DE102020109362A1 - Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem Stokes Shift auf der Basis von verbrückten Benzopyryliumsalzen - Google Patents

Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem Stokes Shift auf der Basis von verbrückten Benzopyryliumsalzen Download PDF

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige, wasserlösliche Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Fluoreszenzquantenausbeute auf der Basis von sauerstoffhaltigen Heterocyclen, deren reaktive Derivate und Farbstoff-Konjugate sowie deren Anwendung zum Markieren von Proben und dem Nachweis von Analyten. Die Verbindungen der neuen Farbstoffklasse sind mit kommerziellen Anregungslichtquellen kompatibel und zeichnen sich durch Stokes-Verschiebungen von mehr als 50 nm aus.

Description

  • Stand der Wissenschaft und Forschung
  • Fluoreszenzbasierte Marker finden seit Jahrzehnten Einsatz in der biologischen, biotechnologischen und medizinischen Forschung sowie in der medizinischen Diagnostik [Brinkley M., A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Haptens and Cross-Linking Reagents, Bioconjugate Chem, 3 (1992) 2-12; Waggoner A., Covalent Labeling of Proteins and Nucleic Acids with Fluorophores, Meth. Enzymol., 246 (1995) 362-373; Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press 2013; Springer Series on Fluorescence 18, 2019 (Pedras B. Editor): Fluorescence in Industry]. Ursprünglich wurden aus dem Bereich der Textil- und Sensibilisatorfarbstoffe bekannte Chromophore derivatisiert, um sie für Anwendungen im wässrig-physiologischen Milieu zu optimieren. Besondere Schwerpunkte der Entwicklungen stellten hier die Wasserlöslichkeit sowie eine hohe Quantenausbeute in wässriger Lösung dar.
  • Das Streben nach immer höherem Informationsgewinn bei bioanalytischen Verfahren findet seinen Ausdruck in Mehrfarb-Analysen, wie sie beispielsweise in der Durchfluß-Zytometrie [Lee L.G., NEAR-IR Dyes in Three Color Volumetric Capillary Cytometry: Cell Analysis With 633- and 785-nm Laser Excitation, Cytometry, 21 (1995) 120-128], der DNA-Sequenzierung und verschiedenen PCR-Methoden (Roche's LightCycler) mittlerweile zum Laboralltag gehören.
  • Auch in der hochauflösenden optischen Mikroskopie, insbesondere der STED-Mikroskopie [Sednev M.V., Belov V.N., Hell S.W., Fluorescent dyes with large Stokes shifts for super-resolution optical microscopy of biological objects: a review, MethodsAppl.Fluoresc. 3 (2015) 042004] finden Farbstoffe mit hohem Stokes Shift Verwendung. Anfänglich wurde hier auf Farbstoff-Kombinationen zurückgegriffen, die mittels Energietransfer von einem Donor auf verschiedene Akzeptoren bei Anregung durch ein und dieselbe (monochromatische) Lichtquelle spektral unterscheidbare Signale liefern. Beispiele hierfür sind die DNA-Sequenzer von Amersham (jetzt GE Healthcare) und ABI (jetzt Life Technologies), die Ende der 1990er Jahre auf den Markt kamen.
  • Ein alternativer Ansatz für Multiplex-Anwendungen stellt der Einsatz von Farbstoffen dar, die ohne Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor eine spektrale Differenzierung zulassen. Beispiele hierfür finden sich in den seit ca. 2002 bekannten MegaStokes-Farbstoffen ( EP 1 318 177 B1 , EP 1 535 969 B1 ). Diese sind vorzugsweise auf eine Anregungswellenlänge zwischen 470 nm (blaugrüne LED) und 500 nm (488 nm-Ar-lonen-Laser) zugeschnitten, da sie somit dem damaligen Stand der Technik bei Anregungslichtquellen am besten entsprachen.
  • Auch die Kombination von mehreren Anregungslichtquellen mit mehr als einem Chromphor je Lichtquelle hat mittlerweile Eingang in den Stand der Technik gefunden (Solexa, WO2007/135 368 A2 ). Eine typische Anwendung ist hier das Next Generation Sequencing (NGS).
  • Mit der Verfügbarkeit von lichtintensiven, kurzwelligen Anregungsquellen wie UV-LEDs bzw. violetten Laserdioden verbreiterte sich auch die Basis geeigneter Fluorophore für bioanalytische Anwendungen. Beispiele hierfür sind das Pacific Orange von Molecular Probes ( US 8 158 801 ) und eine Reihe von Benzoxazol-basierten Farbstoffen von Dyomics ( US 9 453 010 B2 , EP 2 886 542 B1 ), die in Analogie zu den MegaStokes™-Farbstoffen Mehrfarbanalysen erlaubte, allerdings bei einer Anregung um 400 nm.
  • Die Erfindung hat das Ziel, Fluoreszenzmarker auf der Basis von verbrückten BenzopyryliumVerbindungen zugänglich zu machen, wobei zu markierende Moleküle K über den Linker L und die reaktive Gruppe A gebunden werden können, und der Fluoreszenzmarker möglichst viele der folgenden Eigenschaften aufweist: Großer Stokes-Shift, hohe Photo- und Lagerstabilität, Löslichkeit in wässrigen Medien und hohe Fluoreszenzquantenausbeuten.
  • Der Erfindung beschreibt Verbindungen (insbesondere verbrückte Benzopyryliumsalze) der allgemeinen Formel 1
    Figure DE102020109362A1_0001
    und Salze sowie Solvate davon, wobei
    R11 und R12 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl sind, wobei Alkyl vorzugsweise C1-C4-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl, ist,
    R2 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise C1-C4-Alkyl, oder Alkenyl ist, wobei Wasserstoff in einer Ausführungsform bevorzugt ist,
    R3 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise C1-C4-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl, Aryl, Hydroxy bzw. Oxo, Alkoxy, vorzugsweise Methoxy oder Ethoxy, besonders bevorzugt Ethoxy, Aryloxy, NR18R19 oder eine Gruppe Q ist,
    wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und wobei NR18R19 besonders bevorzugt aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4-(Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist,
    und Q eine heterocyclische Struktur ausgewählt aus einer Struktur der Formel 2 oder 3
    Figure DE102020109362A1_0002
    ist, mit n= 1, 2 oder 3; wobei R20 unabhängig voneinander jeweils Alkyl, vorzugsweise C1-C8-Alkyl, ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, R21, R22, R23, R24 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat sind, R25 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise C1-C8-Alkyl, ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, und
    R4 Wasserstoff, Brom, Chlor, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist, wobei Wasserstoff, Sulfonsäure und Pyridin (4-Pyridyl) bevorzugt sind, und
    R5 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist,
    R6 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy (beispielsweise 6-Oxy-hexansäure), Aryloxy oder NR29R30 ist, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus (i) C1-C4-Alkyl, bevorzugt Ethyl, (ii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (iii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist und (iv) Ethylestern von (iii) ausgewählt sind,
    R7 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR31R32, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat besonders bevorzugt ist, wobei R31 und R32 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
    R8 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist,
    R9 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise C1-C6-Alkyl, oder 2-Carboxyphenyl ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist, und
