BR112021002507A2 - corantes de rodamina substituída por silício e conjugados de corante - Google Patents

Abstract

CORANTES DE RODAMINA SUBSTITUÍDA POR SILÍCIO E CONJUGADOS DE CORANTE. Trata-se de compostos de rodamina substituídos por silício. São descritos, também, no presente documento os corantes de SiR que compreendem pelo menos um grupo vinila ligado ao átomo de Si (posição 10) do corante de SiR. Derivados, versões funcionalizadas, conjugados, kits, métodos sintéticos relacionados e usos de compostos de SiR também são fornecidos. Os corantes de silício-rodamina (SiR) podem fornecer fluorescência brilhante em comprimentos de onda vermelhos distantes e podem exibir boa fotoestabilidade. Os compostos descritos no presente documento podem ser úteis para identificação fluorescente e detecção de amostras biológicas.

Description

“CORANTES DE RODAMINA SUBSTITUÍDA POR SILÍCIO E CONJUGADOS DE CORANTE”

[001]A presente divulgação se refere ao campo de corantes fluorescentes e aos seus conjugados.

INTRODUÇÃO E SUMÁRIO

[002]Em muitos campos, é útil ou necessário detectar ou quantificar o material biológico com o uso de corantes fluorescentes. Materiais biológicos como ácidos nucleicos, polipeptídeos, células e membranas podem ser detectados em vários tipos de amostra, por exemplo, em aplicações biomédicas, genéticas, de fermentação, aquicultura, agrícolas, forenses e ambientais. A fim de fornecer um corante com as propriedades desejadas para uma aplicação particular, muitas vezes é útil ou necessário funcionalizar ou conjugar o corante a uma porção química que tem como alvo o corante a componentes específicos, tal como uma determinada localização intracelular, componente intracelular (por exemplo, componente citoesquelético ou ácido nucleico) ou epítopo.

[003]Os corantes de silício-rodamina (SiR) podem fornecer fluorescência brilhante em comprimentos de onda vermelhos distantes e exibir boa fotoestabilidade e, portanto, tentativas de funcionalizar ou conjugar tais corantes foram feitas para várias aplicações. Essas tentativas estavam voltadas de modo geral para a modificação da porção química de xanteno do corante, porém tais modificações resultaram em mudanças significativas nas propriedades fotofísicas do corante, tais como absorção e comprimentos de onda de emissão, rendimento quântico e fotoestabilidade. Consequentemente, há uma necessidade de corantes de SiR que são ou podem ser modificados para aprimorar uma ou mais propriedades fotofísicas do corante, tais como comprimentos de onda de absorção e emissão, rendimento quântico e fotoestabilidade.

[004]No presente documento, são descritos corantes de SiR que compreendem pelo menos um grupo vinila ligado ao átomo de Si (posição 10) do corante de SiR e derivados, versões funcionalizadas, conjugados e seus usos. São fornecidos, também, métodos sintéticos relacionados. O grupo vinila pode ser derivado, por exemplo, com o uso de uma reação tiol-eno, para fornecer corantes de SiR funcionalizados ou conjugados. Os corantes que contém vinila e derivados podem ter propriedades fotofísicas semelhantes ao SiR livre e/ou ter propriedades ou características melhoradas (por exemplo, afinidade de ligação específica) para alvos biologicamente relevantes, tais como aqueles mencionados acima, fornecem outros benefícios ou pelo menos fornecem ao público uma escolha útil.

[005]Dito isso, o conteúdo a seguir é abrangido pelas modalidades fornecidas no presente documento. A modalidade 1 é um composto da Fórmula (I): (I) em que:

R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R3 é -COOH, SO3-, H, R3a, -L1-RA ou -L1-RB1;

R3a é , ou - C(O)N(RN3)(RN4); RN3 é H, metila, C2-6 alquila ou -CH2-A em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um grupo polar ou carregado; RN4 é -L1-RA ou -L¹-RB1 ou -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2, 3, 4, 5 ou 6; R3b é -OH ou -N(RN5)-L3a-RB; cada L3a é independentemente um conector; RB é um ligante reativo ou uma porção química de ligação a alvo; RN5 é H, metila ou C2-6 alquila; R4 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; E é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1;

R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R9 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; cada RN1 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R5 e/ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R6 e/ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo; R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ é um grupo acetila (Ac), AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo, e AM é acetoximetila; adicionalmente, em que (i) R2 não é metila ou C2-6 alquila, caso R1 seja metila ou C2-6 alquila, OR (ii) R3 é R3a ou -L¹-RB1; ou uma forma de espirolactona e/ou sal do mesmo.

[006]A modalidade 2 é um método para preparar um composto da Fórmula (P2):

(P2), sendo que o método compreende reagir compostos da Fórmula (P1a)

(P1a) e Fórmula (P1b)

(P1b)

com uma base de organolítio e, em seguida, com SiCl2R1R2, em que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2;

R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; cada RN1 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R5 e/ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R6 e/ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A2 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo; R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ é um grupo acetila (Ac), AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo, e AM é acetoximetila; desse modo, produzindo o composto da Fórmula (P2).

[007]A modalidade 3 é um método para preparar um composto da Fórmula (I) R4 R9 E R3 R5 R6 (RN1) 2N Si N(RN2) 2 R1 R2 R7 R8 (I)

que compreende reagir um composto da Fórmula (P2)

(P2) com um composto da Fórmula (P2a)

(P2a) na presença de CuBr2 a uma temperatura acima de 100 ºC, em que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R3 é -COOH, SO3-, H, R3a, -L1-RA ou -L1-RB1;

R3a é , ou - C(O)N(RN3)(RN4);

RN3 é H, metila, C2-6 alquila ou -CH2-A em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um grupo polar ou carregado; RN4 é -L1-RA ou -L¹-RB1 ou -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2, 3, 4, 5 ou 6; R3b é -OH ou -N(RN5)-L3a-RB; cada L3a é independentemente um conector; RB é um ligante reativo ou uma porção química de ligação a alvo; RN5 é H, metila ou C2-6 alquila; R4 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; E é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R9 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; cada RN1 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R5 e/ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R6 e/ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo;

R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ representa um grupo acetila, AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo e AM é acetoximetila; adicionalmente, em que (i) R2 não é metila ou C2-6 alquila, caso R1 seja metila ou C2-6 alquila, OR (ii) R3 é R3a ou -L¹-RB1; desse modo, produzindo o composto da Fórmula (I).

[008]A modalidade 4 é o composto ou método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que R1 ou R2 é vinila ou vinila substituída.

[009]A modalidade 5 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R1 ou R2 é vinila.

[010]A modalidade 6 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R1 ou R2 é vinila substituída por metila ou C2-6 alquila.

[011]A modalidade 7 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados.

[012]A modalidade 8 é o composto ou método da modalidade 7, em que o anel é um anel saturado.

[013]A modalidade 9 é o composto ou método da modalidade 7 ou 8, em que o anel é um anel de 5, 6 ou 7 membros.

[014]A modalidade 10 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 7 a 9, em que o anel não é substituído.

[015]A modalidade 11 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que R1 ou R2 é -L¹-RA.

[016]A modalidade 12 é o composto ou um método da modalidade 11, em que RA é -COOH.

[017]A modalidade 13 é o composto ou método da modalidade 11, em que RA é (por exemplo, éster NHS ou éster succinimidílico (SE)), carboxila, carboxiléster, maleimida, amida, éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP), éster acetoximetílico (AM), ácido nitrilotriacético, (NTA) aminodextrano e ciclo-octilina-amina.

[018]A modalidade 14 é o composto ou um método da modalidade 11, em que RA é uma funcionalidade de solubilização.

[019]A modalidade 15 é o composto ou método da modalidade 14, em que a funcionalidade de solubilização compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de óxido de etileno.

[020]A modalidade 16 é o composto ou um método da modalidade 11, em que RA compreende uma fosforamidita.

[021]A modalidade 17 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 6 ou 11 a 16, em que R1 ou R2 é -L¹-RB1.

[022]A modalidade 18 é o composto ou método da modalidade 17, em que RB1 compreende uma porção química de ligação a ácido nucleico.

[023]A modalidade 19 é o composto ou método da modalidade 17, em que RB1 compreende uma porção química de ligação a citoesqueleto.

[024]A modalidade 20 é o composto ou método da modalidade 17, em que RB1 compreende , , ou , em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, opcionalmente por meio de um conector.

[025]A modalidade 21 é o composto ou método da modalidade 17, em que RB1 compreende um anticorpo.

[026]A modalidade 22 é o composto ou método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada L1 é independentemente -(CH2)s- XL3a-, em que s é independentemente 2, 3, 4, 5 ou 6; cada X é independentemente CH2, S, S(O)ou S(O)2; e cada L3a é independentemente - (CH2)p- em que p é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[027]A modalidade 23 é o composto ou método da modalidade 22, em que s é 2.

[028]A modalidade 24 é o composto ou método da modalidade 22 ou 23, em que X é S.

[029]A modalidade 25 é o composto ou método da modalidade 22 ou 23,

em que X é S(O).

[030]A modalidade 26 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 22 a 25, em que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 2.

[031]A modalidade 27 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 22 a 25, em que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 3.

[032]A modalidade 28 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 22 a 25, em que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 4, 5 ou 6.

[033]A modalidade 29 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R3 é -COOH.

[034]A modalidade 30 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 28, em que R3 é SO3-.

[035]A modalidade 31 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 28, em que R3 é H.

[036]A modalidade 32 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 28, em que R3 é R3a.

[037]A modalidade 33 é o composto ou método da modalidade 32, em que R3a é -C(O)N(RN3)(RN4).

[038]A modalidade 34 é o composto ou método da modalidade 33, em que RN3 é metila.

[039]A modalidade 35 é o composto ou método da modalidade 33, em que RN3 é -CH2-A, em que A é um arila ou heteroarila substituída por pelo menos dois grupos polares ou carregados.

[040]A modalidade 36 é o composto ou método da modalidade 33 ou 35, em que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um -OH, -NH2, -COOH, -NO2 ou -SO3-.

[041]A modalidade 37 é o composto ou método da modalidade 33, 35 ou 36, em que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos dois grupos que são independentemente -OH, -NH2, -COOH, -NO2 ou -SO3-.

[042]A modalidade 38 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 35 a 37, em que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída, pelo menos, por dois grupos -SO3-.

[043]A modalidade 39 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 33 ou 35 a 38, em que A é uma arila substituída.

[044]A modalidade 40 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 33 a 39, em que RN4 é -(CH2)3-RB, opcionalmente em que RB de RN4 é -COOH.

[045]A modalidade 41 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 33 a 39, em que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2.

[046]A modalidade 42 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 33 a 39, em que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 3.

[047]A modalidade 43 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 33 a 39, em que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 4, 5 ou

6.

[048]A modalidade 44 é o composto ou método da modalidade 32, em que R3a é .

[049]A modalidade 45 é o composto ou método da modalidade 44, em que R3b é N(RN5)-L3a-RB.

[050]A modalidade 46 é o composto ou método da modalidade 45, em que RN5 é H.

[051]A modalidade 47 é o composto ou método da modalidade 45, em que RN5 é metila.

[052]A modalidade 48 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 44 a 47, em que R3b é -OH.

[053]A modalidade 49 é o composto ou método da modalidade 32, em que R3a é .

[054]A modalidade 50 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 45 a 49, em que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 2.

[055]A modalidade 51 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 45 a 49, em que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 3.

[056]A modalidade 52 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 45 a 49, em que cada L3a é independentemente -(CH2)p- em que p é 4, 5 ou 6.

[057]A modalidade 53 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que RB compreende um ligante reativo, opcionalmente em que o ligante reativo é uma carboxila, amina, maleimida ou éster ativo, ainda opcionalmente em que o éster ativo é um éster NHS ou éster succinimidílico (SE), éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP) ou éster pentafluorofenílico (PFP).

[058]A modalidade 56 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que RB compreende uma fosforamidita.

[059]A modalidade 55 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que RB compreende uma porção química de ligação a ácido nucleico.

[060]A modalidade 56 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que RB compreende uma porção química de ligação a citoesqueleto.

[061]A modalidade 57 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que RB compreende , , ou , em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, opcionalmente através de um ligante.

[062]A modalidade 58 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que RB compreende um anticorpo.

[063]A modalidade 59 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R4 é SO3-.

[064]A modalidade 60 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 58, em que R4 é H.

[065]A modalidade 61 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que E e R9 são, cada um, cloro.

[066]A modalidade 62 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 60, em que E e R9 são, cada um, H.

[067]A modalidade 63 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R5 é H.

[068]A modalidade 64 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 62, em que R5 é metila.

[069]A modalidade 65 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 62, em que R5 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN1.

[070]A modalidade 66 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R6 é H.

[071]A modalidade 67 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 65, em que R6 é metila.

[072]A modalidade 68 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 65, em que R6 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN2.

[073]A modalidade 69 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R7 é H.

[074]A modalidade 70 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que R7 é metila.

[075]A modalidade 71 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que R7 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN1.

[076]A modalidade 72 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R8 é H.

[077]A modalidade 73 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 71, em que R8 é metila.

[078]A modalidade 74 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 71, em que R8 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN2.

[079]A modalidade 75 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN1 é H.

[080]A modalidade 76 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN1 é metila ou C2-4 alquila.

