この混合物をクロロホルムで抽出し、有機
層を水で洗って乾燥（Na₂SO₄）させた後、ヘキサン：エ
ーテル（4:1〜2:1）を用いてシリカゲルのカラムクロマ
トグラフィにより精製した。このようにして目的とする
化合物である薄い灰色の固体を得た。収率は62％であっ
た。mpは112〜113℃であった。［文献上のmpは113℃;R.
E.Lutz,J.Am.Chem.Soc.51,3008（1929）］。IR（KBr）:
3062、2908、2877、1617、490、1391、1211、1160、109
9、1073、1034、1006、925、827、787。¹H NMR（CD
C₁₃）7.69（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、7.67.5（ｍ、4H）、7.
47（ｄ、2H、Ｊ＝8.8）、6.64（ｓ、1H）、3.9（ｓ、3
H）。¹³C（CDCl₃）149.7、147.5、135.5、131.9、131.
5、129.4、129.3、125.0、124.5、121.5、119.3、98.
6、58.6。MSm/e408（M⁺）。

2,5−ビス（４−シアノフェニル）−３−メトキシフ
ラン。2,5−ビス（ブロモフェニル）−３−メトキシフ
ラン（4.08g、0.01モル）とシアン化第一銅（3.09g、0.
035モル）を、乾性Ｎ−メチル−２−ピロリドン10mL中
に入れた混合物をN₂の存在下約200℃で2.5時間加熱し
た。この混合物を冷却し、水200mL中に注ぎ入れ、沈澱
した黄褐色の固体を濾過し、水で完全に洗った。この固
体を水（50mL）と10％NaCN100mLとに再懸濁し、２時間
攪拌した。スラリーを濾過し、水で洗って乾燥、アセト
ン250mLに懸濁して、中性アルミナカラムを通過させ
た。アセトンで溶出させて、黄色の固体を得た。さら
に、CHCl₃:エーテル（1:1）で再結晶して、目的の化合
物を得た（1.8g、60％）。mpは257〜258℃であった。IR
（KBr）3128、2223、1608、1599、1501、1409、1174、1
163、1027、924、836、815、651、537、cm^-1。¹H（DMSO
/45℃）8.03（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、7.95（ｄ、2H、Ｊ＝
8.79）、7.91（ｄ、2H、Ｊ＝8.3）、7.85（ｄ、2H、Ｊ
＝8.79）、7.62（ｓ、1H）、4.0（ｓ、3H）。¹³C（DMSO
/45℃）150.0、149.8、134.6、133.4、133.2、132.7、1
32.5、124.0、122.7、118.9、118.5、110.0、107.6、10
2.4、59.0。MSm/e300（M⁺）。C₁₉H₁₂N₂O（300.31）の計
算値:C、75.98;H、4.03;N、9.33。測定値:C、76.02;H、
4.04;N、9.36。

2,5−ビス［４−（２−イミダゾリニル）フェニル］
−３−メトキシ−フラン。上記で調製したビス−ニトリ
ル（0.9g、0.003モル）を乾性エタノール70mL中に懸濁
し、０〜５℃で乾性HClガスにより飽和した後、乾燥条
件下で３〜４日間攪拌した。この混合物を乾性エーテル
200mLで希釈し、黄色のアミダートエステルを濾過し、
乾性エーテルで洗い、形成された固体が1.2g（86％）と
なるまで５〜６時間真空乾燥した。固体を乾性エタノー
ル30mLに再懸濁して、乾性エチレンジアミン0.46g（0.0
08モル）と共にゆるやかに12時間還流させた。蒸留して
溶媒を除いた。残滓を冷水50mLに懸濁し、1M NaOHでア
ルカリとした。黄色の沈澱物を濾過し、水で洗って乾燥
した後、エタノール−エーテル混液で再結晶して、目的
とする化合物0.74g（75％）を得た。mpは186〜187℃（d
ec.）であった。IR（KBr）3444、3245、2931、2857、16
01、1512、1397、1366、1277、1162、1104、1031、92
6、842、743、670cm^-1。¹H（DMSO−d₆/60℃）7.93〜7.8
6（ｍ、8H）、7.32（ｓ、1H）、3.98（ｓ、3H）、3.69
（ｓ、4H）、3.67（ｓ、4H）。¹³C NMR（DMSO−d₆/60
℃）163.3、163.1、150.0、148.6、138.3、134.7、131.
9、131.3、128.9、127.6、126.1、123.0、121.9、100.
6、58.7、49.0、48.5。MSm/e386（M⁺）。

