JPH10501615A

JPH10501615A - ビス−ジカチオンアリールフラン類を用いる核酸および細胞骨格成分の蛍光検出方法

Info

Publication number: JPH10501615A
Application number: JP7529154A
Authority: JP
Inventors: ダイクストラ，クリスティン・シー; ティドウェル，リチャード・アール; ボイキン，デイヴィッド・ダブリュー; ウィルソン，ダブリュー・デイヴィッド; スピカラ，ヤロスラフ; ダス，バイヤン・ピー; クマール，アルヴィンド
Original assignee: ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル; ジョージア・ステイト・ユニヴァーシティ・リサーチ・ファンデイション，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 1998-02-10
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: WO1995030901A1; JP3098545B2; HU9603078D0; HUT76440A; US5723288A; US5594138A; NZ285309A; AU2436995A; EP0758453A1; AU699223B2; CN1151209A; CA2189125A1; BR9507616A

Abstract

(57)【要約】本発明は、蛍光による核酸の検出方法を開示する。この方法では、先ず核酸にビス−ジカチオンアリール化合物を接触させる。ビス−ジカチオンアリール化合物としては、２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テロラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フランや、２，５−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）アミジノ］フェニル｝フラン、およびこれらの化合物の生理的に許容できる塩が擧げられる。ついで、核酸を化合物から蛍光を発光できる波長の光に暴露する。さらにまた、細胞骨格成分の蛍光検出方法と新規なビス−ジカチオンアリールフラン化合物も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ビス−ジカチオンアリールフラン類を用いる核酸および細胞骨格成分の蛍光検出方法本発明は国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）助成金第ＵＯ１−ＡＩ−３３６３号による政府援助のもとに行われたものである。したがって、政府は本発明に対して権利の一部を所有している。技術分野本発明は核酸および細胞骨格成分を結合検出する方法に関する。より具体的には、ビス−ジカチオンアリールフラン化合物を用いて核酸と細胞骨格成分を蛍光により検出する方法に関する。背景技術多くの種類のサンプルが染色の蛍光特性によって分析されている。一つの分子がある波長の光で励起されると、より長い波長の光が発光して、励起していない（基底）状態に戻る。この時に蛍光が観察される。励起光と分子の発光とは、波長が異なるので、光学フィルターを使えば互いに分離することができる。蛍光はこれまで多年にわたって光学顕微鏡である種の分子（したがって、構造）を観察するのに用いられて来たが、フロー・サイトメトリー（flow cytometry）など他の分析技術にも利用されている。蛍光分析で使用されている蛍光プローブの種類は、他のプローブ（抗体である場合が多い）とラベルを共有するものと、分布あるいは蛍光が細胞の環境、したがって特定の特性を反映しているものとの、二つのカテゴリーに大別することができる。後者のうち、核酸や細胞骨格の構造あるいは成分に特異的に結合する蛍光化合物が特に重要である。各種の蛍光プローブが知られており、例えはプロピジウム(propidium)やエチジウム（ethidium）染料がある。しかしながら、これらの化合物はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、二重鎖リボ核酸（ＲＮＡ）の両方に結合してしまう。したがって、ＤＮＡを測定するときには、ＲＮＡを除かなくてはならない。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）も、細胞学、核酸の生物物理分析やフロー・サイトメトリーの無数の用途においてＤＮＡ染料として使用されている。ＤＡＰＩは、ＡＴ−リッチＤＮＡ配列中のＤＮＡの小さな溝(DNA minor groove at AT-rich DNA sequences）に優先的に結合するが、そればかりでなく、ＧＣおよび混合ＧＣ／ＡＴ配列にインターカレートし、さらに顕著にＲＮＡとも結合する。（W.D．Wilson，et al.，"The Effects of Ligand St ructure on Binding Mode of Unfused Aromatic Cations with DNA" in Molecul ar Basis of Specificity in Nulcleic Acid-Drug Interactions，Klumar Acade mic Publishers，Amsterdam(1990)，pps．331-353; W.D.Wilson，et al.，Bioch emistry 32，4098-4104(1993)を参照されたい）。ＤＡＰＩはチューブリンなど他の細胞成分にも結合して、ＲＮＡやチューブリンを染色する。これまでに、多数のアリールジアミジン類が価値のある抗原虫剤として合成されてきた。(B.P．Das および D.W．Boykin，J．Med．Chem．20，531-536(1977) を参照されたい）。ＤＡＰＩと同様に、２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フラン（２，５−ビス（４−グアニルフェニル）フランとも呼ばれている）もまた、ＡＴ−リッチＤＮＡ配列中にあるＤＮＡの小さな溝と結合するが、そればかりでなく、ＧＣおよび混合ＧＣ／ＡＴ配列と相互作用する。（上記 W.D．Wilson ，et al.，(1990)，上記 W.D．Wilson，et al.，(1993)を参照されたい）。蛍光分析の用途で使用されているもう一つの染料に、ビス−ベンゾイミドＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８がある。しかしながら、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は密接に関連する化合物であるため、ＤＮＡの大きな溝にある自己結合錯体（self -association complex）を介して、ＧＣ−リッチ配列に結合すると、Loontiens et al.が述べている。（F.G.Loontiens，et al.，Biochemistry 29，9029-9039( 1990)を参照されたい）。この薬剤はＲＮＡとも、著しい結合力(association)を持っている（上記 Wilson，et al.，(1993)を参照されたい）。したがって、ＤＡＰＩや２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フランの場合と同様に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８によっても、ＤＮＡでない成分（non-DNA elements）が顕著に染色される。発明の要旨本発明の第一の態様は、次の式（Ｉ）の新規な化合物を提供することである。式中、Ｒ₁とＲ₂とはＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁とＲ₂とでＣ₂からＣ₁₀のアルキレンを表し、あるいはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成する。式中、ｎは１から３までの数で、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₅ とＲ₁₆とがＨおよび低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆である。Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルである。Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基である。式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばる。Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルである。本発明の一実施例において、Ｒ₁とＲ₂の二つで次の基を形成している。式中、ｎは１から３までの数を表し、Ｒ₁₀はＨであるか、あるいはＲ₁₅とＲ₁₆ がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆ である。Ｒ₃、Ｒ₄とＲ₅とは各々Ｈである。本発明の他の実施例においては、Ｒ₁、Ｒ₃ 、Ｒ₄とＲ₅はＨであり、Ｒ₂は低級アルキルである。本発明の第二の実施態様は、核酸の蛍光による検出方法である。この方法は、核酸に式（Ｉ）の化合物を接触させること、および核酸を光に暴露して式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光をせることからなる。本発明の第三の実施態様は、ＤＮＡとＲＮＡとを含有する核酸混液から蛍光によりＤＮＡのみを選択的に検出する方法である。この方法は、（ａ）核酸混液を式（Ｉ）の化合物に接触させること、および（ｂ）核酸混液を光に暴露して、式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることからなる。本発明のさらに他の態様は、微小管構造の蛍光による検出方法である。この方法は、微小管構造に式（Ｉ）の化合物を接触させること、および微小管構造を光に暴露して式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることからなる。本発明のさらに他の態様は、第一の細胞構造と第二の細胞構造とが互いに異なる細胞から、該第一の細胞構造と該第二の細胞構造とを蛍光により同時検出する方法である。この方法では先ず、（ａ）細胞に第一の蛍光化合物と第二の蛍光化合物に接触させる。第一および第二の蛍光化合物は、互いに構造が異なってはいるが、蛍光化合物各々は式（Ｉ）の構造を持っている。第一の蛍光化合物は選択的に第一の構造と結合し、第二の蛍光化合物は選択的に第二の構造と結合する。さらに、第一と第二の蛍光化合物の蛍光発光スペクトルが異なっている。細胞と第一および第二の蛍光化合物とを接触させた後、（ｂ）細胞を光に暴露して、第一および第二の蛍光化合物の両方から蛍光を発光させ、したがって第一の細胞構造と第二の細胞構造から異なる蛍光発光スペクトルの蛍光が発光する。本発明のさらに他の態様は、細胞構造の蛍光検出用キットを提供する。このキットは、（ａ）式（Ｉ）の化合物、および（ｂ）（Ｉ）の化合物が核酸を含有するサンプルと接触するとき、この化合物のラベルを付けた核酸混液を形成するのに充分な量の溶媒からなっている。本発明のさらに他の態様は、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物、あるいはこれらの化合物の生理的に許容できる塩類によって構成されるキットである。以下に記述する明細書によって、本発明の上記その他の目的および態様を詳細説明する。発明の詳細な説明蛍光による核酸の検出方法に有用な化合物類を開示する。この化合物は、次の式（Ｉ）の化合物類からなる。Ｒ₁とＲ₂とはＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、または、Ｒ₁とＲ₂の二つで直鎖または枝分かれ、飽和させたまたは不飽和のＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、あるいはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成する。式中、ｎは１から３までの数であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₅とＲ₁₆がＨおよび低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅ Ｒ₁₆である。