JP2003509528A - 赤色発光［８，９］ベンゾフェノキサジン核酸色素およびそれらの使用のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 種々の状況における核酸を染色するのに有用な赤色発光蛍光［８，９］ベンゾフェノキサジン色素の新規なクラスが提供される。これらの状況として、溶液中、電気泳動ゲルまたは他のマトリクス中、ブロッティング実験中およびインタクトな生細胞を使用するアッセイ中が挙げられる。この新規な色素は、現在利用可能な赤色発光生細胞核酸染色より、鮮やかであり、かつ迅速に浸透する。本発明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、親［８，９］ベンゾフェノキサジン環に結合した脂肪族カチオン性鎖によって特徴付けられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （１．発明の分野） 本発明は、核酸を染色、標識および／または検出するのに有用な蛍光赤色発光
［８，９］ベンゾフェノキサジン色素に関する。

【０００２】 （２．発明の背景） 基本的研究の多くの領域は、迅速かつ敏感に核酸を検出する能力から利益を得
る。例えば、生命科学研究の多くの分野（生物学的研究、生医学的研究、遺伝的
研究、発酵、養殖漁業、農業、法医学研究および環境研究を含む）において、標
準的実験方法の慣用的成分として細胞内および細胞を含まない核酸の両方を同定
する必要がある。一般的な例は、核酸を特徴付けるためのゲル電気泳動の広範な
使用であり、この１つの限界は、核酸バンドを検出するために使用される染色方
法の感度である。

【０００３】 生命医学において、研究者らおよび技術者らは、しばしば、細胞内核酸を同定
および／または細胞内に存在する核酸の量に基づく細胞を識別する必要がある。
存在する核酸の量は、細胞の型、または細胞（有核ヒト赤血球）内の疾患状態の
存在でさえも示し得る。このような適用は、細胞膜によって結合される（または
、囲まれる）場合でさえ、核酸を検出し得る迅速で感受性でかつ選択的な方法を
必要とする。

【０００４】 一般に、広範な適用にわたって核酸を染色するために適用可能な色素は、好ま
しくは、以下の特性を有する： ｉ）核酸−色素複合体は、少量の核酸が、細胞を含まないアッセイおよび細胞
ベースのアッセイの両方において敏感に検出され得るように、低バックグラウン
ドを有する非常に高いシグナルを生成すべきである；および ｉｉ）核酸−色素複合体が、この蛍光シグナルが有意な光脱色なしに観察、モ
ニターそして記録され得るように光安定性であるべきである。

【０００５】 細胞（特に、生細胞）内の核酸を染色する工程を包含する適用に対して、色素
は、好ましくは以下のさらなる特性を有するべきである。

【０００６】 ｉｉｉ）この色素が、それが細胞内に隔離された核酸を結合し得るように細胞
膜に対して浸透性であるべきである； ｉｖ）この膜浸透速度が、検出可能なシグナルがこの色素に対する比較的短時
間の曝露の際に得られ得るように比較的迅速でなければならない；および ｖ）この色素が、染色が細胞の正常な代謝プロセスを乱さないか、または早発
性細胞死を引き起こさないように、生細胞に対して非毒性であるべきである。

【０００７】 細胞を含まないアッセイおよび／または細胞内アッセイにおいて核酸を染色す
るのに有用な種々の色素が、記載されている。例えば、核酸を染色するのに有用
な種々の非対称シアニン色素（Ｂｒｏｏｋｅｒら、１９４２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．６４：１９９）およびチオフラビン色素（米国特許第４，５５４，
５４６号および同第５，０５７，４１３号）が、記載されている。商品名Ｔｈｉ
ａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅで販売される非キメラ非対称性シアニン色素は、未熟
血球または網状赤血球の定量分析（米国特許第４，８８３，８６７号）および血
液運搬寄生虫の核酸を優先的に染色する際（米国特許第４，９３７，１９８号）
において、特定の利点を提供する。Ｔｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅおよび他の
チオフラビンシアニン色素は、多くの哺乳動物細胞の膜に対して浸透性であるが
、それらは多くの真核生物細胞に対して非浸透性である。

【０００８】 他の関連したシアニン色素は、生細胞の膜が乱されない限り、生細胞に対して
非浸透性であると記載される（米国特許第５，３２１，１３０号および同第５，
４１０，０３０号を参照のこと）。電気泳動ゲルにおいて核酸を染色するのに有
用なカチオン性部分を有する種々のダイマー色素が、米国特許第５，３１２，９
２１号；同第５，４０１，８４７号；同第５，５６５，５５４号；および同第５
，７８３，６８７号に記載される。

【０００９】 広スペクトルの生細胞および死細胞の両方の膜を浸透し得る置換された非対称
性シアニン色素もまた、記載されている（米国特許第５，４３６，１３４号を参
照のこと）。

【００１０】 これらの色素の多くが、核酸染色としての使用を見出している一方で、それら
は、特に生細胞アッセイにおいて、それらの一般的適用を制限する幾つかの欠点
に苦しむ。例えば、利用可能な色素のほとんどが、可視スペクトルの緑色領域に
おいて蛍光発光する。緑色レーザーは単に赤色レーザーより高価であるだけでな
く、緑色蛍光は、特に、細胞性成分の自己発光およびアッセイ装置に起因する生
細胞アッセイ内のより高いバックグラウンドシグナルを生じる。これらのより高
いバックグランドシグナルは、アッセイの感度を低下させる。さらに、多くの細
胞性成分は、緑色光を吸収し、さらにアッセイの感度を低下させる。

【００１１】 赤色レーザーは、緑色レーザーより高価ではなく、細胞性成分が一般的に赤色
光に対して透過性であるため、可視スペクトルの赤色領域に励起極大および発光
極大を有する核酸染色が、生細胞アッセイに好ましい。しかし、生細胞アッセイ
に適切な特性を有する膜浸透性の赤色発光核酸染色の利用可能性は、制限される
。不運なことに、最も通常の水溶性赤色発光色素、色素Ｃｙ５のようなシアニン
色素は、光安定ではない。従って、光安定である感受性核酸染色は、可視スペク
トルの赤色領域において励起極大および発光極大を有し、細胞膜に対して浸透性
である感受性核酸染色が、非常に所望される。

【００１２】 （３．発明の要旨） これらの有利な特性および他の有利な特性を有する色素が本発明によって提供
され、これは、１局面において、核酸を標識、染色および／または検出するため
の赤色発光［８，９］ベンゾフェノキサジン色素の新規なクラスを提供する。本
発明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、親［８，９］ベンゾフェ
ノキサジン環に結合した脂肪族カチオン性鎖によって特徴付けられる。親［８，
９］ベンゾフェノキサジン環は、以下の２個の窒素含有置換基を含む：Ｃ３炭素
におけるアミノ置換基およびＣ７炭素におけるイミニウム（ｉｍｍｉｎｉｕｍ）
置換基。Ｃ３アミノ置換基は、一級アミノ基、二級アミノ基または三級アミノ基
であり得る。アミノ基が二級アミノまたは三級アミノである場合、窒素置換基は
、同じかまたは異なる（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリール基または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル基
の１個以上であり、より好ましくは、同じかまたは異なる（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル
基の１個以上である。あるいは、窒素が脂肪族環に含まれ得、この場合、アミノ
窒素は、脂肪族架橋（代表的には、（Ｃ₂−Ｃ₈）アルキルジイル）で置換される
。以下により詳細に記載されるカチオン性鎖は、メチレン炭素を介してＣ７イミ
ニウム窒素に結合される。

【００１３】 親［８，９］ベンゾフェノキサジン環は、独立して、Ｃ１位、Ｃ２位、Ｃ４位
、Ｃ６位、Ｃ１１位、Ｃ１２位、Ｃ１３位および／またはＣ１４位にて、広範な
種々の異なる置換基（同じであっても異なっていてもよい）で置換され得る。任
意のこのような置換基は、一般的に、色素が細胞膜を通って浸透する能力、また
は色素が細胞膜を横切って拡散する能力に悪影響を及ぼさないように荷電されな
いべきである。代表的な置換基は、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ、
−ＳＲ、−ＮＲＲ、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒからなる群から選択さ
れ、ここで、各Ｒは、独立して、水素または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである。この
ような置換基は、特定の適用および装置のために、色素の励起および／または発
光スペクトル特性を調整または微調整するために使用され得る。さらに、親［８
，９］ベンゾフェノキサジン環は、Ｃ１およびＣ２炭素；Ｃ１１およびＣ１２炭
素；Ｃ１２およびＣ１３炭素；ならびに／あるいはＣ１３およびＣ１４炭素に融
合した１個以上の（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノ架橋を含み得る。親［８，９］ベン
ゾフェノキサジン環に対するこのようなアリーレノ架橋置換基の付加は、一般的
に、色素の励起極大および発光極大をレッドシフトさせる。これらのアリーレノ
架橋はまた、上記のように、同じかまたは異なる非荷電の基の１個以上でさらに
置換され得る。

