CN110452187B - 一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用，其结构式如式I所示：

Description

一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分析检测和分子成像领域，具体涉及一种光控酪氨酸酶荧光分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
酪氨酸酶是一种含有铜的氧化还原酶,在动物、植物以及微生物中分布广泛，对于人体来说，无法从外界摄入络氨酸酶只能通过自身来合成，它对生物体的生理功能的发挥起着至关重要的作用，参与黑色素的合成过程。黑色素细胞广泛分布于眼睛、毛囊和皮肤之中。通过酪氨酸酶的催化作用来维持人体正常的生理功能，当酪氨酸酶过多或过少时，常常会引发很多疾病，如白化病、黑色素瘤、皮肤病和帕金森病等。虽然无法从食物中获取酪氨酸酶，但可以从外界获取酪氨酸进入人体，通过一系列转化后变为黑色素，从而起到补充黑色素的作用。黑色素的合成过程如下：首先酪氨酸酶通过催化酪氨酸，在其中引入羟基从使酪氨酸变成一种新物质多巴，随后经过氧化作用，氧化多巴使其进一步转化变为多巴醌，最后经过一系列其他反应生成黑色素。这些黑色素分别进入皮肤和毛发细胞中，赋予我们的皮肤和毛发颜色，从而保护皮肤细胞中的DNA和眼睛，防止它们受到紫外线辐射，并且它还能去除活性氧(ROS)防止体内组织出现过热的状况。由此可见，酪氨酸酶的检测具有十分重要的意义。然而，目前现有的检测酪氨酸酶荧光探针进入细胞后不可控制，导致时空分辨率不高。从而缺少研究一种具有高分辨率检测细胞内酪氨酸酶的方法。因此，发展一种光控的检测酪氨酸酶的荧光探针是非常有必要的。该探针只有在光和酪氨酸酶同时存在情况下，才能产生荧光信号。
试卤灵因其具有长的波长和良好的稳定性而被广泛应用于生物分析中，而基于试卤灵检测酪氨酸酶的光控具有高分辨率的荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种光控酪氨酸酶荧光分子探针。本发明所提供的这种探针，其结构式如下：
Figure 381704DEST_PATH_IMAGE001
所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针的具体合成路线，如下所示：
Figure 648737DEST_PATH_IMAGE002
具体包括以下步骤：
以丙酮为反应溶剂，碳酸钾和反应物1在氮气保护，0℃条件下反应45分钟，然后加入2-硝基溴苄，在氮气保护，室温条件下反应16h，用水和盐水洗涤，再用乙酸乙酯萃取4-5次，萃取液用无水硫酸镁干燥1小时，浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到化合物2。以二氯甲烷为反应溶剂，化合物2和三溴化磷在氮气保护，0℃条件下反应2小时，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取4-5次，萃取液用无水硫酸镁干燥1小时，浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到化合物3。以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，试卤灵和碳酸钾在氮气保护，室温条件下反应10分钟，然后加入化合物3，在氮气保护，60℃条件下反应24h，用盐水洗涤，再用乙酸乙酯萃取4-5次，萃取液用无水硫酸镁干燥1小时，浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到光控酪氨酸酶荧光分子探针Probe。