好ましくはＲ₁₀はＨである。Ｒ₁₀はリングのＣ−２、Ｃ−３、Ｃ− ４、またはＣ−５のどの位置に置かれていても良い。好ましくは、Ｒ₁₀はＣ−３の位置に位置する。本発明の一実施例においては、Ｒ₁とＲ₂の二つで次の基を形成している。式中、ｎおよびＲ₁₀は上記の定義と同様である。本発明の他の実施例においては、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀、直鎖状、飽和させたアルキレンを表している。より好ましくは、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₅直鎖状、飽和させたアルキレンを表す。本発明のさらに他の実施例においては、Ｒ₁はＨであり、Ｒ₂は低級アルキル、好ましくはイソプロピルである。Ｒ₃は、Ｈ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルからなる群から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ₃ はＨであるか、またはＲ₁₄が低級アルキルである式−Ｒ₁₄ＯＨのアルキルヒドロキシである。好ましくは、Ｒ₁₄は−（ＣＨ₂）₂−である。Ａは次の基からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基である。Ａを表している上記の基は、Ｒ₄とＲ₅で置換したオルト(ortho)、メタ(meta) 、またはパラ（para）であっても良い。Ｒ₄は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ₄ はＨまたは低級アルキルである。Ｒ₅は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ₅ はＨである。Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルからなる群から選ぶことができる。一実施例においては、Ａは次の基である。式中、Ｒ₄とＲ₅とは上記の定義と同様であるが、好ましくは、Ｒ₄がＨであり、Ｒ₅はＯＣＨ₃であるか、またはＲがＨまたは低級アルキルであるＯ（Ｃ₆Ｈ₄）Ｒである。より好ましくは、Ｒが低級アルキル、好ましくはメチルである。本明細書で用いる「低級アルキル」なる語は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルなど、Ｃ₁〜Ｃ₄ 直鎖状または枝分かれアルキルを指す。本明細書で用いる「シクロアルキル」なる語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなど、Ｃ₃〜Ｃ₆環状アルキルを指す。本明細書で用いる「アリール」なる語は、フェニル、ナフチル、などＣ₃〜Ｃ₁₀環状芳香族の基を指し、且つトリルなどの置換アリール基を含むものとする。本明細書で用いる「ヒドロキシアルキル」なる語は、Ｃ₁〜Ｃ₄直鎖状または枝分かれヒドロキシ−置換アルキル、すなわち −ＣＨ₂ＯＨ、−（ＣＨ₂）₂ＯＨ、などを指す。本明細書で用いる「アミノアルキル」なる語は、Ｃ₁〜Ｃ₄直鎖状または枝分かれアミノ−置換アルキルを指す。この場合、「アミノ」なる語は、−ＮＨ₂、−ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂など、Ｒ’とＲ ”とが上記定義と同様にＨまたは低級アルキルから別個に選ばれるＮＲ’Ｒ”基である。本明細書で用いる「オキシアルキル」なる語は、Ｃ₁〜Ｃ₄酸素−置換アルキル、すなわち例えば、−ＯＣＨ₃を指し、本明細書で用いる「オキシアリール」なる語は、Ｃ₃〜Ｃ₁₀酸素−置換環状芳香族の基を指す。式（Ｉ）の代表的な新規の化合物であり、且つ本発明の方法に好ましい化合物としては、２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フラン；２，５−ビス［４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾイル−２−イル）フェニル］フラン；２，５−ビス［４−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）フェニル］フラン；２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン；２，５−ビス［４−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニルフラン；およびこれらの化合物の生理的に許容できる塩類が擧げられるが、これらのみに限定はされない。本発明の方法は、核酸の実質的に純粋な溶液、または核酸を含有する生物サンプルを上記式（Ｉ）の化合物と接触または混合した後、生物サンプルを光に暴露して、式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させることよって実施する。生物サンプルを光に暴露して、式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光させるステップによって、サンプルの分析、すなわちサンプル中に含有されている核酸成分の存在を検出することができる。本発明の方法は、例えば、光学顕微鏡による観測、フロー・サイトメトリー、核型の分析、核酸の検出と定量、電気泳動などで有用である。本発明の化合物は、サンプル中の核酸と結合するので、核酸を含有していると推測される生物サンプルを染色するのに好適である。本明細書で用いる「核酸」なる語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の両方を指すものとする。クロモソーム核酸やクロモソーム外核酸（chromosomal and extrac hromosomal nucleic acids）（例えば、プラスミド、ＲＮＡウイルスなど）を含み、どのような核酸でも染色することができる。その結果、光学顕微鏡、共焦点光学顕微鏡、フロー・サイトメトリーなどを始めとして、サンプルと化合物とを結合させ、この化合物を蛍光検出することによりサンプル中の核酸を検出する当業者に公知の技術によって、生物サンプル中に存在している核酸を観察することができる。本発明による染色に好適な代表的サンプルは、典型的には生物体液または生物組織の形で得ることができる。当業者はサンプルは無数の生物源から採取して有用な診断情報を得ることができることを理解している。好適な生物体液としては、血液、唾液、尿、乳汁、リンパ液、および口腔、鼻や気管支の粘膜が擧げられるが、これらのみに限定されない。好適な組織サンプルとしては、腎臓、肝臓、リンパ節、その他の臓器の組織バイオプシーサンプル、および皮膚、その他の軟組織サンプル（例えば、筋肉）などが擧げられるが、これらには限定されない。検査対象からの標本は直接染色することもできるし、また標本を増殖培養することができる。生物標本を正しく選別することや、正しく培養する技術は、当業者が明白に知っていることである。またサンプルが検出すべき核酸の実質的に純粋な溶液、すなわち、上記の標本から単離した細胞内成分の溶液であっても良い。サンプルは、植物種と動物種両方から採取することができる。動物種はヒトでも、非ヒトの種（例えば、犬、猫、ラット、牛、馬、羊、猿など）でも、どちらでも良い。バクテリア、真菌、原虫、その他の単細胞生物などの細胞も、本発明によって処理することができる。したがって、本発明では真核生物と原核生物両方の細胞を使用することができる。典型的には、細胞は式（Ｉ）の蛍光化合物と共に、適当な条件下でインキュベートすることにより染色する。例えば、式（Ｉ）の化合物の染色は、O．Miller ，Principles and Practices in Medical Genetics（Longman Group Limited，N ew York 1983）およびD．Silvonen，ACT Cytogenetic Lab Manual（University of California，San Francisco 1980）が記述している公知の、ＤＡＰＩ染色標準プロトコルにしたがって行うことができる。これとは別に、これもまた公知である、ビス−ベンズイミド染色標準プロトコルによってサンプルを染色することができる（例えば、Human Cytogenetics，Volume 1，Constitutional Analysis ，pg 113（D.Rooney および B．Czepulkowski，Eds.，IRL Press at Oxford Uni versity Press）を参照されたい）。サンプルは、充分量の式（Ｉ）の化合物と接触、または混合して、化合物とサンプル中の核酸とを結合する。一般的に式（Ｉ）の化合物分子は二重鎖核酸の四塩基対と結合するので、検出可能なシグナルを造り出せるに充分などのような量でも使うことができる。したがって、式（Ｉ）の化合物と検出すべきターゲットとの量の割合、すなわち比率は、特に検ターゲットの検出方法次第で、約１：４、１：８、１：１６、１：３２以上となる。所望される場合には、染色後選択的に過剰の化合物を洗い流しても良い。当業者がよく理解しているところであるが、サンプルが上記のように実質的に純粋な核酸溶液であって、例えば蛍光計を使用して分析する分析法である場合には洗うことは必要ではない。化合物から水溶液を造り、サンプルを単に水溶液に浸すことにより接触ステップを実施することができる。しかしながらこの場合、ＤＡＰＩでは必要であると報告されているような、溶液を暗所に貯蔵して化合物の安定性を維持する必要はない。溶液の最終濃度は約０．０１〜５、１０、または２５マイクロモル（μＭ）以上であるが、最小最終濃度は約０．０１マイクロモルである。サンプルと化合物との接触時間は接触技術によって大きく異なるが、サンプルを上記濃度の溶液に浸漬する場合一般には約３０秒〜２時間、好ましくは約１〜１５分間である。また、フルオロクロム(fluorochromes)を併用してサンプルを染色することもできる。こうすることにより、式（Ｉ）の化合物からと他の化合物からとの、異なる波長の蛍光を同時に検出することができる。当業者が理解しているところであるが、複数のラベルを使用する場合、最大発光波長または重複しないスペクトルを持つフルオロクロムを選択するように注意しなければならない。さらに、フルオロクロムの組合せを選択して、蛍光エネルギー移動法により蛍光シグナルを増幅できるようにすることもできる。これも当業者が理解しているところであるが、複数のフルオロクロムを使用する場合、互いに、あるいは式（Ｉ）の化合物と相互作用しないようなフルオロクロムを選択するように注意する。本発明の方法を適用する場合には、他の化合物（other entities）が付着するのに便利な共役部位（conjugation site）を除かないようにしながら、ＤＮＡ結合親和力は除くように式（Ｉ）の化合物を改質（modify）すると有利である。式（Ｉ）の化合物と共役するのに好適な化合物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ両方のオリゴヌクレオチドが擧げられる。式（Ｉ）の化合物に対するこのような共役体は、ＤＮＡ−タンパク錯体のハブリダイゼーション研究、バンドシフト分析（band shift assays）のアンチセンス試薬(anti-sence reagents)、すなわちプローブとして、あるいは蛍光ＤＮＡシークエンシングやＰＣＲ適用のプライマーとして有用である。式（Ｉ）の化合物は in situラベル研究に用いる非常に多くの試薬とも共役することができる。典型的な試薬としては、免疫組織化学用抗体や、容積測定用サイズ・マーカー化合物が擧げられる。さらに、式（Ｉ）の化合物は、例えばプロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、抗生物質失活(antibiotic in activation)、ヌクレアーゼや炭水化物などの試薬と共役して、酵素活性によって増加または減衰する蛍光発光について、酵素活性を測定するための基質を形成することができる。式（Ｉ）の化合物と共役した化合物が蛍光を発光するためには、 in situで共役を解いても良いし、解かなくても良い。つまり、式（Ｉ）の共役化合物は、共役したままでも蛍光を発光できるし、また共役から分離しても蛍光を発光することができる。本発明の暴露ステップは、式（Ｉ）の化合物から検出可能なシグナルを出させるのに好適な公知の方法によって実施する。この方法は一般的には、先ず生物サンプルを、式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光できる波長（例えば、２１０〜３８０ｎｍ）の紫外線に暴露する。