CN107602498B - 一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，公开了一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用。所述荧光探针的系统命名为3,3'‑({5‑[3‑(4‑羟苯基)脲基]‑5H‑苯并[α]吩恶嗪‑9‑基}氮烷二基)二丙酸甲酯，其结构式如式(Ⅰ)所示。本发明荧光探针化合物可用于酪氨酸酶的定性和定量分析，具有良好的检测精度、准确性和很好的抗干扰性。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用。
背景技术
酪氨酸酶也称为多酚氧化酶，是一种金属酶，在它的活性中心含有两个铜离子，这两个铜离子分别与酶分子中的组氨酸结合。酪氨酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在动物和微生物中被称为酪氨酸酶，而在植物中一般被称为多酚氧化酶，在不同来源的酪氨酸酶会具有不同的理化性质。在植物中，酪氨酸酶对L-多巴、酚类、木质素等物质的合成起着重要的作用。并且，酪氨酸酶与水果和蔬菜的褐变也有很大的关系。因此对酪氨酸酶的活性检测和调节等进行研究，在食品保鲜、环境监测等多个领域有重要的意义。
目前国内外已经有报道的关于酪氨酸酶的活性测定的方法主要包括分光光度法、荧光检测法、电化学检测法、高效液相色谱法等。
高效液相色谱法用于检测酪氨酸酶，用C18反相色谱柱，先用缓冲液作溶剂，设定流速和柱温。淋洗一段时间后，改变线性梯度，淋洗几分钟。之后柱子用淋洗液冲洗，冲洗完后，继续用开始条件淋洗。在通过UV探测器后，柱子流出物通过在放射化学探测器中的一个250uL流动池收集，作为液体闪烁体。高效液相色谱法检测过程繁琐，且易受干扰。
分光光度法是利用酪氨酸酶催化底物(目前常用底物有L-左旋多巴、邻苯二酚、酪胺等)氧化生成具有棕褐色的相应醌类或者二酚的反应，后者在其特征波长处具有明显的光吸收，因此，根据吸光度与醌类物质浓度之间的线性关系计算出酪氨酸酶的活性。该方法的显著不足之处是灵敏度较低，检测下限较高。
电化学方法用于检测酪氨酸酶：酪氨酸酶催化底物发生氧化还原反应的过程中会有电子的传递，该电子转移所产生的电流可通过伏安法检测电流强度获得伏安图谱。加入不同浓度的酪氨酸酶对应产生的电流信号强度也会不同，因此可与酪氨酸酶浓度之间建立线性关系，进而计算出酪氨酸酶活性。
近年来，荧光法作为一种新型的检测手段备受关注，其具有选择性好、灵敏度高以及即时检测、响应快、设备简单等特点。同时，荧光化合物在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要。因此，荧光法非常适合于酪氨酸酶的分析检测。中国专利(申请号：201610663952.0)制备了一种花菁类小分子探针，该探针能产生很强的荧光信号，在酪氨酸酶的存在下，加入探针，在670nm的激发光照射下，可在700-720nm波长范围发射荧光，从而实现了对酪氨酸酶的荧光增强型检测；但是该荧光探针检测灵敏度欠佳，且其合成步骤繁琐，不适于精确检测酪氨酸酶。研究论文(Analytical chemical,2016,88,4557-4564)报道了一种基于萘二甲酰胺衍生物的荧光探针，该探针在550nm处几乎没有荧光；体系中有酪氨酸酶存在时，氧气将探针分子中的酚羟基氧化成苯醌，进而发生分子内电荷重排，释放出具有荧光的萘二甲酰胺衍生物试卤灵，在425nm的激光照射下，该探针分子在550nm处发射绿色荧光，实现了对酪氨酸酶的荧光恢复型检测；但该荧光探针易受外界因素干扰，难以实现对酶的准确分析。
综上所述，本领域急需发展一种抗干扰性强、准确度高、简便且高效的酪氨酸酶检测方法。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种荧光探针。
本发明的另一目的在于提供上述荧光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光探针在酪氨酸酶检测中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种荧光探针，该荧光探针的系统命名为3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯，其结构式如式(Ⅰ)所示：
上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4-氨基苯酚和咪唑溶于有机溶剂1中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)反应，产物经分离纯化，得到4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺；
(2)将步骤(1)所得4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和三光气溶于有机溶剂2，在惰性气体的保护下，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，得到中间产物；
(3)在惰性气体的保护下，将9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐(其制备方法见文献：Ma H,Zhang J,Zhang Z,et al.A fast response andred emission probe for mammalian thioredoxin reductase[J].ChemicalCommunications,2016,52(81):12060-12063.)溶于有机溶剂2，加入碱性有机化合物，然后加入步骤(2)所得中间产物进行反应，产物经分离纯化，得到3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯；
(4)将3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于有机溶剂3中，加入正丁基氟化铵(TABPF)反应，产物经分离纯化，得到所述荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯。
优选地，步骤(1)中所述有机溶剂1为四氢呋喃(THF)，所述的反应是指在室温条件下反应30-60min。
优选地，步骤(1)中所述4-氨基苯酚与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1:(1.3-1.4)，所述4-氨基苯酚与咪唑的摩尔比为1:(1.5-1.6)；所述4-氨基苯酚与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(3.5-4)ml。