其中：反应物1为3-羟基苯甲醇，化合物2为（3-（（2-硝基苄基）氧基）苯基）甲醇，化合物3为1-（（3-（溴甲基）苯氧基）甲基）-2-硝基苯。反应物1和2-硝基溴苄摩尔比为1:2，反应溶剂体积为10 mL，所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶，化合物2的分离提纯所用的柱色谱的流动相为石油醚-乙酸乙酯的混合液，体积比为(3-100):1；化合物2和三溴化磷摩尔比为1:2，反应溶剂体积为10 mL，所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶，所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶，化合物3的分离提纯所用的柱色谱的流动相为石油醚-乙酸乙酯的混合液，体积比为(5-100):1；化合物3和试卤灵摩尔比为2:1，反应溶剂体积为15 mL，所述的柱色谱所用的固定相为300-400目的硅胶，光控酪氨酸酶荧光分子探针Probe的分离提纯所用的柱色谱的流动相为二氯甲烷-甲醇的混合液，体积比为(40-100):1。
本发明具有如下的技术效果，探针合成步骤简单，容易分离提纯；其激发和发射光谱在可见光区，化学稳定性好；探针进入细胞后可控，具有高时空分辨率。因此该发明方法具有良好的社会价值和应用前景。
附图说明
图1 光控酪氨酸酶荧光探针合成路线图。
图2 （A）20µM探针与其响应400u/mL酪氨酸酶吸收光谱图；（B）100nM探针与其响应190u/mL酪氨酸酶荧光光谱图。
图3 光控酪氨酸酶荧光探针对紫外光照时间的考察。
图4 紫外光照5h的100nM探针对不同浓度酪氨酸酶的荧光响应图。
图5 紫外光照5h的100nM探针与不同浓度酪氨酸酶响应动力学曲线图。
图6 光控酪氨酸酶荧光探针选择性考察。
图7 酪氨酸酶抑制剂曲酸对酪氨酸酶抑制效果的考察。
图8 光控酪氨酸酶荧光探针细胞毒性试验考察。
图9 紫外光照5h的5µM探针分别用于B16、MCF-7和Hela细胞的共聚焦成像图。
图10 5µM探针分别用于正常培养的B16细胞以及预先与抑制剂孵育过的B16细胞的共聚焦成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：光控酪氨酸酶荧光探针的合成，合成路线如图1所示，基本操作过程如下。
（1）化合物2的合成：将碳酸钾(445.3mg，3.2222mmol)与反应物1（3-羟基苯甲醇）(200mg，1.6111mmol)依次加入到装有无水丙酮（15 mL）的烧瓶（100mL）中，在氮气保护，0℃条件下反应45分钟，然后加入2-硝基溴苄（696.1mg，3.2222mmol），在氮气保护，室温条件下反应16h。反应完成后，用水和盐水洗涤，收集有机相，用乙酸乙酯萃取4-5次，待萃取完成后，往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时，抽滤除去硫酸镁，减压蒸馏得到粗产物。用硅胶柱色谱提纯，得到最终产物固体355.4mg，产率为85.1%。
（2）化合物3的合成：将化合物2（（3-（（2-硝基苄基）氧基）苯基）甲醇）(455.mg，1.7565mmol)与三溴化磷(950.9mg，3.513mmol)依次加入到装有无水二氯甲烷（10 mL）的烧瓶（100mL）中，在氮气保护，0℃条件下反应2小时。反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，收集有机相，用二氯甲烷萃取4-5次，待萃取完成后，往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时，抽滤除去硫酸镁，减压蒸馏得到粗产物。用硅胶柱色谱提纯，得到最终产物白色粉末固体236.6mg，产率为41.8%。