この場合、検出すべき細胞内成分、つまり核酸が光の波長および／または密度によって破壊されないようすることだけを注意する。当業者に理解されているように、化合物から蛍光を発光させるために選択する波長は、「励起極大(excitation maximum)」、すなわち化合物に吸収されると、この化合物が励起されて、電子状態が高くなる波長として当業者にとり公知である。上記したように、本発明の励起波長は紫外線範囲である。化合物が高い電子状態から低い電子状態に遷移する際、一種の可視放射光、つまり「発光極大(emi ssion maximum)」と呼ばれている波長の蛍光を発光する。本発明で検出するのはこの蛍光なのである。化合物が発光する検出可能シグナルは、例えば、一般化した波長（generated wavelength）を検出する電子手段を用いてヒトの目で観察するなど、公知の方法で検出する。好都合なことに、蛍光の波長は励起光の波長から充分に取り除くことができるので、これら二つの波長は光学フィルターによって良く分離することができる。光をフィルターに通して、例えば、インプット側で所望する励起光の波長を選択したり、および／または蛍光のピーク、すなわち極大を測定するのに適当な範囲の発光波長を選択する。本発明の他の態様は、サンプル中の細胞の細胞骨格成分を結合して、その存在を検出する方法である。本発明の方法のこの態様では、上記の式（Ｉ）の化合物またはその生理的に許容できる塩を、実質的に純粋な細胞骨格成分の溶液、または細胞骨格成分を含有する生物サンプルと接触するか、あるいは混合する。上記したように、式（Ｉ）の化合物を細胞骨格成分と混合した後、サンプルを式（Ｉ）の化合物から蛍光を発光できる波長の光に暴露して、サンプルの分析、つまりサンプルに含有されている細胞骨格成分を検出する。本発明のこの態様は、例えば共焦点の光学顕微鏡を含む光学顕微鏡による分析や、生化学検定などに有用である。本発明の方法のこの態様は上記で詳細説明した核酸の蛍光検出と同様にして実施することができる。本明細書で用いる「細胞骨格成分」なる語は、細胞の骨格(framework)からなるタンパク繊維を指す。本発明は、この方法に特に感受性が高い、細胞骨格成分としての微小管構造に用いることが特に好ましい。当業者が理解しているように、チューブリンが微小管の主なタンパクである。したがって、本発明のこの態様は、微小管構造が形成される際にチューブリン重合が分裂するのを測定する技術を提供する。光学顕微鏡では、本発明の化合物（染色試薬に）を導入する前に、サンプルを固体の支持体に固定することが好ましい。どのような固体の支持体でも使用することができるが、典型的な支持体としては顕微鏡スライド、反応ウェルの壁面、試験管やキュベット、およびビーズが擧げられる。固体の支持体の構成材料は、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンや、架橋ポリサッカライドなど当業者にとり好適な、どの公知の材料でも良い。好ましくは、ガラスの顕微鏡スライドに固定する。サンプルを固体の支持体に固定する方法は、自然乾燥や、化学または熱処理など好適などのような方法でも良いが、後になってサンプルの観察に干渉するものは避けなければならない。スライドは、光学顕微鏡で観察できるように固定することが好ましい。光学顕微鏡では、上記した当業者に公知の次のＤＡＰＩまたはビス−ベンズイミド染色標準プロトコルにより、サンプルを式（Ｉ）の化合物で染色する。染色後過剰の式（Ｉ）の化合物を洗って取り除き、バックグラウンド干渉(backgroun d interference)を排除して、サンプルの解像度を高めると好都合である。染色法は先ず、例えば、サンプルを式（Ｉ）の化合物の水溶液に浸漬して、サンプル中の核酸または細胞骨格成分を結合するに充分な量の化合物にサンプルを接触させる。式（Ｉ）の化合物の量と、接触時間は上記した通りとする。このようにして準備したサンプルのスライドを、蛍光顕微鏡などの公知の蛍光法を用いて分析する。例えば、水銀ランプまたはキセノンランプなどの紫外線（ＵＶ）光源と適当なフィルターを備えた写真用顕微鏡で観察して、従来法により画像を撮影する。細胞にはＵＶ光源から照射する。このＵＶ光源は、励起の根源であって、本発明の蛍光化合物を励起する特定の波長を発生できるものでなければならない。本発明の方法は、フロー・サイトメトリーなどの他の分析方法にも使用することができる。フロー・サイトメトリーは、粒子や細胞を液体の流れに載せ、一つづつ検出点を通過させて迅速に測定する技術である。円滑な流れを乱したり、管や孔を塞ぐことなく系を通過できるような、特異的な方法で粒子を染色し、この粒子を分散させた懸濁液をサンプルとして準備する。このサンプルは、公知のフロー・サイトメトリー法により準備する。サンプルの染色は、濃度および接触時間について上記したプロトコルに従って、サンプルを式（Ｉ）の化合物に接触させて行う。すなわち、サンプルをフロー・サイトメトリー系の液体流れに注入あるいは載せる前に、サンプルを式（Ｉ）の化合物に接触させて、分散粒子の懸濁液を調製する。当業者が理解しているように、個々の細胞を含有する血液などの体液は、流動細胞計（flow cytometer）上で直接染色加工して、測定対象である高分子の絶対細胞含量(absolute cellular content )を測定することができる。固形組織は、単に臓器を細断したり、あるいは掻き裂いた後、ふるい分けして、密度勾配遠心法を実施する直接的方法で準備することができる。酵素消化が必要な組織もある。一般に、サンプル懸濁液を液体が流れている密閉チャンネルの中央に注入すると、ランダム三次元懸濁液(random three dimentional suspension)中の粒子の一つづつを照射光線が交差する空間の特定点に載せることができる。細胞が検出点を通過すると、この細胞が照射される。光学顕微鏡の場合と同様に、光が励起の根源であって、本発明の蛍光化合物を励起できる特定波長を発生させることができる光源でなくてはならない。細胞から蛍光が散乱して発光されるが、照射光線を通過する際に光検出器が蛍光を集めて、フォトン・パルスを電子シグナルに転換する。さらにこれを電子加工およびコンピューター加工して、グラフィック・ディスプレーを作成したり、あるいは統計分析を行う。本発明の実施に使用される化合物は、当業者にとり公知の技術に従い（例えば、B.P．Das and D.W．Boykin，J．Med．Chem．20，531-536(1977)を参照されたい。この開示全体を参照することにより本明細書の一部とする）、下記の実施例１〜４および６〜８で例示している技術、もしくは当業者にとり明白な変法により調製することができる。さらに、下記の実施例５で例示している、上記 B.P． Das and D.W．Boykin の方法の変法によっても、これらの化合物を合成することができる。式（Ｉ）の化合物は一般に、下記の反応式と同様にして調製する。すなわち、（ａ）R.E．Lutz，et al.，J．Am．Chem．Soc．56，2698（1934）が記述している方法により、１，４−ジケトン（１）を脱水環化によりフラン化して(cyclode hydrative furanization)、２，５−ビス−（４−ブロモフェニル）フラン（２）を形成する。（ｂ）Ｃｕ₂（ＣＮ）₂を用いて２，５−ビス−（４−ブロモフェニル）フラン（２）をニトリル化(nitrilization)し、対応するビス−ニトリル２，５−ビス−（４−シアノフェニル）フラン（３）を造る。その上で（ｃ）下記の実施例で例示しているように、ビス−ニトリル（３）を先ず、中間体であるイミダート・エステルに転換した後、この中間体とアンモニアまたは適当なジアミン、例えばエチレンジアミン、１，３−プロパンジアミンなどと反応させて、式（Ｉ）のビス−ジカチオンアリールフラン（４）に転換する。ステップ（ａ）と（ｂ）の詳細は実施例１で、ステップ（ｃ）の詳細は実施例２〜８で説明する。この代わりに、上記ステップ（ｃ）を熱分解ステップに置き換えて、下記の実施例５で例示しているように、熱を用いてジアミン、すなわち塩酸アミンとビス −ニトリルとを直接融合させて、ビス−ニトリル（３）を式（Ｉ）の化合物に転換することもできる。この方法転換は、Ｒ₁とＲ₂の二つで環状成分(cyclic moie ty)を形成している式（Ｉ）の化合物を調製する場合に限る。既に述べた通り、本発明で使用する化合物は、生理的に許容できる塩類（例えば、サンプルを著しく分裂させて、化合物の検出が不可能となることがない塩類）でも良い。このような塩類としては、海緑石（glauconite）、乳酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、硫酸塩、および塩酸塩を擧げることができる。本発明の塩類は、一般的に溶液中でアミジン系化合物の等価体二つ（two equivalents of the amidine base compound）と、所望の酸とを反応させて調製する。反応完了後、塩が不溶の溶媒適量を加えて溶液中で結晶化させる。式（Ｉ）の化合物の蛍光染料としての分光分析特性と有用性は、ＤＡＰＩやＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８に類似している。しかしながら、式（Ｉ）の化合物は、二重鎖ＤＮＡと強く結合し、特異性も高く、ＲＮＡとは本質的に結合しない。例えば、２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３− ジアゼピン−２−イル）フェニル］フランは、検出できるようなＲＮＡとの親和力を本質的に持っていない。さらにまた、式（Ｉ）の化合物は、ＤＡＰＩとは僅かに異なる波長の青色光を発光し、また光の散乱度もＤＡＰＩで観察されるものより低い。これにより、輪郭をより詳しく観察することができる（delineation of more detail）。利用者の便宜を考慮して、本発明のキットを提供する。この染色キットは典型的には、上記のステップを実施するのに充分な量の試薬、すなわち式（Ｉ）の化合物からなる。試薬の剤形は一般には、長期貯蔵に好適な結晶状粉末または水溶液である。さらに、一般的にキット中には、とりわけ、試薬貯蔵用バイアル、混合用容器、および上記のステップを実施するためのマニュアルを入れる。試薬には、緩衝剤などの補助剤を添付してもよい。必要な場合には、キットにテスト中のバックグラウンド緩衝を減衰させる薬剤、コントロール試薬、テスト用具なども入れても良い。以下、本発明を実施例を参照してさらに説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。実施例中、「ｇ」はグラムを指す、「ｍｇ」はミリグラムを指す、「μｇ」はマイクログラムを指す、「ｍｍｏｌ」はミリモルを指す、「ｈ」は時間を指す、「ｍｌ」はミリリットルを指す、「Ｍ」はモルを指す、「ｍＭ」はミリモルを指す、「μＭ」はマイクロモルを指す、「ＵＶ」は紫外線を指す、「ＨＣｌ」は塩化水素を指す、「ｍｐ」は融点を指す、「ＨＣＮ」はシアン化水素酸を指す、および「℃」は摂氏温度を指す。特に注釈を付けている場合を除き、式（Ｉ）の化合物の合成実験の詳細事項は、B.P．Das and D.W．Boyk in，J．Med．Chem．20，531-536(1977)が記述している合成法に従った。実施例１先駆化合物の調製２，５−ビス（ｐ−ブロモフェニル）フラン。ブロモベンゼンとフマリルクロリドからｔｒａｎｓ−ジ−ｐ−ブロモベンゾイルエチレンを調製する公知の製法を、文献から引用して使用した（J.B．Conant and R.E．Lutz，J．Am．Ch em．Soc．47，881（1925）を参照されたい）。エチレン化合物をＺｎ−ＨＯＡｃで還元して、１，４−ジ−ｐ−ブロモフェニル−１，４−ブタンジオンを造った（E．Campaigne and W.O．Foye，J．Org．Chem．17，1404（1952）を参照されたい）。飽和１，４−ジケトン（７．９ｇ，０．０２モル）を、ＡＣ₂Ｏ８０ｍＬ中に懸濁し、混合液を熱して還流させた。濃縮Ｈ₂ＳＯ₄（４〜５滴）を添加して、還流を５分間続けた。溶液をウオターアイス（１Ｌ）中に注ぎ入れて、良く攪伴して、濾過した。粗収量７ｇ（９３％）。酢酸で再結晶して、表記の化合物５．６ｇ（７５％）を得た。ｍｐは１９８〜１９９℃であった（文献では、R.E ．Lutz and W.M．Eisner，J．Am．Chem．Soc．56，2698（1934）mp 200〜201℃ ）。２，５−ビス（ｐ−シアノフェニル）フラン。２，５−ビス−（４−ブロモフェニル）フラン７．５ｇ（０．０２モル）と、Ｃｕ（ＣＮ）４ｇ（０．０４５モル）をキノリン４５ｍＬ中で混合した混合物を、２ｈ還流した。混合物を希釈ＨＣＬ液３００ｍＬに注ぎ入れて（注意：ＨＣＮが遊離する）濾過した。