[081]A modalidade 77 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN1 é -C(O)OR10.

[082]A modalidade 78 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 62 ou 65 a 67, em que RN1 forma um anel de 5 ou 6 membros com um R5.

[083]A modalidade 79 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 68 ou 71 a 78, em que um RN1 forma um anel com 5 ou 6 membros com R7.

[084]A modalidade 80 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN2 é H.

[085]A modalidade 81 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN2 é metila.

[086]A modalidade 82 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN2 é C2-4 alquila.

[087]A modalidade 83 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou cada RN2 é -C(O)OR10.

[088]A modalidade 84 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um RN2 forma um anel de 5 ou 6 membros com

R6.

[089]A modalidade 85 é o composto ou o método de qualquer uma das modalidades 1 a 65 ou 68 a 84, em que uma RN2 forma um anel com 5 ou 6 membros com R8.

[090]A modalidade 86 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 72 ou 75 a 85, em que R10 é -CH2-A1, em que A1 é uma arila opcionalmente substituída por pelo menos um R11.

[091]A modalidade 87 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R11 é metila.

[092]A modalidade 88 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 86, em que R11 é -OR12.

[093]A modalidade 89 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 86 ou 88, em que R12 é H.

[094]A modalidade 90 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é metila.

[095]A modalidade 91 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é acetila (Ac).

[096]A modalidade 92 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é acetoximetila (AM).

[097]A modalidade 93 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é -PO32-.

[098]A modalidade 94 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é -PO3(AM)2.

[099]A modalidade 95 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que R12 é um glicosídeo.

[0100]A modalidade 96 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um RN1 ou RN2 é -C(O)R13, opcionalmente em que apenas um dentre RN1 ou RN2 é -C(O)R13.

[0101]A modalidade 97 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R15 é um oligopeptídeo reconhecido por uma protease, opcionalmente em que a protease é uma caspase.

[0102]A modalidade 98 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R15 é um tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octopeptídeo ou nonapeptídeo.

[0103]A modalidade 99 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R15 compreende a sequência de aminoácidos DVED.

[0104]A modalidade 100 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R15 compreende a sequência de aminoácidos DVEDHN.

[0105]A modalidade 101 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R15 é um oligopeptídeo ligado através de sua extremidade C ao anel de R13.

[0106]A modalidade 102 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que R1 ou R2 é metila ou C2-6 alquila.

[0107]A modalidade 103 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um, dois ou três dos seguintes são verdadeiros: a modalidade 104 é o fato de que R5 e R6 são idênticos; a modalidade 105 é o fato de que de um RN1 é idêntico a m RN2; ou a modalidade 106 é o fato de que R7 e R8 são idênticos.

[0108]A modalidade 107 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, cada RN1 é idêntico a um RN2.

[0109]A modalidade 108 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto tem um plano de simetria de espelho que passa através do silício e R4, opcionalmente com a exceção de que R1 e R2 não são necessariamente idênticos.

[0110]A modalidade 109 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores que tem a estrutura: ou uma forma aberta, sal ou ácido livre do mesmo.

[0111]A modalidade 110 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto é um nucleosídeo/nucleotídeo marcado com a fórmula: NUC-DYE em que NUC é uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; DYE é a porção química de SiR do composto, em que NUC e DYE são conectados por um conector; em que o conector está ligado a DYE em uma das posições R1 ou R2 da Fórmula (I); opcionalmente, em que caso o NUC compreenda uma base de purina, a conector está ligada à posição 8 da purina, caso NUC compreenda uma base de 7-deazapurina, a conector está ligada à posição 7 da 7-deazapurina e caso o NUC compreenda uma base de pirimidina, a conector é ligada à posição 5 da pirimidina.

[0112]A modalidade 111 é o composto ou método da modalidade 110, em que o NUC compreende um trifosfato de nucleotídeo, iniciador, produto de extensão de iniciador ou sonda.

[0113]A modalidade 112 é o composto ou método da modalidade 110 ou 111 que compreende adicionalmente um arrefecedor brusco ou fluoróforo em uma relação de transferência de energia com a porção química de SiR do composto.

[0114]A modalidade 113 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 110 a 112, em que o NUC compreende uma base selecionada a partir do grupo que consiste em uracila, citosina, deazaadenina e deazaguanosina.

[0115]A modalidade 114 é o composto ou método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 108, em que o composto é um composto de fosforamidita da Fórmula (L1): (L1) em que: X e Y formam juntos um conector; B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 obtidos separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila e cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; e D é a porção química de SiR do composto; em que Y está ligado a D em uma das posições R1 ou R2 da Fórmula (I).

[0116]A modalidade 115 é o composto ou método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 108, sendo que o composto é um composto de fosforamidita da Fórmula (L2): (L2) em que: B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 considerados separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila ou cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; B5 é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila clivável por ácido; B é uma base de nucleosídeo/nucleotídeo; D é a porção química SiR do composto; B está ligado a D através de uma região ligadora a uma dentre as posições R1 ou R2 da Fórmula (I); opcionalmente, em que caso B seja purina ou 7-deazapurina, a porção química de açúcar está ligada na posição N9 da purina ou 7-deazapurina, e caso B seja pirimidina, a porção química de açúcar está ligada na posição N1 da pirimidina; opcionalmente, em que caso B seja uma purina, a região ligadora é fixada à posição 8 da purina, caso B seja 7-deazapurina, a região ligadora é ligada à posição 7 da 7-deazapurina e caso B seja pirimidina, o conector está ligado à posição 5 da pirimidina.

[0117]A modalidade 116 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 1 a 115, em que o composto que é qualquer um dos compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59, ou uma forma aberta ou de espirolactona e/ou sal ou ácido livre do mesmo.

[0118]A modalidade 117 é um composto formado reagindo-se um primeiro composto que é qualquer um dentre os compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59 com uma porção química de ligação a alvo, a nucleosídeo/nucleotídeo ou a polinucleotídeo, opcionalmente em que o primeiro composto é ativado primeiramente convertendo-se uma porção química do mesmo em um ligante reativo que reage com a porção química de ligação a alvo; ou uma forma aberta ou espirolactona e/ou sal ou ácido livre dos mesmos.

[0119]A modalidade 118 é o composto da modalidade 117, em que a porção química de ligação a alvo é um anticorpo, porção química de ligação a ácido nucleico ou porção química de ligação a citoesqueleto.

[0120]A modalidade 119 é um método de detecção de um polinucleotídeo alvo que compreende colocar uma amostra que compreende, ou suspeita de compreender, o polinucleotídeo-alvo em contato com um composto de qualquer uma das modalidades 1 ou 4 a 117 que tem capacidade para se ligar especificamente ao polinucleotídeo-alvo e determinar se um complexo que compreende o polinucleotídeo-alvo e o composto foi formado.

[0121]A modalidade 120 é o composto ou método, de acordo com a modalidade 119, em que a determinação da possibilidade de um complexo que compreende o polinucleotídeo-alvo e o composto ter sido formado compreende detectar a fluorescência do complexo ou detectar uma mudança na fluorescência resultante da formação do complexo, opcionalmente, em que a mudança na fluorescência resultante da formação do complexo é uma redução do arrefecimento brusco por um arrefecedor brusco devido à clivagem ou uma mudança conformacional.

[0122]A modalidade 121 é um método de sequenciamento de um polinucleotídeo que compreende colocar o polinucleotídeo em contato com o composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 108 ou 110 a 117 durante uma reação de sequenciamento, formar um produto de sequenciamento e detecção de fluorescência do produto de sequenciamento, em que o composto compreende um iniciador ou trifosfato de nucleotídeo.

[0123]A modalidade 122 é o composto ou método da modalidade 121, em que o composto é um nucleotídeo terminador ou dinucleotídeo marcado que termina a síntese do produto de sequenciamento, opcionalmente em que o nucleotídeo terminador identificado é um didesoxinucleotídeo identificado ou um nucleotídeo terminador reversível ou dinucleotídeo.

[0124]A modalidade 123 é o composto ou método da modalidade 121, em que o composto é um iniciador e o produto de sequenciamento é formado pela extensão do iniciador.

[0125]A modalidade 124 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 121 a 123, em que o método compreende separar o produto de sequenciamento de outros produtos de sequenciamento antes de detectar fluorescência, opcionalmente em que a separação ocorre por eletroforese, ainda opcionalmente em que a eletroforese é eletroforese capilar.

[0126]A modalidade 125 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 121 a 123, em que o método compreende detectar o produto de sequenciamento in situ.

[0127]A modalidade 126 é um método para identificar um nucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende um primeiro ligante reativo, sendo que o método compreende reagir o nucleotídeo ou polinucleotídeo com um composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 108 ou 110 a 117 que compreende um segundo ligante reativo com capacidade para formar uma ligação após a reação com o primeiro ligante reativo.

[0128]A modalidade 127 é o composto ou método da modalidade 126, em que o segundo ligante reativo é uma fosforamidita.

[0129]A modalidade 128 é o composto ou método da modalidade 126, em que o segundo ligante reativo é um éster ativo, opcionalmente, em que o éster ativo é um éster NHS.

[0130]A modalidade 129 é um método para marcar um polinucleotídeo que compreende o contato do polinucleotídeo com um composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 108 ou 110 a 117 que compreende uma porção química de ligação ao polinucleotídeo.

[0131]A modalidade 130 é um complexo fluorescente que compreende um composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 108 ou 110 a 117 que compreende uma porção química de ligação ao polinucleotídeo associada não de maneira covalente a um polinucleotídeo.

[0132]A modalidade 131 é o método da modalidade 129 ou o complexo fluorescente da modalidade 130, em que o polinucleotídeo tem um comprimento de cerca de 8 a cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 30 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 50 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 5 Mb, cerca de 5 Mb a cerca de 50 Mb, ou cerca de 50 Mb a cerca de 500 Mb.

[0133]A modalidade 132 é o método ou complexo fluorescente de qualquer uma das modalidades 119 a 131, em que o ácido nucleico é um plasmídeo, cosmídeo, produto de PCR, fragmento de restrição, cDNA, DNA genômico ou um oligonucleotídeo natural ou sintético.

[0134]A modalidade 133 é o método ou complexo fluorescente de qualquer uma das modalidades 119 a 132, em que o polinucleotídeo está em um gel de eletroforese, uma célula, uma organela, vírus, viroide ou fluido biológico ou está em ou foi obtido de uma amostra de água, amostra de solo, alimento, processo de fermentação ou lavagem de superfície.

[0135]A modalidade 134 é um método para determinar a integridade da membrana celular, sendo que o método que compreende:

[0136]a) incubar uma amostra que contém uma ou mais células com um composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 109 ou 116 a 118 por um tempo suficiente para o composto entrar nas células com membranas celulares comprometidas; e

[0137]b) determinar a integridade da membrana celular de uma ou mais células com base na presença de um sinal fluorescente detectável de uma ou mais células, em que a presença do sinal fluorescente detectável indica que a integridade da membrana celular está comprometida e a ausência do sinal fluorescente detectável indica que a integridade da membrana celular está intacta.

[0138]A modalidade 135 é um método de detecção de um alvo que compreende colocar uma amostra que compreende, ou suspeita de compreender, o alvo em contato com um composto de qualquer uma das modalidades 1, 4 a 109 ou 116 a 118 que compreende uma porção química de ligação a alvo que se liga especificamente ao alvo e detecta fluorescência de um complexo que compreende o alvo e o composto.

[0139]A modalidade 136 é o composto ou método da modalidade 135, em que a amostra compreende células.

[0140]A modalidade 137 é o composto ou método da modalidade 135, em que a amostra compreende um extrato biológico.

[0141]A modalidade 138 é o composto ou método de qualquer uma das modalidades 134 a 137, em que a detecção de fluorescência é realizada com o uso de um microscópio de fluorescência, leitor de placas, dispositivo de varredura de fluorescência, fluorímetro ou citômetro de fluxo.

[0142]A modalidade 139 é um kit para detectar um alvo que compreende um composto de qualquer uma das modalidades 1 ou 4 a 117 que compreende uma porção química de ligação a alvo configurada para se ligar especificamente ao alvo.

[0143]A modalidade 140 é o kit da modalidade 139, em que o alvo é actina ou microtúbulos e a porção química de ligação a alvo é uma porção química de ligação à actina ou uma porção química de ligação a microtúbulos.

[0144]A modalidade 141 é o kit da modalidade 139, em que a porção química de ligação a alvo é um anticorpo específico para o alvo.

[0145]A modalidade 142 é o kit da modalidade 139, em que o alvo é um anticorpo primário e a porção química de ligação a alvo é um anticorpo secundário específico para o anticorpo primário.

[0146]A modalidade 143 é o kit de qualquer uma das modalidades 139 a 141, em que o alvo é um polipeptídeo, polissacarídeo, lipídio ou polinucleotídeo.

[0147]A modalidade 144 é um kit para colorir uma amostra que compreende um composto de qualquer uma das modalidades 1 ou 4 a 118.