【００１４】 脂肪族カチオン性鎖は、代表的に、合計で約４〜２０個の水素でない原子を含
み、色素が使用される条件下で正電荷を寄与する１〜４個のヘテロ原子を有する
。親［８，９］ベンゾフェノキサジン環のＣ７イミニウム窒素によって寄与され
る正電荷を含まず、このカチオン性鎖は、色素が使用される条件下で、少なくと
も１個の正電荷を有し、通常、４個以下の正電荷を有し、より代表的には、３個
以下の正電荷を有する。親［８，９］ベンゾフェノキサジン環が合計で４個の融
合環を含む実施形態において、カチオン性鎖は、好ましくは、１個または２個の
正電荷を有し、Ｃ７イミニウム窒素によって寄与される正電荷を含まない。親［
８，９］ベンゾフェノキサジン環が合計で５個の融合環を含む実施形態において
、カチオン性鎖は、好ましくは１個または３個の正電荷を有し、Ｃ７イミニウム
窒素によって寄与される正電荷を含まない。この正電荷は、代表的に、アミノ基
またはイミノ基に基づくが、硫黄、リンおよびヨウ素のような正電荷を支持し得
る他の元素はまた、これらのカチオンが使用の条件下で安定である程度に使用さ
れ得る。

【００１５】 １級アミノ基または１級イミノ基でさえも、使用の代表的ｐＨ（すなわち、ｐ
Ｈ６〜ｐＨ９の範囲のｐＨ）において少なくとも部分的な正電荷を寄与するのに
十分塩基性であるため、アミノ基またはイミノ基（脂肪族鎖に対して内部にある
か、または末端にある）は、置換されても置換されなくてもよい。アミノ基およ
びイミノ基の塩基性は、一般的に置換の増加とともに増加するため、内部アミノ
基は、好ましくは、少なくとも一置換され、そして末端アミノ基は、好ましくは
、少なくとも二置換される。末端イミノ基は、好ましくは、少なくとも一置換さ
れる。あるいは、アミノ基またはイミノ基は、それらが永久的な正電荷を保有す
るように、完全に置換され得る（すなわち、四級アミノまたは四級イミノ）。カ
チオン性鎖が、単一の内部アミノ基のみを含む場合、それは好ましくは、四級ア
ミノである（二置換される）。カチオン性鎖が、１個より多くの内部アミノ基を
含む場合、これらの基の少なくとも１個は、四級アミノであるべきである。任意
の末端アミノ基は、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基または四級アミ
ノ基であり得るが、好ましくは、三級（二置換される）または四級である。

【００１６】 実質的に、任意の置換基は、内部または末端のアミノ基またはイミノ基の窒素
原子を置換するために使用され得る。通常、窒素原子は、各々独立して、同じか
または異なる（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル基の１個以上で置換される。好ましくは、窒
素原子は、各々独立して、同じかまたは異なる直鎖の（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル基の
１個以上で置換され、最も好ましくは、１個以上のメタニル基（ｍｅｔｈａｎｙ
ｌ ｇｒｏｕｐ）で置換される。従って、内部アミノ基および内部イミノ基は、
代表的に、それぞれ式−ＮＲＲ−および＝ＮＲ−を有し、そして末端アミノ基お
よび末端イミノ基は、代表的に、それぞれ、式−ＮＲＲＲおよび＝ＮＲＲを有し
、ここで、各Ｒは、独立して、水素または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである。

【００１７】 カチオン性鎖のアミノ基またはイミノ基は、通常、２個〜６個の炭素原子によ
って互いに隔てられる。代表的に、カチオン性鎖のアミノ基またはイミノ基は、
２個または３個の炭素原子によって隔てられる。同様に、Ｃ７イミニウム窒素は
、２個〜６個の炭素原子、好ましくは３個の炭素原子によって、アミノ基または
イミノ基から隔てられる。カチオン性鎖は、任意の数の炭素−炭素二重結合、炭
素−窒素二重結合または炭素−炭素三重結合を含み得るが、好ましくは、飽和で
ある。さらに、カチオン性鎖は、代表的に直鎖であり、唯一の分岐点がアミノ基
またはイミノ基で生じる。しかし、骨格炭素原子は、同じかまたは異なる（Ｃ₁
−Ｃ₆）アルキル置換基の１個以上を含み得る。

【００１８】 本発明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、広範な状況（例えば
、溶液中、電気泳動ゲル中、ブロット上および他のアッセイ中を含む）における
後の検出のための核酸を染色または標識するために、インターカレート色素また
は非インターカレート色素として使用され得る。操作についての任意の特定の理
論に束縛されることを意図しないが、色素が、例えば二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ
を染色するためのインターカレート色素または染色として使用される場合、それ
らの核酸を結合する能力は、ほとんど塩基対間にインターカレートする親［８，
９］ベンゾフェノキサジン環によって媒介されると考えられる。色素が、例えば
一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを染色するための非インターカレート色素または染色
として使用される場合、それらの核酸を結合する能力は、ほとんど核酸のアニオ
ン性リン酸ジエステル骨格と色素のカチオン性鎖との間のイオン性相互作用によ
って媒介されると考えられる。しかし、当業者は、イオン性相互作用および疎水
性相互作用の両方、ならびに他の型の相互作用が、一本鎖核酸および二本鎖核酸
の両方を結合する際におそらく関与することを認識する。本発明の最も好ましい
色素は、膜浸透性である色素である。

【００１９】 本発明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、広範な適用にわたっ
て核酸を染色するのに理想的に適切にする幾つかの特性を有する。例えば、本発
明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は：（ｉ）可視スペクトルの赤
色領域（６３０ｎｍ以上）において５０，０００ｃｍ^-1Ｍ^-1以上の吸光係数を有
する高いモル吸光率を有し；（ｉｉ）親［８，９］ベンゾフェノキサジン環の置
換パターンに依存して、代表的に６５０ｎｍ以上の長発光波長を有し；（ｉｉｉ
）優れた光安定性を有し；（ｉｖ）核酸を結合する際に量子収率の劇的な増加を
生じ、代表的には、利用可能なおよび／または報告された核酸染色より顕著に輝
き；そして（ｖ）一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方に対して高い結合親和性を
有する。

【００２０】 これらの所望の特性に加えて、本発明の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素
のほとんどは、インタクトな生細胞の膜を通して受動的に浸透し得るか、または
インタクトな生細胞の膜を横切って拡散し得、それらを、ＤＮＡおよびＲＮＡの
両方の生細胞染色に理想的に適切にする。今日まで、本発明の膜浸透性色素は、
試験される全ての細胞株において良好な浸透性を示した。非常に驚くべきことに
、新規の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、現在利用可能な生細胞核酸染
色より顕著に速い速度で細胞膜を横断する。公知のシアニン色素ＳＹＴＯ６１（
登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用い
た、本発明の２個の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素間のＨＣＴ−１１６細
胞における取り込みの速度の直接の比較は、本発明の新規な色素による顕著に速
い取り込み速度を示す（図２）。

【００２１】 さらに、本発明の色素で染色した真核生物細胞は、ＳＹＴＯ６１（登録商標）
のような従来のシアニン色素で染色した細胞より、１０００倍を超える大きい蛍
光を示し得る。それらのより鮮やかなシグナルおよび増大した浸透速度により、
本発明の新規の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、現在利用可能な色素よ
り生細胞核酸アッセイにおいてはるかに少ない色素を用いて、速い結果を提供す
る。さらに、親［８，９］ベンゾフェノキサジン環に結合したカチオン性鎖およ
び／または置換基の単純な合成改変によって、好ましい浸透特性、ならびに可視
スペクトルの赤色領域において吸収および発光スペクトル特性を有する色素が、
容易に得られ得る。従って、本発明の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、
現在利用可能な生細胞核酸染色の多くの欠点を克服する、光安定で、可視励起可
能な生細胞核酸染色の新規なクラスを表す。

【００２２】 （５．好ましい実施形態の詳細な説明） （５．１ 番号付けシステム） 本出願の目的のために、親［８，９］ベンゾフェノキサジン環は、以下のよう
に番号付けされる：

【００２３】

【化９】 （５．２ 定義） 本明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有することが意図
される： 「アルキル」とは、親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの単一の炭素原
子から１個の水素原子を除去することによって誘導体化される、飽和または不飽
和の、分枝鎖、直鎖または環式の一価炭化水素基をいう。代表的なアルキル基と
して、これらに限定されないが、メチル（メタニル）；エタニル、エテニル、エ
チニルのようなエチル；プロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピ
ル）、シクロプロパン−１−イル、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−
エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、シクロプロプ−１−エン−１−
イルのようなプロピル；シクロプロプ−２−エン−１−イル、プロプ−１−イン
−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど；ブタン−１−イル、ブタン−２
−イル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、
２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、シクロブタン−１−イル、ブ
ト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１
−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブ
タ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト
−１−エン−１−イル、シクロブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３
−ジエン−１−イル、ブト−１−イン−１−イル、ブト−１−イン−３−イル、
ブト−３−イン−１−イルなどのようなブチルが挙げられる。