固体をＨ₂Ｏ、希釈ＮａＯＨ、希釈ＨＣＬで洗った後、再びＨ₂Ｏで洗った。固体ビス−ニトリルをアセトンで溶解し、濾過して無機残滓を除き、短いアルミナ・カラムを通過させて、微量の銅塩を取り除いた。銅塩はビス−アミジン類に移転すると精製が困難になるので、この時点で取り除いておかなくてはならない。銅塩は簡便な燃焼テストで存在を検出することができる。アルミナ・カラムから出る溶離液を蒸発させてから、エタノールで再結晶して、表記の化合物３．５ｇ（６５％）を得た。ｍｐは２９４〜２９５℃（dec.）であった。実施例２二塩酸２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フランの調製ジオキサン１００ｍＬと、アブソリュートエタノール２５ｍＬとの混液中に２，５−ビス（４−シアノフェニル）フラン（３ｇ、０．０１１モル）を入れ、５ ℃で乾性ＨＣｌガスによって飽和させた。溶液を耐圧瓶に入れ、３日間（室温）振盪した。中間産物として、塩酸イミダートエステルの黄色の固体が沈澱し、これを濾過して、室温により一晩真空乾燥した。塩酸イミダートエステルのＩＲスペクトルにニトリルによる吸収を認めなかったので、この塩酸イミダートエステルはキャラクタリゼーションを行うことなく直接使用した。塩酸イミダートエステル（３．５ｇ）をアブソリュートエタノール１００ｍＬ中に懸濁して懸濁液を造り、５℃で無水アンモニアにより飽和させた。懸濁液（耐圧瓶）を室温で３日間振盪した。この反応混液を濾過し、固体を乾燥した後、保温（warm）アブソリュートエタノール（約１．５Ｌ）中に溶解した。溶液を５℃で無水ＨＣＬによって酸性とし、室温の真空下で濃縮して、黄色の結晶２．５ｇ（６０％）を得た。アブソリュートエタノールで再結晶して、ｍｐを４００〜４０１℃（dec.）にした。実施例３２，５−ビス［４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール− ２−イル）フェニル］フランの調製実施例２の記述にしたがって合成した塩酸イミダートエステル２．１ｇ（０．００５モル）と、エチレンジアミン０．６ｇ（０．０１モル）とを、アブソリュートエタノール５０ｍＬ中に溶解した溶液を一晩還流した。形成された固体を濾過し、無水ＨＣＬで飽和したアブソリュートエタノールによって再結晶して、２，５−ビス［４−（２−イミダゾリニル）フェニル］フラン１．９ｇ（９０％）を得た。ｍｐは４０９〜４１０℃（dec.）であった。実施例４２，５−ビス［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−ピリミジン− ２−イル）フェニル］フランの調製上記の実施例２の記述にしたがって合成した塩酸イミダートエステルを、実施例３の記述と同様にして、１，３−プロパンジアミンと反応させて、２，５−ビス［４−（１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）フェニル］フラン（９０％）を得た。ｍｐは４３０〜４３１℃（dec.）であった。実施例５２，５−ビス［４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール− ２−イル）フェニル］フラン二塩酸二水和物の調製この化合物は製法を変えて２，５−ビス（４−シアノフェニル）フランから調製した。この反応では、ジニトリル（０．５ｇ、１．９ミリモル）、二塩酸エチレンジアミン（４．９ｇ、３７ミリモル）およびエチレンジアミン（２．５ｍｌ、３７ミリモル）を使用した。ジニトリル、二塩酸エチレンジアミンおよびエチレンジアミンの混合物を造り、３００〜３１０℃で１０分間保持した後、温水に溶解した。形成した黄色の結晶を冷却して分離した。この化合物を熱湯で再結晶した。表記の化合物の収量は２０８ｍｇ（２４％）であった。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ₃ ：ＣＨ₃ＯＨ：２５％ＮＨ₄ＯＨ＝１１：４：１、スポット一個）、ｍｐ＞３６０℃。Ｃ₂₂Ｈ₂₀Ｎ₄Ｏ・２Ｈ₂Ｏ（４６５．３７）の計算値：Ｃ、５６．７８；Ｈ、５．６０；Ｎ、１２．０４。測定値：Ｃ、５６．６９；Ｈ、５．６３；Ｎ、１２．０７。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ＴＭＳ）、δ４．０１（ｓ、８Ｈ）、７．４５（ｓ、２Ｈ）、８．０８（ｄ、４Ｈ、Ｈ＝８．３Ｈｚ）、８．１５（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、８．１５（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、１０．５０（ｂｒｓ、４Ｈ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ＴＭＳ）、δ４５．５、１１３．２、１２１．６、１２５．３、１３０．１、１３５．８、１５３．４、１６５．８。ＩＲ（ＫＢｒ）：ｖ３４１２、３１２３、２９７１、１６０８、１５８０、１４９１、１３６７、１２８７、１０３３、８５０、７４５、６７３。ＭＳ、ｍ／ｚ：３５６（遊離塩基(free base)）。実施例６２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ− １、３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン二塩酸半七水和物（hemiheptahydrate）の調製ビス−メトキシエタノールイミダートエステル（１ｇ、０．００２モル）と、１，４−ジアミノブタン（０．５ｇ、０．００５７モル）を、１、２−ジメトキシエタン１０ｍｌ中に入れて、２日間還流した。真空中で溶媒を取り除き、水を加えた。沈澱物を濾過し、水で洗い、真空オーブン中で乾燥させた（ｍｐ＞３００℃）。ビス−メトキシエタノールイミダートエステルと１，４−ジアミノブタンとの遊離塩基反応産物（free base reaction product）は、塩化水素のメタノール溶液（hydrogen choride in methanol）で塩酸塩に転換した（ｍｐ＞３００ ℃）。２Ｎ水酸化ナトリウムを用いて濾液を中和して、遊離塩基の半分を得た。遊離塩基の総収率は５１％であった。Ｃ₂₆Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ・２ＨＣｌ・３．５Ｈ₂Ｏ（５４８．５０）の計算値：Ｃ、５６．９３；Ｈ、６．８０；Ｎ、１０．２２。測定値：Ｃ、５６．９９；Ｈ、６．８０；Ｎ、１０．２６。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）、δ２．０２（ｓ、８Ｈ）、３．７１（ｓ、８Ｈ）、７．３８（ｓ、２Ｈ）、７．８６（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、８．０４（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、９．７７（ｓ、４Ｈ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ（ＣＨ₃）₃ＳｉＣＨ₂ ＣＨ₂ＣＯ₂Ｎａ）、δ２８．０、４７．０、１１３．９、１２６．５、１２９．７、１３１．２、１３７．０、１５４．５、１６７．１。ＩＲ（ＫＢｒ）、ｖ６８７、７４７、８１４、９３０、１３３１、１３６４、１４５９、１５９７、３００８、３１６４。ＭＳ（ＥＩ）、ｍ／ｚ（％ rel.int.）４１２（１００）（遊離塩基）、３８４（２３）、３５４（９）、３４０（１３）、２９８（１１）、２８４（２３）。実施例７２，５−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）− アミジノ］フェニル｝フランの調製乾性イソプロピルアミン（０．４７ｇ、０．００８モル）を、実施例２で説明したイミダートエステル（１．３ｇ、０．００３モル）をアブソリュートエタノール４５ｍｌに懸濁した懸濁液に加えた。０．５時間以内に、イミダートエステルは溶解して、イミダートエステルとイソプロピルアミンの混合物が発色した。約３時間後、白色の固体が沈澱した。スラリーを室温で一晩振盪した。減圧下で溶媒を除き、水で希釈、濾過して水で洗った。固体を乾燥後、エタノール／エーテル混液で再結晶して、白色の固体０．９ｇ（７８％）を得た。ｍｐは２３３〜４℃であった。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／６０℃）７．７９（ｂｒｓ、８Ｈ）、７．１１（ｓ、２Ｈ）、６．２５（ｂｒ、４Ｈ）、３．８１（ｂｒ、２Ｈ）、１．１４（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝５．９）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／６０℃）１５２．４、１４２．０、１３６．６、１３０．４、１２６．８、１２２．８、１０８．７、４３．５、２２．８。実施例８二塩酸２，５−ビス［４−Ｎ−イソプロピル）アミジノ）− フェニル］フランの調製実施例７で説明した通りに調製した遊離塩基０．７８ｇ（０．００２モル）を、アブソリュートエタノール１０ｍｌに溶解して、塩化水素で飽和したエタノール１０ｍｌによって処理した後、２時間加温した。この混合物の容積を５ｍｌまで減少させた。乾性エーテル２０ｍｌを加えて、鮮やかな黄色の沈澱物を沈澱させ、これを濾過、乾性エーテル３×５ｍｌで洗い、６５℃で２時間真空乾燥させて、表記の化合物０．８ｇ（８７％）を得た。ｍｐは２７６〜７℃（dec.）であった。ＩＲ（ＫＢｒ）、¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）９．７２（ｓ、１Ｈ）９．６９（ｓ、１Ｈ）、９．５７（ｓ、２Ｈ）、９．２４（ｓ、２Ｈ）、８．０６（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．１）、７．８６（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．１）、７．４２（ｓ、２Ｈ）、４．１４（ｓ、２Ｈ、Ｊ＝６．６）、１．２９（ｄ、１２Ｈ、Ｊ＝６．６）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）１６１．１、１５２．３、１３３．６、１２９．２、１２７．７、１２３．５、１１１．３、４５．１、２１．１。Ｃ₂₄Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ・２ＨＣｌ・１．２５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、５９．５７；Ｈ、６．７９；Ｎ、１１．５７。測定値：Ｃ、６０．００；Ｈ、６．８０；Ｎ、１１．５２。実施例９２，５−ビス［（４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニル）］−３−（４−トリルオキシ）フランの調製１−（４−トリルオキシル）−１，２−ビス（４−ブロモベンゾイル）エチレン。１，２−ジブロモ−１，２−ジ（４−ブロモベンゾイル）エタン（１１．１ｇ、０．０２モル）をＴＨＦ３５ｍｌ中に溶解した溶液に、ナトリウム４ −メチルフェノキシド懸濁液［Ｎａ０．９２ｇ（０．０４モル）と、４−メチルフェノール４．３２ｇ（０．０４モル）とを、ＴＨＦ３０ｍｌに懸濁し、４〜５時間還流させて調製］を添加した。この黄色の混合物を２〜３時間還流（続いてＴＬＣを実施）した後、減圧下でＴＨＦを取り除いた。残滓を水で処理して、固体を濾過し、水で洗い、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、クロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液をシリカ・カラム（エーテルの２〜５％ヘキサン溶液で溶出）に通した。その結果、薄い灰色の結晶状固体４．９５ｇ（５０％）を得た。ｍｐは１３７〜８℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）３０８７、３０３５、２８６８、１６８７、１６４６、１５８７、１５７２、１５５７、１５０２、１３９９、１３６４、１１９４、１０６８、１００９、９７１、８７６、８１５、７７２、５２６。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）７．９２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．