优选地，步骤(2)和(3)中所述有机溶剂2为二氯甲烷；步骤(2)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应1h，然后在室温条件反应2-3h；步骤(3)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应30min，然后在室温条件下反应24h。
优选地，步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与三光气的摩尔比为1:4；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:6；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:(45-60)ml。
优选地，步骤(3)中所述碱性有机化合物为三乙胺。
优选地，步骤(3)中所述9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐与步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的摩尔比为(1.1-1.2):1；所述三乙胺与4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的体积摩尔比为(0.15-0.2)ml:1mmol。
优选地，步骤(4)中所述有机溶剂3为四氢呋喃(THF)，所述的反应是指在室温条件下反应3-5h。
优选地，步骤(4)中所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与正丁基氟化铵的摩尔体积比为1mmol:(0.5-1)ml；所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(100-120)ml。
优选地，步骤(1)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用乙酸乙酯萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(3)所述分离纯化步骤为：反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(4)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。
本发明所得产物荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯，分子式为C30H31N4O7，相对分子质量为570.21。该化合物光稳定性好，无毒。
上述荧光探针的制备方法的合成路线图如图1所示。
上述荧光探针在酪氨酸酶检测中的应用。该探针在酪氨酸酶存在条件下会与其快速发生反应，生成9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐，其在580nm的激发光照射下，在660nm左右发射强烈的红色荧光实现荧光的恢复。本发明荧光探针化合物可用于酪氨酸酶的定性和定量分析。
本发明的制备方法及所得到的荧光探针具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的荧光探针化合物在酪氨酸酶存在的条件下会使酚羟基被氧气氧化为苯醌，继而分子内电荷重排，同时发生1,6消除反应，并使荧光分子9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐荧光恢复。因此该探针可实现对酪氨酸酶的荧光恢复型检测，并且随着酪氨酸酶浓度的增加，红色荧光逐渐增强。这种荧光恢复型的检测模式较为直观，荧光发射明显且易于观测，提高了检测精度和准确性。在一定的浓度下，荧光强度与检测物浓度存在较好的线性关系，可用于定量检测。
(2)本发明的荧光探针化合物对酪氨酸酶检测具有较好的抗干扰性，常见的其他离子或化合物无法催化探针中的氨基甲酸酯键的断裂，因此荧光信号出现，说明该探针具有很好的抗干扰性，可特异性用于酪氨酸酶的检测。
(3)本发明所得荧光探针的检测体系构建了一种准确性高的检测酪氨酸酶的方法，其使用方便，便于推广应用。
(4)本发明的荧光探针的制备方法工艺较为简便，产率较高。
附图说明
图1为本发明所述荧光探针的制备方法的合成路线图；
图2为实施例1中4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯的核磁共振氢谱图；
图4为实施例1中3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯的核磁共振氢谱图；
图5为实施例1的荧光探针对酪氨酸酶响应不同时间的荧光光谱图；
图6中(a)为实施例1的荧光探针对不同浓度酪氨酸酶响应的荧光光谱图，(b)为实施例1的荧光探针的荧光强度与不同浓度酪氨酸酶之间的关系图；
图7为实施例1的荧光探针与酪氨酸酶反应前(探针)和反应后(探针+酶)的荧光强度与pH之间的关系图；
图8为实施例1的荧光探针抗干扰性测试柱状图，即探针的荧光强度与不同离子、化合物之间的关系图(1.空白样，2.酪氨酸酶，3.KCl，4.ZnSO4，5.CuSO4，6.CaCl2，7.MgCl2，8.FeCl3，9.葡萄糖，10.胎牛血清，11.HOCl，12.H2O2，13.凝血酶，14.谷胱甘肽，15.羧酸酯酶，16.亮氨酸氨基肽酶)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将1.0g 4-氨基苯酚和0.936g咪唑溶于四氢呋喃中，加入1.797g叔丁基二甲基氯硅烷，快速搅拌生成白色沉淀后，继续反应30分钟，旋蒸除去溶剂，水洗，再用乙酸乙酯萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯，V/V＝10:1)，得到无色粘稠状产物4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺1.842g(产率为90.0％)；通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，核磁共振氢谱图如图2所示；
(2)将0.210g 4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和1.117g三光气溶于15ml二氯甲烷，在惰性气体的保护下，逐滴加入959μl N,N-二异丙基乙胺的有机溶液，先低温(-5℃-0℃)反应1小时，再室温反应2小时，减压旋干，得到反应中间产物；