【００２４】 「アルキルジイル」とは、親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの同じか
または２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導体
化された２個の一価ラジカル中心を有する、１〜２０個の炭素原子の飽和または
不飽和の、分枝鎖、直鎖または環式の炭化水素基をいう。代表的なアルキルジイ
ル基として、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルジイル、１，４−ブチル
ジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【００２５】 「芳香族環系」とは、共役π電子系を有する不飽和の環式環系または多環式環
系をいう。具体的には、「芳香族環系」の定義には、環の１個以上が芳香族であ
り、環の１個以上が飽和または不飽和である融合した環系（例えば、インダン、
インデン、フェナレンなど）が含まれる。代表的な芳香族環系として、アセアン
トリーレン（ａｃｅａｎｔｈｒｙｌｅｎｅ）、アセナフチレン、アセフェナント
リーレン（ａｃｅｐｈｅｎａｎｔｈｒｙｌｅｎｅ）、アントラセン、アズレン、
ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘ
キサフェン、ヘキサレン、ａｓ-インダセン、ｓ−インダセン、インダン、イン
デン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ
−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリーレン、フェ
ナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン（ｐｌｅｉａｄｅｎｅ）、ピレ
ン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００２６】 「アリール」とは、芳香環系の単一炭素原子から１個の水素原子を除去するこ
とによって誘導体化される一価芳香族炭化水素基をいう。代表的なアリール基と
して、アセアントリーレン、アセナフチレン、アセフェナントリーレン、アント
ラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレ
ン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセ
ン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン
、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン
、ペリーレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、
ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから誘導される
基が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アリー
ル基は、（Ｃ₅−Ｃ₂₀）アリールであり、であり、（Ｃ₅−Ｃ₁₀）がさらにより好
ましい。特に好ましいアリールは、フェニル（Ｃ₆アリール）およびナフチル（
Ｃ₁₀アリール）である。

【００２７】 「アリーレノ」とは、親芳香族環系の２個の隣接炭素原子の各々から１個の水
素原子を除去することによって誘導体化される２個の隣接一価ラジカル中心を有
する二価の架橋基をいう。アリーレノ架橋基（例えば、ベンゼノ）の親芳香族環
系（例えば、ベンゼン）への結合は、融合した芳香族環系（例えば、ナフタレン
）を生じる。この架橋は、得られた融合環系への結合と一貫した最大数の非累積
二重結合を有することが想定される。アリーレノ置換基が、炭素原子の二重計測
を避けるために、代替の置換基を含む構造上の２個の隣接置換基と一緒になって
形成される場合、アリーレノ架橋の炭素原子は、構造の架橋炭素原子を置き換え
る。例として、以下の構造が考えられる：

【００２８】

【化１０】 ここで、 Ｒ¹は、単独の場合、水素であり、またはＲ²と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄
）アリーレノであり； そしてＲ²は、単独の場合、水素であり、またはＲ¹と一緒になる場合、（Ｃ₅
−Ｃ₁₄）アリーレノである。

【００２９】 Ｒ¹およびＲ²が各々水素である場合、得られる化合物はベンゼンである。Ｒ²
と一緒になるＲ¹がＣ₆アリーレノ（ベンゼノ）である場合、得られる化合物は、
ナフタレンである。Ｒ²と一緒になるＲ¹がＣ₁₀アリーレノ（ナフタレノ）である
場合、得られる化合物はアントラセンまたはフェナントレンである。代表的なア
リーレノ基として、アセアントリーレノ、アセナフチレノ、アセフェナントリー
レノ、アントラセノ、アズレノ、ベンゼノ（ベンゾ）、クリセノ、コロネノ、フ
ルオランテノ、フルオレノ、ヘキサセノ、ヘキサフェノ、ヘキサレノ、ａｓ−イ
ンダセノ、ｓ−インダセノ、インデノ、ナフタレノ（ナフト）、オクタセノ、オ
クタフェノ、オクタレノ、オバレノ、ペンタ−２，４−ジエノ、ペンタセノ、ペ
ンタレノ、ペンタフェノ、ペリーレノ、フェナレノ、フェナントレノ、ピセノ、
プレイアデノ、ピレノ、ピラントレノ、ルビセノ、トリフェニレノ、トリナフタ
レノなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の連結性が意図される場
合、（アリーレノ架橋の）関与する架橋炭素は、括弧内に示され、例えば、［１
，２］ベンゼノ（［１，２］ベンゾ）、［１，２］ナフタレノ、［２，３］ナフ
タレノなどである。

【００３０】 （５．３ 色素化合物自体） 本発明は、後の検出のために核酸を染色または標識するのに有用な［８，９］
ベンゾフェノキサジン色素の新規なクラスを提供する。要旨の節に記載されるよ
うに、この新規な色素は、一般的に、置換または非置換の親［８，９］ベンゾフ
ェノキサジン環および脂肪族カチオン性鎖を含む。本発明の好ましい実施形態に
おいて、［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、以下の構造式（Ｉ）：

【００３１】

【化１１】 に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、ここで： Ｒ¹は、単独の場合、水素、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−
ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から
選択されるか、あるいはＲ²と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは
同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノで
あり； Ｒ²は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
か、あるいはＲ¹と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかもし
くは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； Ｒ³は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルおよび（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリー
ルからなる群から選択されるか、あるいはＲ^3'と一緒になる場合、（Ｃ₂−Ｃ₈）
アルキルジイルであり； Ｒ^3'は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルおよび（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリ
ールからなる群から選択されるか、あるいはＲ³と一緒になる場合、（Ｃ₂−Ｃ₈
）アルキルジイルであり； Ｒ⁴は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、
−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され； Ｒ⁶は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、
−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され； Ｒ⁷は、以前に記載されたような脂肪族カチオン性鎖であり； Ｒ¹¹は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
か、あるいはＲ¹²と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかも
しくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； Ｒ¹²は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
か、あるいはＲ¹¹またはＲ¹³と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまた
は同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノ
であり； Ｒ¹³は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
か、あるいはＲ¹²またはＲ¹⁴と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまた
は同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノ
であり； Ｒ¹⁴は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
か、あるいはＲ¹³と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかも
しくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； 各々のＷは、独立して、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ
’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され；そし
て、 各Ｒ’は、独立して、水素または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである。

【００３２】 構造式（Ｉ）に従う好ましい化合物の１つの群は、Ｒ⁷が−（ＣＨ₂）_n−［Ｎ
ＲＲ−（ＣＨ₂）_n］_m−ＮＲＲＲである化合物であり、ここで、各ｎは、独立し
て、２〜６の整数であり、ｍは、０〜６の整数であり、そして各Ｒは、独立して
、水素および（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルからなる群から選択される。

【００３３】 構造式（Ｉ）に従う好ましい化合物の別の群は、生きた原核生物細胞または真
核生物細胞の膜を通って受動的に浸透し得るか、または生きた原核生物細胞また
は真核生物細胞の膜を横切って拡散し得る化合物である。細胞が、哺乳動物細胞
のような真核生物である場合、好ましい色素は、さらにより好ましくは、核膜を
通って受動的に浸透し得るか、または核膜を横切って拡散し得、そして細胞の核
の核酸を染色し得る。

【００３４】 本発明の色素の膜浸透性は、１以上の細胞を、色素を含む染色溶液（例えば、
リン酸緩衝生理食塩水）と接触させ（染色溶液は、以下により詳細に議論される
）、そして、検出可能なシグナルについてアッセイすることによって容易に試験
され得る。一般的に、色素が膜浸透性である場合、細胞は、試験される色素の励
起波長および発光波長に適合した照明器および検出器を使用して検出される際に
、暗スポットとして現れる。１０ｐＭ〜１００ｎＭ（またはそれ未満でさえ）の
範囲内の濃度の染色溶液（ｐＨ６〜ｐＨ８−９の範囲のｐＨ）中で使用される場
合、５〜１０分内に検出可能なシグナル（バックグラウンドの２〜３倍以上）を
生成する色素は、膜浸透性であると考えられる。約１〜５分内に極端に低い濃度
（すなわち、１０ｎＭ以下、またはそれ未満でさえ）において非常に鮮やかなシ
グナル（すなわち、バックグラウンドの１００倍以上）を生成する色素が、特に
好ましく、これらの色素は増大した感度を提供する。

【００３５】 構造式（Ｉ）に従う好ましい化合物のさらに別の群は、以下の特徴の群から選
択される１つ以上の特徴を有する化合物である： Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁴およびＲ⁶は、各々水素であり； Ｒ³およびＲ^3'は、各々独立して（Ｃ₅−Ｃ₁₀）アリールまたは（Ｃ₁−Ｃ₃）ア
ルキルであり； Ｒ¹がＲ²と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾ、［１，２］ナフ
タレノまたは［２，３］ナフタレノであり； Ｒ¹¹がＲ¹²と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり； Ｒ¹²がＲ¹³と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり； Ｒ¹³がＲ¹⁴と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり； Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、各々水素であり；および／または Ｒ⁷は、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲ
ＲＲおよび−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ
からなる群から選択され、ここで、各ｎが、独立して２〜３の整数であり、各Ｒ
が、独立して、水素および（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルからなる群から選択される。