    L ein Linker ausgewählt aus -(CH2)s- und -[(CH2)m-O]p-(CH2)m- ist, wobei m eine ganze Zahl von 2 - 5 ist und p und s unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl von 1-10 darstellen, wobei
    jede Verbindung keinen oder einen Linker L enthält mit einer an L gebundenen reaktiven Gruppe A zur kovalenten Bindung an ein zu markierendes Molekül K, wobei
    A eine Amin- (-NH2), Hydroxy- (-OH) oder Phosphoramidit (-O-P-[O-CH2-CH2-CN]-N[(CH(CH3)2]2) - Funktion, eine Carbonsäure (-COOH), ein davon abgeleiteter Alkyl- oder Aktiv-Ester (NHS-Ester, Sulfo-NHS-Ester, Tetrafluoro-Phenylester, p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester), ein Carbonsäure-Hydrazid (-CONHNH2) oder ein Carbonsäure-Amid (-CONHR28) mit R28 gleich -(CH2)t-Y ist, wobei
    Y gleich -OH, -NH2, -NH3 +, Maleimid (-N[CO-CH]2), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH2-I, -NH-CO-CH2-Br, -Azid (-N3), -Alkin (-CCH) oder -Phosphoramidit (-O-P-[O-CH2-CH2-CN]-N-[CH-(CH3)2]2) ist und t eine ganze Zahl von 1-10 ist, und
    K eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe Haptene (Moleküle, die ein unvollständiges Antigen darstellen und erst bei Bindung an Proteine bzw. Zellstrukturen die Wirkung eines Antigens zeigen), Proteine, Antikörper (Proteine, die als Reaktion auf Antigene gebildet werden), niedermolekulare Arzneistoffe (wirksame Bestandteile in Arzneimitteln, die aufgrund ihrer relativ geringen Molmasse bis etwa 800 g/mol, im Gegensatz zu zum Beispiel Proteinen als sehr große Moleküle, in der Lage sind, in Zellen einzudringen), Peptide (kleine bzw. kurzkettige Proteine bis etwa 100 verknüpfte Aminosäuren), Nucleotide (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die aus einem Phosphatteil, einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil bestehen), Nucleoside (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die keinen Phosphatteil besitzen, sondern nur aus einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil bestehen), DNA-Oligomere (im Gegensatz zu DNA als Makromolekül Moleküle der Desoxyribonucleinsäure mit einer relativ geringen, nicht genau definierten Anzahl an Nucleotiden), Polymere (synthethische oder natürliche, kettenförmige oder verzweigte chemische Verbindung aus sich wiederholenden Einheiten, den Monomeren; Polymere können auch als Copolymere aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomeren in verschiedenen Mengenverhältnissen und Anordnungen bestehen), ist.
  • Vorzugsweise enthalten Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R3, R4, R6, R7, R18, R19, R29, R30, R31, R32) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen.
  • Vorzugsweise enthält eine erfindungsgemäße Verbindung mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Alkoxygruppe und einer Aminogruppe, bevorzugt eine Sulfonsäuregruppe.
  • Der Begriff Sulfonsäure umfasst auch den Begriff Sulfonat und der Begriff Sulfonat umfasst auch den Begriff Sulfonsäure. Der Begriff Carbonsäure umfasst auch den Begriff Carboxylat und der Begriff Carboxylat umfasst auch den Begriff Carbonsäure.
  • Die Verben „umfassen“ und „enthalten“ und ihre Konjugationen umfassen auch das Verb „bestehen aus“ und seine Konjugationen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen sind auch in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
  • Im Fall R3= Hydroxy liegen die verbrückten Verbindungen in Abhängigkeit vom pH-Wert bei niedrigen pH-Werten als 3-Hydroxy-xanthenium-Salze 1 vor und bei höheren pH-Werten als 3-Oxo-2H-xanthene 4 mit neutralem Grundkörper. In einer Ausführungsform ist R3 bevorzugt Hydroxy, wobei die Verbindung in Abhängigkeit vom pH-Wert als neutraler Grundkörper 3-Oxo-2H-xanthen 4 vorliegt.
    Figure DE102020109362A1_0003
  • In erfindungsgemäßen Verbindungen können ein oder mehrere ausgewählt aus R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 und R7-R8 verbrückt sein, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten.
  • Weiterhin sind erfindungsgemäße Verbindungen durch die Formel 5 angegeben (Chromenoxanthenium-Verbindungen), zu welchen z.B. eine Verbrückung von R2-R3 führt.
    Figure DE102020109362A1_0004
  • Neben den allgemeinen Ausführungen gilt für die zusätzlichen Substituenten R13-R17, dass
    R13 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise C1-C4-Alkyl, oder 2-Carboxyphenyl ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist,
    R14 Wasserstoff oder Alkyl, vorzugsweise C1-C4-Alkyl, ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist,
    R15 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR33R34, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat oder verbrückt zu R16 ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist,
    wobei R33 und R34 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders
    bevorzugt 3, ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
    R16 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR35R36 ist, wobei NR35R36 besonders bevorzugt ist,
    wobei R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) (ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
    wobei besonders bevorzugt ist, dass R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus C1-C4-Alkyl, bevorzugt Ethyl, und ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H) ausgewählt sind, wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist,
    R17 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist, und
    ein oder mehrere ausgewählt aus R5-R6, R6-R7, R7-R8, R14-R15, R15-R16 und R16-R17 verbrückt sein können, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten können und
    vorzugsweise Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen enthalten.
  • Wenige Beispiele von einfachen, nicht funktionalisierten Verbindungen dieses Typs sind bekannt. In DE 2942931 A1 ; BASF AG; 07.05.1981; Schmidt R., Koch V. [1] wurde die Synthese von Grundkörpern der Formel 5 und deren Anwendung zum Anfärben anionisch modifizierter Textilfasern erstmals beschrieben. Es wurden keine genauen Angaben zur Fluoreszenz gemacht.
  • In Russian Journal of Organic Chemistry, 37(4), 2001, 527-538 ; Olekhnovich E.P., Boroshko S.L., Korobka I.V., Metelitsa A.V., Olekhnovich L.P. [2] wurden mehrere Verbindungen dieses Types mit einer eingeschränkte Kombination von einfachen, nicht funktionalisierten Substituenten hergestellt und bezüglich ihren Absorptions- und Emissionseigenschaften genauer untersucht. Dort wurde ein anderer synthetischer Zugang genutzt, der auch die Verbindungen der Formeln 1 und 4 zugänglich machte. Eine konkrete Anwendung dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben. Diese Grundstrukturen sind nur in organischen Lösungsmitteln löslich und enthalten keine Funktionalitäten, welche die Löslichkeit in wässriger Lösung bewirkt und die das kovalente Anbinden von beispielsweise Biomolekülen ermöglichen.
  • Durch die Darstellung der von uns beanspruchten funktionalisierten verbrückten BenzopyryliumVerbindungen werden folgende Vorteile erreicht:
  • Durch die Einführung von Linkern und reaktiven Gruppen an diesen Typen der verbrückten Benzopyryliumsalze ermöglichen wir das Eingehen einer kovalenten Bindung mit einem geeigneten Biomolekül als Voraussetzung für den Einsatz als Fluoreszenzmarker.