(3)在惰性气体的保护下，将0.449g 9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐(其制备方法见文献：Ma H,Zhang J,Zhang Z,et al.A fastresponse and red emission probe for mammalian thioredoxin reductase[J].Chemical Communications,2016,52(81):12060-12063.)溶于15ml二氯甲烷，加入141μl三乙胺，将步骤(2)所得反应中间产物溶于15ml二氯甲烷逐滴滴加，先低温(-5℃-0℃)反应30分钟，再室温反应24小时，反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:40)，得到有紫红色固体产物3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯0.491mg(产率为76.2％)；通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，核磁共振氢谱图如图3所示；
(4)将0.1g 3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于15ml四氢呋喃中，加入73μl正丁基氟化铵，室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:50)，得到紫红色的检测酪氨酸酶的荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯0.055g(产率为66.0％)；通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，核磁共振氢谱图如图4所示。
从图2的测试结果可知：1H NMR(600MHz,DMSO)：δ6.41(d，J＝9Hz，1H),6.33(d,J＝9Hz,1H),4.50(s,2H),0.82(s,9H),0.00(s,6H)；其中，6.41ppm、6.33ppm处对应为苯环上质子特征峰，4.50ppm处对应为苯环所连氨基上质子特征峰，0.82ppm处对应为叔丁基质子特征峰，0.00处对应为硅甲基质子特征峰；通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。
从图3的测试结果可知：1H NMR(600MHz,DMSO)：δ9.54(s,1H),8.35(s,1H),8.23(d，J＝7.8Hz,1H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),7.54(t，J＝7.8Hz,1H),7.38(d，J＝8.4Hz,2H),6.62(d，J＝8.4Hz,2H),6.58(s,1H),6.42(s,2H),3.52(s,4H),3.43(s,6H),2.44(s,4H),0.77(s,9H),0.00(s,6H)。其中9.54ppm、8.35ppm、8.23ppm、7.59ppm、7.54ppm、7.38ppm、6.62ppm、6.42ppm处对应为苯环质子特征峰，6.58ppm对应乙烯基质子特征峰，3.52ppm、2.44ppm处对应为亚甲基质子特征峰，3.43ppm、0.77ppm、0ppm处对应为甲基质子特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。
从图4的测试结果可知：1H NMR(600MHz,DMSO)：δ9.60(s,1H),9.14(s,1H),8.56(d,J＝7.8Hz,1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝6.8Hz,1H),7.76–7.70(m,1H),7.58(d,J＝9.0Hz,H),7.46(d,J＝8.8Hz,2H),6.79(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.68–6.63(m,1H),6.64–6.58(m,1H),3.71(t,J＝7.1Hz,4H),3.61(s,6H),2.63(t,J＝11.4Hz,4H)。其中9.60ppm处对应为羟基质子特征峰，9.14ppm、8.56ppm、8.43ppm、7.79ppm、7.76-7.70ppm、7.58ppm、7.46ppm、6.79ppm、6.72ppm处对应为苯环质子特征峰，6.68-6.63ppm处对应为乙烯基质子特征峰，6.64-6.58ppm处对应为季碳质子特征峰，3.71ppm、2.63ppm处对应为亚甲基质子特征峰，3.61ppm处对应为甲基质子特征峰；通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。此外，还通过质谱对本实施例制备的荧光探针进行了辅助证明，MS(ESI):m/z 569.2042[M-H]+。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物目标化合物。
实施例2
(1)将1.0g 4-氨基苯酚和0.967g咪唑溶于四氢呋喃中，加入1.866g叔丁基二甲基氯硅烷，快速搅拌生成白色沉淀后，继续反应45分钟，旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯，V/V＝10:1)，得到无色粘稠状产物4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺1.887g(产率为92.2％)；
(2)将0.210g 4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和1.117g三光气溶于15ml二氯甲烷，在惰性气体的保护下，逐滴加入959μl N，N-二异丙基乙胺的有机溶液，先低温反应1小时，再室温反应2.5小时，减压旋干，得到反应中间产物；
(3)在惰性气体的保护下，将0.470g 9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐溶于20ml二氯甲烷，加入180μl三乙胺，将步骤(2)所得反应中间产物溶于15ml二氯甲烷逐滴滴加，先低温反应30分钟，再室温反应24小时，反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:40)，得到有紫红色固体产物3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯0.431g(产率为66.9％)；