６５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．５５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．４８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．２７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．１１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、６．３２（ｓ、１Ｈ）、２．４（ｓ、３Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）１８９．４、１８７．６、１６８．４、１５０．９、１３６．６、１３６．０、１３３．４、１３２．３、１３１．８、１３０．９、１３０．３、１２９．６、１２９．２、１２８．２、１２０．６、１０１．８、２０．９５。ＭＳｍ／ｅ５００（Ｍ⁺）。２，５−ビス（４−ブロモフェニル）−３−（ｐ−トリルオキシ）フラン。１−（４−トリルオキシ）−１，２−ビス−（４−ブロモベンゾイル）エチレン５．０ｇ（０．０１モル）を三塩化リン１０ｍｌに溶解した溶液を還流しながら３〜４時間加熱した（続いてＴＬＣ）。蒸留して過剰のＰＣｌ₃を除き、残滓を氷／水で粉砕した（発熱反応）。溶液をジクロロメタン（７５ｍｌ）で抽出して、ジクロロメタン層を飽和重炭酸ナトリウム溶液と水とで洗い、乾燥した（Ｎａ₂ ＳＯ₄）。減圧して溶媒を除いた。残滓の固体をシリカゲル上で、溶離液としてエーテル：ヘキサン（２：８〜１：１）を用いるクロマトフラフィを行った。その結果、薄い灰色の結晶状の固体２．７８ｇ（５６％）が得られた。ｍｐは９２〜３℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）２９３９、２８５１、１５６０、１５０６、１４６７、１３９０、１２０９、１０７２、１０６６、９４５、８２５、７０７、４８６。¹ＨＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）７．６９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．４６〜７．４３（ｍ、６Ｈ）、７．１２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、６．４７（ｓ、１Ｈ）、２．３１（ｓ、３Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）１５０．８、１５０．１、１４２．８、１３９．３、１３３．０、１３１．９、１３１．７、１３０．３、１２９．１、１２８．６、１２５．１、１２５．０、１２１．８、１２０．５、１１７．１、１０２．７、２０．６。ＭＳｍ／ｅ４８４（Ｍ⁺）。２，５−ビス（４−シアノフェニル）−３−（４−トリルオキシ）フラン。上記で調製したジブロモ化合物（２．５ｇ、０．００５１モル）とシアン化第一銅（１．８１ｇ、０．０２モル）とを、乾性Ｎ−メチル−２−ピロリドン８ｍｌ中で混合して、窒素雰囲気下約２００℃で２．５時間加熱し（続いてＴＬＣ）、冷却して、水２００ｍｌ中に注ぎ入れた。沈澱してきた固体を濾過し、水１００ｍｌ中に再懸濁して、１０％ＮａＣＮ１００ｍｌを加えて、混合物を３〜４時間攪伴した。このようにして得た固体を濾過し、水で洗い、アセトンを用いているソックスレー抽出器（soxlate device）に約２４時間置いた。アセトン抽出によって容積を減らし、中性アルミニウムの短いカラムを通過させ、溶離液を蒸発し、それによって得た固体をＣＨＣｌ₃：エーテル（２：８）で再結晶して、黄色の結晶状固体１．２ｇ（６２％）を得た。ｍｐは１９８〜９℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）３０６７、２２２３、１６１８、１３０３、１５０５、１４０２、１２２０、１１６９、１００８、９２６、８４０、８２０、６６８、５４６ｃｍ^-1 。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）７．９８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．７５（ｄ、２Ｈ、８．３）、７．６８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．６５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．１９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．０５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、６．６６（ｓ、１Ｈ）、２．３６（ｓ、３Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／３５℃）１５４．３、１５０．３、１４５．８、１３９．１、１３４．０、１３３．６、１３３．３、１３２．７、１３２．６、１３０．５、１２４．２、１２３．８、１１９．０、１１８．６、１１７．８、１１１．５、１１０．０、１０４．５、２０．７。Ｃ₂₅Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₂の計算値：Ｃ、７９．７６；Ｈ、４．２８；Ｎ、７．４４。測定値：Ｃ、７９．６８；Ｈ、４．３１；Ｎ、７．３９。ＭＳｍ／ｅ３７６（Ｍ⁺）。２，５−ビス［（４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニル）］−３−（４−トリルオキシ）フラン。上記で調製したビス− ニトリル［１ｇ（０．００２６モル）］を、アブソリュートエタノール２０ｍｌおよび０℃で乾性ＨＣＬガスにより飽和したアブソリュートジオキサン５０ｍｌ中に置いた。混合物を室温で攪伴しながら４日間放置した(allowed)。このようにして濃密な黄色の沈澱物を形成し、乾性エーテル１００ｍｌを加え、固体を濾過し、乾性エーテル１００ｍｌで洗い、２５℃で５時間真空乾燥して、塩酸イミダートエステル０．７８ｇ（６６％）を得た。イミダートエステルを乾性エタノール２５ｍｌ中に再懸濁し、エチレンジアミン０．３１ｇ（０．００５３モル）と共にゆっくりと還流させながら１２時間加熱した。蒸留して過剰のエタノールを除き、残滓を水で処理して、１ＭＮａＯＨを加え（攪伴冷却して）アルカリとした。黄色の沈澱物を濾過し、水で洗い、沸騰しているエタノールで再結晶して、表記の化合物０．６ｇ（７４％）を得た。ｍｐは１５６〜７℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）３２１８、２９２７、２８６２、１６０９、１５０６、１３９８、１２１８、１１０５、９８７、８４８、６６９ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ −ｄ₆／５０℃）７．９４〜７．８４（ｍ、８Ｈ）、７．２１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．１２（ｓ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７９）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、３．６２（ｓ、４Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／５０℃）１６３．０、１６２．９、１５４．３、１５０．４、１４２．８、１３９．０、１３２．４、１３０．８、１３０．４、１３０．１、１２９．７、１２８．５、１２７．５、１２７．４、１２３．２、１２２．６、１１６．５、１０４．０、４９．３、４９．２、１９．９。ＭＳｍ／ｅ４６２（Ｍ⁺）。ＨＣｌのエタノール溶液(ethanolic HCl)１０ｍｌ中に遊離塩基［０．５ｇ（０．００１モル）］を入れて、還流しながら３時間加熱した後、希釈した乾性エーテル５０ｍｌに添加した。このようにして得た黄色の沈澱物を濾過し、乾性エーテルで洗い、８０℃で２４時間真空乾燥して、Ｃ₂₉Ｈ₂₆Ｎ₄Ｏ₂・２ＨＣｌ０．４８ｇ（９０％）を得た。ｍｐは＞３００℃であった。Ｃ₂₉Ｈ₂₆Ｎ₄Ｏ₂・２ＨＣｌの計算値：Ｃ、６５．０４；Ｈ、５．２７；Ｎ、１０．４６。測定値：Ｃ、６４．８３；Ｈ、４．９９；Ｎ、１０．２２。ＩＲ（ＫＢｒ）３４２２、３２３５、２９６４、２７７５、１６０９、１５０６、１３７０、１２８９、１２０６、８４８、６６７ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／６０℃ ）７．９８〜７．８６（ｍ、８Ｈ）、７．１９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７９）、７．０９（ｓ、１Ｈ）、７．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、３．８８（ｓ、４Ｈ）、３．７６（ｓ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、３Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ− ｄ₆／Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／６０℃）１６５．３、１６５．３、１５４．７、１５１．２、１４５．７、１３９．５、１３４．３、１３４．２、１３５．１、１３１．２、１２９．６、１２９．５、１２４．８、１２４．１、１２３．３、１２１．６、１１７．７、１０６．０、４５．８、４５．６、２０．７。実施例１０２，５−ビス［４−（２−テトラヒドロ−ピリミジニル）フェニル］３−（４−トリオキシ）フランの調製イミダートエステル（１．０８ｇ、０．００２モル）と新しく蒸留した１，３ −ジアミノプロパン（０．４３ｇ、０．００６モル）を、アブソリュートエタノール３０ｍＬ中で攪伴した混合物を、還流しながら（湿気を防ぎ）１２時間ゆるやかに加熱した。減圧して過剰のエタノールを除き、残滓を蒸留水５０ｍＬで滴定した。混合物を冷やして攪伴しながら１ＭＮａＯＨ（ｐＨ１０）を加えてアルカリとし、沈澱した遊離塩基を濾過し、水で洗って乾燥し、加熱エタノールで再結晶して、目的の化合物０．８０ｇ（８１．６％）を得た。ｍｐは１９０〜１９１℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３２６７、２９３１、２８５８、１６０９、１５０５、１３６９、１２１６、８４６、６６６ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ− ｄ₆／５０℃）７．８８〜７．７８（ｍ、８Ｈ）、７．２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．１２（ｓ、１Ｈ）、７．０７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、３．３８（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝５．１）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、１．７５（ｔｔ、４Ｈ、Ｊ＝５．１）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／５０℃）１５４．４、１５３．８、１５３．４、１５０．５、１４２．８、１３９．０、１３４．５、１３２．９、１３２．４、１３０．６、１３０．３、１３０．３、１２６．８、１２６．７、１２３．１、１２２．５、１１６．６、１０４．１、４１．０、４０．８、２０．０、１９．８；ＭＳｍ／ｅ（Ｍ⁺）。遊離塩基０．５ｇ（０．００１モル）をアブソリュートエタノール５ｍＬに懸濁した懸濁液を、ＨＣｌのエタノール溶液(ethanolic HCl)１０ｍＬで処理して、ゆるやかに還流させながら２時間加熱し、乾性エタノール５０ｍＬを加えた。このようにして得た黄色の沈澱物を濾過し、乾性エーテルで洗って、６０℃で１２時間真空乾燥した。黄色の固体の収量は０．４６ｇ（８２％）であった。Ｍｐは＞３２０℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２３、３１１７、３００２、１６３８、１６０９、１５０７、１３７５、１３１５、１２０２、８４６、６６９ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／６５℃）８．