遊離塩基0.58g（0.0015モル）を加熱エタノール10mL
に溶解し、HClの飽和エタノール溶液（sat.ethanolic H
CL）10mLで処理した。混液を還流させながら30分間加熱
した。真空中で容積を５〜6mLとなるまで減少させた。
このように処理した混液を乾性エーテルで希釈して60mL
とした。これにより得た黄色の結晶状固体を濾過し、乾
性エーテルで洗って60℃で12時間真空乾燥して、目的の
化合物0.62g（83％）を得た。mpは189〜190℃（dec.）
であった。IR（KBr）:3422、3128、2975、1599、1510、
1405、1363、1285、1207、1028、845、666cm^-1。¹H（D₂
O/TSP/50℃）7.52〜7.43（ｍ、8H）、6.87（ｓ、1H）、
3.92（ｓ、3H）、3.86（ｓ、8H）。¹³C（D₂O/TSP/50
℃）167.2、153.1、152.4、137.6、137.2、130.9、130.
7、126.5、125.4、122.1、119.8、104.2、61.5、47.0、
46.9。C₂₃H₂₂N₄O_2-0.5H₂O−2HClの計算値:C、58.97;H、
5.38;N、11.96。測定値:C、59.16;H、5.35;N、11.80。

実施例 12 2,5−ビス［４−（Ｎ−シクロ−プロピルグアニル）フ
ェニルフランの調製イミダートエステル（1.3g、0.003モル）とシクロプ
ロピルアミノ（0.43g、0.0075モル）とを乾性エタノー
ル35mL中で混合した混合物を一晩攪拌した。真空中で溶
媒を除き、水を加えて黄色の溶液とした。溶液を冷却攪
拌しながら1M NaOHを加えてアルカリとした。これによ
り形成した固体を濾過し、水で洗って乾燥した。固体を
クロロホルムに溶解し、Na₂SO₄上で乾燥した後、溶媒を
除いた。残滓をエーテル:CHCl₃（5:1）で再結晶して、
淡黄色の固体0.8g（70.9％）を得た。mpは185〜186℃
（dec.）であった。IR（KBr）:3464、3320、3080、161
0、1510、1364、1022、848、791cm^-1。¹H NMR（CD
C₁₃）:7.71（br ｓ、8H）、6.78（ｓ、2H）、5.3（ｖ
br、4H）、2.6（br ｍ、8H）、0.87〜0.81（ｍ、4
H）、0.67〜0.62（ｍ、4H）。¹³C NMR（CDC₁₃＋DMSO−d
₆）:159.6、152.2、134.8、130.7、126.4、122.6、107.
7、25.7、6.04。MSm/e388（M⁺）。

遊離塩基（0.6g、0.0015モル）を乾性メタノール3mL
に懸濁し、HClのエタノール溶液（ethanolic HCL）6mL
で処理して、65℃で１時間ゆるやかに加熱した。この黄
色の溶液を乾性エーテル50mLで希釈して、濾過し、乾性
エーテルで洗った後、75℃で12時間真空乾燥した。この
ようにして目的の化合物である黄色の固体0.55g（80
％）を得た。mpは＞310℃（dec.）であった。IR（KB
r）:3369、3181、3037、1665、1607、1502、1032、78
2、674cm^-1。¹H NMR（DMSO−d₆）:10.24（ｓ、2H）、9.
86（ｓ、2H）、9.27（ｓ、2H）、8.06（ｄ、4H、Ｊ＝7.
94）、7.95（ｄ、4H、Ｊ＝8.54）、7.42（ｓ、2H）、2.
87（br ｍ、2H）、1.09〜0.85（ｍ、8H）。¹³C NMR（D
MSO−d₆）:163.9、152.3、133.7、129.1、126.6、123.
5、111.3、24.7、6.5。C₂₄H₂₄N₄O−2HClの計算値:C、6
3.02;H、5.73;N、12.25。測定値:C、62.89;H、5.95;N、
12.00。