(4)将0.1g 3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于16ml四氢呋喃中，加入110μl正丁基氟化铵，室温反应4小时，旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:50)，得到紫红色的检测酪氨酸酶的荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯0.0575g(产率为69.0％)。
本实施例所得荧光化合物的中间体以及最终的化合物3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯的表征与实施例1中的结果是相同的。
实施例3
(1)将1.0g 4-氨基苯酚和0.998g咪唑溶于四氢呋喃中，加入1.932g叔丁基二甲基氯硅烷，快速搅拌生成白色沉淀后，继续反应1小时，旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯，V/V＝10:1)，得到无色粘稠状产物4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺1.862g(产率为91.1％)；
(2)将0.210g 4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和1.117g三光气溶于20ml二氯甲烷，在惰性气体的保护下，逐滴加入959μl N,N-二异丙基乙胺的有机溶液，先低温反应1小时，再室温反应3小时，减压旋干，得到反应中间产物；
(3)在惰性气体的保护下，将0.490g 9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐溶于20ml二氯甲烷，加入188μl三乙胺，将步骤(2)所得反应中间产物溶于20ml二氯甲烷逐滴滴加，先低温反应30分钟，再室温反应24小时，反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:40)，得到有紫红色固体产物3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯0.419g(产率为65.1％)；
(4)将0.100g 3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于17.5ml四氢呋喃中，加入146μl正丁基氟化铵，室温反应5小时，旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(甲醇:二氯甲烷，V/V＝1:50)，得到紫红色的检测酪氨酸酶的荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯0.059g(产率为70.8％)。
本实施例所得荧光化合物的中间体以及最终的化合物3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯的表征与实施例1中的结果是相同的。
性能测试：
对实施例1制备的荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯进行性能测试，测试结果如图5～图8所示。
1、测试步骤和条件分别为：取18个5ml样品瓶，分别加入2240uL的PBS、150uL的二甲基亚砜(DMSO)、酪氨酸酶600uL(该酪氨酸酶母液浓度为1000U/mL，是用pH＝7.4的PO4 3-浓度为10mM的PBS溶液配制)，在水浴锅中搅拌并控制温度为37℃，预热3min，然后分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的溶液10uL(该荧光探针母液浓度为1mM，是用二甲基亚砜配制)，最后分别测定探针与酪氨酸酶反应0min、1min、2min、3min、4min、5min、7min、9min、11min、13min、15min、20min、25min、30min、45min、60min、90min、120min，以580nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得18个样品的荧光发射光谱变化图，结果见图5。图5为实施例1的荧光探针对酪氨酸酶响应不同时间的荧光光谱图。
2、测试步骤和条件分别为：取10个5ml样品瓶，分别加入2840-2240uL的PBS，150uL的二甲基亚砜(DMSO)，相对应加入PBS的体积，酪氨酸酶分别加入0-600uL(该酪氨酸酶母液浓度为1000U/mL，是用pH＝7.4的PO4 3-浓度为10mM的PBS溶液配制)，在水浴锅中搅拌并控制温度为37℃，预热3min，然后分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的溶液10uL(该荧光探针母液浓度为1mM，是用二甲基亚砜配制)，最后分别测定探针与酪氨酸酶反应30min，以580nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得22个样品的荧光发射光谱变化图，见图6(a)。根据图6(a)在660nm荧光强度与初始荧光强度的变化可作出对应的拟合曲线，结果见图6(b)。图6(a)为实施例1的荧光探针对不同浓度酪氨酸酶响应的荧光光谱图，(b)为探针的荧光强度与初始荧光强度差对应的不同浓度酪氨酸酶之间的关系图。
3、测试步骤和条件分别为：取11个5ml样品瓶，分别加入2240uL的pH分别为2、3、4、5、6、7、7.4、8、9、10、11的PBS、150uL的二甲基亚砜(DMSO)、酪氨酸酶600uL(该酪氨酸酶母液浓度为1000U/mL，是用pH＝7.4的PO4 3-浓度为10mM的PBS溶液配制)，在水浴锅中搅拌并控制温度为37℃，预热3min，然后分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的溶液10uL(该荧光探针母液浓度为1mM，是用二甲基亚砜配制)，最后分别测定探针与酪氨酸酶反应30min，以580nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得11个样品的荧光发射光谱变化图，根据测得的荧光谱图在660nm处荧光强度作图，结果见图7。图7为实施例1的探针与酪氨酸酶反应前(探针)和反应后(探针+酶)的荧光强度与pH之间的关系图。