[0148]A modalidade 145 é um kit para conjugar um composto da Fórmula (I) a uma porção química de ligação a alvo, nucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende um composto de qualquer uma das modalidades 1 ou 4 a 118 que compreende pelo menos um ligante reativo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0149]As Figuras 1A a 1R mostram estruturas de compostos de Si- Rodamina (SiR) exemplificativos fornecidos no presente documento. A Figura 1A mostra as estruturas dos Compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2 e 2A. A Figura 1B mostra as estruturas dos Compostos 3, 4 e 4A. A Figura 1C mostra as estruturas dos Compostos 5 e 6. A Figura 1D mostra as estruturas dos Compostos 7, 7A e 7B. A Figura 1E mostra as estruturas dos Compostos 8, 9 e 10A. A Figura 1F mostra as estruturas dos Compostos 10B, 11 e 12. A Figura 1G mostra as estruturas dos Compostos 13, 14 e 15. A Figura 1H mostra as estruturas dos Compostos

16, 17, 18, 19, 20 e 21. A Figura 1I mostra as estruturas dos Compostos 22, 23, 24, 25, 26 e 27. A Figura 1J mostra as estruturas dos Compostos 28, 29, 30, 31, 32 e 33. A Figura 1K mostra as estruturas dos Compostos 34, 35, 36, 37, 38 e

39. A Figura 1L mostra a estrutura do Composto 43. A Figura 1M mostra as estruturas dos Compostos 45 e 46. A Figura 1N mostra as estruturas dos Compostos 47, 48, 49 e 50. A Figura 1O mostra as estruturas dos compostos 51 e 52. A Figura 1P mostra as estruturas dos Compostos 53, 54, 55 e 56. A Figura 1Q mostra as estruturas dos Compostos 57, 58 e 59. A Figura 1R ilustra a forma aberta zwitteriônica fluorescente de um composto de SiR genérico à esquerda e a forma fechada espiro não fluorescente do mesmo composto de SiR genérico à direita.

[0150]As Figuras 2A a 2E ilustram a preparação de vários compostos de SiR. A Figura 2A mostra uma rota sintética para um composto de SiR de acordo com métodos conhecidos. A Figura 2B mostra um esquema sintético exemplificativo para os compostos 1 a 3 de acordo com as modalidades fornecidas no presente documento que podem ser usados em reações de conjugação a vários ligantes de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento (o composto 3 pode ser produzido por oxidação do Composto 2 com o uso de métodos conhecidos). A Figura 2C mostra uma preparação exemplificativa do Composto 2A a partir do Composto 2 que pode ser usado em reações de conjugação, tais como aquelas indicadas de acordo com determinadas modalidades no presente documento fornecidas. A Figura 2D mostra as estruturas de um corante nuclear para células vivas (Composto 4), uma sonda de tubulina (Composto 5) e uma sonda de actina (Composto 6) que pode ser preparada a partir do Composto 2 (por exemplo, por meio do Composto 2A) de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento. A Figura 2E mostra um esquema sintético exemplificativo para o Composto 7B por meio do Composto 7A, de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento.

[0151]As Figuras 3A a 3E mostram uma comparação da marcação de células vivas de SiR-Hoechst (Spirochrome, Suíça) ou Composto 4 em duas concentrações diferentes e da intensidade média do sinal nuclear. As células com marcação positiva aparecem como objetos cinza a branco em um segundo plano preto. A marcação foi visivelmente mais brilhante com o Composto 4. A Figura 3A mostra células marcadas com SiR-Hoechst 1 μM. A Figura 3B mostra células marcadas com SiR-Hoechst a 2 μM. A Figura 3C mostra células marcadas com Composto 4 a 1 μM. A Figura 3D mostra células marcadas com Composto 4 a 2 μM. A Figura 3E mostra um gráfico de barras que compara a intensidade de sinal nuclear observada das células marcadas com SiR-Hoechst e Composto 4. A intensidade do sinal nuclear foi determinada calculando-se a média da intensidade de fluorescência nos núcleos para cada marcação e concentração testada.

[0152]As Figuras 4A a 4D mostram uma comparação de células marcadas com sondas de tubulina com o uso de docetaxel (Taxol) como o ligante de direcionamento. Dois campos são mostrados para cada corante. As células foram marcadas com o Composto 5 a 0,5 μM ou SIR-Taxol (Spirochrome, Suíça) e o imageamento foi realizado. As Figuras 4A a 4B mostram células marcadas com o Composto 5. As Figuras 4C a 4D mostram células marcadas com SiR- Taxol.

[0153]As Figuras 5A a 5D mostram uma comparação da intensidade de fluorescência e de fotoestabilidade do Composto 7 e TO-PRO-3. As células A459 fixas foram marcadas com Composto 7 a 1 μM ou TO-PRO-3, e as imagens foram coletadas com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência. As células com marcação positiva aparecem como objetos cinza claro em um segundo plano preto. A Figura 5A mostra a marcação com TO-PRO-3 a 1 μM. A Figura 5C mostra a marcação com o Composto 7 a 1 μM. A Figura 5B mostra a fluorescência TO-PRO-3 após uma exposição de 1 minuto à luz de excitação do canal Cy5 (pouca ou nenhuma fluorescência foi observada). A Figura 5D mostra a fluorescência do Composto 7 após uma exposição de 1 minuto à luz de excitação do canal Cy5.

[0154]As Figuras 6A a 6E mostram uma comparação da intensidade de fluorescência e vazamento do canal DAPI dos Compostos 7 e 7B. As Figuras 6A a 6D mostram que o Composto 7B é mais brilhante que o Composto 7 quando visualizado no canal Cy5 (Figura 6A e 6C, respectivamente) e mostra menos vazamento no canal DAPI (Figura 6B e 6D, respectivamente). A Figura 6E mostra um gráfico de barra demonstrando que o sinal do Composto 7B aumentou 12% no canal Cy5 quando comparado ao Composto 7 (consultar a Figura 6E, nº 3 e nº 1, respectivamente), e uma redução surpreendente de 50% no canal DAPI quando comparado ao Composto 7 (Figura 6E, nº 4 e nº 2, respectivamente).

[0155]As Figuras 7A a 7B comparam a fotoestabilidade do Composto 10B ao corante ALEXA FLUOR™ 647 ("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) após parar as lâminas com PROLONG™ Diamond ("PLD", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ou meio de montagem VECTASHIELDTM (“VSH”, Vector Laboratories, Burlingame, CA). As células HeLa foram colocadas em lâminas e marcadas com o Composto 10B a 50 μM ou com AF647. A Figura 7A compara a porcentagem de fluorescência remanescente em espécimes marcadas com AF647 ou com o Composto 10B e montados com PROLONG™ Diamond (PLD) ou VECTASHIELD™. O AF647 e o VECTASHIELD foram completamente fotobranqueados (dados não mostrados). A Figura 7B mostra um diagrama esquemático de como as amostras foram fotografadas com um microscópio confocal com o uso do laser de 633 nm. Cada região de interesse em 3 campos de visão foi digitalizada 50 vezes.

[0156]A Figura 8 ilustra o uso do Composto 54-Fosforamidita e FAM- Fosforamidita para a geração de um marcador de iniciador do Composto 54-FAM que pode ser usado para marcar polinucleotídeos ou oligonucleotídeos, de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento. O iniciador emitirá mais de 650 nm.

[0157]A Figura 9 ilustra a geração de um oligonucleotídeo iniciador conjugado com FAM e uma porção química de SiR derivada do Composto 59 através de um éster NHS do mesmo. O oligonucleotídeo iniciador é marcado por um marcador de iniciador do Composto 59-FAM, de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento.

[0158]As Figuras 10A a 10B mostram as estruturas de compostos exemplificativos úteis para procedimentos em laboratório, tais como marcação de células fixas ou marcação de anticorpos. A Figura 10A ilustra a preparação de um composto útil como um corante de células fixas, representado no presente documento por um corante de SiR conjugado a um ligante, de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento. A Figura 10B ilustra a preparação de um éster NHS de SiR solúvel em água seguido por sua conjugação a um anticorpo, de acordo com determinadas modalidades fornecidas no presente documento.

[0159]As Figuras 11A a 11B comparam os espectros de absorbância e emissão de vários compostos com o corante ALEXA FLUOR™ 647 ("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A Figura 11A compara os espectros de absorção dos Compostos 8, 10A e 12 com AF647. A Figura 11B compara os espectros de emissão dos compostos 10A e 12 com AF647.

[0160]As Figuras 12A a 12C mostram exemplos de células marcadas com um anticorpo antitubulina e com um corante ALEXA FLUOR™ 647 ("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ou o Composto 10A conjugado a um anticorpo secundário em um grau de identificação (“DOL”) de

15. As células com marcação positiva para tubulina aparecem de cinza a branco no segundo plano preto. Os núcleos foram marcados com DAPI. A Figura 12A mostra células marcadas com AF647. A Figura 12B mostra a marcação de células com o Composto 10A (DOL = 15). A Figura 12C compara a fluorescência de AF647, do Composto 10A (DOL = 10) e do Composto 10A (DOL = 15) versus a concentração de cada reagente secundário identificado usado. Nos resultados do Composto 10A, embora menos brilhante que o AF647, nenhuma fluorescência fora do alvo ou em segundo plano foi observada, e o Composto 10A mostrou fotoestabilidade superior à do AF647.

[0161]A Figura 13 mostra uma comparação de conjugados de anticorpos do Composto 13, Composto 14 ou AF647 em sua capacidade de resistir ao fotobranqueamento. Tanto o Composto 13 quanto o Composto 14 foram substancialmente resistentes à fotodegradação por mais de 700 segundos de exposição, ao passo que o AF647 não foi resistente. DOL indica o grau de identificação (por exemplo, porções químicas de corante de SiR por anticorpo).

[0162]A Figura 14 mostra a intensidade do sinal nuclear de células marcadas com Composto 4B (PDT inferior) e com o Composto 4C (PDT superior) para os tipos de células A549 e HeLa.

[0163]A Figura 15 mostra gráficos de barras que comparam a intensidade do sinal nuclear de células marcadas com SiR-Hoechst e com o Composto 4B e 4C nos canais Cy5 e DAPI.

[0164]A Figura 16 mostra um gráfico de barras que compara as intensidades de sinal dos diasterômeros A e B para o Composto 5 em comparação a uma mistura de diasterômeros e um composto comercial de SiR- Taxol.

[0165]A Figura 17A mostra um gráfico de barras que compara a intensidade média do sinal às sondas de actina do Composto 6 preparadas com diferentes tipos de ligantes. A Figura 17B mostra um gráfico de barras que compara a relação sinal-segundo plano (S/B) para sondas de actina do Composto 6 preparadas com diferentes tipos de ligantes.

[0166]A Figura 18A mostra um gráfico de barras que compara a intensidade média do sinal Composto 6A, Composto 6B, uma mistura do Composto 6A e 6B isolado (antes da separação do isômero), uma combinação dos dois isômeros separados do Composto 6 (A/B) e células identificadas com SiR-Actina (Spirochrome). A Figura 18B mostra um gráfico de barras que compara a relação sinal-segundo plano para cada um dos compostos testados na Figura 18A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS MODALIDADES

[0167]A seguir, a referência será feita detalhadamente a determinadas modalidades da divulgação cujos exemplos são ilustrados nos desenhos anexos.

Deve-se entender que tanto a descrição geral quanto a descrição detalhada servem a título de exemplo e de explicação apenas e não limitam os ensinamentos. Embora a divulgação seja descrita em combinação com as modalidades ilustradas, será entendido que estas não devem limitar a divulgação a essas modalidades. Pelo contrário, a divulgação deve abranger todas as alternativas, modificações e equivalentes que possam ser incluídos na divulgação, conforme definido pelas reivindicações anexas.

[0168]Antes de descrever os presentes ensinamentos detalhadamente, deve ser entendido que a divulgação não se limita a composições ou a etapas de processo específicas, pois estas podem variar. Deve-se observar que, conforme usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem o plural, salvo quando o contexto dite claramente o contrário. Disto isso, por exemplo, a referência a "um corante" inclui uma pluralidade de corantes, e a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de células e semelhantes. O termo “ou” é usado em um sentido inclusivo, isto é, equivalente a “e/ou”, salvo quando o contexto ditar claramente de outro modo.

[0169]Para efeito do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, salvo quando indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades, porcentagens ou proporções e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo “aproximadamente”, até o ponto em que já não tiverem sido modificados. “Aproximadamente” indica um grau de variação que não afeta substancialmente as propriedades da matéria descrita, por exemplo, dentro de 10%, 5%, 2% ou 1%. Por conseguinte, salvo quando indicado de outro modo, os parâmetros numéricos estabelecidos no relatório descritivo a seguir e nas reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades cuja obtenção é desejada. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina dos equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado considerando o número de dígitos significativos relatados e aplicando-se técnicas comuns de arredondamento. Além disso, o uso de “compreendem”, “compreende”, “que compreende”, “contêm”, “contém”, “que contém”, “incluem”, “inclui” e “incluindo” não deve ser limitativo.

[0170]Salvo quando especificamente indicado no relatório descritivo acima, as modalidades no relatório descritivo que recitam "que compreende" vários componentes também são contempladas como “que consistem" ou “que consistem essencialmente" nos componentes recitados; as modalidades no relatório descritivo que recitam “que consiste em" vários componentes também são contempladas como "que compreendem" ou “que consistem essencialmente" nos componentes recitados; e as modalidades no relatório descritivo que recitam “que consiste essencialmente em" vários componentes também são contempladas como “que consistem" ou "que compreendem" os componentes recitados (essa intercambialidade não se aplica ao uso desses termos nas reivindicações).