  • Durch die erweiterte Auswahl an Substituenten, insbesondere um unterschiedlich substituierte Alkoxy- bzw. Aminogruppen, ist es möglich, die Wellenlängen von Absorption bzw. Emission in einem größeren Bereich einzustellen. Überraschenderweise sind die Derivate mit R3= NR18R19 chemisch ausgesprochen stabil, insbesondere auch photostabil. Je nach Grundstruktur und Substitution liegen die Absorptionsmaxima im gesamten Bereich des sichtbaren Lichtes, mit einem Schwerpunkt bei 500-530 nm. Die Verbindungen weisen einen hohen Stokes Shifts im Bereich von 80 nm auf. Die Messung der Absorption erfolgt zum Beispiel bei 25 °C in wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 1,0 mit einem Specord 205 von Analytik Jena, wobei die wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen. Die Emission wird zum Beispiel bei 25 °C in verdünnten wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 0,1 mit einem FP-6600 Spectrofluorometer von Jasco gemessen, wobei die verdünnten wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen. Eine erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise zumindest dadurch charakterisiert, dass es sich bei der Verbindung um eine fluoreszierende Verbindung handelt, die ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 650 nm, vorzugsweise von 500 nm bis 550 nm, aufweist. Vorzugsweise beträgt die Stokes-Verschiebung mindestens 40 nm, vorzugsweise 50 nm bis 120 nm, noch bevorzugter 70 nm bis 90 nm.
  • Ferner ist wegen der höheren Stabilität in einer Ausführungsform bevorzugt, dass R3 NR18R19 ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und wobei NR18R19 besonders bevorzugt aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4-(Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist.
  • Durch die Substitution mit Resten, die eine Löslichkeit in Wasser ermöglichen (z.B. Sulfonsäuren), wird die Anwendbarkeit dieser Farbstoffe für analytische bzw. diagnostische Zwecke in protischen Lösungsmitteln möglich. Der hydrophile Charakter der unterschiedlichen Verbindungen kann durch die Anzahl der wasserlöslich machenden Gruppen über einen gewissen Bereich eingestellt werden. Daher ist eine erfindungsgemäße Verbindung vorzugsweise zumindest dadurch charakterisiert, dass bei 25 °C mindestens 1 mg, bevorzugt 2 mg bis 4 mg, der Verbindung in 1,000 g Wasser löslich sind.
  • Weiterhin beeinflussen die Sulfonsäuregruppen das Aggregationsverhalten und verringern eine nicht-kovalente Dimerenbildung sowie eine nicht-kovalente Anbindung an Biomoleküle und Oberflächen. Insbesondere Sulfonsäure-Substituenten, welche direkt am Farbstoffgrundkörper gebunden sind, wirken auch auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Farbstoffe so ein, dass die Absorptions- und Emissionswellenlängen verschoben werden und in der Regel eine signifikante Erhöhung der Quantenausbeute erzielt wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist aus diesen Gründen bevorzugt, dass die Verbindung mindestens eine Sulfonsäuregruppe enthält.
  • Aufgrund der Verbrückung werden stabil Benzopyryliumverbindungen erhalten, die in Abhängigkeit von den Substituenten in wässriger Lösung überraschend hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten erreichen. Vorzugsweise beträgt die Fluoreszenz-Quantenausbeute einer erfindungsgemäßen Verbindung 0,1 bis 0,95, bevorzugter 0,5 bis 0,9. Fluoreszenzquantenausbeuten werden bevorzugt bei 25 °C in verdünnten wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 0,1 mit einem Hamamatsu Absolute Photoluminescence Quantum Yield Measurement System C-9920 bestimmt, wobei die verdünnten wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen. Die Verbindungen ergänzen damit die bereits kommerziell verfügbaren Farbstoffe mit hohem Stokes Shift bzw. stellen besser fluoreszierende Alternativen dar.
  • Derivate mit R3= OH liegen in stark sauren Lösungen als Hydroxy-Benzopyryliumsalz vor und werden bei höheren pH-Werten deprotoniert. Sie liegen dann als 3-Oxo-2H-xanthene mit neutralem Grundkörper vor. Diese weisen eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute auf und sind im physiologischen pH-Bereich stabil.
  • Die Fotostabilität der Verbindungen ist sehr gut. Sie liegt signifikant höher als die von vergleichbaren Farbstoffen auf Cumarinbasis, zum Beispiel als DY-510XL (vgl. ).
  • Eine erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den folgenden Verbindungen und deren Salzen sowie Solvaten davon (bei Ionen ist das Gegenion, gegebenenfalls die Gegenionen, vorzugsweise ausgewählt aus Tetrafluoroborat, Chlorid und Natrium):
    • 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin, 6-[[6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure, 3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-1-sulfonat, 3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino] propan-1-sulfonat, 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, 3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat, 6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat, 6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2-sulfonat, 6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol, 8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure, 3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat, 3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)propan-1-sulfonat, 6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)hexansäureethylester, 3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat, 3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat, 6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]hexansäure, 4-[[1-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat, 6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-1H-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure, (2E)-1-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2-enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat, 3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-1-yl]propan-1-sulfonat, 6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-on, 6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-1-sulfonat, 6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-Hydroxy-1,1-dimethyl-3-oxo-2 H-xanthen-4-sulfonat, 6-(5-Carboxypentoxy)-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-1-yl)hexansäure, 1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure, 6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure und 6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure.
  • Eine erfindungsgemäße Verbindung ist besonders bevorzugt ausgewählt aus
    6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-aminTetrafluoroborat,
    6-[[6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure Chloridsalz,
    3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-1-sulfonat,
    3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz,
    3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2 H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz,
    6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester Tetrafluoroborat,
    3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat,
    3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat,
    4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz,
    6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat,
    6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat Natriumsalz,
    6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2-sulfonat,
    6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat,
    8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat,
    6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure Chloridsalz,
    3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat Natriumsalz,
    3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)propan-1-sulfonat,
    6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)hexansäureethylester Tetrafluorborat,
    3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat,
    3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat,
    6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]hexansäure Chloridsalz,
    4-[[1-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz,
    6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-1H-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
    6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure Chloridsalz,
    (2E)-1-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2-enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat,
    3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-1-yl]propan-1-sulfonat Natriumsalz,
    6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-on,
    6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
    6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz,
    3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz,
    6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat diNatriumsalz,
    6-Hydroxy-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz,
    6-(5-Carboxypentoxy)-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz,
    6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-1-yl)hexansäure,
    1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat Natriumsalz,
    6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
    3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz,
    2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure Chloridsalz,
    6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz und
    6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure Chloridsalz.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Erkennungseinheiten, z. B. von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymeren Trägermaterialien verwendet werden.
  • Die Markierung der Erkennungseinheiten kann dabei durch die Ausbildung von ionischen oder van der Waals-Wechselwirkungen zwischen den Markern (erfindungsgemäßen Verbindungen) und den zu markierenden Materialien erfolgen.
  • Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, die Erkennungseinheit oder das Trägermaterial kovalent mit dem Fluorophor zu verbinden. Diese Kopplungsreaktion kann in wässriger oder überwiegend wässriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht eine Fluoreszenz-Sonde (Konjugat) zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von unterschiedlichen Biomaterialien bzw. anderen organischen und anorganischen Materialien.
  • Sowohl die erfindungsgemäßen Verbindungen als auch davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), zur Erforschung des Genoms (DNA-Sequenzierung) und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Throughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (DNA- und Protein-Chips).
  • Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität zu einem gegebenen Liganden besitzt. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Moleküle sein. Rezeptoren können in reiner Form oder gebunden an andere Spezies eingesetzt werden. Rezeptoren können kovalent oder nichtkovalent entweder direkt oder durch bestimmte Kopplungsvermittler an einen Bindungspartner angeknüpft werden. Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden, die durch diese Erfindung detektiert werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für ZellMembran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und Antikörper ein, sind aber nicht auf die angeführten Stoffe beschränkt.