4、测试步骤和条件分别为：分别取16个5ml样品瓶，分别加入2140uL PBS，150uL的二甲基亚砜(DMSO)，酪氨酸酶600uL(该酪氨酸酶母液浓度为1000U/mL，是用pH＝7.4的PO4 3-浓度为10mM的PBS溶液配制)，再分别加入100uL的PBS，KCl、ZnSO4、CuSO4、CaCl2、MgCl2、FeCl3，(以上6种金属离子由PBS缓冲溶液配制，检测浓度为100mM)，H2O2、HOCl、胎牛血清(以上3种化合物由PBS缓冲溶液配制，检测浓度为100mM)，葡萄糖、谷胱甘肽(以上2种化合物由PBS缓冲溶液配制，检测浓度为50mM)，羧酸酯酶、亮氨酸氨基肽酶、凝血酶(以上3种化合物由PBS缓冲溶液配制，检测浓度为20U/L)，在水浴锅中搅拌并控制温度为37℃，预热3min，然后分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的溶液10uL(该荧光探针母液浓度为1mM，是用二甲基亚砜配制)，最后分别测定探针与酯酶反应120min，以580nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得16个样品的荧光发射光谱变化图，根据测得的荧光谱图在660nm处荧光强度的柱状图，结果见图8。图8为实施例1的探针抗干扰性测试柱状图：探针的荧光强度差(探针荧光强度与空白样荧光强度之差)与不同离子、化合物之间的关系图(1.空白样，2.酪氨酸酶，3.KCl，4.ZnSO4，5.CuSO4，6.CaCl2，7.MgCl2，8.FeCl3，9.葡萄糖，10.胎牛血清，11.HOCl，12.H2O2，13.凝血酶，14.谷胱甘肽，15.羧酸酯酶，16.亮氨酸氨基肽酶)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于：该荧光探针的系统命名为3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯，其结构式如式(Ⅰ)所示：
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将4-氨基苯酚和咪唑溶于有机溶剂1中，加入叔丁基二甲基氯硅烷反应，产物经分离纯化，得到4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺；
(2)将步骤(1)所得4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和三光气溶于有机溶剂2，在惰性气体的保护下，加入N，N-二异丙基乙胺反应，得到中间产物；
(3)在惰性气体的保护下，将9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐溶于有机溶剂2，加入碱性有机化合物，然后加入步骤(2)所得中间产物进行反应，产物经分离纯化，得到3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯；
(4)将3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于有机溶剂3中，加入正丁基氟化铵反应，产物经分离纯化，得到所述荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂1为四氢呋喃，所述的反应是指在室温条件下反应30-60min；所述4-氨基苯酚与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1:(1.3-1.4)，所述4-氨基苯酚与咪唑的摩尔比为1:(1.5-1.6)；所述4-氨基苯酚与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(3.5-4)ml。
3.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述有机溶剂2为二氯甲烷；步骤(2)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应1h，然后在室温条件反应2-3h；步骤(3)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应30min，然后在室温条件下反应24h。
4.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与三光气的摩尔比为1:4；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:6；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:(45-60)ml。
5.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述碱性有机化合物为三乙胺；步骤(3)中所述9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐与步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的摩尔比为(1.1-1.2):1；所述三乙胺与4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的体积摩尔比为(0.15-0.2)ml:1mmol。
6.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述有机溶剂3为四氢呋喃，所述的反应是指在室温条件下反应3-5h；所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与正丁基氟化铵的摩尔体积比为1mmol:(0.5-1)ml；所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(100-120)ml。
7.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用乙酸乙酯萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(3)所述分离纯化步骤为：反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(4)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。
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