[0171]Os cabeçalhos de seção usados no presente documento são para fins organizacionais somente e não serão interpretados como limitativos da matéria descrita. Caso qualquer literatura incorporada a título de referência contradiga qualquer termo definido no presente relatório descritivo, este relatório descritivo prevalece. Embora os presentes ensinamentos sejam descritos em combinação com várias modalidades, os presentes ensinamentos não estão destinados a serem limitados por tais modalidades. Pelo contrário, os presentes ensinamentos englobam várias alternativas, modificações e equivalentes, como será apreciado por aqueles versados na técnica.

DEFINIÇÕES

[0172]Salvo quando indicado de outro modo, os seguintes termos e frases, conforme usados no presente documento, devem ter os seguintes significados:

[0173]O termo "ou combinações dos mesmos", conforme usado no presente documento, se refere a todas as permutações e combinações dos termos listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações dos mesmos" deve incluir pelo menos um dentre: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC, e caso a ordem seja importante em um contexto específico, também BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC ou CAB. Continuando com esse exemplo, estão expressamente incluídas as combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB e assim por diante. A pessoa versada na técnica entenderá que normalmente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, salvo quando evidente de outro modo a partir do contexto.

[0174]Conforme usado no presente documento, o termo "kit" se refere a um conjunto empacotado de componentes relacionados, tais como um ou mais compostos ou composições e um ou mais materiais relacionados, tais como solventes, soluções, tampões, instruções ou dessecantes.

[0175]"Substituído", conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por um ou mais átomos de não hidrogênio, grupos funcionais ou porções químicas. Por exemplo, um nitrogênio não substituído é —NH2, ao passo que um nitrogênio substituído é —NHCH3. Os substituintes incluem, porém sem limitação, halogênio, por exemplo, flúor e cloro, (C1C8) alquila, sulfato, sulfonato, sulfona, amino, amônio, amido, nitrila, nitro, alcóxi inferior, fenóxi, aromático, fenila, aromático policíclico, heterociclo, grupo solubilizante em água, ligação, porção química de ligação. Em algumas modalidades, os substituintes incluem, porém sem limitação

[0176]-X, -R, -OH, -OR, -SR, -SH, -NH2, -NHR, -NR2, -+NR3, -N=NR2, - CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N2+, -N3, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)NR2, -S(O)2O- , -S(O)2R, -OS(O)2OR, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)(OR)2, -P(O)(OR)2, -P(O)(O- )2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -CO2- , -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -C(NR)NR2, em que cada X é independentemente um halogênio, e cada R é independentemente -H, C1C6 alquila, C5C14 arila, heterociclo ou grupo de ligação.

[0177]Salvo quando indicado de outro modo, a nomenclatura de substituintes que não são explicitamente definidos no presente documento é fornecida nomeando-se a porção terminal da funcionalidade seguida pela funcionalidade adjacente em direção ao ponto de fixação. Por exemplo, o substituinte “arilalquilóxicarbonila” se refere ao grupo (aril)-(alquil)-OC(O)-.

[0178]Entende-se que em todos os grupos substituídos definidos no presente documento, os polímeros obtidos definindo-se substituintes com substituintes adicionais para si mesmos (por exemplo, arila substituída que em um grupo arila substituído como um substituinte que é, por si só, substituído por um grupo arila substituído, que é substituído adicionalmente por um grupo arila substituído etc.) não devem ser incluídos no presente documento. Em tais casos, o número máximo de tais substituições é três. Por exemplo, as substituições em série de grupos arila substituídos por dois outros grupos arila substituídos estão limitadas a -arila substituída -(arila substituída)-arila substituída.

[0179]De modo semelhante, entende-se que as definições fornecidas no presente documento não devem incluir padrões de substituição inadmissíveis (por exemplo, metila substituída por 5 grupos fluoro). Esses padrões de substituição inadmissíveis são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

[0180]Os compostos divulgados no presente documento podem existir em formas não solvatadas, assim como em formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. Estes compostos podem existir em múltiplas formas cristalinas ou amorfas. De modo geral, todas as formas físicas são equivalentes para os usos descritos no presente documento e devem ser abrangidas pelo escopo da presente divulgação. Os compostos no presente documento divulgados podem possuir átomos de carbono assimétricos (isto é, centros quirais) ou ligações duplas; os racematos, diastereômeros, isômeros geométricos e isômeros individuais dos compostos descritos no presente documento estão dentro do escopo da presente divulgação. Os compostos descritos no presente documento podem ser preparados como um único isômero ou como uma mistura de isômeros.

[0181]Quando os grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais e são escritos da esquerda para a direita, estes abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, –CH2O– também deve recitar –OCH2–.

[0182]Será entendido que as estruturas químicas que são utilizadas para definir os compostos divulgados no presente documento são, cada uma, representações de uma das possíveis estruturas de ressonância pelas quais cada estrutura fornecida pode ser representada. Além disso, será entendido que, por definição, as estruturas de ressonância são apenas uma representação gráfica usada pelas pessoas versadas na técnica para representar a deslocalização de elétrons e que a presente divulgação não se limita, de modo algum, a mostrar uma estrutura de ressonância específica para qualquer estrutura determinada.

[0183]Quando um composto divulgado inclui um sistema de anel conjugado, a estabilização de ressonância pode permitir que uma carga eletrônica formal seja distribuída por toda a molécula. Embora uma carga particular possa ser descrita como localizada em um sistema de anel particular, ou um heteroátomo particular, é geralmente entendido que pode ser desenhada uma estrutura de ressonância comparável na qual a carga pode estar formalmente localizada em uma porção alternativa do composto.

[0184]“Alquila" significa um radical de hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado, de cadeia linear ou cíclica derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um alcano, alceno ou alquina parental. Os grupos alquila típicos consistem em 1 a 12 carbonos saturados e/ou insaturados, incluindo, porém sem limitação, metila, etila, propila, butila e semelhantes. Em algumas modalidades, uma alquila é um grupo hidrocarbila alifático saturado monovalente que tem de 1 a 10 átomos de carbono, por exemplo, 1 a 6 átomos de carbono, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono. “Alquila” inclui, a título de exemplo, grupos hidrocarbila linear e ramificados, tais como metila (CH3-), etila (CH3CH2-), n-propila (CH3CH2CH2-), isoproprila ((CH3)2CH-), n-butila (CH3CH2CH2CH2-), isobutila ((CH3)2CHCH2-), sec-butila ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butila ((CH3)3C-), n-pentila (CH3CH2CH2CH2CH2-) e neopentila ((CH3)3CCH2-).

[0185]“Alquila substituída” se refere a um grupo alquila que tem de 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 ou 1 a 2 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em alcóxi, alcóxi substituído, acila, acilamino, acilóxi, amino, amino substituído, aminocarbonila, aminotiocarbonila, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarbonilóxi, aminossulfonila, aminossulfonilóxi, aminossulfonilamino, amidino, arila, arila substituída, arilóxi, arilóxi substituído, ariltio, ariltio substituído, carboxila, carboxilalquila, éster carboxílico) amino, (éster carboxílico) ciano, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilóxi, cicloalquilóxi substituído, cicloalquiltio, cicloalquiltio substituído, cicloalcenila, cicloalquenila substituída, cicloalquenilóxi, cicloalcenilóxi substituído, cicloalceniltio, cicloalqueniltio substituído, halilóxi substituído, heteroalqueniltio, guanidino, hetero-guanidino substituído, heterilóxi substituído, heterilóxi, hetero- guanidino, heterilóxi substituído, heterilóxi substituído, hetero-hidróxi, heteroariltio, heteroariltio substituído, heterocíclico, heterocíclico substituído, heterociclilóxi substituído, heterociclilóxi substituído, heterocicliltio, heterocicliltio substituído, nitro, -SO3H, sulfonila substituída, sulfonilóxi, tioacila, tiol, alquiltio e alquiltio substituído, em que os substituintes citados são definidos no presente documento. Os grupos alquila substituída específicos compreendem um grupo reativo para ligação direta ou indireta a uma molécula carreadora ou suporte sólido, por exemplo, porém sem limitação, alquila substituída por carboxila ou um éster carboxílico (por exemplo, um éster ativado, tal como um éster de N- hidroxisuccinimida) e alquila substituída por aminocarbonil -CONHR, em que R é uma porção química orgânica, conforme definido abaixo com referência ao termo “aminocarbonila", por exemplo, um grupo C1-C10 (por exemplo, C1-C6) alquila com terminal substituído por um grupo reativo (Rx), incluindo, porém sem limitação, carboxila, éster carboxílico, maleimida, éster succinimidílico (SE), éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP), ácido nitrilotriacético (NTA), aminodextrano e ciclo-octina-amina.

[0186]O “alquilsulfonato” é –(CH2)n–SO3H, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0187]“Alcóxi" se refere ao grupo –O-alquila, em que alquila é definida no presente documento. O alcóxi inclui, a título de exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, t-butóxi, sec-butóxi e n-pentóxi. Em algumas modalidades, um alcóxi é OR, em que R é C1-C6 alquila.

[0188]O "alcóxi substituído" se refere ao grupo –O-(alquila substituída), em que alquila substituída é definida no presente documento.

[0189]“Alquildi-ila" significa um radical de hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado, de cadeia linear ou cíclica de 1 a 20 átomos de carbono e que tem dois centros de radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano, alceno ou alquina parental. Os radicais alquildi-ila típicos incluem, porém sem limitação, 1,2-etildi-ila, 1,3-propildi-ila, 1,4-butildi-ila e semelhantes.

[0190]“Arila" ou "Ar" significam um radical de hidrocarboneto aromático monovalente de 6 a 20 átomos de carbono derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Grupos arila típicos incluem, porém sem limitação, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e semelhantes. Em algumas modalidades, uma arila é um grupo carboxílico aromático monovalente de 6 a 14 átomos de carbono com um único anel (por exemplo, fenila) ou múltiplos anéis condensados (por exemplo, naftila ou antrila) cujos anéis condensados podem ou não ser aromáticos (por exemplo, 2- benzoxazolinona, 2H-1,4-benzoxazin-3 (4H)-ona-7-ila e semelhantes), desde que o ponto de ligação seja um átomo de carbono aromático. Os grupos arila preferidos incluem fenila e naftila.

[0191]“Arila substituída” se refere a grupos arila que são substituídos por 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 ou 1 a 2 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, acila, acilamino, acilóxi, amino, amino substituído, aminocarbonila, aminotiocarbonila, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarbonilóxi, aminosulfonila, aminosulfonilóxi, aminosulfonilamino, amidino, arila, arila substituída, arilóxi, arilóxi substituída, ariltio, ariltio substituído, carboxila, éster carboxílico, (éster carboxílico)amino, (éster carboxílico)óxi, ciano, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilóxi, cicloalquilóxi substituído, cicloalquiltio, cicloalquiltio substituído, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, cicloalquenilóxi, cicloalquenilóxi substituído, cicloalqueniltio, cicloalqueniltio substituído, guanidino, guanidino substituído, halo, hidróxi, heteroarila, heteroarila substituída, heteroarilóxi, heteroarilóxi substituído, heteroariltio, heteroariltio substituído, heterocíclico, heterocílico substituído, heterociclilóxi, heterociclilóxi substituído, heterocicliltio, heterocicliltio substituído, nitro, –SO3H, sulfonila substituída, sulfonilóxi, tioacila, tiol, alquiltio e alquiltio substituído, em que os ditos substituintes são definidos no presente documento.

[0192]"Arileno" significa um anel aromático fusionado em dois carbonos arílicos contíguos de um composto, isto é, um radical de ponte divalente que tem dois centros radicais monovalentes adjacentes derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de cada um dos dois átomos de carbono adjacentes de um sistema de anel aromático parental. A fixação de um radical de ponte arileno, por exemplo, benzeno, a um sistema de anel aromático parental resulta em um sistema de anel aromático fusionado, por exemplo, naftaleno. Os grupos arileno típicos incluem, porém sem limitação: [1,2]benzeno, [1,2]naftaleno e [2,3]naftaleno.

[0193]“Arildi-ila" significa um radical de hidrocarboneto cíclico ou policíclico insaturado de 620 átomos de carbono que tem um sistema de elétrons de ressonância conjugado e pelo menos dois centros de radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio de dois átomos de carbono diferentes de um composto arila parental.

[0194]“Heteroarila" se refere a um grupo aromático de 1 a 10 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre dentro do anel. Esses grupos heteroarila podem ter um único anel (por exemplo, piridinila ou furila) ou múltiplos anéis condensados (por exemplo, indolizinila ou benzotienila) em que os anéis condensados podem ou não ser aromáticos e/ou conter um heteroátomo, desde que o ponto de ligação seja através um átomo do grupo heteroarila aromático.

Em uma modalidade, o nitrogênio e/ou o átomo (ou átomos) do anel de enxofre do grupo heteroarila são opcionalmente oxidados para fornecer as porções químicas de N-óxido(N→O), sulfinila ou sulfonila. As heteroarilas preferenciais incluem piridinila, pirrolila, indolila, tiofenila e furanila.

[0195]“Heteroarila substituída" se refere a grupos heteroarila que são substituídos por substituintes de 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 ou 1 a 2 selecionados a partir do grupo que consiste no mesmo grupo de substituintes definidos para arila substituída.