１２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．８）、８．０８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．３）、７．８８（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．３２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．２２（ｓ、１Ｈ）、７．１６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、３．６（ｂｒ、ｍ、８Ｈ）、２．３７（ｓ、３Ｈ）、２．１（ｂｒ、ｍ、４Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／６５℃）１５９．５、１５４．８、１５１．１、１４５．１、１４０．９、１３９．６、１３４．１、１３３．９、１３３．５、１３３．２、１２８．７、１２８．５、１２７．２、１２４．８、１１７．６、１０５．９、４１．５、４１．４、２０．６、１８．２。Ｃ₃₁Ｈ₃₀Ｎ₄Ｏ₂・２ＨＣｌの計算値：Ｃ、６６．０６；Ｈ、５．３６；Ｎ、９．９４。測定値：Ｃ、６５．９１；Ｈ、５．２１；Ｎ、９．８８。実施例１１２，５−ビス［４−（２−イミダゾリニル）フェニル− ３−メトキシ−フランの調製１，２−ビス（４−ブロモベンゾイル）−１−メトキシエタン。１，２ −ジブロモ−１，２−ジ（４−ブロモベンゾイル）エタン（１１．１ｇ、０．０２モル）を乾性メタノール１５０ｍＬに溶解した溶液に、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（メタノール５０ｍＬにナトリウム０．９２ｇ）を添加した。黄褐色の混液を１〜１．５時間還流した。蒸留して溶媒を除き、残滓を水に懸濁して、混液をクロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム抽出物を水で洗って、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。このようにして得た残滓を乾性メタノール−エーテル（３：１）で滴定して、目的の化合物である薄い灰色の結晶状固体６．６ｇ（７８％）を得た。ｍｐは１５３〜１５４℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３１０６、３０６２、２９３２、１６８９、１６４９、１５８３、１５５６、１４０３、１２２３、１２０２、１１８２、１０８６、１０１０、１０００、８５７、８１４、７３８、６１８、４７２ｃｍ^-1。¹Ｈ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／４０℃ ）：７．９５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．８）、７．７７（４Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．７２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．８）、６．８９（ｓ、１Ｈ）、４．０３（ｓ、３Ｈ）。¹³Ｃ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／４０℃）：１８９．９、１８７．２、１６８．８、１３９．９、１３５．９、１３３．１、１３２．２、１３１．８、１３０．３、１２８．１、１２７．４、９８．６、５８．５。ＭＳｍ／ｅ４２４（Ｍ⁺）。２，５−ビス−［４−ブロモフェニル］−３−メトキシ−フラン。上記で調製したメトキシメタンをＰＣｌ₃５ｍＬに溶解して、還流しながら３時間加熱した。蒸留して過剰のＰＣｌ₃を除いた。氷と水で処理すると、残滓がゴム状の塊となった。この混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を水で洗って乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）させた後、ヘキサン：エーテル（４：１〜２：１）を用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィにより精製した。このようにして目的とする化合物である薄い灰色の固体を得た。収率は６２％であった。ｍｐは１１２〜１１３ ℃であった［文献上のｍｐは１１３℃；R.E．Lutz，J．Am．Chem．Soc．51，300 8(1929)］。ＩＲ（ＫＢｒ）：３０６２、２９０８、２８７７、１６１７、４９０、１３９１、１２１１、１１６０、１０９９、１０７３、１０３４、１００６、９２５、８２７、７８７。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣ₁₃）７．６９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、７．６７．５（ｍ、４Ｈ）、７．４７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８）、６．６４（ｓ、１Ｈ）、３．９（ｓ、３Ｈ）。¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃）１４９．７、１４７．５、１３５．５、１３１．９、１３１．５、１２９．４、１２９．３、１２５．０、１２４．５、１２１．５、１１９．３、９８．６、５８．６。ＭＳｍ／ｅ４０８（Ｍ⁺）。２，５−ビス（４−シアノフェニル）−３−メトキシフラン。２，５− ビス（ブロモフェニル）−３−メトキシフラン（４．０８ｇ、０．０１モル）とシアン化第一銅（３．０９ｇ、０．０３５モル）を、乾性Ｎ−メチル−２−ピロリドン１０ｍＬ中に入れた混合物をＮ₂の存在下約２００℃で２．５時間加熱した。この混合物を冷却し、水２００ｍＬ中に注ぎ入れ、沈澱した黄褐色の固体を濾過し、水で完全に洗った。この固体を水（５０ｍＬ）と１０％ＮａＣＮ１００ｍＬとに再懸濁し、２時間攪伴した。スラリーを濾過し、水で洗って乾燥、アセトン２５０ｍＬに懸濁して、中性アルミナカラムを通過させた。アセトンで溶出させて、黄色の固体を得た。さらに、ＣＨＣｌ₃：エーテル（１：１）で再結晶して、目的の化合物を得た（１．８ｇ、６０％）。ｍｐは２５７〜２５８℃であった。ＩＲ（ＫＢｒ）３１２８、２２２３、１６０８、１５９９、１５０１、１４０９、１１７４、１１６３、１０２７、９２４、８３６、８１５、６５１、５３７、ｃｍ^-1。¹Ｈ（ＤＭＳＯ／４５℃）８．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．９５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７９）、７．９１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３）、７．８５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７９）、７．６２（ｓ、１Ｈ）、４．０（ｓ、３Ｈ）。¹³ Ｃ（ＤＭＳＯ／４５℃）１５０．０、１４９．８、１３４．６、１３３．４、１３３．２、１３２．７、１３２．５、１２４．０、１２２．７、１１８．９、１１８．５、１１０．０、１０７．６、１０２．４、５９．０。ＭＳｍ／ｅ３００（Ｍ⁺）。Ｃ₁₉Ｈ₁₂Ｎ₂Ｏ（３００．３１）の計算値：Ｃ、７５．９８；Ｈ、４．０３；Ｎ、９．３３。測定値：Ｃ、７６．０２；Ｈ、４．０４；Ｎ、９．３６。２，５−ビス［４−（２−イミダゾリニル）フェニル］−３−メトキシ−フラン。上記で調製したビス−ニトリル（０．９ｇ、０．００３モル）を乾性エタノール７０ｍＬ中に懸濁し、０〜５℃で乾性ＨＣｌガスにより飽和した後、乾燥条件下で３〜４日間攪伴した。この混合物を乾性エーテル２００ｍＬで希釈し、黄色のアミダートエステルを濾過し、乾性エーテルで洗い、形成された固体が１．２ｇ（８６％）となるまで５〜６時間真空乾燥した。固体を乾性エタノール３０ｍＬに再懸濁して、乾性エチレンジアミン０．４６ｇ（０．００８モル）と共にゆるやかに１２時間還流させた。蒸留して溶媒を除いた。残滓を冷水５０ｍＬに懸濁し、１ＭＮａＯＨでアルカリとした。黄色の沈澱物を濾過し、水で洗って乾燥した後、エタノール−エーテル混液で再結晶して、目的とする化合物０．７４ｇ（７５％）を得た。ｍｐは１８６〜１８７℃（dec.）であった。ＩＲ（ＫＢｒ）３４４４、３２４５、２９３１、２８５７、１６０１、１５１２、１３９７、１３６６、１２７７、１１６２、１１０４、１０３１、９２６、８４２、７４３、６７０ｃｍ^-1。¹Ｈ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／６０℃）７．９３〜７．８６（ｍ、８Ｈ）、７．３２（ｓ、１Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）、３．６９（ｓ、４Ｈ）、３．６７（ｓ、４Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／６０℃）１６３．３、１６３．１、１５０．０、１４８．６、１３８．３、１３４．７、１３１．９、１３１．３、１２８．９、１２７．６、１２６．１、１２３．０、１２１．９、１００．６、５８．７、４９．０、４８．５。ＭＳｍ／ｅ３８６（Ｍ⁺）。遊離塩基０．５８ｇ（０．００１５モル）を加熱エタノール１０ｍＬに溶解し、ＨＣｌの飽和エタノール溶液（sat．ethanolic HCL）１０ｍＬで処理した。混液を還流させながら３０分間加熱した。真空中で容積を５〜６ｍＬとなるまで減少させた。このように処理した混液を乾性エーテルで希釈して６０ｍＬとした。これにより得た黄色の結晶状固体を濾過し、乾性エーテルで洗って６０℃で１２時間真空乾燥して、目的の化合物０．６２ｇ（８３％）を得た。ｍｐは１８９〜１９０℃（dec.）であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２２、３１２８、２９７５、１５９９、１５１０、１４０５、１３６３、１２８５、１２０７、１０２８、８４５、６６６ｃｍ^-1。¹Ｈ（Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／５０℃）７．５２〜７．４３（ｍ、８Ｈ）、６．８７（ｓ、１Ｈ）、３．９２（ｓ、３Ｈ）、３．８６（ｓ、８Ｈ）。¹³Ｃ（Ｄ₂Ｏ／ＴＳＰ／５０℃）１６７．２、１５３．１、１５２．４、１３７．６、１３７．２、１３０．９、１３０．７、１２６．５、１２５．４、１２２．１、１１９．８、１０４．２、６１．５、４７．０、４６．９。Ｃ₂₃Ｈ₂₂Ｎ₄ Ｏ₂_０．５Ｈ₂Ｏ−２ＨＣｌの計算値：Ｃ、５８．９７；Ｈ、５．３８；Ｎ、１１．９６。測定値：Ｃ、５９．１６；Ｈ、５．３５；Ｎ、１１．８０。実施例１２２，５−ビス［４（Ｎ−シクロ−プロピルグアニル）フェニルフランの調製イミダートエステル（１．３ｇ、０．００３モル）とシクロプロピルアミノ（０．４３ｇ、０．００７５モル）とを乾性エタノール３５ｍＬ中で混合した混合物を一晩攪伴した。真空中で溶媒を除き、水を加えて黄色の溶液とした。溶液を冷却攪伴しながら１ＭＮａＯＨを加えてアルカリとした。これにより形成した固体を濾過し、水で洗って乾燥した。固体をクロロホルムに溶解し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥した後、溶媒を除いた。残滓をエーテル：ＣＨＣｌ₃（５：１）で再結晶して、淡黄色の固体０．８ｇ（７０．９％）を得た。ｍｐは１８５〜１８６ ℃（dec.）であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３４６４、３３２０、３０８０、１６１０、１５１０、１３６４、１０２２、８４８、７９１ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣ₁₃）：７．７１（ｂｒｓ、８Ｈ）、６．７８（ｓ、２Ｈ）、５．３（ｖｂｒ、４Ｈ）、２．６（ｂｒｍ、８Ｈ）、０．８７〜０．８１（ｍ、４Ｈ）、０．６７〜０．６２（ｍ、４Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣ₁₃＋ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１５９．６、１５２．２、１３４．８、１３０．７、１２６．４、１２２．６、１０７．７、２５．７、６．０４。ＭＳｍ／ｅ３８８（Ｍ⁺）。遊離塩基（０．６ｇ、０．００１５モル）を乾性メタノール３ｍＬに懸濁し、ＨＣｌのエタノール溶液(ethanolic HCL)６ｍＬで処理して、６５℃で１時間ゆるやかに加熱した。