CN115340517B - 一种极性敏感阳离子荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞膜染料技术领域，尤其涉及一种极性敏感阳离子荧光染料及其制备方法和应用。本发明所述极性敏感阳离子荧光染料中带有两个以上正电荷，能够与细胞膜上的负电荷产生静电相互作用，从而使其能够在细胞膜上滞留的时间更长。同时本发明所述极性敏感阳离子荧光染料的近红外荧光指发射波长在650～900nm之间，其波长在传播过程中散射小，组织穿透能力强，进而能得到更深层次的信号，越有利于生物成像。因此，本发明所述极性敏感阳离子荧光染料具有更久的细胞膜滞留效果和更适合细胞成像的近红外荧光发射。
Description
技术领域
本发明涉及细胞膜染料技术领域，尤其涉及一种极性敏感阳离子荧光染料及其制备方法和应用。
背景技术
细胞膜是一种非常重要的细胞器，其主要是由磷脂双分子层组成，是活细胞与其周围环境之间的三维保护边界。细胞膜除了维持细胞相对独立的内环境以外，还参与了各种细胞过程和生物功能，如细胞信号转导、细胞粘附、胞吞、胞吐和物质选择性渗透等(Chem.sci,2018,9,3685-3693)。同时生物膜的极性、电位和黏度等物理状态随着细胞的凋亡、恶性增殖和受饥饿、氧化应激等刺激发生变化(J.Am.Chem.Soc.2021,143,912-924)。因此对细胞膜的物理状态如极性等的检测与分析对于理解细胞周期和应激反应等生理过程有着重要意义。
利用环境敏感的荧光团，如分子转子、机械敏感和溶剂变色染料等通过连接有带正电荷的亲脂基团，可以实现细胞膜膜上粘度(Phys.Chem.Chem.Phys.2015,17,18393-18402)、机械张力(Nat.Cell Biol.2020,22,947-959)和极性(Chem.Biol.2014,21,97-113.)的监测。然而，在荧光团上链接上带正电荷的亲脂基团的极性敏感染料在细胞膜上的滞留时间并不理想，而且需要增加染料的合成步骤导致这些染料商业化成本增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种极性敏感阳离子荧光染料及其制备方法和应用，所述极性敏感阳离子荧光染料具有更久的细胞膜滞留效果和更适合细胞成像的近红外荧光发射。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种具有细胞膜靶向能力的极性敏感阳离子荧光染料，具有式1～3任一项所示结构：
本发明还提供了上述技术方案所述极性敏感阳离子荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
将4-(二乙基氨基)水杨醛和乙酰基芳香烃混合后，在冰浴条件下滴加浓硫酸，进行环化反应后，加入高氯酸，进行沉淀反应，得到所述极性敏感阳离子荧光染料；
所述乙酰基芳香烃包括1,4-二乙酰苯、1,3,5-三乙酰苯或4,4'-二乙酰联苯。
优选的，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式1所示结构时，所述乙酰基芳香烃为1,4-二乙酰苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,4-二乙酰苯的摩尔比3:1。
优选的，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式2所示结构时，所述乙酰基芳香烃为4,4'-二乙酰联苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和4,4'-二乙酰联苯的摩尔比为3:1。
优选的，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式3所示结构时，所述乙酰基芳香烃为1,3,5-三乙酰苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,3,5-三乙酰苯的摩尔比为4:1。
优选的，所述乙酰基芳香烃和浓硫酸的用量比为1mmol：5mL。
优选的，所述环化反应的温度为90℃，时间为11～12h。
优选的，所述高氯酸的质量浓度为70.0～72.0％；
所述乙酰基芳香烃和高氯酸的用量比为1mmol：(1～2)mL。
本发明还提供了上述技术方案所述极性敏感阳离子荧光染料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的极性敏感阳离子荧光染料在荧光成像领域中的应用。
优选的，所述极性敏感阳离子荧光染料为细胞膜染色剂。
本发明提供了一种具有细胞膜靶向能力的极性敏感阳离子荧光染料，具有式1～3任一项所示结构：
本发明所述极性敏感阳离子荧光染料中带有两个以上正电荷，能够与细胞膜上的负电荷产生静电相互作用，从而使其能够在细胞膜上滞留的时间更长。进一步的，滞留时间越长越有利于实验过程对细胞膜的观察。同时，目前最常用的染料蓝绿光区(400～560)nm偏多，且由于生物体内有自发荧光也在蓝绿光区，会产生信号干扰，本发明所述极性敏感阳离子荧光染料的近红外荧光指发射波长在650～900nm之间，其波长在传播过程中散射小，组织穿透能力强，进而能得到更深层次的信号，越有利于生物成像。因此，本发明所述极性敏感阳离子荧光染料具有更久的细胞膜滞留效果和更适合细胞成像的近红外荧光发射。