[0196]“Heteroarilóxi” se refere a –O-heteroarila.

[0197]“Heteroarilóxi substituído” se refere ao grupo –O-(heteroarila substituída).

[0198]“Alquenila" se refere a grupos alquenila que têm de 2 a 6 átomos de carbono, por exemplo, 2 a 4 átomos de carbono e tendo pelo menos 1, por exemplo, de 1 a 2 locais de insaturação de alquenila. Tais grupos são exemplificados, por exemplo, por vinila, alila, but-3-en-1-ila e propenila.

[0199]“Alquenila substituída” se refere a grupos alquenila que têm de 1 a 3 substituintes, por exemplo, 1 a 2 substituintes, selecionados a partir do grupo que consiste em alcóxi alquóxi substituído, acila, acilamino, acilóxi, amino, amino substituído, aminocarbonila, aminotiocarbonila, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarbonilóxi, aminosulfonila, aminosulfonilóxi, aminosulfonilamino, amidino, arila, arila substituída, arilóxi, arilóxi substituído, ariltio, ariltio substituído, carboxila, éster carboxílico, (éster carboxílico)amino, (éster carboxílico)óxi, ciano, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilóxi, cicloalquilóxi substituído, cicloalquiltio, cicloalquiltio substituído, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, cicloalquenilóxi, cicloalquenilóxi substituído,

cicloalqueniltio, cicloalqueniltio substituído, guanidino, guanidino substituído, halo, hidróxi, heteroarila, heteroarila substituída, heteroarilóxi, heteroarilóxi substituído, heteroariltio, heteroariltio substituído, heterociclilóxi heterocíclico, heterocíclico substituído, heterociclilóxi substituído, heterocicliltio, heterocicliltio substituído, nitro, –SO3H, sulfonila substituída, sulfonilóxi, tioacila, tiol, alquiltio e alquiltio substituído, em que os ditos substituintes são definidos no presente documento e com a condição de nenhuma substituição de hidróxi esteja fixada a um átomo de carbono vinílico (não saturado).

[0200]“Acila" se refere aos grupos HC(O)-, alquil-C(O)-, alquil-C(O)- substituído, alquenil-C(O)-, alquenil-C(O)- substituído, alquinil-C(O)-, alquinil substituído-C(O)-, cicloalquil-C(O)-, cicloalquil-C(O)- substituído, cicloalcenil- C(O)-, cicloalquenila substituída-C(O)-, aril- C(O)-, aril-C(O)- substituído, heteroaril-C(O)-, heteroaril-C(O)- substituído, heterocíclico-C(O)-, e heterocíclico substituído-C(O)-, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento. Acila inclui o grupo “acetila" CH3C(O)-.

[0201]“Acilamino” se refere aos grupos -NRC(O)alquila, -NRC(O)alquila substituída, -NRC(O)cicloalquila, -NRC(O)cicloalquila substituída, - NRC(O)cicloalquenil, -NRC(O)cicloalquenila substituída, -NRC(O)alquenila, - NRC(O)alquenil substituída, -NRC(O)alquinila, -NRC(O)alquinila substituída, - NRC(O)arila, -NRC(O)arila substituída, -NRC(O)heteroarila, -NRC(O)heteroarila substituída, -NRC(O)heterocíclico e -NRC(O)heterocíclico substituído, em que R é hidrogênio ou alquila e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0202]“Acilóxi” se refere aos grupos alquil-C(O)O-, alquila substituída-C(O)O-, alquenil-C(O)O-, alquenila substituída-C(O)O-, alquinil-C(O)O-, alquinila substituída-C(O)O-, aril-C(O)O-, arila substituída-C(O)O-, cicloalquil-C(O)O-, cicloalquila substituída-C(O)O-, cicloalquenil-C(O)O-, cicloalquenila substituída-C(O)O-, heteroaril-C(O)O-, heteroarila substituída-C(O)O-, heterocíclico-C(O)O- e heterocíclico substituído-C(O)O-, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0203]“Amino” se refere ao grupo –NH2.

[0204]“Amino substituído” se refere ao grupo –NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, -SO2-alquila, -SO2-alquila substituída, -SO2-alquenila, -SO2-alquenila substituída, -SO2-cicloalquila, -SO2- cicloalquila substituída, -SO2-cicloalquenila, -SO2-cicloalquila substituída,-SO2- arila, -SO2-arila substituída, -SO2-heteroarila, -SO2-heteroarila substituída, -SO2-

heterocíclico e -SO2-heterocíclico substituído e em que R′ e R″ são unidos opcionalmente junto do nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, desde que tanto R′ quanto R″ não sejam hidrogênio, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento. Quando R’ é hidrogênio e R' é alquila, o grupo amino substituído é denominado no presente documento alvezes vezes de alquilamino. Quando R'e R' são alquila, o grupo amino substituído é denominado no presente documento algumas vezes de dialquilamino. Quando se refere a um amino monossubstituído, significa que R′ ou R″ é hidrogênio, porém não os dois. Quando se refere a um amino dissubstituído, significa que nem R’ nem R' são hidrogênio.

[0205]“Aminocarbonila” se refere ao grupo -C(O)NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0206]“Aminotiocarbonila” se refere ao grupo -C(S)NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0207]“Aminocarbonilamino” se refere ao grupo -NRC(O)NR’R” em que R é hidrogênio ou alquila e R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0208]“Aminotiocarbonilamino” se refere ao grupo -NRC(S)NR’R” em que R é hidrogênio ou alquila e R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0209]“Aminocarbonilóxi” se refere ao grupo –O–C(O)NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0210]“Aminosulfonila” se refere ao grupo –SO2NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0211]“Aminosulfonilóxi” se refere ao grupo –O-SO2NR’R” em que R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0212]“Aminosulfonilamino” se refere ao grupo –NRSO2NR’R” em que R é hidrogênio ou alquil e R’ e R” são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquienila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquienila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0213]“Amidino” se refere ao grupo –C(=NR’’’)R’R” em que R’, R” e R’’’ são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e em que R’ e R” são unidos opcionalmente ao nitrogênio ligado aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0214]"Arilóxi" se refere ao grupo –O-arila, em que arila é conforme definido no presente documento, que inclui, a título de exemplo, fenóxi e naftóxi.

[0215]“Arilóxi substituída" se refere ao grupo –O-(arila substituída), em que a arila substituída é conforme definido no presente documento.

[0216]"Ariltio" se refere ao grupo –S-arila, em que a arila é conforme definido no presente documento.

[0217]"Ariltio substituído" se refere ao grupo –S-(aril substituído), em que arila substituída é conforme definido no presente documento.

[0218]“Alquinila" se refere a grupos alquinila que têm de 2 a 6 átomos de carbono e, por exemplo, 2 a 3 átomos de carbono e que tem pelo menos 1, por exemplo, de 1 a 2 locais de insaturação de alquinila.

[0219]“Alquinila substituída” se refere a grupos alquinila que têm de 1 a 3 substituintes, por exemplo, 1 a 2 substituintes, selecionados a partir do grupo que consiste em alquóxi, alquóxi substituído, acila, acilamino, acilóxi, amino, amino substituído, aminocarbonila, aminotiocarbonila, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarbonilóxi, aminosulfonila, aminosulfonilóxi, aminosulfonilamino, amidino, arila, arila substituída, arilóxi, arilóxi substituída, ariltio, ariltio substituída, carboxila, éster carboxílico, (éster carboxílico)amino, (éster carboxólico)óxi, ciano, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilóxi, cicloalquilóxi substituída, cicloalquiltio, cicloalquiltio substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, cicloalquenilóxi, cicloalquenilóxi substituída, cicloalqueniltio, cicloalqueniltio substituída, guanidino, guanidino substituído, halo, hidróxi, heteroarila, heteroarila substituído, heteroarilóxi, heteroarilóxi substituído, heteroariltio, heteroariltio substituído, heterocíclico, heterocíclico substituído, heterociclilóxi, heterociclilóxi substituído, heterocicliltio, heterocicliltio substituído, nitro, –SO3H, sulfonila substituída, sulfonilóxi, tioacila, tiol, alquiltio e alquiltio substituído, em que os ditos substituintes são definidos no presente documento e com a condição de que uma substituição nenhuma substituição de hidróxi esteja fixa a um átomo de carbono acetilênico.

[0220]“Carbonila” se refere ao grupo divalente –C(O)- que é equivalente a –C(=O)-.

[0221]“Carboxila” ou “carbóxi” se refere a –COOH ou sais do mesmo.

[0222]"Carboxil alquila" ou “carboxialquila" se referem ao grupo – (CH2)nCOOH, em que n é 1 a 6.

[0223]“Éster carboxílico” ou “carboxi éster” se refere aos grupos -C(O)O- alquila, -C(O)O-alquila substituída, -C(O)O-alquenila, -C(O)O-alquenil substituída, -C(O)O-alquinila, -C(O)O-alquinila substituída, -C(O)O-arila, - C(O)O-arila substituída, -C(O)O-cicloalquila, -C(O)O-cicloalquila substituída, - C(O)O-cicloalquenila, -C(O)O-cicloalquenila substituída, -C(O)O-heteroarila, - C(O)O-heteroarila substituída, -C(O)O-heterocíclico, e -C(O)O-heterocíclico substituído, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0224]“(Éster carboxílico)amino” se refere ao grupo -NR-C(O)O-alquila, -NR-C(O)O-alquila substituída, -NR-C(O)O-alquenila, -NR-C(O)O-alquenil substituída, -NR-C(O)O-alquinila, -NR-C(O)O-alquinila substituída, -NR-C(O)O- arila, -NR-C(O)O-arila substituída, -NR-C(O)O-cicloalquila, -NR-C(O)O- cicloalquila substituída, -NR-C(O)O-cicloalquenila, -NR-C(O)O-cicloalquenila substituída, -NR-C(O)O-heteroarila, -NR-C(O)O-heteroarila substituída, - NR-C(O)O-heterocíclico e -NR-C(O)O-heterocíclico substituído, em que R é alquila ou hidrogênio, e em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0225]“(Éster carboxílico)óxi” se refere ao grupo -O-C(O)O-alquila, -O- C(O)O-alquila substituída, -O-C(O)O-alquenila, -O-C(O)O-alquenil substituída, - O-C(O)O-alquinila, -O-C(O)O-alquinila substituída, -O-C(O)O-arila, -O-C(O)O- arila substituída, -O-C(O)O-cicloalquila, -O-C(O)O-cicloalquila substituída, -O- C(O)O-cicloalquenila, -O-C(O)O-cicloalquenila substituída, -O-C(O)O- heteroarila, -O-C(O)O-heteroarila substituída, -O-C(O)O-heterocíclico e -O-C(O)O-heterocíclico substituído, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0226]“Ciano” se refere ao grupo –CN.

[0227]“Cicloalquila" se refere a grupos alquila cíclica com 3 a 10 átomos de carbono com anéis cíclicos únicos ou múltiplos, incluindo sistemas de anéis fusionados, em ponte e espiro. Exemplos de grupos cicloalquila adequados incluem, por exemplo, adamantila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclo- octila.

[0228]“Cicloalquenila" se refere a grupos alquila cíclicas não aromáticas de 3 a 10 átomos de carbono que têm anéis cíclicos únicos ou múltiplos e que têm pelo menos uma não saturação de anel >C=C<, por exemplo, de 1 a 2 sítios de não saturação de anel >C=C<.

[0229]“Cicloalquila substituída” e “cicloalquenila substituída” se refere a um grupo cicloalquila ou cicloalquenila que tem de 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em oxo, tiona, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, acila, acilamino, acilóxi, amino, amino substituído, aminocarbonila, aminotiocarbonila, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarbonilóxi, aminosulfonila, aminosulfonilóxi, aminosulfonilamino, amidino, arila, arila substituída, arilóxi, arilóxi substituído, ariltio, aliltio substituído, carboxila, éster carboxílico, (éster carboxílico)amino, (éster carboxílico)óxi, ciano, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilóxi, cicloalquilóxi substituído cicloalquiltio, cicloalquiltio substituído, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, cicloalquenilóxi, cicloalquenilóxi substituído, cicloalqueniltio, cicloalqueniltio substituído, guanidino, guanidino substituído, halo, hidróxi, heteroarila, heteroarila substituída, heteroarilóxi, heteroarilóxi substituído, heteroariltio, heteroaliltio substituído, heterocíclico, heterocíclico substituído, heterociclilóxi, heterociclilóxi substituído, heterocicliltio, heterocicliltio substituído, nitro, –SO3H, sulfonila substituída, sulfonilóxi, tioacila, tiol, alquiltio e alquiltio substituído, em que os ditos substituintes são definidos no presente documento.

[0230]“Cicloalquilóxi” se refere a –O-cicloalquila.

[0231]“Cicloalquilóxi substituído” se refere a –O-(cicloalquila substituída).

[0232]“Cicloalquiltio” se refere a –S-cicloalquila.

[0233]“Cicloalquiltio substituído” se refere a –S-(cicloalquila substituída).

[0234]“Cicloalcenilóxi” se refere a –O-cicloalquenila.

[0235]“Cicloalcenilóxi substituído” se refere a –O-(cicloalquenila substituída).