【００３６】 構造式（Ｉ）に従う好ましい化合物の別の群は、以下を有する化合物である： Ｒ¹は、単独の場合、水素であるか、あるいは、Ｒ²と一緒になる場合、ベンゾ
、ナフタレノ、［１，２］ナフタレノまたは［２，３］ナフタレノであり； Ｒ²は、単独の場合、水素であるか、あるいは、Ｒ¹と一緒になる場合、ベンゾ
、ナフタレノ、［１，２］ナフタレノまたは［２，３］ナフタレノであり； Ｒ³は、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルであり； Ｒ^3'は、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルであり； Ｒ⁴は、水素であり； Ｒ⁶は、水素であり； Ｒ⁷は、前に記載されるように、脂肪族カチオン性鎖であり、好ましくは、−
（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲまたは−
（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲであり、ここ
で、各ｎが、独立して２〜３の整数であり、各Ｒが、独立して、水素および（Ｃ ₁ −Ｃ₃）アルキルからなる群から選択され； Ｒ¹¹は、単独の場合、水素であるか、あるいはＲ¹²と一緒になる場合、ベンゾ
であり； Ｒ¹²は、単独の場合、水素であるか、あるいはＲ¹¹またはＲ¹³と一緒になる場
合、ベンゾであり； Ｒ¹³は、単独の場合、水素であるか、あるいはＲ¹²またはＲ¹⁴と一緒になる場
合、ベンゾであり；そして Ｒ¹⁴は、単独の場合、水素であるか、あるいはＲ¹³と一緒になる場合、ベンゾ
である。

【００３７】 構造式（Ｉ）に従う好ましい化合物のなお別の群は、以下の構造式（ＩＩ）お
よび（ＩＩＩ）：

【００３８】

【化１２】 に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、ここで、Ｒ⁷は、前に構造
式（Ｉ）について記載された通りである。構造式（ＩＩ）に従う化合物は、代表
的に、６３０〜６５０ｎｍの範囲に励起（吸収）極大を有し、６６０〜６８０ｎ
ｍの範囲に発光極大を有し、一方、構造式（ＩＩＩ）に従う化合物は、代表的に
、６５０〜６６０ｎｍの範囲に励起（吸収）極大を有し、６８０〜７２０ｎｍの
範囲に発光極大を有し、これらは、緩衝液、ｐＨ、温度、および他のサンプル条
件に依存する（例えば、以下の３３頁、節６．２、表１を参照のこと）。

【００３９】 構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に従う好ましい化合物は、Ｒ⁷が、−（ＣＨ₂ ）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲおよび−（ＣＨ₂ ）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲからなる群から選択
される化合物であり、ここで、各ｎが、独立して２〜３の整数であり、各Ｒが、
独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルおよびメチルからなる群から選択される
。

【００４０】 良好な膜浸透性を示す構造式（ＩＩ）に従う特に好ましい化合物は、以下：

【００４１】

【化１３】 に示される。

【００４２】 良好な膜浸透性を示す構造式（ＩＩＩ）に従う特に好ましい化合物は、以下：

【００４３】

【化１４】 に示される。

【００４４】 当業者は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）によって包含される化合物の
多く、および特に上に記載した化合物種が、互変異性、立体配座異性（ｃｏｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ）、幾何異性および／または立体異
性（ｓｔｅｒｅｏ ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ）の現象を示し得ることを理解する。本
明細書および特許請求の範囲内の式の図は、可能な互変異性形態、立体配座異性
形態、鏡像異性形態または幾何異性形態のうちの１つのみを表し得るため、本発
明が本明細書中に記載される有用性の１つ以上を有する化合物の、任意の互変異
性形態、立体配座異性形態、鏡像異性形態および／または幾何異性形態を包含す
ることは理解されるべきである。

【００４５】 具体的な例として、Ｃ３アミノ置換基およびＣ７イミニウム置換基に対する参
照番号が、本明細書を通して付けられる。この学術用語は、化合物の幾つかの可
能な互変異性形態（または共鳴構造）のうちの一つのみを表す例示された構造式
に対応するため、これらの参照番号は簡便さのみのためであり、任意のこのよう
な参照番号が本明細書中に記載される化合物の範囲を限定することを意図しない
ことが理解される。

【００４６】 さらに、当業者はまた、本発明の化合物が、特にそれらの環境のｐＨに依存し
て、多くの異なるプロトン化状態で存在し得ることを理解する。本明細書中に提
供される構造式は、幾つかの可能なプロトン化状態のうちのたった１つで化合物
を表すが、これらの構造が例示にすぎず、そして本発明は任意の特定のプロトン
化状態に限定されず、化合物の任意および全てのプロトン化形態が、本発明の範
囲内に入るように意図されることが理解される。

【００４７】 本発明の化合物はそれらの物理的状態に依存して、複数の正電荷を有し得るた
め、本発明の化合物は、それらに付随した対イオンを有し得る。任意の付随の対
イオンの同一性は、代表的に、化合物が得られる合成および／または単離方法に
よって決定される。代表的な対イオンとして、ハライド、アセテート、トリフル
オロアセテートなど、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定され
ない。任意の付随の対イオンの同一性が本発明の重要な特徴ではなく、本発明が
任意の型の対イオンを付随した色素を包含することが理解される。さらに、化合
物は種々の異なる形態で存在し得るため、本発明は、対イオンを付随する色素の
形態（例えば、乾燥塩）のみならず、対イオンを付随しない形態（例えば、水溶
液または有機溶液）を包含することが意図される。

【００４８】 （５．４ 化合物を合成する方法） 本発明の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、以下のスキーム（Ｉ）およ
び（ＩＩ）に例示されるように、都合よく、ヨード前駆体から合成され得る。ス
キーム（Ｉ）は、ヨード前駆体の合成を例示する。スキーム（ＩＩ）は、本発明
の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素を得るためのヨード前駆体の使用を例示
する。スキーム（Ｉ）および（ＩＩ）において、種々のＲⁿは、構造式（Ｉ）に
ついて前に規定される通りである。

【００４９】

【化１５】 スキーム（Ｉ）を参照して、３−ヒドロキシ−２−ニトロソアニリン誘導体３
０（１０ｍＭ）、１−アミノナフタレン誘導体４０（１０ｍＭ）およびＨＣｌ（
０．２４Ｍ）をメタノール中で、約２−５０時間還流し、［８，９］ベンゾフェ
ノキサジン誘導体４２を生成し、これを溶出液としてメタノール：塩化メチレン
を使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離する。

【００５０】 次いで、［８，９］ベンゾフェノキサジン誘導体４２（水中で約６０ｍＭ、約
６０℃）で、等量の水性ＮａＯＨ（０．５Ｍ）で処理する。この反応物を塩化メ
チレン（１００ｍｌ）で３回抽出し、合わせた抽出物をブライン、次いで無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、そして残留する溶媒をエバポレーションによって除去し
、化合物４２の塩基形態を得る。この塩基性化合物４２（０．２ｍｍｏｌ）を水
性トルエン（５ｍｌ）に溶解し、１，３−ジヨードプロパン１０（２．０ｍｍｏ
ｌ）を加え、この混合物をアルゴン下で約１６時間還流する。溶出液としてメタ
ノール：塩化メチレンを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーによって、ヨード前駆体４４を単離する。

【００５１】 ヨード前駆体４４を本発明の色素に転化するための方法が、スキーム（ＩＩ）
に例示される。

【００５２】

【化１６】 スキーム（ＩＩ）を参照して、ヨード前駆体４４のヨウ素原子は、脂肪族アミ
ンで置換される。脂肪族アミンの同一性は、所望のカチオン鎖の性質に依存する
。例えば、ヨウ素原子のトリメチルアミン２１との置換は、色素４６を生成し、
ここで、カチオン性鎖の末端アミノ基は、４級アンモニウムである。ヨウ素原子
のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−ジアミノプロパン１０との置換
は、４級内部アンモニウム基および／または３級末端アミノ基を有する色素４８
および５０の混合物を生じる。ヨウ素原子のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−ペンタ
メチルジエチレントリアミン２３との置換は、２個の内部アミノ基（１個の４級
アミノ基および１個の３級アミノ基）および／または３級末端アミノ基を有する
色素５２および５４の混合物を生じる。例示した反応を実行するための条件およ
び色素生成物を単離するための方法は、実施例の節に提供される。

【００５３】 スキーム（Ｉ）および（ＩＩ）は、特定の例示的なカチオン性鎖を有する色素
の合成を示す。当業者は、他のカチオン性鎖を有する色素が、適切なジヨードア
ルキルおよび脂肪族アミン出発物質を使用して容易に得られ得ることを理解する
。例えば、Ｃ７イミニウム窒素およびヨウ素原子を隔てる異なる数のメチレン基
を有する種々の異なるヨード前駆体は、化合物４２を構造Ｉ−（ＣＨ₂）_n−Ｉを
有するジヨードアルキレンと反応させることによって得られ得、ここで、ｎは、
介在メチレン基の所望の数である。互いに、および末端アミノ基から種々の内部
アミノ基の窒素原子を隔てるメチレン基の数は、同様な様式で、ヨード前駆体の
ヨウ素原子を置換するための適切な脂肪族アミンを選択することによって調整さ
れ得る。カチオン性鎖の飽和レベルは、同様に、ジヨードアルキルおよび脂肪族
アミン反応物の適切な選択によって調整され得る。

【００５４】 スキーム（Ｉ）および（ＩＩ）は、本発明の色素の合成に特に好都合であり、
なぜならアミノ基を除いて、種々のＲ置換基は、保護を必要としないためである
。アミノ基は、周知の方法（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ、１９９１、
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照の
こと）に従って、Ｆｍｏｃまたは他の通常の塩基不安定アミノ保護基で好都合に
保護され得る。