実施例 13 蛍光検出用サンプルの調製化学薬品 DAPI、Hoechst 33258およびジスタマイシ
ン（distamycin）は、シグマ化学会社から入手した。

サンプルの由来ジアルジア・ラムブリア（Giardia
lamblia）は、前報の記述（C.A.Bell,et al.,Agents an
d Chemother.37,2668−2673（1993））通りに標準方法
により培養、冷却して細菌培養チューブから取り出し
て、ハンクス（シグマ化学会社が市販しているHanks Ba
lanced Salt Solution）緩衝液（HBSS^-）で洗った。こ
の細菌を染料と共に５分間インキュベートし、ハンクス
緩衝液で一度洗った後、顕微鏡にセットした。ヒト・リ
ンパ球から標準方法により中期クロモソーム塗抹平板を
作成した。染料はすべて、DA（distamycin）/DAPIによ
るＣバンドの染色標準法［O.Miller,Principles and Pr
actices in Medical Genetics（Longman Group Limite
d,New York1983）およびD.Silvonen,ACT Cytogenetic L
ab Manual（University of California,San Francisco
（1980）］に従って染色した。

特に、DAPIで染色する場合、スライドは緩衝液、それ
もマキルベイン緩衝液（MacIlvaine's buffer）（pH7.
5）に約10分間浸した。（マキルベイン緩衝液は、無水
クエン酸溶液（0.2M、19.2g/リットル）と、無水第二リ
ン酸ナトリウム（anhydrous sodium phosphate dibasi
c）（Na₂HPO₄）（0.2M、28.4g/リットル）とを混合する
公知の方法で調製することができる）。スライドをDAPI
（0.2μg/ml）で約10分間染色して、マキルベイン緩衝
液で洗浄した。式（Ｉ）の化合物で染色する場合は、ス
ライドを化合物0.02μg/mlで染色する以外は、全く同様
の方法に従った。

実施例 14 核酸の検出ハンクス緩衝液（HBSS−buffer）あるいは、グリセロ
ールのいずれかでスライドを塗り、その上に組織を置い
て、カバーガラスで覆った。特別の資材は必要ではなか
った。ニコン写真顕微鏡に、UVレンズ（360nm励起光用
と460nm発光用フィルターが付いているもの）とネオフ
ロロレンズ（neofluor lens）を装着して、サンプルを
観察した。エクタクローム1600ASAフイルムか、テクニ
カルパンASA黒白フィルムのどちらかで画像を撮影し
た。露出時間は0.1〜５秒であった。

G.ラムブリアの核を式（Ｉ）の染料で染色したもの
を、DAPIおよびHoechst 33258のものとを写真で比較す
る。DNA特異性が高い染料である、2,5−ビス［４−（4,
5,6,7−テトラヒドロ−1H−１、３−ジアゼピン−２−
イル）フェニル］フランでは、ジアルジア細胞質のバッ
クグラウンド染色がなく、RNAや細胞骨格成分と結合し
ないことを示していた。DAPI、Hoechst 33258および2,
5−ビス（４−アミジノフェニル）フランでは、ジアル
ジア細胞質が顕著に染色されているのが観察された。DA
PIと2,5−ビス（４−アミジノフェニル）フランは、微
小管構造と繊維状構造までもはっきりと染色していた。
これまでに、DAPIはチューブリンや微小管を染色するこ
ともあることが報告されていた（D.Bonne,et al.,J.Bio
l.Chem.260,2819−2825（1985））が、これらの著者ら
は無傷の繊維芽細胞ではこの染色を観察することはでき
なかったとも報告していた。これらの写真は、ジアルジ
アにおいては、DAPIはチューブリンを含む構造成分を染
色し、また核酸の染色の場合には、コントラストがどぎ
つくなる（intense staining）ことを示している。

ジアルジアの他に、ヒト中期クロモソームも式（Ｉ）
の化合物で染色して、DAPIと比較検討した。このDAPI
は、クロモソームの１、９、15、16およびＹ上で「Ｃバ
ンド」を形成するクロモソームのATリッチ（AT−rich）
領域のマーカーの検査用として広く使用されている（O.
Miller,Principles and Practices in Medical Genetic
s（Longman Group Limited,New York1983）。