この黄色の溶液を乾性エーテル５０ｍＬで希釈して、濾過し、乾性エーテルで洗った後、７５℃で１２時間真空乾燥した。このようにして目的の化合物である黄色の固体０．５５ｇ（８０％）を得た。ｍｐは＞３１０℃（ dec.）であった。ＩＲ（ＫＢｒ）：３３６９、３１８１、３０３７、１６６５、１６０７、１５０２、１０３２、７８２、６７４ｃｍ^-1。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ −ｄ₆）：１０．２４（ｓ、２Ｈ）、９．８６（ｓ、２Ｈ）、９．２７（ｓ、２Ｈ）、８．０６（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝７．９４）、７．９５（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝８．５４）、７．４２（ｓ、２Ｈ）、２．８７（ｂｒｍ、２Ｈ）、１．０９〜０．８５（ｍ、８Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１６３．９、１５２．３、１３３．７、１２９．１、１２６．６、１２３．５、１１１．３、２４．７、６．５。Ｃ₂₄Ｈ₂₄Ｎ₄Ｏ−２ＨＣｌの計算値：Ｃ、６３．０２；Ｈ、５．７３；Ｎ、１２．２５。測定値：Ｃ、６２．８９；Ｈ、５．９５；Ｎ、１２．００。実施例１３蛍光検出用サンプルの調製化学薬品ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８およびジスタマイシン（distamycin）は、シグマ化学会社から入手した。サンプルの由来ジアルジア・ラムブリア(Giardia lamblia)は、前報の記述(C.A．Bell，et al.，Agents and Chemother．37，2668-2673(1993))通りに標準方法により培養、冷却して細菌培養チューブから取り出して、ハンクス（シグマ化学会社が市販しているHanks Balanced Salt Solution）緩衝液（ＨＢＳＳ^- ）で洗った。この細菌を染料と共に５分間インキュベートし、ハンクス緩衝液で一度洗った後、顕微鏡にセットした。ヒト・リンパ球から標準方法により中期クロモソーム塗抹平板を作成した。染料はすべて、ＤＡ（distamycin）／ＤＡＰＩによるＣバンドの染色標準法［O．Miller，Principles and Practices in Med ical Genetics（Longman Group Limited，New York 1983）および D．Silvonen ，ACT Cytogenetic Lab Manual（University of California，San Francisco(19 80)］に従って染色した。特に、ＤＡＰＩで染色する場合、スライドは緩衝液、それもマキルベイン緩衝液(MacIlvaine's buffer)（ｐＨ７．５）に約１０分間浸した。（マキルベイン緩衝液は、無水クエン酸溶液（０．２Ｍ、１９．２ｇ／リットル）と、無水第二リン酸ナトリウム（anhydrous sodium phosphate dibasic）（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）（０．２Ｍ、２８．４ｇ／リットル）とを混合する公知の方法で調製することができる）。スライドをＤＡＰＩ（０．２μｇ／ｍｌ）で約１０分間染色して、マキルベイン緩衝液で洗浄した。式（Ｉ）の化合物で染色する場合は、スライドを化合物０．０２μｇ／ｍｌで染色する以外は、全く同様の方法に従った。実施例１４核酸の検出ハンクス緩衝液（HBSS^-buffer）あるいは、グリセロールのいずれかでスライドを塗り、その上に組織を置いて、カバーガラスで覆った。特別の資材は必要ではなかった。ニコン写真顕微鏡に、ＵＶレンズ（３６０ｎｍ励起光用と４６０ｎｍ発光用フィルターが付いているもの）とネオフロロレンズ(neofluor lens)を装着して、サンプルを観察した。エクタクローム１６００ＡＳＡフイルムか、テクニカルパンＡＳＡ黒白フィルムのどちらかで画像を撮影した。露出時間は０．１〜５秒であった。Ｇ．ラムブリアの核を式（Ｉ）の染料で染色したものを、ＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８のものとを写真で比較する。ＤＮＡ特異性が高い染料である、２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１、３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フランでは、ジアルジア細胞質のバックグラウンド染色がなく、ＲＮＡや細胞骨格成分と結合しないことを示していた。ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８および２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フランでは、ジアルジア細胞質が顕著に染色されているのが観察された。ＤＡＰＩと２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フランは、微小管構造と繊維状構造までもはっきりと染色していた。これまでに、ＤＡＰＩはチューブリンや微小管を染色することもあることが報告されていた（D．Bonne，et al.，J．Biol．Che m．260，2819-2825(1985)）が、これらの著者らは無傷の繊維芽細胞ではこの染色を観察することはできなかったとも報告していた。これらの写真は、ジアルジアにおいては、ＤＡＰＩはチューブリンを含む構造成分を染色し、また核酸の染色の場合には、コントラストがどぎつくなる（intense staining）ことを示している。ジアルジアの他に、ヒト中期クロモソームも式（Ｉ）の化合物で染色して、ＤＡＰＩと比較検討した。このＤＡＰＩは、クロモソームの１、９、１５、１６およびＹ上で「Ｃバンド」を形成するクロモソームのＡＴリッチ(AT-rich)領域のマーカーの検査用として広く使用されている（O．Miller，Principles and Prac tices in Medical Genetics(Longman Group Limited，New York 1983)。フラン染料である、２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトロヒドロ−１Ｈ１，３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン、２，５−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）アミジノ］フェニル｝フラン、および２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フランの染色パターンは、ＤＡＰＩのそれと実質的に同様であった。フラン染料の発光は、ＤＡＰＩの発光とは僅かに異なる波長の青色の光である。このため、光の散乱度がＤＡＰＩで観察されるものより低く、より詳しく観察(delineate more detail)できるようなる可能性がある。さらに、フラン染料では、取扱や貯蔵に特別のマニュアルを必要としない。また、上記以外の細菌、イースト、植物、や組織培養細胞など、数多くの種類の組織を用いて,ジカチオンフラン類の検討を重ねた。どの場合でも、ジカチオンフラン類のＤＮＡ検出感度はＤＡＰＩのそれに匹敵するばかりでなく、濃い青色光とＤＮＡ特異特性によって、より詳しい観察が可能となる(can elucidate m ore detail)利点を有する。実施例１５結合による核酸の測定式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物を除き、従来から核酸に対する染料の結合親和力が説明されている［W.D．Wilson，et al.，Biochemistry 3，4098-4104(1 993); W.D．Wilson，et al.，Molecular Basis of Specificity in Nucleic Aci d-Drug Interactions（Kluwer Academic Publishers，Amsterdam 1990）pp．331 -353］。他の化合物と同様にして、式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物の核酸結合パラメーターを測定した。特に、ＡｐｐｌｅＩＩｅマイクロコンピューターと連動させたＣａｒｙ２１９分光光度計を用いて、熱融解（Ｔｍ）実験を行い、核酸結合パラメーターを測定した。Ｃａｒｙの温度は、ＨａａｋｅＡ８１冷却浴に連結したＨａａｋｅＰＧ２０プログラマーによって制御した。ＨａａｋｅＡ８１冷却浴は温度が毎分０．５℃上昇するように設定した。温度のモニターには、サーミスターを照合キュベットに固定したものを使用した。ＲＮＡポリマーのポリ（Ａ）・ポリ（Ｕ）と、これに対応する配列を持つＤＮＡポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＴ）によって、Ｔｍを比較した。長さ１ｃｍ経路の換算体積を持つクオーツ・セル（1 cm path length reduced volume quartz cells）に、緩衝液１ｍＬを置きこれにポリマーを添加し、２６０ｎｍで吸光度を測定して濃度を決定した。実験は一般に、ＤＮＡ塩基対濃度は５×１０^-5Ｍ、および化合物／塩基対の比率は０．６で行った。化合物のＴｍ（△Ｔｍ＝錯体のＴｍ−遊離核酸のＴｍ）の上昇によって、化合物を比較した。表ＩはＤＮＡとＲＮＡに対する親和力について、蛍光染料２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フラン（ＤＢ７５）；２，５−ビス［４−（４、５、６、７−テロラヒドロ−１Ｈ−１、３−ジアゼピン−２−イル）フェニル］フラン（ＤＢ１６１）；２，５−ビス｛［４−（Ｎ−イソプロピル）アミジノ］フェニル｝フラン（ＤＢ１８１）；および２，５−ビス［４−（１、４、５、６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）フェニル］フラン（ＤＢ１０３）と、化合物ＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８とを比較したものである。実施例１６スペクトルの測定ＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合と存在しない場合について、シマズ複光束光度計により染料の吸収極大を観測した。また、染料の蛍光励起と発光極大をＬＫＢ蛍光計により測定した。これらの吸収極大、励起係数、励起極大、および発光極大を下記の表ＩＩに示す。実施例１７細胞骨格成分の検出サンプルを用意し、これらのサンプルを次の化合物：ＤＢ９９、ＤＢ１５４およびＤＢ１５５で染色したこと以外は、実施例９および１０と同様にして観測を行った。撮影した写真は、化合物ＤＢ９９、ＤＢ１５４、およびＤＢ１５５が、Ｇ．ランブリアの細胞骨格成分、すなわち、微小管構造または繊維状構造を染色することを示している。上記の実施例は本発明の説明のためになされたものであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。本発明の範囲は下記の請求の範囲によって定められており、同等物はこの範囲に入るものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 21/78 0276−2ＪＧ０１Ｎ 21/78 Ｃ 33/50 0276−2Ｊ 33/50 Ｐ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダイクストラ，クリスティン・シーアメリカ合衆国、27516 ノース・キャロライナ、チャペル・ヒル、ペニントン・ドライヴ 203 (72)発明者ティドウェル，リチャード・アールアメリカ合衆国、27514 ノース・キャロライナ、チャペル・ヒル、ジ・オークス 1806 (72)発明者ボイキン，デイヴィッド・ダブリューアメリカ合衆国、30306 ジョージア、アトランタ、スプリングデイル・ロード・エヌ．イー． 1369 (72)発明者ウィルソン，ダブリュー・デイヴィッドアメリカ合衆国、30307 ジョージア、アトランタ、ダイソン・ドライヴ 1669 (72)発明者スピカラ，ヤロスラフポーランド国、60−241 ポズナニ、パラオザ 18エイ、エム．313 (72)発明者ダス，バイヤン・ピーアメリカ合衆国、30306 ジョージア、アトランタ、チャルメット・ドライヴ 1364 (72)発明者クマール，アルヴィンドアメリカ合衆国、30329 ジョージア、アトランタ、ビュフォード・ハイウェイ 3500、アパートメントエイチ５