【００５５】 本発明の特定の好ましい化合物を合成するための方法は、実施例の節に提供さ
れる。

【００５６】 （５．５ 化合物を使用する方法） 本発明の新規な［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、広範な範囲の適用に
おける後の検出のために、核酸を標識または染色するために使用され得る。例え
ば、色素は、溶液、電気泳動ゲル、ブロッティング適用などにおいて核酸を染色
するために使用され得る。使用において、本発明の色素は、核酸を含むサンプル
と合わせられ、検出可能な蛍光シグナルを得るのに十分な時間をかけてインキュ
ベートされ、蛍光シグナルを観察する。

【００５７】 色素は、サンプルに直接加えられ得るが、代表的に、サンプルと生物学的に適
合性である水性染色溶液の成分として存在する。染色溶液は、水、緩衝溶液（例
えば、リン酸緩衝化生理食塩水；「ＰＢＳ」）または細胞培養培地、水混和性有
機溶媒または水性溶媒と水混和性有機溶媒とを含む混合物のような水性溶媒中に
、直接、色素を溶解することによって作製される。有用な水混和性有機溶媒とし
て、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ
−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、低級アルコール（例えば、エタノール、プロパ
ノール、イソプロパノールなど）およびアセトニトリルが挙げられるが、これら
に限定されない。本発明の色素は水溶性であるため、色素は、通常、まず染色溶
液における使用に所望される濃度より約１，０００〜１０，０００倍高い濃度の
水溶液中に溶解され、次いで、生物学的細胞培養液またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）
のような水性溶媒で１回以上希釈され、有効量の色素を含む染色溶液を生じる。
色素の有効量は、核酸の存在下において検出可能な蛍光シグナルを与えるのに十
分な量である。

【００５８】 操作の任意の特定の理論によって束縛されることを意図しないが、本発明の色
素の、細胞膜を浸透する能力および／または核酸を結合する能力が、カチオン性
鎖の正電荷に一部起因すると考えられる。カチオン性鎖の正味の電荷が、種々の
要因（例えば、染色溶液のｐＨを含む）によって影響（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ／
ａｆｆｅｃｔｅｄ）され得るが、特定のｐＨの使用は、成功において重要ではな
い。本発明の色素は、細胞を浸透し得、および／または核酸を結合し得、広範囲
のｐＨ値にわたって検出可能な蛍光シグナルを生じる。従って、核酸は、特定の
適用に好都合であるｐＨを使用して、本発明の色素で染色され得る。ほとんどの
核酸染色アッセイが、ｐＨ６〜ｐＨ８−９の範囲のｐＨで実施され得る。従って
、染色電気泳動ゲルのようなインビトロ適用のための染色溶液は、代表的に、こ
の同じ範囲のｐＨを有する。生細胞アッセイに関するインビボ適用のための染色
溶液は、好ましくは、細胞培養培地のｐＨと同じｐＨ（代表的に、約ｐＨ７．４
）で維持される。

【００５９】 代表的に、細胞サンプルのための染色溶液は、約０．１ｎＭより高く約１００
μＭ未満、より代表的には、約１ｎＭより高い色素濃度を有する。好ましくは、
染色溶液は、約１ｎＭ〜２０ｎＭ色素を含む。電気泳動ゲルのための染色溶液は
、代表的に、約１μＭより高く約１０μＭ未満、より代表的には、約４〜５μＭ
の色素濃度を有する。上記の染色溶液は一般的な基準を提供するが、染色溶液の
特定の色素濃度が、特に、サンプルの物理的性質、存在する核酸の濃度および実
施される分析の性質によって決定されることは当該分野で理解される。それ故に
、特定のアッセイを実施するのに必要な色素濃度は、アッセイに依存し、当業者
によって容易に決定される。

【００６０】 染色溶液は、核酸を含むサンプルと合わせられる。サンプル中の核酸は、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡ、あるいはそれらの混合物のいずれかであり得る。あるいは、サ
ンプルは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの染色特性と同様の染色特性を有するＲ
ＮＡおよび／またはＤＮＡのアナログを含み得る。核酸がＤＮＡ（または、それ
らのアナログ）である場合、それは、任意の程度のストランド（例えば、一本鎖
、二本鎖、三本鎖または四本鎖）で存在し得る。核酸は、天然（すなわち起源に
おいて、生物学的である）または合成的（すなわち、人工的に調製される）のい
ずれかであり得、天然の状態で（例えば、ｍＲＮＡまたは凝縮染色体の形態で）
または非天然状態で（例えば、変性核酸の形態で）、サンプル中に存在し得る。

【００６１】 核酸は、実質的に、１０〜４０ほどの少ないヌクレオチドまたは塩基対を含む
オリゴヌクレオチドから、数百〜千の範囲のヌクレオチドまたは塩基対を含むポ
リヌクレオチドまで、ｃＤＮＡ、遺伝子および染色体全体でさえまでの任意の長
さであり得る。核酸は、サンプル全体を通して均一に分散され得（例えば、核酸
溶液に溶解される）、あるいはサンプルの一部のみに存在し得（例えば、電気泳
動ゲルバンド内、または細胞もしくは細胞の一部内に隔離される）、それ故に、
個々のサンプル間を識別するか、または単一サンプル内の一部もしくは領域を分
化するために使用され得る。

【００６２】 本発明の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素の有意な利点は、それらの細胞
に対する浸透性であるため、核酸は、生物学的構造体内に封入され得、例えば、
ウイルス粒子、細胞小器官または細胞内に封入され得る。生物学的構造体に封入
された核酸は、広範な種々の環境（培養された細胞、生物または組織、濾過され
ていないかまたは分離された生物学的流体（例えば、尿、脳脊髄流体、血液リン
パ液など）、組織ホモジネート、粘膜、唾液、糞便、生理学的分泌物、土壌、水
および空気を含むが、これらに限定されない）から得られ得る。この核酸は、サ
ンプルに対して内因性であり得るか、またはそれは異物として（例えば、感染ま
たはトランスフェクションによって）導入され得る。細胞全体が染色され得（生
きていても死んでいてもよい）、そしてまず固定され、慣用的な組織学的手順ま
たは細胞化学的手順に従って処置され得る。

【００６３】 このサンプルは、色素と核酸との間の接触を容易にする任意の手段を介して、
染色溶液と合わせられ得る。この接触は、サンプルが溶液である場合、サンプル
混合の際に、あるいは、電気泳動ゲルまたは他のマトリクス内に包埋された核酸
を染色する場合、核酸を含む構造体の染色溶液とのインキュベーションの際に、
起こり得る。本発明の色素は、染色溶液の細胞サンプルへの添加の際に、迅速か
つ完全に細胞膜に浸透することが示されるが、好ましくは、細胞および／または
膜完全性の最小の崩壊を伴い、膜を横切る色素を輸送するのに適切である任意の
他の技術もまた、色素と組み合わせて使用され得る。例示的な技術として、化学
薬剤（界面活性剤、酵素、アデノシン三リン酸）、レセプタータンパク質または
輸送タンパク質、細孔形成タンパク質、微量注入法、エレクトロポレーション、
低浸透圧性ショック、切屑充填（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、粒子ボンバ
ードメントなどの使用が挙げられる。

【００６４】 このサンプルは、色素の存在下で、検出可能な蛍光シグナルを生じるのに十分
な時間、インキュベートされる。操作の任意の理論によって束縛されることを意
図しないが、本発明の色素は、核酸の存在下において量子収率の顕著な増加を示
すため、この検出可能な蛍光シグナルは、核酸−色素複合体の形成の際に生じる
と考えられる。核酸の溶液中の検出可能な蛍光は、本質的に瞬間的である。細胞
膜内の検出可能な蛍光は、色素の細胞内への浸透を必要とする。一般に、視覚的
に検出可能な蛍光は、広範な種々の細胞において、本発明の実施形態を用いて、
細胞を約１ｎＭ〜１０ｎＭの色素を含む染色溶液と合わせて約５分以内に得られ
得る。

【００６５】 染色後、この染色溶液は除去され得、適用に依存して、検出の前に核酸をリン
スする。例えば、電気泳動適用において、染色されたゲルは、検出の前に、（例
えば、水または緩衝液で）リンスされ得る。しかし、核酸との結合または複合体
化の際のそれらの量子収率の大きな増加のために、非結合色素は、検出の前に除
去される必要はない。色素のこの特性によって、それらは、静的血球計算法およ
び／またはフローサイトメトリー（ここで、染色溶液は、検出の前に除去されな
い）によって生細胞内の核酸を分析するのに貴重となる。浸透および蛍光はほと
んどの実施形態に対して迅速であるが、検出可能な蛍光シグナルの十分な形成に
必要な時間は、特に、個々のサンプルおよびサンプル媒体の物理的性質および化
学的性質に依存することが当業者に容易に理解される。

【００６６】 本発明の色素のほぼ一般的な膜浸透性およびそれらの迅速な取り込み速度は、
広範な種々の生サンプル中の核酸の試験を可能にする。実質的に任意の細胞型（
細菌のような原核生物および哺乳動物細胞のような真核生物を含む）は、本発明
の色素を使用してプローブ化され得る。幾つかの細胞株（例えば、ＨＣＴ−１１
６）において、色素は、これらの細胞の核を特異的に染色するため、特に有用で
ある。

【００６７】 多くの核酸染色と同様に、本発明の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素は、
核酸の存在下で増大した蛍光を示す。核酸の非存在下における［８，９］ベンゾ
フェノキサジン色素のスペクトル特性（量子収率を含む）が、表１に示される。
代表的には、量子収率は、核酸の存在下で顕著に増加する。利用可能な赤色発光
生細胞色素と比較して、本発明の色素は、核酸へ結合の際に、向上した量子収率
を有する。