[0236]“Cicloalceniltio” se refere a –S-cicloalquenila.

[0237]“Cicloalqueniltio substituído” se refere a –S-(cicloalquenila substituída).

[0238]“Guanidino” se refere ao grupo –NHC(=NH)NH2.

[0239]"Guanidino substituído" se refere a –NRC(=NR)N(R)2, em que cada R é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído, e dois grupos R ligados a um átomo de nitrogênio de guanidino comum são opcionalmente ligados juntos ao nitrogênio aos mesmos para formar um grupo heterocíclico ou heterocíclico substituído, desde que pelo menos um R não seja hidrogênio, e em que os ditos substituintes sejam conforme definido no presente documento.

[0240]“H” indica hidrogênio.

[0241]"Halo" ou "halogênio" se refere a flúor, cloro, bromo e iodo.

[0242]“Hidróxi” ou “hidroxila” se refere ao grupo –OH.

[0243]“Heteroarila" se refere a um grupo aromático de 1 a 10 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre dentro do anel. Esses grupos heteroarila podem ter um único anel (por exemplo, piridinila ou furila) ou múltiplos anéis condensados (por exemplo, indolizinila ou benzotienila) em que os anéis condensados podem ou não ser aromáticos e/ou conter um heteroátomo, desde que o ponto de ligação seja através um átomo do grupo heteroarila aromático. Em uma modalidade, o nitrogênio e/ou o átomo (ou átomos) do anel de enxofre do grupo heteroarila são opcionalmente oxidados para fornecer as porções químicas de N-óxido(N→O), sulfinila ou sulfonila. As heteroarilas preferenciais incluem piridinila, pirrolila, indolila, tiofenila e furanila.

[0244]“Heteroarila substituída" se refere a grupos heteroarila que são substituídos por 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 ou 1 a 2, substituintes selecionados a partir do grupo que consiste no mesmo grupo de substituintes definidos para arila substituída.

[0245]“Heteroarilóxi” se refere a –O-heteroarila.

[0246]“Heteroariloxi substituído” se refere ao grupo –O-(heteroarila substituída).

[0247]“Heteroariltio” se refere ao grupo –S-heteroarila.

[0248]“Heteroariltio substituído” se refere ao grupo –S-(heteroarila substituída).

[0249]"Heterociclo" ou "heterocíclico" ou “heterocicloalquila" ou “heterociclila" significa qualquer sistema de anel com pelo menos um átomo de não carbono em um anel, por exemplo, nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades, um heterociclo é um grupo saturado ou insaturado com um único anel ou múltiplos anéis condensados, incluindo sistemas de anel fusionado em ponte e espiro, de 1 a 10 átomos de carbono e de 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, enxofre ou oxigênio dentro do anel em que, em sistemas de anéis fusionados, um ou mais dentre os anéis podem ser cicloalquila, arila ou heteroarila, desde que o ponto de ligação seja através do anel não aromático. Em uma modalidade, o átomo de nitrogênio e/ou enxofre (ou átomos de nitrogênio e/ou de enxofre) do grupo heterocíclico são opcionalmente oxidados para fornecer as porções químicas de N-óxido, sulfinila, sulfonila. Heterociclos incluem, porém sem limitação: pirrol, indol, furano, benzofurano, tiofeno, benzotiofeno, 2-piridila, 3- piridila, 4-piridila, 2-quinolila, 3-quinolila, 4-quinolila, 2-imidazol, 4-imidazol, 3- pirazol, 4-pirazol, piridazina, pirimidina, pirazina, cinolina, ftalazina, quinazolina, quinoxalina, 3-(1,2,4-N)-triazolila, 5-(1,2,4-N)-triazolila, 5-tetrazolila, 4-(1-O, 3- N)-oxazol, 5-(1-O, 3-N)-oxazol, 4-(1-S, 3-N)-tiazol, 5-(1-S, 3-N)-tiazol, 2- benzoxazol, 2-benzotiazol, 4-(1,2,3-N)-benzotriazol, e benzimidazol.

[0250]"Heterocíclico substituído" ou "heterocicloalquila substituída" ou "heterociclila substituída" se referem a grupos heterociclila que são substituídos por 1 a 5, por exemplo, 1 a 3 dos mesmos substituintes definidos para cicloalquila substituída.

[0251]Os exemplos de heterociclo e heteroarilas incluem, porém sem limitação, azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, di-hidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina, 4,5,6,7- tetra-hidrobenzo[b]tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinila, tiomorfolinila (também denominada de tiamorfolinila), 1,1-dioxotiomorfolinila, piperidinila, pirrolidina e tetra-hidrofuranila.

[0252]“Heterociclilóxi” se refere ao grupo –O-heterociclila.

[0253]“Heterociclilóxi substituído” se refere ao grupo –O-(heterociclila substituída).

[0254]“Heterocicliltio” se refere ao grupo –S- heterociclila.

[0255]“Heterocicliltio substituído” se refere ao grupo –S-(heterociclila substituída).

[0256]“Hidrazinila” se refere ao grupo –NHNH2- ou =NNH-.

[0257]“Hidrazinila substituída" se refere a um grupo hidrazinila, em que um átomo de não hidrogênio, como um grupo alquila, é anexado a um ou ambos os grupos hidrazinilamina. Um exemplo de hidrazinila substituída é –N(alquil)- NH2 ou =N+(alquil)-NH2.

[0258]“Nitro” se refere ao grupo –NO2.

[0259]"Oxo" se refere ao átomo (=O) ou (-O-).

[0260]“Espirociclila” se refere ao grupo cíclico saturado divalente de 3 a 10 átomos de carbono que tem um anel cicloalquila ou heterociclila com uma união espiro (a união formada por um único átomo que é o único membro comum dos anéis), conforme exemplificado pela seguinte estrutura .

[0261]“Sulfonila" se refere ao grupo divalente -S(O)2-.

[0262]“Sulfonila substituída” se refere ao grupo -SO2-alquila, -SO2- alquila substituída, -SO2-alquenila, -SO2-alquenil substituída, -SO2- cicloalquila, -SO2-cicloalquila substituída, -SO2-cicloalquenila, -SO2-cicloalquila substituída, -SO2-arila, -SO2-arila substituída, -SO2-heteroarila, -SO2-heteroarila substituída, -SO2-heterocíclico, -SO2-heterocíclico substituído, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento. Sulfonila substituída inclui grupos, tais como metil-SO2-, fenil-SO2- e 4-metilfenil-SO2-.

[0263]“Sulfonilóxi” se refere ao grupo –OSO2-alquila, -OSO2-alquila substituída, -OSO2-alquenila, -OSO2-alquenila substituída, -OSO2- cicloalquila, -OSO2-cicloalquila substituída, -OSO2-cicloalquenila, -OSO2- cicloalquila substituída,-OSO2-arila, -OSO2-arila substituída, -OSO2- heteroarila, -OSO2-heteroarila substituída, -OSO2- heterocíclico, -OSO2-heterocíclico substituído, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0264]“Tioacila” se refere aos grupos H-C(S)-, alquil-C(S)-, alquila substituída-C(S)-, alquenil-C(S)-, alquenil substituída-C(S)-, alquinil-C(S)-, alquinila substituída-C(S)-, cicloalquil-C(S)-, cicloalquila substituída-C(S)-, cicloalquenil-C(S)-, cicloalquenila substituída-C(S)-, aril-C(S)-, arila substituída-C(S)-, heteroaril-C(S)-, heteroarila substituída-C(S)-, heterocíclico-C(S)- e heterocíclico substituído-C(S)-, em que alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquenila, cicloalquenila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico e heterocíclico substituído são conforme definido no presente documento.

[0265]“Tiol” se refere ao grupo -SH.

[0266]“Tiocarbonila” se refere ao grupo divalente -C(S)- que é equivalente a –C(=S)-.

[0267]“Tiona” se refere ao átomo (=S).

[0268]"Alquiltio" se refere ao grupo -S-alquila, em que alquila é conforme definido no presente documento.

[0269]"Alquiltio substituído" se refere ao grupo -S-(alquila substituída), em que alquila substituída é conforme definido no presente documento.

[0270]O termo "resposta detectável", conforme usado no presente documento, se refere a uma ocorrência de ou uma mudança em um sinal que é detectável direta ou indiretamente por observação ou por instrumentação. Em algumas modalidades, a resposta detectável é uma resposta óptica que resulta em uma mudança nos padrões de distribuição de comprimento de onda ou intensidade de absorbância ou fluorescência ou uma mudança na dispersão de luz, tempo de vida de fluorescência, polarização de fluorescência ou uma combinação dos parâmetros acima.

[0271]O termo "corante”, conforme usado no presente documento, se refere a um composto que emite luz para produzir um sinal detectável observável.

[0272]Conforme usado no presente documento, o termo "fluorogênico" se refere a um composto ou uma composição que demonstra uma mudança na fluorescência após a ligação a um composto biológico ou analito de interesse e/ou após clivagem por uma enzima.

[0273]Conforme usado no presente documento, o termo "fluoróforo" se refere a uma porção química ou composto com capacidade para emitir luz mediante excitação e inclui fluoróforos fluorogênicos que exibem fluorescência mediante ligação a um composto biológico ou analito de interesse e/ou mediante clivagem por uma enzima. Os fluoróforos da presente divulgação podem ser substituídos para alterar a solubilidade, propriedades espectrais ou propriedades físicas do fluoróforo.

[0274]Conforme usado no presente documento, "um sal farmaceuticamente aceitável" ou "um sal biologicamente compatível" é um contraíon que não é tóxico, conforme usado, e não tem um efeito substancialmente deletério nas biomoléculas. Exemplos de tais sais incluem, entre outros, K+, Na+, Cs+, Li+, Ca2+, Mg2+, Cl-, AcO- e sais de alquilamônio ou de alcoxiamônio.

[0275]O termo "conector" ou "L", conforme usado no presente documento, se refere a uma única ligação covalente ou uma porção química que compreende uma série de ligações covalentes estáveis, em que a porção química muitas vezes incorpora 1 a 40 átomos de valência plural selecionados a partir do grupo que consiste em C, N, O, S e P que ligam de maneira covalente os compostos fluorogênicos ou fluorescentes a outra porção química, tal como um grupo quimicamente reativo ou um componente biológico e não biológico. O número de átomos de valência plural em um conector pode ser, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30 ou um número maior até 40 ou mais. Um conector pode ser linear ou não linear; alguns ligantes têm cadeias laterais pendentes ou grupos funcionais pendentes, ou os dois. Exemplos de tais porções químicas pendentes são modificadores de hidrofilicidade, por exemplo, grupos de solubilização como, por exemplo, sulfo (-SO3H ou -SO3-). Em determinadas modalidades, L é composto de qualquer combinação de ligações carbono-carbono simples, duplas, triplas ou aromáticas, ligações carbono-

nitrogênio, ligações nitrogênio-nitrogênio, ligações carbono-oxigênio e ligações carbono-enxofre. Membros de ligação exemplificativos incluem uma porção química que inclui –C(O) NH–, –C(O) O–, –NH–, –S–, –O– e semelhantes. Os ligantes podem, a título de exemplo, consistir em uma combinação de porções selecionadas de alquila; –C(O)NH–; –C(O)O–; –NH–; –S–; –O–; –C(O)–; – S(O)n– em que n é 0, 1 ou 2; –O–; anéis monocíclicos de 5 ou 6 membros; e grupos funcionais pendentes opcionais, por exemplo, sulfo, hidróxi e carbóxi. A porção química formada por um conector ligado a um grupo reativo ou conector reativa (Rx) pode ser denominada de –LRx. O grupo reativo pode ser reagido com uma substância que possa ser reativa com o mesmo, por meio da qual o conector é ligado a uma substância conjugada (Sc) e pode ser denominado de -LSc, ou em alguns casos, o conector pode conter um resíduo de um grupo reativo (por exemplo, o grupo carbonila de um éster) e pode ser denominado de “–LR”. Um "conector clivável" é um conector que tem um ou mais grupos cliváveis que podem ser quebrados pelo resultado de uma reação ou condição. O termo "grupo clivável" se refere a uma porção química que permite a liberação de uma porção, por exemplo, uma porção química fluorogênica ou fluorescente de um conjugado do restante do conjugado por clivagem de uma ligação ligante a porção química liberada ao restante do conjugado. Essa clivagem é de natureza química ou mediada enzimaticamente. Grupos cliváveis enzimaticamente exemplificativos incluem aminoácidos naturais ou sequências de peptídeos que terminam com um aminoácido natural.

[0276]O termo "grupo reativo" também denominado no presente documento de "ligante reativo" (ou "Rx"), conforme usado no presente documento, se refere a um grupo com capacidade para reagir com outro grupo químico para formar uma ligação covalente, isto é, é reativo de maneira covalente sob condições de reação adequadas e geralmente representa um ponto de ligação para outra substância. O grupo reativo é uma porção química, tal como ácido carboxílico ou éster succinimidílico, nos compostos da presente divulgação que tem capacidade para reagir quimicamente com um grupo funcional em um composto diferente para formar uma ligação covalente. Os grupos reativos incluem geralmente nucleófilos, eletrófilos e grupos fotoativáveis.