  • Die Verwendung einer der hierin offenbarten Verbindungen für die hierin genannten Zwecke und/oder Verfahren, insbesondere als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Erfindungsgemäße Verbindungen können wenigstens eine reaktive Gruppe A in Form eines Aktiv-Esters aufweisen, wobei der Aktiv-Ester vorzugsweise gleich ein NHS-Ester (N-Hydroxysuccinimidylester), ein Sulfo-NHS-Ester (Sulfo-Hydroxysuccinimidylester), ein TFP-Ester (Tetrafluoro-Phenylester) oder ein STP-Ester (p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester) ist, wie diese in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind.
    A Aktiv-Ester
    Figure DE102020109362A1_0005
         		NHS
    Figure DE102020109362A1_0006
         		Sulfo-NHS
    Figure DE102020109362A1_0007
         		TFP
    Figure DE102020109362A1_0008
         		STP
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in weiteren Ausführungen A in Form eines Carbonsäurederivats aufweisen, wobei das Carbonsäurederivat vorzugsweise ein Hydrazid, ein Amin, ein lod-Acetamid, ein Maleimid, ein Alkin oder ein Azid ist, wie diese in der nachstehenden Tabelle angegeben sind.
    A Carbonsäureamid-Derivate
    Figure DE102020109362A1_0009
         		Hydrazid
    Figure DE102020109362A1_0010
         		Amin
    Figure DE102020109362A1_0011
         		lod-acetamid
    Figure DE102020109362A1_0012
         		Maleimid
    Figure DE102020109362A1_0013
         		Alkin
    Figure DE102020109362A1_0014
         		Azid
  • Auch werden Verbindungen beschrieben, in denen A in Form eines Phosphoramidits vorliegt, wobei A eine Gruppe der Formel
    Figure DE102020109362A1_0015
    ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1.
  • Das Verfahren umfasst die Reaktion von (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-yliden)-ethyl-oxonium oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-yliden]-ethyl-oxonium mit einer Benzaldehyd-Verbindung, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
  • Vorzugsweise wird die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, wobei das organische Lösungsmittel bevorzugt Orthoameisensäuretriethylester ist. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 70 °C bis 200 °C, bevorzugter bei 90 °C bis 130 °C, durchgeführt. Vorzugsweise wird (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-yliden)-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-yliden]-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat verwendet. Die Benzaldehyd-Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus 2-Hydroxy-4-diethylaminobenzaldehyd, 3-(N-(6-Ethoxy-6-oxo-hexyl)-4-formyl-3-hydroxy-anilino)propan-1-sulfonat, Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure, 2,4-Dihydroxybenzaldehyd, 3-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1-quinolyl)propan-1-sulfonat und 6-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1-quinolyl)hexansäure.
  • Das Verfahren kann in einer vorgeschalteten Reaktion die Umwandlung der Verbindung 5,5-Dimethylcyclohexan-1,3-dion oder 3-Hydroxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-on unter Verwendung von Orthoameisensäuretriethylester und Tetrafluoroborsäure in die Verbindung (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-yliden)-ethyl-oxonium bzw. (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-yliden]-ethyl-oxonium umfassen. Vorzugsweise erfolgt dies bei einer Temperatur zwischen 5 und 50 °C.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 5.
  • Das Verfahren umfasst die Reaktion einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise von 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, mit einer Benzaldehyd-Verbindung, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
  • Vorzugsweise wird die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, wobei das organische Lösungsmittel bevorzugt Eisessig ist. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 70 °C bis 200 °C, bevorzugter bei 90 °C bis 110 °C, durchgeführt. Vorzugsweise wird 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin Tetrafluoroborat oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester Tetrafluoroborat verwendet. Die Benzaldehyd-Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzoyl]benzoesäure, 4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzaldehyd und 2-Hydroxy-4-methoxy-benzaldehyd.
  • Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 bzw. 5 das Einführen mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Alkoxygruppe und einer Aminogruppe, besonders bevorzugt einer Sulfonsäuregruppe.
  • Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher ausgeführt.
  • Es zeigen
    • : Photostabilität der Verbindungen 5, 8, 11 und 38 im Vergleich zum MegaStokes-Farbstoff DY-510XL.
    • : Emissionsspektren ausgewählter, erfindungsgemäßer Verbindungen in PBS.
  • Ausführungsbeispiele
  • Verbindung 1:
  • (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-yliden)-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0016
    5 mmol 5,5-Dimethylcyclohexan-1,3-dion werden in 10 ml Orthoameisensäuretriethylester
    suspendiert und bei Raumtemperatur mit 1,5 ml 48%iger Tetrafluoroborsäure versetzt. Nach Rühren für 30 Minuten bei RT werden 50 ml trockener Diethylether zugegeben und die Mischung bei RT für einige Stunden belassen. Der entstandene farblose Niederschlag wird filtriert, mit wenig trockenem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
    Ausbeute 1,1 g (78%)
    (C12H21BF4O2; 284,10 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 197,2 [M+]
  • Verbindung 2:
  • 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0017
    3 mmol Verbindung 1 werden in 15 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 3 mmol 2-Hydroxy-4-diethylaminobenzaldehyd in 10 ml Orthoameisensäure-triethylester versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute 980 mg (80%)
    (C21H28BF4NO2; 413,26 g/mol)
    MS ESI + (m/z): 326,1 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 605 nm
  • Verbindung 3:
  • 6-[[6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0018
    485 µmol Verbindung 2 und 1,5 mmol 6-Aminohexansäure Natriumsalz werden in 10 ml DMF suspendiert und 8 Stunden bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand durch RP-Chromatografie gereinigt.
    Ausbeute: 100 mg (46%)
    (C26H36C|N2O3; 447,01 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 411,2 ([M]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 505 nm; λem: 570 nm; ε = 39.200 I/mol*cm; QY: 0,58
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 510 nm; λem: 575 nm; ε = 32.500 I/mol*cm; QY: 0,82
  • Verbindung 4:
  • 3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0019
    1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 3-(N-(6-Ethoxy-6-oxo-hexyl)-4-formyl-3-hydroxy-anilino)propan-1-sulfonat Natriumsalz in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute 385 mg (72%)
    (C28H39NO7S; 533,68 g/mol)
    MS ESI + (m/z): 534,3 ([M+ H+]+)
  • Verbindung 5:
  • 3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0020
    375 µmol Verbindung 4 und 1,5 mmol 3-Aminopropansulfonsäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 98 mg (42%)
    (C27H37N2NaO9S2; 620,71 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 597,2 (base, [M]- ); 297,9 (25%, [M- H+]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 505 nm; λem: 572 nm; ε = 45.000 l/mol*cm; QY: 0,72
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 512 nm; λem: 570 nm; ε = 49.800 l/mol*cm; QY: 0,87
    1H-NMR (400 MHz D2O): δ (ppm)= 1,10 (S, 6H, CH3); 1,24 (M, 2H, CH2); 1,40 (M, 2H, CH2); 1,67 (M, 2H, CH2); 1,89 (M, 2H, CH2); 2,04 (M, 2H, CH2); 2,32 (T, 2H, CH2); 2,45 (S, 2H, CH2); 2,87 (T, 2H, CH2); 2,92 (T, 2H, CH2); 3,14 (T, 2H, CH2); 3,35 (T, 2H, CH2); 3,46 (T, 2H, CH2); 5,64 (S, 1H, 4-H); 6,16 (S, 1H, 5-H); 6,47 (D, 1H, 7-H); 6,95 (D, 1H, 8-H); 7,26 (S, 1H, 9-H)
    13C-NMR (400 MHz D2O): δ (ppm)= 22,27; 23,43; 24,31; 25,71; 26,17; 26,31, 26,86, 33,78; 34,20; 42,14; 42,76; 48,15; 48,29; 49,08; 50,29; 89,31; 95,96; 111,06; 111,34; 126,90; 129,46; 134,58; 151,33; 153,71; 168,62; 169,42; 178,23
  • Verbindung 6:
  • 3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0021
    125 µmol Verbindung 5 werden in 3 ml DMF gelöst. Bei 0°C werden 45 mg TSTU (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium Tetrafluoroborat) und 26 µl DIPEA (Diisopropyl-ethylamin) zugegeben und es wird bei RT 20 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand durch RP-Chromatografie gereinigt.