【００６８】 さらに、本発明の色素は、現在利用可能な赤色発光生細胞株より顕著に迅速な
浸透速度を示し、一般的に、ＳＹＴＯ６１（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）よりも顕著に速くとりこまれる。図２は、
Ｂｏｎａ１２およびＢｏｎａ２５色素が、およそ５分で有意な検出可能な蛍光を
示し、一方ＳＹＴＯ６１はおよそ１〜２時間必要とすることを示す。量子収率お
よび浸透速度のこれらの改善は、核酸検出のほとんど全ての領域において、直接
的に、改善した速度および感度に変えられる。

【００６９】 本発明の色素の全ての実施形態が、以前の公知の核酸染色に対する量子収率お
よび／または浸透速度の改善を示すわけではないが、本発明の色素の他の特性は
、使用の他の局面において有意な改善を示し、特定の機器（例えば、レーザー励
起周波数）に適合するようにそれらの励起バンドおよび／または発光バンドを選
択的に調整する能力、および／またはそれらの増加した光安定性を含む。非常に
重要なことに、本発明の色素の全てが、可視スペクトルの赤色領域（６３０ｎｍ
以上）で励起および発光し、非常に光安定である。融合環系の５個の環を有する
色素は、７００ｎｍより長い波長で発光する。現在、発光極大が７００ｎｍより
長い、市販の光安定な生細胞核酸染色は、存在しない。

【００７０】 核酸は、核酸−色素複合体の励起および発光スペクトル特性に基づいて検出さ
れる。一般に、染色されたサンプルは、核酸−色素複合体の励起極大またはその
付近の波長で光を発生し得る光源（例えば、レーザー）によって励起される。細
胞性核酸の核酸塩基および／または他の細胞性成分（例えば、タンパク質）は、
高いモル吸光率で、紫外光（λ_max＝２６０〜２８０ｎｍ）を吸収する。結果と
して、本発明の色素の可視赤色励起プロフィールは、これらの細胞性成分のほと
んどが赤色光を吸収しない（すなわち、透過性である）という重要な利点を提供
する。

【００７１】 核酸−色素複合体の蛍光は、適切な波長において得られる光発光を検出するこ
とによって、定性的または定量的に検出される。本発明の色素は、可視スペクト
ルの赤色領域で蛍光発光するため、蛍光シグナルは、代表的に、約６５０ｎｍよ
り長い波長で検出される。より長い発光極大を有する色素ほど、より長い波長で
検出され得る。この発光は、可視検査、写真フィルム、蛍光定量、量子計算器、
プレートリーダー、エピ蛍光顕微鏡ならびに静的血球計算器およびフローサイト
メトリーを含む手段によって検出され得、これらは例示のためであり、限定する
ものではない。発光された光は、直接的に検出され得るか、またはそれは、まず
、例えば、光増倍管を通過させ得ることによって増幅され得る。定量的な検出の
ために、発光光子は、光子カウンターを用いてカウントされ得る。

【００７２】 本発明の色素の感度、浸透性、光安定性ならびに励起特性および発光特性は、
核酸の染色に関する全てのアッセイにおける一般的な有用性、および現在利用可
能な生細胞および他の核酸染色における実質的な改善を提供する。任意の溶液中
の核酸、任意の基材上の核酸、および／または任意のサンプル由来の核酸、なら
びに特に生細胞サンプル由来の核酸を赤色レーザーを用いて迅速に検出および／
または定量する能力は、核酸の蛍光染色を利用する分野において空前の機会を提
供する。

【００７３】 （６．実施例） 本発明が記載され、以下の実施例が例示の目的で提供されるが、限定されない
。

【００７４】 （６．１ 化合物合成） （６．１．１ Ｂｏｎａ １１およびＢｏｎａ １２の合成） ［８，９］ベンゾフェノキサジン色素のＢｏｎａ １１およびＢｏｎａ １２
を以下のスキーム（ＩＩＩ）に例示されるように合成した。

【００７５】

【化１７】 スキーム（ＩＩＩ）を参照して、１．１８ｇのＮｉｌｅ Ｂｌｕｅ Ｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ（４；Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１００ｍｌの水中、６０℃で、３０分間懸
濁した。１００ｍｌの０．５Ｍ水性ＮａＯＨを加えた。塩基性Ｎｉｌｅ Ｂｌｕ
ｅを塩化メチレン（３回、１回につき１００ｍｌ）で抽出し、合わせた抽出物を
ブライン、次いで、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。エバポレーションによる溶媒除
去後、残留物（塩基性Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ）を真空下で一晩乾燥した。

【００７６】 ５０ｍｌの丸底フラスコ中で、６４ｍｇの塩基性Ｎｉｌｅ ｂｌｕｅ（０．２
ｍｍｏｌ）を５ｍｌの無水トルエンに溶解した。２３０ｍｌのジヨードプロパン
（６；２ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この混合物をアルゴン下で１６
時間還流した。８８．１ｍｇの化合物８を、溶出液として塩化メチレン中５％（
ｖ／ｖ）メタノールを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー
によって得た（収率７２％）。化合物８ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：計算値：４８６．１；
実測値：４８６．３。

【００７７】 ５０ｍｌの丸底フラスコ中で、１０ｍｇの化合物８（１６ｍｍｏｌ）を１０ｍ
ｌの無水エタノールに溶解し、１７．２ｍｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ
ル−１，３−ジアミノプロパン（１０；１０３ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）を加
え、この混合物をアルゴン下で６時間還流し、Ｂｏｎａ １１およびＢｏｎａ１
２の混合物を得た。この２種類の色素を、溶出液として、緩衝液Ａ（水中０．１
％ＴＦＡ）中の直線勾配（３０分にわたって０％−７０％）の緩衝液Ｂ（アセト
ニトリル中０．０８５％ＴＦＡ）を使用する逆相ＨＰＬＣを介して単離した。こ
の勾配において、色素Ｂｏｎａ １１を１４．８分で溶出し；色素Ｂｏｎａ １
２を１６．１分で溶出した。

【００７８】

【化１８】 （６．１．２ 色素Ｂｏｎａ ２の合成） ［８，９］ベンゾフェノキサジン色素Ｂｏｎａ ２を、以下のスキーム（ＩＶ
）に例示されるように合成した。

【００７９】

【化１９】 スキーム（ＩＶ）を参照して、２５０ｍｌの丸底フラスコ中で、１．１６ｇの
２−ニトロソ−５−ジエチルアミノフェノール塩酸塩（１４；５ｍｍｏｌ；ＴＣ
Ｉ Ａｍｅｒｉｃａ）および０．９７ｇの１−アミノアントラセン（１６；４．
５ｍｍｏｌ；約９０％純度；Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３ｍｌの濃ＨＣｌ（３７％）
を含む１００ｍｌのエタノールに溶解し、この混合物を２時間還流した。１．６
２ｇの化合物１８（収率８９％）を、溶出液としてメタノール／塩化メチレンを
使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを介して得た。

【００８０】

【化２０】 １０１ｍｇの化合物１８（０．２５ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌのメタノールに溶
解し、９０ｍｌの塩化メチレンを加え、この溶液を、分離漏斗中で、５０ｍｌの
１Ｍ ＮａＯＨ（２回）、次いで、５０ｍｌのブライン（１回）で洗浄した。こ
の有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒をエバポレーション後、この残渣を
オイルポンプを用いて、６時間乾燥した。次いで、乾燥した残渣を２０ｍｌのト
ルエンに溶解し、３４５ｍＬの１，３−ジヨードプロパン（６，３ｍｍｏｌ）を
加え、この混合物をアルゴン下で１６時間還流した。９５ｍｇの化合物２０（収
率５７％）を、溶出液として塩化メチレン中５％（ｖ/ｖ）メタノールを使用す
るフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって得た。

【００８１】

【化２１】 ２５ｍｌの丸底フラスコ中に、２７ｍｇの化合物２０（０．０４１ｍｍｏｌ）
を５ｍｌの無水エタノールに溶解し、３４ｍｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
チル−１，３−ジアミノプロパン（１０；０．２０４ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ
）を加え、この混合物をアルゴン下で４時間還流した。このエタノールをエバポ
レーション後、この残渣を０．５ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する１５
ｍｌのＨ₂Ｏに溶解し、酢酸エチル（１回につき５０ｍｌ）で５回洗浄し、出発
物質を除去した。次いで、水溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０）に通した。５％酢酸水溶液を溶出液として適用した。溶媒をエバポ
レーション後、９．１ｍｇの純粋なＢｏｎａ ２を得た（収率３１％）。

【００８２】

【化２２】 （６．１．３ 色素Ｂｏｎａ ２２、Ｂｏｎａ ２４およびＢｏｎａ ２５の
合成） ［８，９］ベンゾフェノキサジン色素Ｂｏｎａ ２２、Ｂｏｎａ ２４および
Ｂｏｎａ ２５を、以下のスキーム（Ｖ）に例示されるように、合成した：