附图说明
图1为M1的核磁共振氢谱；
图2为M1的核磁共振碳谱；
图3为M1的高分辨质谱；
图4为M2的核磁共振氢谱；
图5为M2的核磁共振碳谱；
图6为M2的高分辨质谱；
图7为M3的核磁共振氢谱；
图8为M3的核磁共振碳谱；
图9为M3的高分辨质谱；
图10为M1(10μM)在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中不断增加二氯甲烷含量的荧光发射光谱；
图11为M2(10μM)在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中不断增加二氯甲烷含量的荧光发射光谱；
图12为M3(10μM)在二氧六环和甲醇的混合溶剂中不断增加二氧六环含量的荧光发射光谱；
图13为M系列染料在HepG2细胞中与细胞膜定位剂DIO的共定位激光共聚焦成像图；
图14为不同染色时间下M2染料在HepG2细胞中与细胞膜定位剂DIO的共定位激光共聚焦成像图。
具体实施方式
本发明提供了一种具有细胞膜靶向能力的极性敏感阳离子荧光染料，具有式1～3任一项所示结构：
在本发明中，所述极性敏感阳离子荧光染料的荧光发射均处在生物自发背景荧光较低的红光区，其中具有式1所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M1)的荧光发射波长λem＝675nm；具有式2所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M2)的荧光发射波长λem＝635nm；具有式3所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M3)的荧光发射波长λem＝625nm。
本发明还提供了上述技术方案所述极性敏感阳离子荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
将4-(二乙基氨基)水杨醛和乙酰基芳香烃混合后，在冰浴条件下滴加浓硫酸，进行环化反应后，加入高氯酸，进行沉淀反应，得到所述极性敏感阳离子荧光染料；
所述乙酰基芳香烃包括1,4-二乙酰苯、1,3,5-三乙酰苯或4,4'-二乙酰联苯。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将4-(二乙基氨基)水杨醛和乙酰基芳香烃混合后，在冰浴条件下滴加浓硫酸，进行环化反应后，加入高氯酸，进行沉淀反应，得到所述极性敏感阳离子荧光染料；所述乙酰基芳香烃包括1,4-二乙酰苯、1,3,5-三乙酰苯或4,4'-二乙酰联苯。
在本发明中，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式1所示结构时，所述乙酰基芳香烃优选为1,4-二乙酰苯；所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,4-二乙酰苯的摩尔比优选为3:1。当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式2所示结构时，所述乙酰基芳香烃优选为4,4'-二乙酰联苯；所述4-(二乙基氨基)水杨醛和4,4'-二乙酰联苯的摩尔比优选为3:1。当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式3所示结构时，所述乙酰基芳香烃优选为1,3,5-三乙酰苯；所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,3,5-三乙酰苯的摩尔比优选为4:1。
本发明对所述混合的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
本发明对所述浓硫酸的浓度没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓度即可。
在本发明中，所述乙酰基芳香烃和浓硫酸的用量比优选为1mmol：5mL。
本发明对所述浓硫酸的加入方式没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式并能够保证在所述浓硫酸的加入过程中不产生爆沸即可。
所述浓硫酸加入完成后，本发明还优选包括静置使得到的反应体系稳定。
在本发明中，所述环化反应的温度优选为90℃；时间优选为11～12h。在本发明中，所述环化反应优选在油浴和搅拌的条件下进行；所述油浴的温度即为所述环化反应的温度；本发明对所述搅拌的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
在本发明中，优选通过TLC检测判断所述环化反应是否完成。