フラン染料である、2,5−ビス［４−（4,5,6,7−テト
ロヒドロ−1H1,3−ジアゼピン−２−イル）フェニル］
フラン、2,5−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）アミ
ジノ］フェニル｝フラン、および2,5−ビス（４−アミ
ジノフェニル）フランの染色パターンは、DAPIのそれと
実質的に同様であった。フラン染料の発光は、DAPIの発
光とは僅かに異なる波長の青色の光である。このため、
光の散乱度がDAPIで観察されるものより低く、より詳し
く観察（delineate more detail）できるようなる可能
性がある。さらに、フラン染料では、取扱や貯蔵に特別
のマニュアルを必要としない。

また、上記以外の細菌、イースト、植物、や組織培養
細胞など、数多くの種類の組織を用いて，ジカチオンフ
ラン類の検討を重ねた。どの場合でも、ジカチオンフラ
ン類のDNA検出感度はDAPIのそれに匹敵するばかりでな
く、濃い青色光とDNA特異特性によって、より詳しい観
察が可能となる（can elucidate more detail）利点を
有する。

実施例 15 結合による核酸の測定式（I a）および（I b）の化合物を除き、従来から核
酸に対する染料の結合親和力が説明されている［W.D.Wi
lson,et al.,Biochemistry3,4098−4104（1993）;W.D.W
ilson,et al.,Molecular Basis of Specificity in Nuc
leic Acid−Drug Interactions（Kluwer Academic Publ
ishers,Amsterdam1990）pp.331−353］。他の化合物と
同様にして、式（I a）および（I b）の化合物の核酸結
合パラメータを測定した。特に、Apple IIeマイクロコ
ンピューターと連動させたCary 219分光光度計を用い
て、熱融解（Tm）実験を行い、核酸結合パラメーターを
測定した。Caryの温度は、Haake A81冷却浴に連結した
Haake PG20プログラマーによって制御した。Haake A8
1冷却浴は温度が毎分0.5℃上昇するように設定した。温
度のモニターには、サーミスターを照合キュベットに固
定したものを使用した。RNAポリマーのポリ（Ａ）・ポ
リ（Ｕ）と、これに対応する配列を持つDNAポリ（dA）
・ポリ（dT）によって、Tmを比較した。長さ1cm経路の
換算体積を持つクオーツ・セル（1cm path length redu
ced volume quartz cells）に、緩衝液1mLを置きこれに
ポリマーを添加し、260nmで吸光度を測定して濃度を決
定した。実験は一般に、DNA塩基対濃度は５×10^-5M、お
よび化合物／塩基対の比率は0.6で行った。化合物のTm
（△Tm＝錯体のTm−遊離核酸のTm）の上昇によって、化
合物を比較した。

表ＩはDNAとRNAに対する親和力について、蛍光染料 2,5−ビス（４−アミジノフェニル）フラン（DB7
5）； 2,5−ビス［４−（４、５、６、７−テロラヒドロ−1
H−１、３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン
（DB161）； 2,5−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）アミジノ］
フェニル｝フラン（DB181）；および 2,5−ビス［４−（１、４、５、６−テトラヒドロピ
リミジン−２−イル）フェニル］フラン（DB103）と、化合物DAPIおよびHoechst 33258とを比較したもの
である。

実施例 16 スペクトルの測定 DNAまたはRNAが存在する場合と存在しない場合につい
て、シマズ複光束光度計により染料の吸収極大を観測し
た。また、染料の蛍光励起と発光極大をLKB蛍光計によ
り測定した。これらの吸収極大、励起係数、励起極大、
および発光極大を下記の表IIに示す。

実施例 17 細胞骨格成分の検出サンプルを用意し、これらのサンプルを次の化合物:D
B99、DB154およびDB155で染色したこと以外は、実施例
９および10と同様にして観測を行った。撮影した写真
は、化合物DB99、DB154、およびDB155が、G.ランブリア
の細胞骨格成分、すなわち、微小管構造または繊維状構
造を染色することを示している。