（3）光控酪氨酸酶荧光探针的制备：将试卤灵(100mg，0.4691mmol)与碳酸钾(129.7mg，0.9382mmol)依次加入到装有无水N,N-二甲基甲酰胺（15 mL）的烧瓶（100mL）中，在氮气保护，室温条件下反应10分钟，然后加入化合物3（1-（（3-（溴甲基）苯氧基）甲基）-2-硝基苯）（302.3mg，0.9382mmol），在氮气保护，60℃条件下反应24h。反应完成后，用水盐水洗涤，收集有机相，用乙酸乙酯萃取4-5次，待萃取完成后，往所收集的有机相中加入过量的无水硫酸镁干燥1小时，抽滤除去硫酸镁，减压蒸馏得到粗产物。用硅胶柱色谱提纯，得到最终产物固体37.9mg，产率为17.8%。
实施例2：光控酪氨酸酶荧光探针的可行性验证。
为了验证得到的目标探针是否具有预期理想的功能，进行了初步试验。如图2（A）所示，光控酪氨酸酶荧光探针（20µM）在440nm处有吸收峰，在探针经过紫外光照5h后加入400u/mL酪氨酸酶在37℃条件下响应3h后，吸收峰明显红移，样品池中颜色由粉色明显变成了玫瑰红色。如图2（B）所示，在550nm激发下，光控酪氨酸酶荧光探针（100nM）表现出极小的荧光发射峰，但经过紫外光照5h后加入190u/mL酪氨酸酶在37℃条件下响应3h后，探针的荧光发射强度有很明显的上升，表明该探针可以被光控并对于酪氨酸酶的响应具有高灵敏度。而且同时随着探针紫外光照5h后酪氨酸酶的加入，可以看到样品池中溶液由微弱的荧光到明显的红色荧光颜色的改变。这些现象证明了所设计的目标探针能够被光控并与酪氨酸酶响应，释放试卤灵染料，吸收峰发生明显的红移。
实施例3：光控酪氨酸酶荧光探针对紫外光照时间的考察。
用pH值为7.4的0.0067mol/L的磷酸缓冲溶液为溶剂测定光控酪氨酸酶荧光探针在不同紫外光照时间下的荧光强度图，紫外光照时间范围为0-5h，随着紫外光照时间的增加，荧光强度也在不断的增加，在5h时，光控酪氨酸酶荧光探针与酶在37℃条件下响应的荧光强度达到最大值，如图3所示。
实施例4：光控酪氨酸酶荧光探针的荧光响应曲线图。
用pH值为7.4的0.0067mol/L的磷酸缓冲溶液为溶剂测定光控酪氨酸酶荧光探针与不同浓度的酪氨酸酶的荧光响应曲线图，酪氨酸酶的浓度范围为0-190u/mL，随着酪氨酸酶的浓度增加，荧光强度也在不断的增加，在190u/mL的酪氨酸酶时，紫外光照5h的100nM的探针与酶在37℃条件下响应3h后荧光强度达到最大值，如图4所示。
实施例5：光控酪氨酸酶荧光探针响应动力学考察。
对探针反应动力学进行考察，进行时间扫描实验，得到紫外光照5h的100nM探针与各浓度酪氨酸酶响应时荧光信号与时间对应的关系图。由图5可知，加入 酪氨酸酶后荧光信号随着时间不断地增大且在大约3h的时候达到响应平衡的最大值。
实施例6：光控酪氨酸酶荧光探针的选择性考察。
为了评价该探针的选择特性，用pH值为7.4的0.0067mol/L的磷酸缓冲溶液为溶剂测定光控酪氨酸酶荧光探针对各种潜在的干扰物，包括无机盐（KCl，MgCl2，FeCl3，CaCl2），葡萄糖，维生素C，谷氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，尿素，一些酶（亮氨酸氨肽酶，胰蛋白酶），牛血清白蛋白，不同的活性氧物质（H2O2，HClO）的荧光强度图。如图6所示，相对于酪氨酸酶而言，其他的干扰物对探针的响应程度很小，只有加入酪氨酸酶才会发生荧光增强，表明光控酪氨酸酶荧光探针能够很灵敏地特异性响应磷酸缓冲溶液中的酪氨酸酶。此外，实验也表明该探针能够在有其他干扰物存在的情况下与酪氨酸酶特异性响应。
注：各变量分别为(1)空白；(2)氯化钾；(3)MgCl2；(4)FeCl3；(5)CaCl2；(6)葡萄糖；(7)维生素C；(8)谷氨酸；(9)甘氨酸；(10)半胱氨酸；(11)甘油三酯；(12)尿素；(13)亮氨酸氨肽酶；(14)胰蛋白酶；(15)BSA；(16)H2O2；(17)HClO；(18)酪氨酸酶。
实施例7：酪氨酸酶抑制剂曲酸对酪氨酸酶抑制效果的考察。