所述环化反应完成后，本发明还优选包括在搅拌的条件下将得到的产物体系倒入冰水中；所述浓硫酸与冰水的体积比优选为1:20。本发明对所述搅拌和所述冰水的倒入方式没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
在本发明中，所述高氯酸的质量浓度优选为70.0～72.0％。
在本发明中，所述乙酰基芳香烃和高氯酸的用量比优选为1mmol：(1～2)mL。
在本发明中，所述沉淀反应优选为在加入所述高氯酸的过程中同时发生。
所述沉淀反应完成后，本发明还优选包括依次进行的抽滤、干燥滤饼、溶解滤饼和柱层析洗脱；本发明对所述抽滤和干燥滤饼的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。在本发明中，所述溶解滤饼优选采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂进行溶解；所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为(15～20)：1。在本发明中，所述柱层析洗脱采用的洗脱液优选为甲醇和乙酸的二氯甲烷溶液；所述甲醇的体积浓度优选为3.5％，所述乙酸的体积浓度优选为0.5％。所述柱层析洗脱采用的硅胶优选为200～300目的硅胶。
本发明还提供了上述技术方案所述极性敏感阳离子荧光染料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的极性敏感阳离子荧光染料在荧光成像领域中的应用。
在本发明中，所述极性敏感阳离子荧光染料优选为细胞膜染色剂。
下面结合实施例对本发明提供的极性敏感阳离子荧光染料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
具有式1所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M1)的制备：
向25mL单颈烧瓶中加入4-(二乙基氨基)水杨醛(3.0mmol,579.7mg)和1,4-二乙酰苯(1.0mmol,162.19mg)，然后在冰浴条件缓慢加入5mL浓硫酸。待反应体系稳定后，将烧瓶移至90℃油浴中持续搅拌11小时。TLC反应完成后，在持续搅拌下将反应混合物倒入约100mL冰水中，然后在冰水中加入1.5mL高氯酸(质量浓度为70.0～72.0％)，形成絮凝沉淀，抽滤并收集滤饼。滤饼干燥过夜后，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂将滤饼溶解。然后以含3.5v/v％甲醇和0.5v/v％乙酸的二氯甲烷为洗脱液经硅胶(200～300目)柱层析洗脱收集得紫黑色固体产物(M1)496mg(收率：73.2％)；
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.89(d,J＝7.2Hz,1H),δ8.60(s,2H),δ8.36(d,J＝7.2Hz,1H),δ8.09(d,J＝9.0Hz,1H),δ7.65(d,J＝9.6Hz,1H)δ7.50(s,1H),δ3.80(s,4H),δ1.31(d,J＝15.6Hz 6H)；(如图1所示)13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ163.33,159.95,157.40,148.77,134.07,133.29,128.75,121.39,120.22,111.09,96.55,46.55,12.57.(如图2所示)HR-MS(ESI),m/z:[M]2+calcd for C32H34N2O2 2+,239.1305；found,239.13098.(如图3所示)。
实施例2
具有式2所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M2)的制备：
向25mL单颈烧瓶中加入4-(二乙基氨基)水杨醛(3.0mmol,579.7mg)和4,4-二乙酰联苯(1.0mmol,238.3mg)，然后在冰浴条件缓慢加入5mL浓硫酸。待反应体系稳定后，将烧瓶移至90℃油浴中持续搅拌11小时。TLC反应完成后，在持续搅拌下将反应混合物倒入约100mL冰水中，然后在冰水中加入1.5mL高氯酸(质量浓度为70.0～72.0％)，形成絮凝沉淀，抽滤并收集滤饼。滤饼干燥过夜后，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂将滤饼溶解。然后以含3.5v/v％甲醇和0.5v/v％乙酸的二氯甲烷为洗脱液经硅胶(200～300目)柱层析洗脱收集得紫黑色固体产物(M2)508mg(收率：67.4％)；