Claims

【特許請求の範囲】１．次の（ａ）および（ｂ）からなる核酸を蛍光により検出する方法。（ａ）該核酸を次の式（Ｉ）の化合物または、生理的に許容できる塩と接触させること。式中、Ｒ₁およびＲ₂はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキルまたはアルキルアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁およびＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、あるいは、Ｒ₁およびＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるかまたはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ₁₆とがＨおよび低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基であり、式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばれ、Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルである。（ｂ）該核酸を式（Ｉ）の該化合物が蛍光を発光できる光に暴露すること。２．上記核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。３．上記核酸がＲＮＡである請求項１に記載の方法。４．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。５．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。６．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。７．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。８．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。９．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。１０．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。１１．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。１２．Ａが次の構造式で表される請求項１に記載の方法。１３．Ｒ₁とＲ₂の二つが次の式で表される請求項１に記載の方法。式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるかＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅ とＲ₁₆がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ ＮＲ₁₅Ｒ₁₆である。１４．Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₄アルキレンを表し、Ｒ₃はＨである請求項１に記載の方法。１５．Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₄アルキレンを表し、Ｒ₃はＨである請求項１に記載の方法。１６．Ｒ₁とＲ₃はＨであり、Ｒ₂は低級アルキルである請求項１に記載の方法。１７．Ｒ₂はイソプロピルである請求項１６に記載の方法。１８．上記化合物が次からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。２，５−ビス（４−アミジノフェニル）フラン、２，５−ビス［４−（４、５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾイル−２−イル）フェニル］フラン、２，５−ビス［４−（１，４，５，６−テロラヒドロピリミジン−２−イル）フェニル］フラン、２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアセピン−２−イル）フェニル］フラン、２，５−ビス［４−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニルフランおよび、これら化合物の生理的に許容できる塩。１９．上記式（Ｉ）の化合物が２，５−ビス［４−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアセピン−２−イル）フェニル］フラン、またはその生理的に許容できる塩である請求項１に記載の方法。２０．上記式（Ｉ）の化合物が２，５−ビス［４−（Ｎ−イソプロピルアミジノ）フェニル］フラン、またはその生理的に許容できる塩である請求項１に記載の方法。２１．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₃アルキレンを表し、Ｒ₃はＨであり、Ａは次の基である、式中、Ｒ₄はＨであり、Ｒ₅はＲがＨまたは低級アルキルであるＯＣＨ₃、またはＯ（Ｃ₆Ｈ₄）Ｒである。２２．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂直鎖の飽和アルキレンを表し、Ｒ₃はＲ₁₄が低級アルキルである−Ｒ₁₄ＯＨであり、Ａは次の基であり、式中、Ｒ₄とＲ₅とは各々Ｈである。２３．Ｒ₁₄が−（ＣＨ₂）₂−である請求項２２に記載の化合物。２４．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₄アルキレンを表し、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、またはアルキルアミノアルキルであり、Ａは次の基であり、式中、Ｒ₄およびＲ₅はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、またはオキシアリールアルキルからなる群から選ばれる。２５．Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅がＨである請求項２４に記載の化合物。２６．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨであり、Ｒ₃はイソプロピルであり、Ａは次の基であり、式中、Ｒ₄およびＲ₅は各々Ｈである。２７．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨであり、Ｒ₃は−（ＣＨ₂）₃Ｎ（ＣＨ₃）₂であり、Ａは次の基であり、式中、Ｒ₄およびＲ₅は各々Ｈである。２８．次の式（Ｉ）で表される化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ¹⁶がＨおよび低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨであり、Ａは次の基であり、式中、Ｒ₄およびＲ₅は各々Ｈである。２９．ＤＮＡとＲＮＡを含有する核酸混合物から蛍光により選択的にＤＮＡを検出する次の（ａ）および（ｂ）からなる方法。（ａ）該核酸混合物を次の式（Ｉ）の化合物、またはその生理的に許容できる塩に接触させる。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、またはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ₁₆がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基であり、式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばれ、Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、またはアミノアルキルである。（ｂ）該核酸混合物を式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光できる光に暴露すること。３０．次の（ａ）および（ｂ）からなる蛍光により微小管構造を検出する方法。（ａ）該微小管構造を次の式（Ｉ）の化合物、またはその生理的に許容できる塩に接触させる。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、またはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ₁₆がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基であり、式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばれ、Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、またはアミノアルキルである。（ｂ）該微小管構造を式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光できる光に暴露すること。３１．微小管構造が細胞の細胞骨格に存在している請求項３０に記載の方法。３２．第一の細胞構造と第二の細胞構造とが互いに異なる細胞から、該第一の細胞構造と該第二の細胞構造とを蛍光により同時に検出する次の（ａ）および（ｂ）からなる方法。（ａ）該細胞を第一の蛍光化合物および第二の蛍光化合物、またはその生理的に許容できる塩に接触させ、該第一の蛍光化合物は該第一の構造に選択的に結合し、該第二の蛍光化合物は該第二の構造に選択的に結合し、さらに該第一の蛍光化合物と該第二の蛍光化合物の蛍光発光スペクトルは互いに異なり、さらにまた、該蛍光化合物各々は次の式（Ｉ）で表される構造を持っている。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、またはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ₁₆がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基であり、式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばれ、Ｒ₁₂は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、またはアミノアルキルである。（ｂ）該細胞を該第一の蛍光化合物と該第二の蛍光化合物とが蛍光を発光できる光に暴露して、該第一の細胞構造と該第二の細胞構造に異なる蛍光発光スペクトルにより蛍光を発光させること。３３．上記第一の細胞構造と上記第二の細胞構造がＤＮＡ、ＲＮＡ、および微小管構造からなる群から選ばれる請求項３２に記載の方法。３４．次の（ａ）および（ｂ）からなる細胞構造の蛍光検出用キット。（ａ）次の式（Ｉ）の化合物、またはその生理的に許容できる塩。式中、Ｒ₁とＲ₂はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルからなる群から各々別個に選ばれるか、Ｒ₁とＲ₂の二つでＣ₂〜Ｃ₁₀アルキレンを表すか、またはＲ₁とＲ₂の二つで次の基を形成し、式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₁₀はＨであるか、またはＲ₁₁が低級アルキルであり、Ｒ₁₅とＲ₁₆がＨと低級アルキルからなる群から各々別個に選ばれる−ＣＯＮＨＲ₁₁ＮＲ₁₅Ｒ₁₆であり、Ｒ₃はＨ、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキルであり、Ａは次からなる群から選ばれるヘテロ環式芳香族の基であり、式中、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はＨ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリールまたはオキシアリールアルキルからなる群から各々別個に選ばれる。（ｂ）該式（Ｉ）の化合物が核酸を含むサンプルに接触するとき、該化合物のラベルを付けた核酸混合物を形成するに充分な量の溶媒。光に暴露されて該式（Ｉ）の化合物が蛍光を発光することにより、上記式（Ｉ）の化合物による蛍光検出が可能となる。