    Ausbeute: 80 mg (90%)
    (C31H40N3NaO11S2; 717,78 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 694,2 (base, [M]-); 346,5 (25%, [M- H+]2-)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 512 nm; λem: 570 nm; ε = 44.000 l/mol*cm
  • Verbindung 7:
  • 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0022
    1 mmol Verbindung 1 und Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt.
    Ausbeute 420 mg (80%)
    (C27H38BF4NO4; 527,40 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 440,3 ([M]+)
  • Verbindung 8:
  • 3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0023
    375 µmol Verbindung 7 und 3-Aminopropansulfonsäure Natriumsalz werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 5 wird umgesetzt.
    Ausbeute: 110 mg (58%)
    (C26H36N2O6S; 504,63 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 503,2 ([M- H+]- ); MS ESI+ (m/z): 505,3 (base, [M+ H+]+); 527,3 (15%, [M+ Na+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 509 nm; λem: 578 nm; ε = 38.500 l/mol*cm; QY: 0,58
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 511 nm; λem: 571 nm; ε = 41.600 l/mol*cm; QY 0,84
  • Verbindung 9:
  • 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0024
    375 µmol Verbindung 4 und 750 µmol N-Methylanilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 80 mg (38%)
    (C31H38N2O6S; 566,71 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 565,2 ([M- H+]-); MS ESI+ (m/z): 567,3 (80%, [M+ H+]+); 589,3 (base, [M+ Na+]+); 605,3
    (70%, [M+ Ka+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 523 nm; λem: 600 nm; ε = 39.000 l/mol*cm; QY: 0,24
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 601 nm; ε = 41.000 l/mol*cm; QY 0,47
  • Verbindung 10:
  • 4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0025
    177 µmol Verbindung 9 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 75 mg (64%)
    (C31H38N2O6S; 668,75 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 645,5 (base, [M]-); 322,1 (95%, [M-- H+]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 527 nm; λem: 612 nm; ε = 44.000 l/mol*cm; QY: 0,35
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 533 nm; λem: 609 nm; ε = 48.000 l/mol*cm; QY 0,57
  • Verbindung 11:
  • 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0026
    375 µmol Verbindung 7 und N-Methylanilin werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 9 umgesetzt.
    Ausbeute: 100 mg (53%)
    (C39H37ClN2O3; 509,08 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 473,3 ([M]+); MS ESI- (m/z): 471,2 ([M+- 2H+]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 526 nm; λem: 606 nm; ε = 39.000 l/mol*cm; QY: 0,27
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 601 nm; ε = 44.000 l/mol*cm; QY 0,42
  • Verbindung 12:
  • 4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0027
    177 µmol Verbindung 11 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 67 mg (69%)
    (C30H36N2O6S; 552,68 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 551,2 ([M- H+]-); MS ESI+ (m/z): 553,4 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax. 532 nm; λem: 619 nm; ε = 45.000 l/mol*cm; QY: 0,26
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 533 nm; λem: 610 nm; ε = 50.000 l/mol*cm; QY 0,51
  • Verbindung 13:
  • 6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0028
    375 µmol Verbindung 7 und 750 µmol trockenes Anilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 50 mg (27%)
    (C29H35ClN2O3; 495,05 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 459,3 ([M]+); MS ESI- (m/z): 457,2 ([M- 2H+]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 526 nm; λem: 609 nm; ε = 38.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 532 nm; λem): 603 nm; ε = 44.000 l/mol*cm
  • Verbindung 14:
  • 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0029
    177 µmol Verbindung 13 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 30 mg (26%)
    (C29H33N2O9S2 Na; 640,70 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 617,3 ([M]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 545 nm; λem: 625 nm; ε = 40.100 l/mol*cm; QY: 0,11
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 542 nm; λem: 616 nm; ε = 45.300 l/mol*cm; QY 0,61
  • Verbindung 15:
  • 6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0030
    375 µmol Verbindung 7 und 420 µmol 6-Amino-2-naphthalinsulfonsäure Hydrat werden in 5 ml Eisessig bei 120°C 8 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 18 mg (8%)
    (C33H36N2O6S; 588,71 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 587,3 ([M- H+]-)
    MS ESI+ (m/z): 589,3 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 546 nm; λem: 619 nm; ε = 32.000 l/mol*cm
  • Verbindung 16:
  • 6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0031
    5 mmol Verbindung 1 werden in 25 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit 5 mmol 2,4-Dihydroxybenzaldehyd versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute 500 mg (28%)
    (C17H19BF4O3; 358,14 g/mol)
    MS ESI + (m/z): 271,2 ([M]+)
  • Verbindung 17:
  • 8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0032
    750 µmol Verbindung 16 und 1,5 mmol N-Methylanilin werden in 10 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute: 125 mg (40%)
    (C22H22BF4NO2; 419,22 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 332,3 ([M]+)
  • Verbindung 18:
  • 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0033
    286 µmol Verbindung 17 werden in 5 ml DMF mit 80 mg K2CO3 und 100 mg 6-Bromohexansäureethylester bei 120°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 35 mg (24%)
    (C28H32ClNO4; 482,01 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 446,4 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 452 + 469 nm; λem: 520 nm
  • Verbindung 19:
  • 3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0034
    35 mg Verbindung 18 werden in 1 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 27 mg (59%)
    (C28H30CINNaO10S2; 627,66 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 604,2 ([M]-)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 465 nm; λem: 522 nm; ε = 18.000 l/mol*cm
    UV-Vis in PBS: λmax: 460 nm; λem: 509 nm; ε = 16.500 l/mol*cm
  • Verbindung 20:
  • 3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0035
    1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 3-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1-quinolyl) propan-1-sulfonat Natriumsalz in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute 320mg (68%) (C26H33NO5S; 471,61 g/mol)
    MS ESI + (m/z): 472,2 (base, [M+ H+]+); 494,3 (60%, [M+ Na+]+); 510,3 (20%, [M+ K+]+)
  • Verbindung 21:
  • 6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)hexansäureethylester Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0036
    1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 6-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1-quinolyl)hexan-säure in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
    Ausbeute 245 mg (42%)
    (C31H42BF4NO4; 579,47 g/mol)
    MS ESI + (m/z): 492,3 ([M]+)
  • Verbindung 22:
  • 3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0037
    375 µmol Verbindung 20 und 1,5 mmol 6-Aminohexansäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 25 mg (12%)
    (C30H40N2NaO6S; 556,71 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 555,2 ([M- H+]-)
    MS ESI+ (m/z): 557,2 (50%, [M+ H+]+); 579,5 (base, [M+ Na+]+); 595,3 (20%, [M+ K+]+
    UV-Vis in PBS: λmax: 516 nm; λem. 590 nm; ε = 37.500 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 589 nm; ε = 39.000 l/mol*cm
  • Verbindung 23:
  • 3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0038
    375 µmol Verbindung 20 und 1,5 mmol N-Methylbuttersäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 30 mg (15%)
    (C29H38N2O6S; 542,69 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 541,2 ([M- H+]-)
    MS ESI+ (m/z): 553,3 (base, [M+ H+]+); 565,5 (20%, [M+ Na+]+); 581,3 (15%, [M+ K+]+
    UV-Vis in PBS: λmax: 527 nm; λem: 600 nm; ε = 45.400 l/mol*cm; QY: 0,58