上記の実施例は本発明の説明のためになされたもので
あって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
本発明の範囲は下記の請求の範囲によって定められてお
り、同等物はこの範囲に入るものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/58 33/58 Ａ (73)特許権者 999999999 ジョージア・ステイト・ユニヴァーシティ・リサーチ・ファンデイション，インコーポレイテッドアメリカ合衆国、30303−3083 ジョージア、アトランタ、ユニヴァーシティ・プラザ (72)発明者ダイクストラ，クリスティン・シーアメリカ合衆国、27516 ノース・キャロライナ、チャペル・ヒル、ペニントン・ドライヴ 203 (72)発明者ティドウェル，リチャード・アールアメリカ合衆国、27514 ノース・キャロライナ、チャペル・ヒル、ジ・オークス 1806 (72)発明者ボイキン，デイヴィッド・ダブリューアメリカ合衆国、30306 ジョージア、アトランタ、スプリングデイル・ロード・エヌ．イー． 1369 (72)発明者ウィルソン，ダブリュー・デイヴィッドアメリカ合衆国、30307 ジョージア、アトランタ、ダイソン・ドライヴ 1669 (72)発明者スピカラ，ヤロスラフポーランド国、60−241 ポズナニ、パラオザ 18エイ、エム．313 (72)発明者ダス，バイヤン・ピーアメリカ合衆国、30306 ジョージア、アトランタ、チャルメット・ドライヴ 1364 (72)発明者クマール，アルヴィンドアメリカ合衆国、30329 ジョージア、アトランタ、ビュフォード・ハイウェイ 3500、アパートメントエイチ５ (56)参考文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，32 （26），ｐ．6605−6612（1993) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，260 （５），ｐ．2819−2825（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 307/52 C07D 307/58 C07D 405/14 C12Q 1/68 G01N 21/78 G01N 33/50 G01N 33/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の（ａ）および（ｂ）からなる核酸を蛍
光により検出する方法。（ａ）該核酸を次の式（Ｉ）の化合物または、生理的
に許容できる塩と接触させること。式中、R₁およびR₂はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わか
れ低級アルキル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC
₁₀のアリール、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロ
キシアルキル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノ
アルキルまたはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアルキ
ルアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれる
か、 R₁およびR₂の二つでC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、あるいは、R₁およびR₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるかまたはR₁₁が
C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキルであり、
R₁₅とR₁₆とがＨおよびC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ
低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−CONH
R₁₁NR₁₅R₁₆であり、 R₃はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ル、からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀のアリール、C
₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシアルキル、C
₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノアルキルまたはC
₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアルキルアミノアルキ
ルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基で
あり、式中、R₄、R₅およびR₆はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝
わかれ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキ
シアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群
から各々別個に選ばれ、 R₁₂は水素、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アル
キル、ヒドロキシル基、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わか
れアミノアルキルまたはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わか
れアルキルアミノアルキルであり、上記ＡがでありかつR₁、R₂、R₄およびR₅が水素であるときに、R₃
が水素ではない。（ｂ）該核酸を式（Ｉ）の該化合物が蛍光を発光でき
る光に暴露すること。
【請求項２】上記核酸がDNAである請求項１に記載の方
法。
【請求項３】上記核酸がRNAである請求項１に記載の方
法。
【請求項４】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項５】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項６】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項７】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項８】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項９】Ａが次の構造式で表される請求項１に記載
の方法。
【請求項１０】Ａが次の構造式で表される請求項１に記
載の方法。
【請求項１１】Ａが次の構造式で表される請求項１に記
載の方法。
【請求項１２】Ａが次の構造式で表される請求項１に記
載の方法。
【請求項１３】R₁とR₂の二つが次の式で表される請求項
１に記載の方法。式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるかR₁₁がC₁から
C₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキルであり、R₁₅とR
₁₆がＨとC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキル
からなる群から各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆で
ある。
【請求項１４】R₁とR₂の二つでC₂〜C₄アルキレンを表
し、R₃はＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】R₁とR₂の二つでC₄アルキレンを表し、R₃
はＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】R₁とR₃はＨであり、R₂はC₁からC₄の直鎖