[0277]Grupos reativos exemplificativos incluem, porém sem limitação, olefinas, acetilenos, álcoois, fenóis, éteres, óxidos, haletos, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, cianatos, isocianatos, tiocianatos, isotiocianatos, aminas, hidrazinas, hidrazonas, hidrazidas, diazo, diazônio, nitro, nitrilas, mercaptanos, sulfetos, dissulfetos, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfônicos, ácidos sulfínicos, acetais, cetais, anidridos, sulfatos, isonitrilos de ácidos sulfênicos, amidinas, imidas, imidatos, nitronas, hidroxilaminas, oximas, ácidos hidroxâmicos, tio-hidroxâmicos, alenos, ortoésteres, sulfitos, enaminas, inaminas, ureias, pseudoureias, semicarbazidas, carbodi-imidas, carbamatos, iminas, azidas, compostos azo, compostos azóxi e compostos nitroso. Grupos funcionais reativos também incluem aqueles usados para preparar bioconjugados, por exemplo, ésteres de N-hidroxissuccinimida (ou ésteres succinimidílicos (SE)), maleimidas, ésteres sulfodiclorofenílicos (SDP), ésteres sulfotetrafluorofenílicos (STP), ésteres tetrafluorofenílicos (TFP), ésteres pentluorofenílicos (PFP), ácidos nitrilotriacéticos (NTA), aminodextranos, ciclo- ocinaminas e semelhantes. Métodos para preparar cada um desses grupos funcionais são bem conhecidos na técnica e sua aplicação ou modificação para um propósito particular está dentro da capacidade de uma pessoa versada técnica (consultar, por exemplo, Sandler and Karo, eds., Organic Functional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989).Os grupos reativos ou ligantes reativos exemplificativos incluem ésteres NHS, fosforamiditas e outras porções químicas listradas na Tabela 1 a seguir. Nucleotídeos, nucleosídeos e sacarídeos (por exemplo, riboses e desoxirriboses) também são considerados ligantes reativos devido, pelo menos, à sua capacidade de formar ligações de fosfodiéster por meio de catálise enzimática. Para evitar dúvidas, os grupos alquila saturados não são considerados ligantes reativos.

[0278]O termo "molécula carreadora", conforme usado no presente documento, se refere a um componente biológico ou não biológico que é ou se torna de maneira covalente ligado a um composto rastreador de células divulgado no presente documento. Tais componentes incluem, porém sem limitação, um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucleico, um hapteno, um psoraleno, uma droga, um hormônio, um lipídio, um conjunto de lipídios, um polímero sintético, uma micropartícula polimérica, uma célula biológica, um vírus e combinações dos mesmos. Está incluída uma modalidade em que as moléculas carreadoras compreendem uma porção química orgânica com pelo menos 4 átomos de valência plural e frequentemente mais de 10 átomos de valência plural (isto é, átomos diferentes de hidrogênio e halo), por exemplo, pelo menos 15 desses átomos, como no caso de porções com pelo menos 20 desses átomos.

[0279]O termo "substância conjugada" ou "Sc" se refere a uma molécula carreadora ou suporte sólido.

[0280]Conforme usado no presente documento, uma "porção química de ligação a alvo" se refere a uma porção química que é ou pode ser ligada a um fluoróforo para fornecer um composto com atividade de ligação específica e propriedades fluorescentes ou fluorogênicas. Porções químicas de ligação a alvo exemplificativas incluem porções químicas de ligação a citoesqueleto, tais como taxol ou peptídeos de ligação à actina; porções químicas de ligação a DNA, tais como Hoechst ou nitro-Hoechst; polinucleotídeos (que podem hibridizar com uma sequência complementar); e anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.

[0281]O termo "suporte sólido", conforme usado no presente documento, se refere a uma matriz ou meio que é substancialmente insolúvel em fases líquidas e que tem capacidade para se ligar a uma molécula ou partícula de interesse. Os suportes sólidos adequados para uso no presente documento incluem suportes semissólidos e não estão limitados a um tipo específico de suporte. Suportes sólidos úteis incluem matrizes sólidas e semissólidas, como aerogéis e hidrogéis, resinas, grânulos, biochips (incluindo biochips revestidos de filme fino), chip microfluídico, um chip de silício, placas de vários poços (também denominados de placas de microtitulação ou microplacas), membranas, metais condutores e não condutores, vidro (incluindo lâminas de microscópio) e suportes magnéticos. Exemplos mais específicos de suportes sólidos úteis incluem géis de sílica, membranas poliméricas, partículas, filmes plásticos derivados, microesferas de vidro, algodão, microesferas de plástico, géis de alumina, polissacarídeos, tais como SEPHAROSE® (GE Healtcare), poli(acrilato), poliestireno, poli(acrilamida), poliol, agarose, ágar, celulose, dextrano, amido, FICOLL® (GE Healthcare), heparina, glicogênio, amilopectina, manana, inulina, nitrocelulose, diazocelulose, cloreto de polivinila, polipropileno,

polietileno (incluindo poli(etilenoglicol)), náilon, microesfera de látex, microesfera magnética, microesfera paramagnética, microesfera superparamagnética, amido e semelhantes.

[0282]Conforme usado no presente documento, o termo “marcação" é uma técnica usada em microscopia para aumentar o contraste na imagem microscópica. Manchas e corantes são usados frequentemente para destacar estruturas em tecidos e células biológicas. A marcação também envolve a adição de um corante a um substrato para quantificar ou qualificar a presença de um composto específico, tal como uma proteína, ácido nucleico, lipídio ou carbo- hidrato. A marcação biológica também é usada para marcar células em citometria de fluxo e para sinalizar proteínas ou ácidos nucleicos em eletroforese em gel. A marcação não se limita a materiais biológicos e pode ser usada para estudar a morfologia de outros materiais, tais como polímeros semicristalinos e copolímeros em bloco.

[0283]“Alquila inferior" denota porções químicas de hidrocarboneto de cadeia linear e ramificada que contém de 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, terc-butila, isobutila, sec-butila, neopentila, terc- pentila e semelhantes. “Haloalquila inferior" denota uma alquila inferior substituída por um ou mais substituintes de átomo de halogênio, geralmente flúor, cloro, bromo ou iodo.

[0284]"Alceno inferior" denota um hidrocarboneto que contém de 1 a 8 átomos de carbono em que uma ou mais das ligações carbono-carbono são ligações duplas.

[0285]"Alcino inferior" denota um hidrocarboneto que contém de 1 a 8 átomos de carbono, em que um ou mais dos carbonos estão ligados com uma ligação tripla.

[0286]"Nucleosídeo" se refere a um composto que consiste em uma base de nucleosídeo purina, deazapurina ou pirimidina, por exemplo, adenina, guanina, citosina, uracila, timina, deazaadenina, deazaguanosina e semelhantes, ligada a uma pentose na posição 1'. Quando a base de nucleosídeo é purina ou 7-deazapurina, a porção química de açúcar é ligada na posição N9 da purina ou deazapurina, e quando a base de nucleosídeo é pirimidina, a porção química de açúcar é ligada na posição de N1 da pirimidina, por exemplo, Kornberg e Baker, DNA Replication, 2ª edição (Freeman, São Francisco, 1992).

[0287]O termo "nucleotídeo", conforme usado no presente documento, se refere a um éster fosfato de um nucleosídeo, por exemplo, ésteres trifosfato, em que o local mais comum de esterificação é o grupo hidroxila ligado à posição C-5 da pentose. O termo "nucleosídeo/nucleotídeo", conforme usado no presente documento, se refere a um conjunto de compostos que incluem nucleosídeos e nucleotídeos e seus análogos. "Análogos" em referência a nucleosídeos/nucleotídeos incluem análogos sintéticos que têm porções de base modificadas, porções químicas de açúcar modificadas e/ou porções químicas de fosfato modificadas, por exemplo, descrito geralmente por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, Nova Iorque, 1980). Os análogos de fosfato compreendem análogos de fosfato em que o átomo de fósforo está no estado de oxidação +5 e um ou mais dentre os átomos de oxigênio é substituído por uma porção química de não oxigênio, análogos exemplificativos incluindo fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodiselenoato, fosforanilotioato, fosforanilidato, boronofosfatos e semelhantes, incluindo contraíons associados,

por exemplo, H+, NH4+, Na+ e semelhantes, caso tais contraíons estejam presentes. Análogos de base exemplificativos incluem, porém sem limitação, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudouridina, C-5-propina, isocitosina, isoguanina, 2-tiopirimidina e outros análogos semelhantes. Análogos de açúcar exemplificativos incluem, porém sem limitação, modificações 2’ em que a posição 2’ é hidrogênio, hidróxi, alcóxi, por exemplo, metóxi, etóxi, alilóxi, isopropóxi, butóxi, isobutóxi e fenóxi, amino ou alquilamino, flúor, cloro e bromo. O termo "nucleosídeo/nucleotídeo identificado" se refere a nucleosídeos/nucleotídeos que são ligados de maneira covalente aos compostos corantes da Fórmula (I), opcionalmente através de um conector.

[0288]"Polinucleotídeo" (que inclui "oligonucleotídeo") significa polímeros lineares de monômeros de nucleotídeos naturais ou análogos dos mesmos, incluindo desoxirribonucleotídeos de dupla fita ou fita simples, ribonucleotídeos, formas α-anoméricas dos mesmos e semelhantes. Normalmente, os monômeros de nucleosídeo são ligados por ligações fosfodiéster, em que, conforme usado no presente documento, o termo "ligação fosfodiéster" se refere a ligações fosfodiéster ou ligações incluindo análogos de fosfato dos mesmos, incluindo contraíons associados, por exemplo, H+, NH4+, Na+ e semelhantes, caso tais contraíons estejam presentes. Os polinucleotídeos normalmente variam de tamanho de algumas unidades monoméricas, por exemplo, 8 a 40, a diversos milhares de unidades monoméricas. Sempre que um polinucleotídeo é representado por uma sequência de letras, será entendido que os nucleotídeos estão na ordem 5'→3' da esquerda para a direita e que "A" denota desoxiadenosina, "C" denota desoxicitidina, "G" denota desoxiguanosina e "T" denota timidina, salvo quando indicado de outro modo.

[0289]"Grupo solubilizante em água" significa um substituinte que aumenta a solubilidade dos compostos da invenção em solução aquosa. Grupos de solubilização em água exemplificativos incluem, porém sem limitação, amina quaternária, sulfato, sulfonato, carboxilato, fosfonato, fosfato, poliéter, poli- hidroxila, boronato, polietilenoglicol e unidades repetidas de óxido de etileno (- (CH2CH2O)-). COMPOSTOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS, USOS E KITS

EXEMPLIFICATIVOS

[0290]São fornecidos no presente documento corantes de silício- rodamina (SiR) e seus conjugados, kits e composições que incluem tais corantes, assim como métodos que usam tais corantes para detectar e quantificar materiais biológicos, métodos de produção e/ou funcionalização ou conjugação de tais corantes.

1.CORANTES E CONJUGADOS

[0291]Os compostos da fórmula (I) são divulgados, conforme estabelecido na modalidade 1 acima: (I) em que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1;

R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R3 é -COOH, SO3-, H, R3a, -L1-RA ou -L1-RB1;

R3a é , ou - C(O)N(RN3)(RN4); RN3 é H, metila, C2-6 alquila ou -CH2-A em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um grupo polar ou carregado; RN4 é -L1-RA ou -L¹-RB1 ou -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2, 3, 4, 5 ou 6; R3b é -OH ou -N(RN5)-L3a-RB; cada L3a é independentemente um conector; RB é um ligante reativo ou uma porção química de ligação a alvo; RN5 é H, metila ou C2-6 alquila; R4 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; E é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2;

R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R9 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; cada RN1 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R5 e/ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, -C(O)R10, - C(O)R13 ou forma um anel com R6 e/ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo; R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ é um grupo acetila (Ac), AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo, e AM é acetoximetila; adicionalmente, em que (i) R2 não é metila ou C2-6 alquila, caso R1 seja metila ou C2-6 alquila, OR (ii) R3 é R3a ou -L¹-RB1; ou uma forma de espirolactona e/ou sal do mesmo.

[0292]São divulgados, também, os Compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59 mostrados nas Figuras 1A a 1Q. Embora contraíons, tais como uma trietilamina, sejam mostrados com determinados compostos, tais como os compostos 10A a 13, a referência a tais compostos não inclui um contraíon específico, salvo quando expressamente indicado. Disto isso, por exemplo, o "Composto 10A" inclui sais com outros cátions, assim como o ácido sulfônico livre correspondente (hidróxido de sulfonila). De modo semelhante, em alguns casos, precursores, produtos colaterais, reagentes etc. são ilustrados, por exemplo, com o Composto 45; estes são apenas para fins informativos e não limitam a estrutura do próprio composto. Substituintes tais como R1, R2 etc. podem ter os valores estabelecidos em qualquer uma das modalidades estabelecidas acima e nas reivindicações, por exemplo, os valores estabelecidos para a Fórmula (I) na modalidade 1.

[0293]São divulgados, também, os compostos em que R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 ou RN2 têm os valores estabelecidos em qualquer uma das modalidades estabelecidas acima e nas reivindicações.

[0294]Os compostos selecionados listados como Compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59 acima não devem ser interpretados como uma lista exclusiva dos corantes da presente divulgação. Várias modificações, substituições e alterações nos substituintes e na estrutura do composto são possíveis sem haver afastamento do espírito e do escopo da divulgação. Por exemplo, conforme descrito no presente documento, os conjugados de compostos descritos no presente documento também são fornecidos.