【００８３】

【化２３】 （Ｂｏｎａ ２２） ２５ｍｌの丸底フラスコ中で、３．０ｍｇの化合物２０（４．５ｍｍｏｌ；前
出の節６．１．２に記載されるように調製した）を、２ｍｌの無水エタノールに
溶解し、２．８６ｍｌのトリメチルアミン（２１；４５．２ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）を加え、この混合物をアルゴン下で４時間還流した。エタノールをエバ
ポレートした後、残渣を０．１％の水性ＴＦＡに溶解し、前出の節６．１．１に
記載されるように、ＨＰＬＣによって精製した。１．９ｍｇの純粋なＢｏｎａ
２２を得た（収率６１％；保持時間１７．０分）。

【００８４】

【化２４】 （Ｂｏｎａ ２４およびＢｏｎａ ２５） ２５ｍｌの丸底フラスコ中で、１．５ｍｇの化合物２０（２．３ｍｍｏｌ；前
出の節６．１．２に記載されるように調製した）を、３ｍｌの無水エタノールに
溶解し、２０．８ｍｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−ペンタメチルジエチレント
リアミン（２３；０．１ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、この混合物をアル
ゴン下で８時間還流し、色素Ｂｏｎａ ２４およびＢｏｎａ ２５の混合物を得
、これらを前出の節６．１．１に記載されるようにＨＰＬＣによって精製した。
色素Ｂｏｎａ ２４は、１７．８分で溶出し；色素Ｂｏｎａ ２５は、１９．２
分で溶出した。色素Ｂｏｎａ ２５の形成は、おそらく還流条件の間の化合物２
４の断片化に起因するものであった。

【００８５】

【化２５】 スキーム（Ｖ）を参照して、代替の方法において、色素Ｂｏｎａ ２５を以下
のように得た：１０ｍｌの丸底フラスコ中で、１ｍｇの化合物２０（１．５ｍｍ
ｏｌ）をメタノール中２Ｍジメチルアミン３ｍｌに溶解した（２６；６ｍｍｏｌ
；Ａｌｄｒｉｃｈ）。この溶液を、アルゴン下で２時間還流し、純粋なＢｏｎａ ２５を上記のようにＨＰＬＣによって得た。

【００８６】 （６．１．４ 色素Ｂｏｎａ ２７および２８の合成）

【００８７】

【化２６】 ［８，９］ベンゾフェノキサジン色素Ｂｏｎａ ２７および２８（上記に示さ
れる）（これらは、１級末端アミノ基を有する）は、アルキルアミンとして３，
３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＣＨ₃Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ ₂ ）₂；Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してスキーム（Ｖ）に例示されるように、化合物
２０から合成した。簡単にいうと、２５ｍｌの丸底フラスコ中で、１．５ｍｇの
化合物２０（２．３ｍｍｏｌ；前出の節６．１．２に記載されるように調製した
）を、３ｍｌの無水エタノールに溶解し、１６．１ｍｌの３，３’−ジアミノ−
Ｎ−メチルジプロピルアミン（０．１ｍｍｏｌ）を加え、この混合物をアルゴン
下で８時間還流し、色素Ｂｏｎａ ２７およびＢｏｎａ ２８の混合物を得た。
純粋なＢｏｎａ ２７およびＢｏｎａ ２８を、前出の節６．１．１に記載され
るように、ＨＰＬＣによって得た。色素Ｂｏｎａ２７は、１７．０分で溶出し；
色素Ｂｏｎａ２８は、１８．１分で溶出した。

【００８８】

【化２７】 （６．２ 本発明の色素のスペクトル特性） Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．４）および／またはメタノール中の本発明の特定
の例示的色素の吸収（励起）極大（λ_abs,max）、モル吸光係数（ε）、発光極
大（λ_em,max）および量子収率（Ｑ）を、以下の表１に提供する：

【００８９】

【化２８】 （６．３ 本発明の色素は、細胞膜を横切って拡散する） この実施例は、本発明の色素が、生細胞の膜を介して受動的に浸透するか、ま
たは生細胞の膜を横切って拡散する能力を実証する。

【００９０】 （６．３．１ 実験プロトコル） ＨＣＴ−１１６結腸直腸細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ ３６０３）中で、２００μｌの容量の培地（１０％ウシ胎児血清を有
するＲＰＭＩ １６４０培地）中、約１０，０００細胞／ウェルの密度でプレー
とした。ペニシリン／ストレプトマイシンを、細胞培養物中の細菌感染を阻害す
るために添加した。細胞をプレートマトリクスに結合した後（一晩、インキュベ
ーション）、この細胞を５０μｌの染色溶液（各培地中１−１０ｎＭの色素、１
２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを
含むＰＢＳまたはカルシウム緩衝液、ｐＨ ７．４）で染色した。ＦＭＡＴ ８
１００ＨＴＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で染色直後、この細胞の画像を、収集した。

【００９１】 （６．３．２ 結果） 膜浸透性実験の結果は、表２に提供される。

【００９２】

【化２９】 表２に示されるように、色素Ｂｏｎａ １１、Ｂｏｎａ １２、Ｂｏｎａ ２
４、およびＢｏｎａ ２５は、優れた膜浸透性を示した。色素Ｂｏｎａ ２２は
、良好な膜浸透性を示した。色素Ｂｏｎａ ２、Ｂｏｎａ ２７およびＢｏｎａ ２８は、細胞膜に対して不浸透性であった。

【００９３】 ＵＣ１１（神経膠星状細胞腫）、ＣＯＳ（サル腎臓）、ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮）細胞を用いて実施した同
様の実験は、同様の結果を提供した。

【００９４】 （６．４ 本発明の色素は、細胞全体中の核酸を染色する） ＨＣＴ−１１６細胞を、前出の節６．３．１に以前に記載されるように、色素
Ｂｏｎａ １２（２０ｎＭ）、Ｂｏｎａ ２４（２０ｎＭ）、Ｂｏｎａ ２５（
２０ｎＭ）および市販のＳＹＴＯ６１（登録商標）（４ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色した。コントロールとして、細
胞をまた、シアニン色素Ｃｙ５（Ｃｙ５−ＮＨＳエステル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）
で標識されている０．５７μｇ／μｌ抗体ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ）で染色した。

【００９５】 生細胞染色実験の結果は、図１Ａ−Ｄに提供される。図１Ａは、標識した抗体
で染色した細胞を示し、これは、膜レセプターに結合し、従って、細胞全体を明
るくする。図１Ａにおいて、細胞全体は、明らかに目に見える。比較として、そ
れぞれＢｏｎａ １２、Ｂｏｎａ２４およびＢｏｎａ２５で染色した細胞を示す
図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄにおいて、染色された領域は、はるかにより小さく、よ
り局在化しており、このことは、この色素が核膜を浸透し、細胞の核を染色する
ことを示す。ＳＹＴＯ ６１（登録商標）で染色した細胞において（図１Ｅ）、
細胞のより大きな領域は、目に見え、標識化抗体で染色した細胞によく似ていた
。 従って、この実験は、本発明の色素が、市販の赤色発光色素ＳＹＴＯ ６１（登
録商標）より、鮮やかでかつ核酸に対してより特異的であることを証明する。

【００９６】 （６．５ 本発明の色素は、利用可能な赤色発光生細胞核酸染色より、鮮やか
であり、優れた染色速度を有する） ＨＣＴ−１１６細胞を、前出の節６．３．１に記載されるように、０．１５６
ｎＭの色素Ｂｏｎａ １２、Ｂｏｎａ ２５およびＳＹＴＯ ６１（登録商標）
で染色し、平均蛍光を時間の関数として記録した。時間依存蛍光のグラフを、図
２に示す。ほとんど全ての時点において、本発明の色素は、ＳＹＴＯ ６１（登
録商標）より鮮やかなシグナルを生成し、このことは、本発明の色素が、ＳＹＴ
Ｏ ６１（登録商標）より速く細胞膜を浸透することを示す。非常に驚くべきこ
とに、２００分において、Ｂｏｎａ １２からの蛍光シグナルは、ＳＹＴＯ ６
１（登録商標）の蛍光シグナルより４桁以上大きく；Ｂｏｎａ ２５からのシグ
ナルは、ＳＹＴＯ ６１（登録商標）の蛍光シグナルより３桁以上大きかった。

【００９７】 より速い浸透速度およびより鮮やかなシグナルはまた、より高い色素濃度で観
察される。４０ｎＭの色素を使用する同様の実験（結果は示されない）において
、ＳＹＴＯ ６１（登録商標）に対して１〜２時間と比較して、ＨＣＴ−１１６
細胞をＢｏｎａ ２５で検出可能なレベルにまで標識するのにたったの５分しか
かからなかった。

【００９８】 本発明の新規の［８，９］ベンゾフェノキサジン色素が、蛍光生細胞核酸染色
の新規かつ重要なクラスを提供することは、上記の種々の実験から明らかである
。この新規な色素は、市販のＳＹＴＯ ６１（登録商標）より、顕著に速い速度
および鮮やかな蛍光を提供し、これによって、少ない色素を使用する生細胞アッ
セイにおけるのＤＮＡの迅速な検出が可能となる。この色素はまた、それらの赤
色励起および発光スペクトル特性に起因して、有意な利点を提供する。スペクト
ルの可視赤色領域における励起は、有利である。なぜなら、それは、細胞中に通
常見られる発色団（例えば、フラビン、ポルフィリンなど）からの自己蛍光、水
のラマン散乱およびアッセイ装置（例えば、プラスチック）によって寄与される
蛍光を最小化するためである。従って、緑色で自己蛍光発光する多くの化合物お
よび／または物質は、赤色において透明であり、それによって、バックグラウン
ドシグナルを減少させ、また、細胞内の化合物のアッセイをクエンチする可能性
を最小化する。スペクトルの可視赤色領域内の発光は、有利である。なぜなら、
それは、より低いコストの検出装置の使用を可能にするためである。従って、本
発明の新規の色素は、インビトロおよびインビボの両方の核酸染色適用において
有意な利点を提供する。