もしくは枝わかれ低級アルキルである請求項１に記載の
方法。
【請求項１７】R₂はイソプロピルである請求項16に記載
の方法。
【請求項１８】上記化合物が次からなる群から選ばれる
請求項１に記載の方法。 2,5−ビス（４−アミジノフェニル）フラン、 2,5−ビス［４−（４、５−ジヒドロ−1H−イミダゾイ
ル−２−イル）フェニル］フラン、 2,5−ビス［４−（1,4,5,6−テロラヒドロピリミジン−
２−イル）フェニル］フラン、 2,5−ビス［４−（4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−1,3−
ジアセピン−２−イル）フェニル］フラン、 2,5−ビス［４−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニ
ルフランおよび、これら化合物の生理的に許容できる
塩。
【請求項１９】上記式（Ｉ）の化合物が2,5−ビス［４
−（4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−1,3−ジアセピン−２
−イル）フェニル］フラン、またはその生理的に許容で
きる塩である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】上記式（Ｉ）の化合物が2,5−ビス［４
−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニル］フラン、ま
たはその生理的に許容できる塩である請求項１に記載の
方法。
【請求項２１】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂の二つでC2〜C3アルキレンを表し、 R₃はＨであり、Ａは次の基である、式中、R₄はＨであり、 R₅はＲがＨまたはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級
アルキルであるOCH₃、またはＯ（C₆H₄）Ｒである。
【請求項２２】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂の二つでC₂直鎖の飽和アルキレンを表し、 R₃はR₁₄がC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ルである−R₁₄OHであり、Ａは次の基であり、式中、R₄とR₅とは各々Ｈである。
【請求項２３】R₁₄が−（CH₂）_２−である請求項22に記
載の化合物。
【請求項２４】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂の二つでC₄アルキレンを表し、 R₃はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀のアリー
ル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシアルキ
ル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノアルキル又
はC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアルキルアミノアル
キルであり、Ａは次の基であり、式中、R₄およびR₅はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わか
れ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシア
リール、またはオキシアリールアルキルからなる群から
選ばれる。
【請求項２５】R₃、R₄およびR₅がＨである請求項24に記
載の化合物。
【請求項２６】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂はＨであり、 R₃はイソプロピルであり、Ａは次の基であり、式中、R₄およびR₅は各々Ｈである。
【請求項２７】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂はＨであり、 R₃は−（CH₂）₃N（CH₃）_２であり、Ａは次の基であり、式中、R₄およびR₅は各々Ｈである。
【請求項２８】次の式（Ｉ）で表される化合物、または
その生理的に許容できる塩。式中、R₁とR₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるか、またはR₁₁
が低級アルキルであり、R₁₅とR₁₆がＨおよび低級アルキ
ルからなる群から各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆
であり、 R₃はＨであり、Ａは次の基であり、式中、R₄およびR₅は各々Ｈである。
【請求項２９】DNAとRNAを含有する核酸混合物から蛍光
により選択的にDNAを検出する次の（ａ）および（ｂ）
からなる方法。（ａ）該核酸混合物を次の式（Ｉ）の化合物、またはそ
の生理的に許容できる塩に接触させる。式中、R₁とR₂はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀の
アリール、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシ
アルキル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミ
ノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、 R₁とR₂の二つでC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、またはR₁とR₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるか、またはR₁₁
がC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキルであ
り、R₁₅とR₁₆がＨとC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−CONHR
₁₁NR₁₅R₁₆であり、 R₃はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀のアリー
ル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシアルキ
ル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノアル
キルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基で
あり、式中、R₄、R₅およびR₆はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝
わかれ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキ
シアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれ、 R₁₂は水素、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アル
キル、ヒドロキシ、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わ
かれアミノアルキルであり、上記ＡがでありかつR₁、R₂、R₄およびR₅が水素であるときに、R₃
が水素ではない。（ｂ）該核酸混合物を式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光
できる光に暴露すること。
【請求項３０】次の（ａ）および（ｂ）からなる蛍光に
より微小管構造を検出する方法。（ａ）該微小管構造を次の式（Ｉ）の化合物、または
その生理的に許容できる塩に接触させる。式中、R₁とR₂はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀の
アリール、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシ
アルキル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミ
ノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、 R₁とR₂の二つでC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、またはR₁とR₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるか、またはR₁₁
がC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキルであ
り、R₁₅とR₁₆がＨとC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−CONHR
₁₁NR₁₅R₁₆であり、 R₃はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀のアリー
ル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシアルキ
ル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノアル
キルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基で
あり、式中、R₄、R₅およびR₆はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝
わかれ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキ
シアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれ、 R₁₂は水素、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アル
キル、ヒドロキシ、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わ
かれアミノアルキルであり、上記ＡがでありかつR₁、R₂、R₄およびR₅が水素であるときに、R₃
が水素ではない。（ｂ）該微小管構造を式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光
できる光に暴露すること。
【請求項３１】微小管構造が細胞の細胞骨格に存在して
いる請求項30に記載の方法。
【請求項３２】第一の細胞構造と第二の細胞構造とが互
いに異なる細胞から、該第一の細胞構造と該第二の細胞
構造とを蛍光により同時に検出する次の（ａ）および
（ｂ）からなる方法。（ａ）該細胞を第一の蛍光化合物および第二の蛍光化
合物、またはその生理的に許容できる塩に接触させ、該
第一の蛍光化合物は該第一の構造に選択的に結合し、該
第二の蛍光化合物は該第二の構造に選択的に結合し、さ
らに該第一の蛍光化合物と該第二の蛍光化合物の蛍光発
光スペクトルは互いに異なり、さらにまた、該蛍光化合
物各々は次の式（Ｉ）で表される構造を持っている。式中、R₁とR₂はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀の
アリール、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシ
アルキル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミ
ノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、 R₁とR₂の二つでC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、またはR₁とR²の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるか、またはR₁₁
がC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキルであ
り、R₁₅とR₁₆がＨとC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−CONHR
₁₁NR₁₅R₁₆であり、 R₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒ
ドロキシアルキル、またはアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基で
あり、式中、R₄、R₅およびR₆はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝
わかれ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキ
シアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれ、 R₁₂は水素、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アル
キル、ヒドロキシ、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わ
かれアミノアルキルであり、上記ＡがでありかつR₁、R₂、R₄およびR₅が水素であるときに、R₃
が水素ではない。（ｂ）該細胞を該第一の蛍光化合物と該第二の蛍光化
合物とが蛍光を発光できる光に暴露して、該第一の細胞
構造と該第二の細胞構造に異なる蛍光発光スペクトルに
より蛍光を発光させること。
【請求項３３】上記第一の細胞構造と上記第二の細胞構
造がDNA、RNA、および微小管構造からなる群から選ばれ
る請求項32に記載の方法。
【請求項３４】次の（ａ）および（ｂ）からなる細胞構
造の蛍光検出用キット。（ａ）次の式（Ｉ）の化合物、またはその生理的に許
容できる塩。式中、R₁とR₂はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低
級アルキル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀の
アリール、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシ
アルキル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミ
ノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、 R₁とR₂の二つでC₂〜C₁₀アルキレンを表すか、またはR₁とR₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、R₁₀はＨであるか、またはR₁₁
が低級アルキルであり、R₁₅とR₁₆がＨと低級アルキルか
らなる群から各々別個に選ばれる−CONHR₁₁NR₁₅R₁₆であ
り、 R₃はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれ低級アルキ
ル、C₃からC₆のシクロアルキル、C₃からC₁₀のアリー
ル、C₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれヒドロキシアルキ
ル、またはC₁からC₄の直鎖もしくは枝わかれアミノアル
キルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基で
あり、式中、R₄、R5およびR₆はＨ、C₁からC₄の直鎖もしくは枝
わかれ低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキ
シアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群か
ら各々別個に選ばれ、上記ＡがでありかつR₁、R₂、R₄およびR₅が水素であるときに、R₃
が水素ではない。（ｂ）該式（Ｉ）の化合物が核酸を含むサンプルに接
触するとき、該化合物のラベルを付けた核酸混合物を形
成するに充分な量の溶媒。光に暴露されて該式（Ｉ）の
化合物が蛍光を発光することにより、上記式（Ｉ）の化
合物による蛍光検出が可能となる。