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.88(d,J＝8.0Hz,1H),δ8.52(d,J＝8.8Hz,2H),δ8.28(d,J＝8.0Hz,1H),δ8.21(d,J＝8.4Hz,2H),δ8.08(d,J＝9.2Hz,1H),δ7.60(dd,J1＝9.6Hz,J2＝2.4Hz,1H),δ7.46(d,J＝2.0Hz,1H),δ3.78(d,J＝6.8Hz,4H),δ1.29(s,6H)；(如图4所示)13C-NMR(100MHz,DMSO-d6):δ164.94,159.78,157.02,149.21,143.44,133.11,130.10,128.87,128.53,120.39,119.56,110.05,96.41,46.21,13.55,12.54；(如图5所示)HR-MS(ESI),m/z:[M]2+calcd for C38H38N2O2 2+,277.1461；found,277.1463.(如图6所示)。
实施例3
具有式3所示结构的极性敏感阳离子荧光染料(记为M3)的制备：
向25mL单颈烧瓶中加入4-(二乙基氨基)水杨醛(4.0mmol,772.4mg)和1,3,5-三乙酰苯(1.0mmol,204.2mg)，然后在冰浴条件缓慢加入5mL浓硫酸。待反应体系稳定后，将烧瓶移至90℃油浴中持续搅拌12小时。TLC反应完成后，在持续搅拌下将反应混合物倒入约100mL冰水中，然后在冰水中加入1.5mL高氯酸(70.0～72.0％)，形成絮凝沉淀，抽滤并收集滤饼。滤饼干燥过夜后，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂将滤饼溶解。然后以含3.5v/v％甲醇和0.5v/v％乙酸的二氯甲烷为洗脱液经硅胶(200～300目)柱层析洗脱收集得紫黑色固体产物(M3)650mg(收率：66.5％)；
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.26(s,3H),δ8.99(d,J＝8Hz,3H),δ8.51(d,J＝8Hz,3H),δ8.12(d,J＝9.6Hz,3H),δ7.69(dd,J1＝9.2Hz,J2＝1.2Hz,3H),δ7.55(s,3H),δ3.83(s,12H),δ1.26(t,J＝5.2Hz 18H)；(如图7所示)13C-NMR(100MHz,DMSO-d6):δ162.15,159.94,157.61,148.74,133.45,132.99,129.48,121.75,120.56,110.90,96.77,46.47,13.59,12.58；(如图8所示)HR-MS(ESI),m/z:[M]3+calcd for C45H48N3O3 3+,226.1226；found,226.1228.(如图9所示)。
测试例1
M1在甲醇与二氯甲烷的混合体系中的荧光发射光谱：
用分析天平称取M1并将其溶解在分析纯的DMSO中，配置成4mM的M1储备液待用。然后配置不同比例的二氯甲烷与甲醇的体系2992.5μL(二氯甲烷体积含量从0％～100％)，取7.5μL M1储备液加入到2992.5μL的甲醇与二氯甲烷混合测试体系中并混合均匀，最后得到终浓度为10μM的M1测试液。将10μM的M1测试液转移至10×10mm的石英比色皿中，设置测试参数(激发波长590nm，激发带宽和发射带宽均为10nm，电压900V)后进行荧光测试并记录荧光光谱(如图10所示)，由图10可知，从甲醇(大极性)到二氯甲烷(小极性)M1在675nm处的荧光强度呈现84倍的增强，因此M1可以通过荧光强度的变化灵敏的显示测试体系极性的变化。
M2在甲醇与二氯甲烷的混合体系中的荧光发射光谱
用分析天平称取M2并将其溶解在分析纯的DMSO中，配置成4mmol/L的M2储备液待用。然后配置不同比例的二氯甲烷与甲醇的体系2992.5μL(二氯甲烷体积含量从0％～100％)，取7.5μLM2储备液加入到2992.5μL的甲醇与二氯甲烷混合测试体系中并混合均匀，最后得到终浓度为10μmol/L的M2测试液。将10μmol/L的M2测试液转移至10×10mm的石英比色皿中，设置测试参数(激发波长560nm，激发带宽5nm和发射带宽10nm，电压650V)后进行荧光测试并记录荧光光谱(如图11所示)，由图11可知，从甲醇(大极性)到二氯甲烷(小极性)M2在635nm处的荧光强度呈现64倍的增强，因此M2可以通过荧光强度的变化灵敏的显示测试体系极性的变化。
M3在甲醇与1,4-二氧六环的混合体系中的荧光发射光谱：
用分析天平准确称取M3并将其溶解在分析纯的DMSO中，配置成4mmol/L的M3储备液待用。然后配置不同比例的1,4-二氧六环与甲醇的体系2992.5μL(1,4-二氧六环的体积含量从0％-100％)，取7.5μL M3储备液加入到2992.5μL的甲醇与1,4-二氧六环混合测试体系中并混合均匀，最后得到终浓度为10μmol/L的M3测试液。将10μmol/L的M3测试液转移至10×10mm的石英比色皿中，设置测试参数(激发波长550nm，激发带宽10nm和发射带宽10nm，电压900V)后进行荧光测试并记录荧光光谱(如图12所示)，由图12可知，从甲醇(大极性)到1,4-二氧六环(小极性)M3在625nm处的荧光强度呈现185倍的增强，因此M3可以通过荧光强度的变化灵敏的显示测试体系极性的变化。