【００９９】 本明細書中に言及される全ての公報、特許および特許出願は、各個々の公報、
特許または特許出願が、特にかつ個々に参考として援用されることが示されるよ
うに、同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。

【０１００】 本発明は、ここで、完全に記載されているが、多くの変更および改変が特許請
求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者にと
って明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、０．５７μｇ／ｍＬのＣｙ５標識抗体抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃで染色
したＨＣＴ−１１６細胞の写真である。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、２０ｎＭ Ｂｏｎａ１２で染色したＨＣＴ−１１６細胞の写真であ
る。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、２０ｎＭ Ｂｏｎａ２４で染色したＨＣＴ−１１６細胞の写真であ
る。

【図１Ｄ】 図１Ｄは、２０ｎＭ Ｂｏｎａ２５で染色したＨＣＴ−１１６細胞の写真であ
る。

【図１Ｅ】 図１Ｅは、４ｎＭ ＳＹＴＯ６１（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色したＨＣＴ−１１６細胞の写真である。

【図２】 図２は、市販のＳＹＴＯ６１（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と比較して、色素Ｂｏｎａ１２およびＢｏｎａ２５を
用いて達成されるより速い染色速度およびより鮮やかな蛍光シグナルを示すグラ
フである（全ての色素０．１５６ｎＭ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/48 Ｐ 27/447 33/50 Ｐ 33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/50 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｇ ３０１Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミラグリア， シェリ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303， パロ アルト， クララ ドライブ 907 (72)発明者 ユアン， パウ ミアウ アメリカ合衆国 カリフォルニア 95129， サン ノゼ， ジョンソン アベニュー 1249 Ｆターム(参考） 2G045 BA14 BB25 CB01 DA13 DA14 FA11 FA37 FB05 FB12 GC15 2G054 AA06 AA08 CA21 CA22 CE02 EA03 GA03 GA05 GB02 GB10 4B024 AA11 CA01 CA11 HA13 4B063 QA01 QA11 QA18 QQ08 QQ20 QQ42 QQ52 QR66 QS36 QX02 4C056 AA02 AB01 AC03 AD07 AD08 AE03 AF01 AF05 EA01 EB01 EC01 ED08

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の構造式（Ｉ）： 【化１】 に従い、任意の付随の対イオンを含むベンゾフェノキサジン化合物であって、 ここで、 Ｒ¹は、単独の場合、水素、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−
   ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から
   選択されるか、あるいはＲ²と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは
   同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノで
   あり； Ｒ²は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
   ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
   か、あるいはＲ¹と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかもし
   くは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； Ｒ³は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルおよび（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリー
   ルからなる群から選択されるか、あるいはＲ^3'と一緒になる場合、（Ｃ₂−Ｃ₈）
   アルキルジイルであり； Ｒ^3'は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルおよび（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリ
   ールからなる群から選択されるか、あるいはＲ³と一緒になる場合、（Ｃ₂−Ｃ₈
   ）アルキルジイルであり； Ｒ⁴は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、
   −ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され； Ｒ⁶は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、
   −ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され； Ｒ⁷は、合計で約４〜２０個の水素ではない原子、および約ｐＨ６〜ｐＨ９の
   範囲内のｐＨで正に荷電される１〜４個のヘテロ原子を含む脂肪族カチオン性鎖
   であり； Ｒ¹¹は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
   ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
   か、あるいはＲ¹²と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかも
   しくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； Ｒ¹²は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
   ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
   か、あるいはＲ¹¹またはＲ¹³と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまた
   は同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノ
   であり； Ｒ¹³は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
   ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
   か、あるいはＲ¹²またはＲ¹⁴と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまた
   は同じかもしくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノ
   であり； Ｒ¹⁴は、単独の場合、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−
   ＮＲ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択される
   か、あるいはＲ¹³と一緒になる場合、（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノまたは同じかも
   しくは異なるＷ基の１個以上で置換された（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリーレノであり； 各々のＷは、独立して、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ
   ’Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ₂および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’からなる群から選択され；そし
   て、 各Ｒ’は、独立して、水素または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである、 ベンゾフェノキサジン化合物。
2. 【請求項２】 膜浸透性である、請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化
   合物。
3. 【請求項３】 Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁴およびＲ⁶が、各々水素である、請求項１に記
   載のベンゾフェノキサジン化合物。
4. 【請求項４】 Ｒ³およびＲ^3'が、各々独立して、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルで
   ある、請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物。
5. 【請求項５】 Ｒ¹が、Ｒ²と一緒になる場合、ベンゾ、［１，２］ナフタレ
   ノまたは［２，３］ナフタレノである、請求項１に記載のベンゾフェノキサジン
   化合物。
6. 【請求項６】 Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³およびＲ¹⁴が、各々水素である、請求項１
   に記載のベンゾフェノキサジン化合物。
7. 【請求項７】 Ｒ¹¹が、Ｒ¹²と一緒になる場合、ベンゾである、請求項１に
   記載のベンゾフェノキサジン化合物。
8. 【請求項８】 Ｒ¹²が、Ｒ¹³と一緒になる場合、ベンゾである、請求項１に
   記載のベンゾフェノキサジン化合物。
9. 【請求項９】 Ｒ¹³が、Ｒ¹⁴と一緒になる場合、ベンゾである、請求項１に
   記載のベンゾフェノキサジン化合物。
10. 【請求項１０】 Ｒ⁷が、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ
    −（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲおよび−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（
    ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲからなる群から選択され、ここで、各ｎが、独立して２〜３
    の整数であり、各Ｒが、独立して、水素および（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルからなる群
    から選択される、請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物であって、
    該化合物は、以下の構造式（ＩＩ）： 【化２】 に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、 ここで、Ｒ⁷が、合計で約４〜２０個の水素ではない原子、および約ｐＨ６〜
    ｐＨ９の範囲内のｐＨで正に荷電される１〜４個のヘテロ原子を含む脂肪族カチ
    オン性鎖である、ベンゾフェノキサジン化合物。
12. 【請求項１２】 膜浸透性である、請求項１１に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
13. 【請求項１３】 Ｒ⁷が、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ
    −（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲおよび−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（
    ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲからなる群から選択され、ここで、各ｎが、独立して２〜３
    の整数であり、各Ｒが、独立して、水素および（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルからなる群
    から選択される、請求項１１に記載のベンゾフェノキサジン化合物。
14. 【請求項１４】 以下の構造式： 【化３】 を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項１１に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
15. 【請求項１５】 以下の構造式： 【化４】 を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項１１に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物であって、
    該化合物は、以下の構造式（ＩＩＩ）： 【化５】 に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、 ここで、Ｒ⁷が、合計で約４〜２０個の水素ではない原子、および約ｐＨ６〜
    ｐＨ９の範囲内のｐＨで正に荷電される１〜４個のヘテロ原子を含む脂肪族カチ
    オン性鎖である、ベンゾフェノキサジン化合物。
17. 【請求項１７】 膜浸透性である、請求項１６に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
18. 【請求項１８】 Ｒ⁷が、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲ、−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ
    −（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲおよび−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（ＣＨ₂）_n−ＮＲＲ−（
    ＣＨ₂）_n−ＮＲＲＲからなる群から選択され、ここで、各ｎが、独立して２〜３
    の整数であり、各Ｒが、独立して、水素および（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルからなる群
    から選択される、請求項１６に記載のベンゾフェノキサジン化合物。
19. 【請求項１９】 以下の構造式： 【化６】 を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項１６に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
20. 【請求項２０】 以下の構造式： 【化７】 を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項１６に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
21. 【請求項２１】 以下の構造式： 【化８】 を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項１６に記載のベンゾフェノキサジ
    ン化合物。
22. 【請求項２２】 核酸を請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物と接
    触させる工程を包含する、核酸を染色する方法。
23. 【請求項２３】 前記核酸が、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項２
    ２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記核酸がＤＮＡである、請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記核酸がＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記核酸が生物学的構造に含まれる、請求項２２に記載の
    方法。
27. 【請求項２７】 前記生物学的構造が、細胞膜である、請求項２６に記載の
    方法。
28. 【請求項２８】 前記核酸が、マトリクス内に包埋される、請求項２２に記
    載の方法。
29. 【請求項２９】 前記マトリクスが、電気泳動ゲルである、請求項２２に記
    載の方法。
30. 【請求項３０】 生物学的サンプル中の核酸を染色する方法であって、該方
    法が、該生物学的サンプルを請求項１に記載のベンゾフェノキサジン化合物と接
    触させる工程を包含する、方法。
31. 【請求項３１】 前記生物学的サンプルが細胞全体を含み、前記ベンゾフェ
    ノキサジン化合物が膜浸透性である、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方
    法。
33. 【請求項３３】 前記核酸が、ＤＮＡである、請求項３０に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記細胞が、真核生物細胞である、請求項３１に記載の方
    法。