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 542 nm; λem: 600 nm; ε = 55.000 l/mol*cm; QY: 0,88
  • Verbindung 24:
  • 6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0039
    750 µmol Verbindung 21 und 1,5 mmol N-Methylanilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 95 mg (22%)
    (C34H41NClN2O3, 561,15 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 341,3 (base, [M-- H+]2-); 683,3 (15%, [M]-
    UV-Vis in PBS: λmax: 548 nm; λem: 632 nm; ε = 39.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 555 nm; λem: 630 nm; ε = 41.000 l/mol*cm
  • Verbindung 25:
  • 4-[[1-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0040
    150 µmol Verbindung 24 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei 50°C 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 70 mg (67%)
    (C34H39NaN2O9S2; 706,80 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 525,3 ([M]+
    UV-Vis in PBS: λmax: 540 nm; λem: 620 nm; ε = 42.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 545 nm; λem: 615 nm; ε = 43.000 l/mol*cm
  • Verbindung 26:
  • 6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0041
    375 µmol Verbindung 7, 420 µmol 4-Amino-N,N-dimethylanilin Dihydrochlorid und 700 µmol Diisopropylethylamin werden in 5 ml Eisessig bei 120°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 44 mg (22%)
    (C31H40ClN3O3; 538,12 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 502,4 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 573 nm; ε = 34.000 l/mol*cm
  • Verbindung 27:
  • 6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0042
    375 µmol Verbindung 7 und 420 µmol p-Phenylendiamin werden in 5 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 63 mg (33%)
    (C29H36CIN3O3; 510,07 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 474,3 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 530 nm; λem: 612 nm; ε = 35.000 l/mol*cm
  • Verbindung 28:
  • 6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0043
    375 µmol Verbindung 7 und 420 µmol Di-(2-picolyl)amin werden in 5 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 180 mg (80%)
    (C35H41CIN4O3; 601,18 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 565,4 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 531 nm; λem: 593 nm; ε = 28.000 l/mol*cm
  • Verbindung 29:
  • 6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-1H-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0044
    1,2 ml einer 1,0 M Lösung von Lithiumdiisopropylamid in THF/ Hexan werden in 10 ml trockenem THF gelöst und die Mischung wird bei -10°C mit 1 mmol trockenem 2-Methylpyridin versetzt. Diese Lösung wird auf 0°C erwärmt und 30 Minuten bei 0°C gerührt. Dazu wird eine Lösung von 336 µmol Verbindung 35 in 10 ml trockenem THF langsam zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird auf RT erwärmt und noch 1 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP-Chromatografie isoliert.
    Ausbeute: 85 mg (51%)
    (C29H33ClN2O3; 495,05 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 459,3 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 434 nm; λem: 541 nm; ε = 24.000 l/mol*cm
  • Verbindung 30:
  • 6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0045
    1,0 mol Verbindung 35 werden in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und bei -40°C langsam mit 5 ml einer 0,5 M Lösung von 4-(N,N-Dimethylanilin)-magnesiumbromid in THF versetzt. Nach beendeter Zugabe wird auf diese Lösung auf RT erwärmt und 3 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP-Chromatografie isoliert.
    Ausbeute: 100 mg (18%)
    (C31H39ClN2O3; 523,11 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 487,5 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 664 nm; λem: 713 nm; ε = 30.000 l/mol*cm
  • Verbindung 31:
  • 6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0046
    1,0 mol Verbindung 35 werden in 10 ml trockenem THF gelöst unter Rühren bei -20°C langsam mit 3 ml einer 1,4 M Lösung von Methylmagnesiumbromid in THF/ Toluol versetzt. Nach beendeter Zugabe wird auf diese Lösung auf RT erwärmt und 1 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP-Chromatografie isoliert.
    Ausbeute: 125 mg (30%)
    (C20H26ClNO; 331,88 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 296,1 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 538 nm; λem: 628 nm; ε = 9.800 l/mol*cm
  • Verbindung 32:
  • (2E)-1-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2-enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat
  • Figure DE102020109362A1_0047
  • 1,0 mol Verbindung 31 sowie 1,1 mmol 2-[(E)-2-Anilinovinyl]-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-indol-1-ium-5-sulfonat werden in 4 ml Acetanhydrid und 4 ml Eisessig gelöst und unter Zusatz von 250 mg Natriumacetat 15 Minuten am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird durch Fällung mit Diethylether ein öliger Niederschlag erhalten, der durch RP-Chromatografie gereinigt wird.
    Ausbeute: 92 mg (14%)
    (C38H46N2O6S; 658,85 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 659,4 (base, [M+ H+]+); 681,6 (30%, [M+ Na+]+); 697,6 (20%, [M+ K+]+
    MS ESI- (m/z): 657,3 ([M- H+]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 755nm; λem: 788 nm; ε = 75.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 770 nm; λem: 795 nm; ε = 143.600 l/mol*cm
  • Verbindung 33:
  • 3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-1-yl]propan-1-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0048
    1,0 mol Verbindung 31 sowie 1 mmol 3-[5-Formyl-3-(6-methoxy-6-oxo-hexyl)-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-1-yl]propan-1-sulfonat Natriumsalz werden in 5 ml Acetanhydrid und 5 ml Eisessig gelöst und unter Zusatz von 250 mg Natriumacetat 15 Minuten am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird durch Fällung mit Diethylether ein Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wird zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl und 10 ml Aceton versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 150 mg (22%)
    (C34H42NaN3O9S; 691,77 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 668,1 ([M]-)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 683 nm; λem: 719 nm; ε = 67.000 l/mol*cm
  • Verbindung 34:
  • 6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-on
  • Figure DE102020109362A1_0049
    500 µmol Verbindung 2 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 80 mg (54%) rotbraunes Öl (C19H23NO2; 297,39 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 298,1 (base, [M+ H+]+); 617,4 (90%, [2M+ Na+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 450 nm; λem: 558 nm; ε = 23.00 l/mol*cm
    UV-Vis in Wasser pH 3: λmax: x nm; λem: x nm (liegt als Hydroxy-BPS vor)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 440 nm; λem: 540 nm; ε = 24.800 l/mol*cm
  • Verbindung 35:
  • 6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure
  • Figure DE102020109362A1_0050
    500 µmol Verbindung 7 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 150 mg (78%)
    (C23H29NO4; 383,48 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 382,2 ([M- H+]- ); MS ESI+ (m/z): 384,3 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 457 nm; λem: 559 nm; ε = 24.200 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 441 nm; λem: 540 nm; ε = 25.300 l/mol*cm
  • Verbindung 36:
  • 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0051
    177 µmol Verbindung 35 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 17 mg (20%)
    (C23H28NO7S Na; 485,53 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 462,0 (60%, [M]- ); 230,4 (base, [M- H+]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 482 nm; λem: 565 nm; ε = 30.100 l/mol*cm; QY: 0,66
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 446 nm; λem: 542 nm; ε = 25.000 l/mol*cm; QY 0,90
  • Verbindung 37:
  • 3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-1-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0052
    375 µmol Verbindung 4 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand mittels RP-Chromatografie mit Acetonitril-Wasser-Gradient gereinigt.