测试例2
对HepG2细胞细胞膜进行特异性标记的荧光成像：
将生长状态良好的贴壁的肝癌细胞(HepG2)铺板至35mm共聚焦成像培养皿中培养12小时，成像时的细胞密度约为1×103/cm2。将测试例1中4mmol/L的M系列染料(M1、M2和M3)和细胞膜定位剂DIO的储备液稀释至0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(1×PBS)中配置成终浓度均为5μmol/L的细胞染色工作液。弃去共聚焦成像培养皿中的细胞培养液，加入1mL多聚甲醛水溶液(0.4wt％)固定细胞约15分钟后弃去甲醛溶液。将1mL染色工作液加入到共聚焦成像培养皿中染色10分钟后，直接使用共聚焦成像荧光显微镜对细胞进行成像并收集荧光成像图(如图13所示)。由图13可知，M系列染料在极性环境中(PBS缓冲液)几乎无荧光发射，只有在结合了细胞膜上的非极性部分(磷脂的疏水区域)才会发射明亮的红色/近红外荧光，因此其背景荧光很弱可以实现免洗的细胞成像。明显的M1，M2，M3均具有细胞膜定位能力，而且其在膜上的集中程度要略好于商业性的细胞膜染色剂DIO；
不同染色时间下M2与DIO染料对HepG2细胞细胞膜标记的荧光成像：
将生长状态良好的贴壁的肝癌细胞(HepG2)铺板至35mm共聚焦成像培养皿中培养12小时，成像时的细胞密度约为1×103/cm2。将实施例2中4mmol/L的M2和DIO的储备液稀释至0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(1×PBS)中配置成终浓度均为5μmol/L的细胞染色工作液。弃去共聚焦成像培养皿中的细胞培养液，加入1mL多聚甲醛水溶液(0.4％)固定细胞约15分钟后弃去甲醛溶液。将1mL染色工作液加入到共聚焦成像培养皿中染色后，直接使用共聚焦成像荧光显微镜对细胞进行成像并收集在5分钟、10分钟、和15分钟时的荧光成像图(如图14所示)。由图14可知，5分钟时M2与DIO均集中于细胞膜上并未见明显扩散；10分钟时DIO出现小部分扩散而M2未见明显扩散，15分钟时DIO出现大面积扩散明而M2仅有小部分发生扩散。明显的M2在细胞膜上的扩散速度小于DIO，M2能够在细胞膜上滞留更长时间，以实现更好的细胞膜定位能力。
综上可知，本发明所述M系列染料具有合成过程简单、收率高和极性敏感特征，同时还具有优于商业性细胞膜染色剂DIO的细胞膜定位能力。因此该系列染料在精细化工上具有商业化应用的潜质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种具有细胞膜靶向能力的极性敏感阳离子荧光染料，其特征在于，具有式1～3任一项所示结构：
2.权利要求1所述极性敏感阳离子荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将4-(二乙基氨基)水杨醛和乙酰基芳香烃混合后，在冰浴条件下滴加浓硫酸，进行环化反应后，加入高氯酸，进行沉淀反应，得到所述极性敏感阳离子荧光染料；
所述乙酰基芳香烃为1,4-二乙酰苯、1,3,5-三乙酰苯或4,4'-二乙酰联苯。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式1所示结构时，所述乙酰基芳香烃为1,4-二乙酰苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,4-二乙酰苯的摩尔比3:1。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式2所示结构时，所述乙酰基芳香烃为4,4'-二乙酰联苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和4,4'-二乙酰联苯的摩尔比为3:1。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述极性敏感阳离子荧光染料具有式3所示结构时，所述乙酰基芳香烃为1,3,5-三乙酰苯；
所述4-(二乙基氨基)水杨醛和1,3,5-三乙酰苯的摩尔比为4:1。
6.如权利要求2～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰基芳香烃和浓硫酸的用量比为1mmol：5mL。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应的温度为90℃，时间为11～12h。
8.如权利要求2～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述高氯酸的质量浓度为70.0～72.0％；
所述乙酰基芳香烃和高氯酸的用量比为1mmol:(1～2)mL。
9.权利要求1所述极性敏感阳离子荧光染料或权利要求2～8任一项所述的制备方法制备得到的极性敏感阳离子荧光染料在制备细胞膜染色剂中的应用。
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