为了评价酪氨酸酶抑制剂曲酸对酪氨酸酶抑制效果，用pH值为7.4的0.0067mol/L的磷酸缓冲溶液为溶剂，在4个装有500µL的磷酸缓冲溶液的1.5mL离心管里分别加入紫外光照5h的100nM探针，紫外光照5h的100nM探针和190u/mL的酪氨酸酶，190u/mL的酪氨酸酶、100µM的曲酸和紫外光照5h的100nM探针，190u/mL的酪氨酸酶、200µM的曲酸和紫外光照5h的100nM探针。如图7所示，加入酪氨酸酶荧光强度明显上升（红线），随着抑制剂浓度的增加，抑制效果更好。
实施例8：光控酪氨酸酶荧光探针在小鼠的黑色素瘤细胞B16细胞中毒性考察。
在37℃和5%CO2条件下，用含有10%（v/v）小牛血清、100u/mL青霉素、100µg/mL的链霉素的DMEM培养基培养小鼠的黑色素瘤细胞B16细胞。细胞使用之前用DMEM清洗。在96孔板中细胞中加入含有紫外光照5h的不同浓度的光控酪氨酸酶荧光探针（0，0.1，1，2.5，5，10，15，20，25µM）的100µL DMEM，孵育12h后，每孔加入10µL MTT溶液（噻唑蓝）继续培养4h，然后吸出DMEM每孔加入100µL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的探针、培养液、MTT、二甲基亚砜）。如图8所示。
实施例9：光控酪氨酸酶荧光探针检测不同细胞的应用。
在37℃和5%CO2条件下，用含有10%（v/v）小牛血清、100u/mL青霉素、100µg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞（培养的细胞为小鼠的黑色素瘤细胞B16，人乳腺癌细胞MCF-7和人宫颈癌细胞Hela细胞）。细胞使用之前用DMEM清洗。在细胞中加入含有5µM探针的1mLDMEM孵育4h后，然后在紫外光照3h后进行共聚焦荧光成像，激发波长为550nm，收集波段为570-670nm，如图9所示。
实施例10：酪氨酸酶抑制剂曲酸对光控酪氨酸酶荧光探针检测B16细胞的应用。
在37℃和5%CO2条件下，用含有10%（v/v）小牛血清、100u/mL青霉素、100µg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞（培养的细胞为小鼠的黑色素瘤细胞B16）。细胞使用之前用DMEM清洗。在细胞中加入酪氨酸酶抑制剂曲酸（kojic acid）预处理1.5h，然后再加入含有5µM探针的1mL DMEM孵育4h后，再在紫外光照3h后进行共聚焦荧光成像，激发波长为550nm，收集波段为570-670nm，如图10所示。

Claims (4)

1.一种光控酪氨酸酶荧光分子探针，其结构式如式I所示：
Figure 459088DEST_PATH_IMAGE001
（式I）。
2.根据权利要求1所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针的制备方法，其特征在于，它如下步骤：
以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，式Ⅱ试卤灵和碳酸钾在氮气保护，室温条件下反应10分钟，然后加入1-（（3-（溴甲基）苯氧基）甲基）-2-硝基苯，在氮气保护，60℃条件下反应24h，用盐水洗涤，再用乙酸乙酯萃取4-5次，萃取液用无水硫酸镁干燥1小时，浓缩经硅胶色谱柱分离提纯得到光控酪氨酸酶荧光分子探针式I：
Figure 172966DEST_PATH_IMAGE002
（式Ⅱ）。
3.根据权利要求1所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针，其特征在于，所述探针在紫外照射下与不在紫外照射下探针的荧光强度有明显的区别。
4.根据权利要求1所述的一种光控酪氨酸酶荧光分子探针，其特征在于，所述探针在细胞中可控制，时空分辨率高。
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