    Ausbeute: 105 mg (56%)
    (C24H30NO7S Na; 499,55 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 476,0 (base, [M]- ); 237,5 (15%, [M-- H+]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 454 nm; λem: 553 nm; ε = 26.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 439 nm; λem: 538 nm; ε = 27.000 l/mol*cm
  • Verbindung 38:
  • 6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat diNatriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0053
    177 µmol Verbindung 37 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 90 mg (85%)
    (C24H29NO10S Na; 601,60 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 556,2 (15%, [M2-+ H+]- ); 277,6 (base, [M]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 479 nm; λem: 557 nm; ε = 28.000 l/mol*cm; QY: 0,78
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 463 nm; λem: 544 nm; ε = 31.000 l/mol*cm; QY 0,91
    1H-NMR (400 MHz D2O): δ (ppm)= 1,26 (S, 6H, CH3); 1,32 (M, 2H, CH2); 1,51 (M, 2H, CH2); 1,54 (M, 2H, CH2); 1,94 (M, 2H, CH2); 2,30 (T, 2H, CH2); 2,31 (S, 2H, CH2); 2,89 (T, 2H, CH2); 3,27 (T, 2H, CH2); 3,43 (T, 2H, CH2); 6,71 (D, 1H, 7-H); 6,86 (S, 1H, 5-H); 7,34 (D, 1H, 8-H); 7,52 (S, 1H, 9-H)
    13C-NMR (400 MHz D2O): δ (ppm)= 22,02; 24,23; 25,61; 25,98; 26,32; 33,34; 33,91; 48,47; 49,29; 50,23; 50,57; 97,71; 110,71; 111,46; 112,52; 128,02; 129,20; 133,93; 150,95; 153,95; 165,49; 179,17; 193,27
  • Verbindung 39:
  • 6-Hydroxy-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0054
    750 µmol Verbindung 16 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 115 mg (45%)
    (C15H13NaO6S; 344,31 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 321,3 (base, [M]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 409 nm; λem: 485 nm
    UV-Vis in Puffer pH 9: λmax: 462 nm; λem: 536 nm
  • Verbindung 40:
  • 6-(5-Carboxypentoxy)-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0055
    290 µmol Verbindung 39 werden in 5 ml DMF mit 80 mg K2CO3 und 100 mg 6-Bromohexansäureethylester bei 120°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 33 mg (25%) (C21H23NaO8S Na; 458,46 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 435,2 (base, [M]-); 217,0 (30%, [M-- H+]2-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 407 nm; λem: 483 nm; ε = 21.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 403 nm; λem: 487 nm; ε = 19.500 l/mol*cm
  • Verbindung 41:
  • 6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-1-yl)hexansäure
  • Figure DE102020109362A1_0056
    375 µmol Verbindung 21 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl
    versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    mittels RP-Chromatografie mit Acetonitril-Wasser-Gradient gereinigt.
    Ausbeute: 60 mg (38%)
    (C27H33NO4; 435,56 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 436,2 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 460 nm; λem: 575 nm; ε = 23.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 463 nm; λem: 557 nm; ε = 24.000 l/mol*cm
  • Verbindung 42:
  • 1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0057
    177 µmol Verbindung 41 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch 1h bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
    Ausbeute: 45 mg (48%)
    (C27H32NO7S Na; 537,60 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 514,2 ([M]-)
    UV-Vis in PBS: λmax: 487 nm; λem: 578 nm; ε = 28.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 473 nm; λem: 559 nm; ε = 30.000 l/mol*cm
  • Verbindung 43:
  • (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-yliden]-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat
  • Figure DE102020109362A1_0058
    4 mmol 3-Hydroxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-on werden in 10 ml Orthoameisensäuretriethylester suspendiert und bei Raumtemperatur mit 1,2 ml 48%iger Tetrafluoroborsäure versetzt. Nach Rühren für 30 Minuten bei RT werden 50 ml trockener Diethylether zugegeben und die Mischung bei RT für einige Stunden belassen. Der entstandene leicht gelbliche Niederschlag wird filtriert, mit wenig trockenem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
    Ausbeute 970 mg (67%)
    (C17H24BF4NO2; 361,18 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 274,2 [M+]
  • Verbindung 44:
  • 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
  • Figure DE102020109362A1_0059
    1 mmol Verbindung 43 und 1 mmol Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie. Ausbeute 97 mg (21%) (C28H32N2O4; 460,56 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 460,3 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 472 nm; λem: 573 nm; ε = 13.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Puffer pH 5: λmax: 523 nm; λem: 600 nm; ε = 13.300 l/mol*cm
  • Verbindung 45:
  • 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz
  • Figure DE102020109362A1_0060
    1 mmol Verbindung 43 und 1 mmol Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie. Ausbeute 97 mg (21%) (C29H34N2O4S; 554,65 g/mol)
    MS ESI- (m/z): 553,2 ([M- H+])
    MS ESI+ (m/z): 555,4 ([M+ H+]+)
    UV-Vis in PBS: λmax: 470 nm; λem: 570 nm; ε = 15.000 l/mol*cm
    UV-Vis in Puffer pH 5: λmax: 524 nm; λem: 594 nm; ε = 15.400 l/mol*cm
  • Verbindung 46:
  • 2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0061
    1 mmol Verbindung 2 und 1 mmol 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzoyl] benzoesäure werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
    Ausbeute 214 mg (34%)
    (C37H39ClN2O4; 611,17 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 575,4 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 664 nm; λem: 710 nm; ε = 60.000 l/mol*cm
    UV-Vis in PBS: λmax: 663 nm; λem: 711 nm; ε = 42.000 l/mol*cm
  • Verbindung 47:
  • 6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0062
    500 µmol Verbindung 7 und 500 µmol 4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzaldehyd werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
    Ausbeute 70 mg (24%) (C34H41ClN2O4; 577,15 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 541,3 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 679 nm; λem: 713 nm; ε = 80.300 l/mol*cm
    UV-Vis in PBS: λmax: 670 nm; λem: 710 nm; ε = 37.000 l/mol*cm
  • Verbindung 48:
  • 6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure Chloridsalz
  • Figure DE102020109362A1_0063
    1 mmol Verbindung 7 und 1 mmol 2-Hydroxy-4-methoxy-benzaldehyd werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
    Ausbeute 43 mg (8%)
    (C31H34ClNO5; 536,06 g/mol)
    MS ESI+ (m/z): 500,2 ([M]+)
    UV-Vis in Ethanol: λmax: 654 nm; λem: 712 nm; ε = 53.000 l/mol*cm
  • Photostabilität ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen
  • 1 zeigt die Ergebnisse der Bestrahlung von wässrigen Lösungen (PBS pH 7,5, 100 mM & 100 mM NaCI plus 5 mM NaN3) der Verbindungen 5, 8, 11 und 38 im Vergleich zum MegaStokes-Farbstoff DY-510XL. Hierbei wurden Die Lösungen auf eine Extinktion von „1“ im Absorptionsmaximum bei einer Schichtdicke von 1 cm eingestellt und mit Weißlicht der 150W-Xe-Lampe eines Fluoreszenzspektrometers (JASCO FP-6600, Monochromator auf 0 nm, Spalteistellung L: 10nm) bestrahlt und die Absorption im Maximum in 5 min-Intervallen über eine Stunde verfolgt.
  • Fluoreszenzmaxima ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen
  • 2 zeigt die Fluoreszenzmaxima ausgewählter Verbindungen.
  • Die Erfindung bezieht sich auf neuartige, wasserlösliche Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Fluoreszenzquantenausbeute auf der Basis von sauerstoffhaltigen Heterocyclen, deren reaktive Derivate und Farbstoff-Konjugate sowie deren Anwendung zum Markieren von Proben und dem Nachweis von Analyten. Die Verbindungen der neuen Farbstoffklasse sind mit kommerziellen Anregungslichtquellen kompatibel und zeichnen sich durch Stokes-Verschiebungen von mehr als 50 nm aus.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 1318177 B1 [0004]
    • EP 1535969 B1 [0004]
    • WO 2007/135368 A2 [0005]
    • US 8158801 [0006]
    • US 9453010 B2 [0006]
    • EP 2886542 B1 [0006]
    • DE 2942931 A1 [0018]
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    • Olekhnovich E.P., Boroshko S.L., Korobka I.V., Metelitsa A.V., Olekhnovich L.P. [2] [0019]

Claims (15)

  1. Verbindung der allgemeinen Formel 1
    Figure DE102020109362A1_0064
     und Salze sowie Solvate davon, wobei R11 und R12 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl sind, R2 Wasserstoff, Alkyl oder Alkenyl ist, R3 Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR18R19 oder eine Gruppe Q ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) ω-Sutfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x 1-5 ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und Q eine heterocyclische Struktur ausgewählt aus einer Struktur der Formel 2 oder 3
    Figure DE102020109362A1_0065
     ist, mit n= 1, 2 oder 3; wobei R20 unabhängig voneinander jeweils Alkyl, ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, R21, R22, R23, R24 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat sind, R25 Wasserstoff, Alkyl, ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, wobei x jeweils eine ganze Zahl von 1-5 ist, und R4 Wasserstoff, Brom, Chlor, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist und R5 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, R6 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR29R30 ist, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus (i) C1-C4-Alkyl, (ii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x 1-5ist, (iii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y 1-8 ist und (iv) Ethylestern von (iii) ausgewählt sind, R7 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR31R32, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei R31 und R32 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x 1-5 ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, R8 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, R9 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist und L ein Linker ausgewählt aus-(CH2)s- und -[(CH2)m-O]p-(CH2)m- ist, wobei m eine ganze Zahl von 2 - 5 ist und p und s unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl von 1-10 darstellen, wobei jede Verbindung keinen oder einen Linker L enthält mit einer an L gebundenen reaktiven Gruppe A zur kovalenten Bindung an ein zu markierendes Molekül K, wobei A eine Amin- (-NH2), Hydroxy- (-OH) oder Phosphoramidit (-O-P-[O-CH2-CH2-CN]-N[(CH(CH3)2]2)-Funktion, eine Carbonsäure (-COOH), ein davon abgeleiteter Alkyl- oder Aktiv-Ester (NHS-Ester, Sulfo-NHS-Ester, Tetrafluoro-Phenylester, p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester), ein Carbonsäure-Hydrazid (-CONHNH2) oder ein Carbonsäure-Amid (-CONHR28) mit R28 gleich -(CH2)t-Y ist, wobei Y gleich -OH, -NH2, -NH3 +, Maleimid (-N[CO-CH]2), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH2-I, -NH-CO-CH2-Br, -Azid (-N3), -Alkin (-CCH) oder -Phosphoramidit (-O-P-[O-CH2-CH2-CN]-N-[CH-(CH3)2]2) ist und t eine ganze Zahl von 1-10 ist, K eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe Haptene (Moleküle, die ein unvollständiges Antigen darstellen und erst bei Bindung an Proteine bzw. Zellstrukturen die Wirkung eines Antigens zeigen), Proteine, Antikörper (Proteine, die als Reaktion auf Antigene gebildet werden), niedermolekulare Arzneistoffe (wirksame Bestandteile in Arzneimitteln, die aufgrund ihrer relativ geringen Molmasse bis etwa 800 g/mol, im Gegensatz zu zum Beispiel Proteinen als sehr große Moleküle, in der Lage sind in Zellen einzudringen), Peptide (kleine bzw. kurzkettige Proteine bis etwa 100 verknüpfte Aminosäuren), Nucleotide (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die aus einem Phosphatteil, einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil bestehen), Nucleoside (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die keinen Phosphatteil besitzen, sondern nur aus einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil bestehen), DNA-Oligomere (im Gegensatz zu DNA als Makromolekül Moleküle der Desoxyribonucleinsäure mit einer relativ geringen, nicht genau definierten Anzahl an Nucleotiden), Polymere (synthethische oder natürliche, kettenförmige oder verzweigte chemische Verbindung aus sich wiederholenden Einheiten, den Monomeren; Polymere können auch als Copolymere aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomeren in verschiedenen Mengenverhältnissen und Anordnungen bestehen), ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch R3= Hydroxy, wobei die Verbindung in Abhängigkeit vom pH-Wert als neutraler Grundkörper 3-Oxo-2H-xanthen 4
    Figure DE102020109362A1_0066
     vorliegt.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass mindestens eine ausgewählt aus R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 und R7-R8 verbrückt ist, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate enthalten.
  4. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Struktur der Formel 5,
    Figure DE102020109362A1_0067
     wobei R13 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist, R14 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist, R15 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR33R34, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat oder verbrückt zu R16 ist, wobei R33 und R34 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x 1-5 ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-CO2H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, R16 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR35R36 ist, wobei R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4-Alkyl, (vii) ω-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)x-SO3 -), wobei x 1-5ist, (viii) ω-Carbonsäurealkyl) (-(CH2)y-CO2H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, R17 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist und ein oder mehrere ausgewählt aus R5-R6, R6-R7, R7-R8, R14-R15, R15-R16 und R16-R17 verbrückt sein können, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten können und vorzugsweise Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen enthalten.
  5. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mindestens eine Sulfonsäuregruppe enthält.
  6. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R3 NR18R19 ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Benzyl, Aryl, Heteroaryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei NR18R19 vorzugsweise aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4-(Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist.
  7. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei 25 °C mindestens 1 mg der Verbindung in 1,000 g Wasser löslich sind.
  8. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um eine fluoreszierende Verbindung handelt, die ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 650 nm, vorzugsweise von 500 nm bis 550 nm, aufweist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Stokes-Verschiebung mindestens 40 nm, vorzugsweise 50 nm bis 120 nm, noch bevorzugter 70 nm bis 90 nm, beträgt.
  10. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin, 6-[[6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure, 3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-1-sulfonat, 3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino] propan-1-sulfonat, 3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, 3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-1-sulfonat, 4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl-amino]benzensulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methylamino]benzensulfonat, 6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat, 6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2-sulfonat, 6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol, 8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure, 3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat, 3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)propan-1-sulfonat, 6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl)hexansäureethylester, 3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat, 3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]propan-1-sulfonat, 6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-1-yl]hexansäure, 4-[[1-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-11-ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat, 6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-1H-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure, (2E)-1-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2-enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat, 3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-1-yl]propan-1-sulfonat, 6-(Diethylamino)-1,1-dimethyl-2H-xanthen-3-on, 6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-1-sulfonat, 6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-Hydroxy-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-(5-Carboxypentoxy)-1,1-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-1-yl)hexansäure, 1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
  11. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1, wobei das Verfahren die Reaktion von (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-yliden)-ethyl-oxonium oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-1-yliden]-ethyl-oxonium mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
  12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 5, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise von 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
  13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde.
  14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Markierung von ein oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, Zellen, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka.
  15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14 in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und/oder quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), zur Erforschung eines Genoms (DNA-Sequenzierung), in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Throughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (DNA- und Protein-Chips).
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