[0295]Compostos de SiR da presente divulgação que compreendem um grupo 2’-carboxila no anel fenila (isto é, a posição R3 na fórmula (I)) podem existir em equilíbrio entre uma espirolactona (que pode ser não fluorescente) e uma forma fluorescente (por exemplo, zwitterion). Consultar a Figura 1R. A isomerização em uma forma de espirolactona pode tornar o composto de SiR permeável às células. Consequentemente, também são fornecidas no presente documento formas de espirolactona dos compostos de SiR divulgados no presente documento, por exemplo, formas de espirolactona de compostos de SiR que compreendem um grupo 2’-carboxila no anel fenila divulgado no presente documento. A espirolactonização pode ser favorecida quando o corante não está ligado (talvez, sem desejar ser limitado por qualquer teoria particular, devido à agregação hidrofóbica de moléculas de corante livres), ao passo que o estado zwitteriônico fluorescente pode ser favorecido quando associado a um alvo. Desse modo, o corante pode exibir fluorogenicidade dependente da ligação ao alvo em que uma forma de espirolactona não fluorescente é convertida em um zwitterion fluorescente após a ligação ao alvo.

[0296]Alternativamente, os substituintes R3 que não sejam de um grupo 2'-carboxila podem impedir a espirolactonização e podem resultar no corante sendo incapaz de isomerizar de modo a sair de um estado fluorescente e/ou tornar o corante de SiR da presente divulgação impermeável a células vivas. Esses corantes podem ser úteis para a discriminação de células vivas/mortas. Tais corantes podem ser adicionalmente conjugados a porções químicas de ligação a alvo, conforme descrito ao longo do presente documento, o que pode aumentar seu tempo de permanência dentro de células permeáveis e/ou mortas e/ou o diferencial de fluorescência em experimentos de discriminação de células vivas/mortas.

[0297]Em algumas modalidades, são fornecidos compostos que exibem fluorescência de infravermelho próximo. A fluorescência de um composto de SiR da presente divulgação pode ser deslocada para o vermelho incluindo anéis adicionais no sistema de anéis fusionados do SiR. Por exemplo, um RN1 e R5 podem juntos formar um anel, e R6 e um RN2 podem juntos formar um anel. Anéis formados por RN1 e R5 e R6 e um de RN2 podem ser, cada um, fusionados a pelo menos um anel adicional. Alternativa ou adicionalmente, um RN1 e R7 podem formar juntos um anel, e R8 e um RN2 podem formar juntos um anel. Em algumas modalidades, um composto compreende um sistema de anel fusionado que compreende pelo menos 5 anéis. Em algumas modalidades, um composto compreende um sistema de anel fusionado que compreende pelo menos 7 anéis. Em algumas modalidades, um composto compreende um sistema de anel fusionado que compreende pelo menos 9 anéis. Em algumas modalidades, qualquer um dos sistemas de anéis fusionados supracitados consiste em anéis com 5 e 6 membros. Em algumas modalidades, qualquer um dos sistemas de anéis fusionados supracitados consiste em anéis com 6 membros. Compostos exemplificativos que compreendem um sistema de anéis fusionados com 5 ou mais anéis são os compostos 18 a 37 e 45 a 59. Em algumas modalidades, o sistema de anel fusionado de qualquer um dos compostos anteriores é combinado com R1, R2, R3 e R4, conforme definido para a fórmula (I) ou conforme estabelecido em qualquer modalidade divulgada no presente documento, incluindo R1, R2, R3 e R4 de outro composto de SiR ou R1, R2, R3 e R4, conforme definido em qualquer modalidade ou reivindicação numerada.

[0298]Em algumas modalidades, o composto tem um plano de simetria de espelho que passa através do silício e R4 da fórmula (I), opcionalmente com a exceção de que R1 e R2 não são necessariamente idênticos. Uma carga formal no nitrogênio ligado a RN1 ou o nitrogênio ligado a RN2 e as localizações formais de ligações duplas que podem se reorganizar por ressonância ou deslocar em orbitais moleculares ou um sistema pi conjugado não são considerados desreguladores de simetria. Além disso, R3 e geralmente não interrompem a simetria na medida em que podem ocupar o plano de simetria por meio da rotação da ligação entre o anel ao qual estão ligados e o sistema de anel que compreende o silício. Dito isso, por exemplo, o Composto 1A tem um plano de simetria de espelho que passa através do silício e R4 da fórmula (I), e o Composto 1 tem um plano de simetria de espelho que passa pelo silício e R4 da fórmula (I), com a exceção que R1 e R2 não são idênticos.

[0299]As pessoas versadas na técnica observarão que os compostos podem exibir os fenômenos de tautomerismo, isomerismo conformacional, isomerismo geométrico e/ou estereoisomerismo. Uma vez que os desenhos de fórmulas dentro do presente relatório descritivo e nas reivindicações não podem representar necessariamente todas as formas tautoméricas, isoméricas conformacionais, enantioméricas ou isoméricas geométricas, deve ser entendido que a divulgação abrange quaisquer formas tautoméricas, isoméricas conformacionais, enantioméricas e/ou isoméricas geométricas dos compostos que têm uma ou mais das utilidades descritas no presente documento.

[0300]Além disso, também ficará evidente que os compostos podem existir em muitos estados de protonação diferentes, dependendo, entre outras coisas, do pH de seu ambiente. Embora as fórmulas estruturais fornecidas no presente documento representem os compostos em apenas um dentre os vários estados de protonação possíveis, será entendido que essas estruturas são apenas ilustrativas e que a divulgação não está limitada a qualquer estado de protonação específico. Toda e qualquer forma protonada dos compostos de SiR deve ser abrangida pelo escopo da divulgação.

[0301]Além disso, os compostos da divulgação podem suportar múltiplas cargas positivas ou negativas. Os contraíons associados aos substratos enzimáticos são tipicamente ditados pelos métodos de síntese e/ou de isolamento por meio dos quais os compostos são obtidos. Os contraíons típicos incluem, porém sem limitação, amônio, sódio, potássio, lítio, haletos, acetato, trifluoroacetato, etc., e suas misturas. Será entendido que a identidade de qualquer contraíon associado não é uma característica crucial da divulgação, e que a divulgação abrange os compostos associados a qualquer tipo de contraíon, salvo quando especificado de outro modo.

[0302]Em determinadas modalidades da presente divulgação, é fornecida uma composição, sendo que a composição compreende qualquer um dos compostos fornecidos no presente documento e pelo menos um solvente. Em determinadas modalidades, o solvente compreende água ou DMSO ou uma combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, a composição compreende adicionalmente um meio de cultura.

[0303]Em determinadas modalidades, são fornecidas composições, sendo que as composições compreendem: a) um ou mais dentre os compostos fornecidos no presente documento; e b) um carreador.

[0304]Em determinadas modalidades, são fornecidas composições, sendo que as composições compreendem: a) um ou mais dentre os compostos fornecidos no presente documento; e b) um analito.

2.GRUPOS REATIVOS, MOLÉCULAS CARREADORAS E SUPORTES

SÓLIDOS

[0305]Em uma modalidade exemplificativa, os compostos de SiR fornecidos no presente documento compreendem um grupo reativo ou ligante reativo que é um membro selecionada a partir de uma acrilamida, um éster ativado de um ácido carboxílico, uma acil azida, um acil nitrila, um aldeído, um haleto de alquila, um anidrido, uma anilina, um haleto de arila, uma azida, uma aziridina, um boronato, um ácido carboxílico, um diazoalcano, uma haloacetamida, uma halotriazina, uma hidrazina, uma hidrazida, um imido éster, um isocianato, um isotiocianato, uma maleimida, uma fosforamidita, um complexo de platina reativo, um haleto de sulfonila, um grupo tiol e um grupo fotoativável. Em algumas modalidades, um composto compreende um grupo reativo ou ligante reativo útil para a conjugação com outra molécula. Grupos reativos e/ou ligantes exemplificativos incluem, porém sem limitação, éster de N- hidroxisuccinimida (NHS), carboxila, carboxiléster, maleimida, amida, éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP), éster acetoximetílico (AM), ácido nitrilotriacético (NTA), aminodextrano e ciclo-octina-amina.

[0306]Esses grupos reativos podem ser ligados de maneira covalente durante ou após a síntese dos compostos de SiR fornecidos no presente documento, a fim de fornecer compostos de SiR que contém grupos reativos. Dessa maneira, os compostos de SiR que contém grupos reativos podem ser ligados de maneira covalente a uma ampla variedade de moléculas carreadoras ou suportes sólidos que contêm, ou são modificados para conter, grupos funcionais com reatividade adequada, resultando na ligação química dos componentes. Em uma modalidade exemplificativa, o grupo reativo de um composto de SiR divulgado no presente documento e o grupo funcional da molécula carreadora de suporte sólido compreendem eletrófilos e nucleófilos que podem gerar uma ligação covalente entre si. Alternativamente, o grupo reativo compreende um grupo passível de fotoativação, que se torna quimicamente reativa apenas após a iluminação com luz de um comprimento de onda apropriado. Tipicamente, a reação de conjugação entre o grupo reativo e a molécula carreadora ou o suporte sólido resulta na incorporação de um ou mais átomos do grupo reativo em uma nova ligação que liga o composto de SiR à molécula carreadora ou ao suporte sólido.

[0307]Por exemplo, um protocolo geral para conjugar um éster NHS a um conector ou molécula com um grupo nucleofílico (por exemplo, grupo amino ou sulfidrila) envolve diluir do éster NHS em acetonitrila aquosa (a porcentagem de acetonitrila é determinada pela hidrofobicidade do corante para atingir a solubilidade) com conector em água (ou solução aquosa de acetonitrila, caso o conector seja hidrofóbico). Tampão de bicarbonato de sódio aquoso (1 M) é adicionado à solução para obter a concentração de tampão 0,1 M durante o vórtice ou agitação. A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos a 30 minutos. O conjugado bruto na mistura de reação pode ser purificado por HPLC de fase reversa.

[0308]Exemplos selecionados a partir de grupos reativos e ligações são mostrados abaixo na Tabela 1, em que a reação de um grupo eletrofílico e um grupo nucleofílico produz uma ligação covalente. Uma pessoa versada na técnica pode selecionar um emparelhamento apropriado de grupos dependendo da identidade dos compostos que são conjugados, a reatividade de outras porções nesses compostos (por exemplo, para evitar produtos colaterais indesejados) e as propriedades desejadas para a ligação covalente. Por conseguinte, em algumas modalidades, um ligante reativo é selecionado a partir de um grupo eletrofílico ou do grupo nucleofílico listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o grupo reativo ou ligante reativo de um composto é selecionado a partir de um grupo eletrofílico listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o grupo reativo ou ligante reativo de um composto é selecionado a partir de um grupo nucleofílico listado na Tabela 1. TABELA 1 - EXEMPLOS DE ALGUMAS ROTAS PARA LIGAÇÕES

COVALENTES ÚTEIS Grupo Eletrofílico Grupo Nucleofílico Ligação Covalente Resultante ésteres ativados* aminas/anilinas carboxamidas acrilamidas tióis tioéteres acil azidas** aminas/anilinas carboxamidas haletos de acila aminas/anilinas carboxamidas haletos de acila álcoois/fenóis ésteres acil nitrilas álcoois/fenóis ésteres acil nitrilas aminas/anilinas carboxamidas aldeídos aminas/anilinas iminas aldeídos ou cetonas hidrazinas hidrazonas aldeídos ou cetonas hidroxilaminas oximas haletos de alquila aminas/anilinas alquil aminas haletos de alquila ácidos carboxílicos ésteres haletos de alquila tióis tioéteres haletos de alquila álcoois/fenóis éteres sulfonatos de alquila tióis tioéteres sulfonatos de alquila ácidos carboxílicos ésteres sulfonatos de alquila álcoois/fenóis éteres anidridos álcoois/fenóis ésteres anidridos aminas/anilinas carboxamidas haletos de arila tióis tiofenóis haletos de arila aminas aril aminas aziridinas tióis tioéteres boronatos glicóis ésteres de boronato carbodi-imidas ácidos carboxílicos N-acilureias ou anidridos diazoalcanos ácidos carboxílicos ésteres epóxidos tióis tioéteres haloacetamidas tióis tioéteres haloplatinato amino complexo de platina haloplatinato heterociclo complexo de platina haloplatinato tiol complexo de platina halotriazinas aminas/anilinas aminotriazinas halotriazinas álcoois/fenóis éteres triazinílicos halotriazinas tióis éteres triazinílicos ésteres imido aminas/anilinas amidinas isocianatos aminas/anilinas ureias isocianatos álcoois/fenóis uretanos isotiocianatos aminas/anilinas tioureias maleimidas tióis tioéteres fosforamiditas álcoois ésteres fosfito haletos de silila álcoois éteres silílicos ésteres sulfonato aminas/anilinas alquil aminas ésteres sulfonato tióis tioéteres ésteres sulfonato ácidos carboxílicos ésteres ésteres sulfonato álcoois éteres haletos de sulfonila aminas/anilinas sulfonamidas haletos de sulfonila fenóis/álcoois ésteres sulfonato

*Ésteres ativados, conforme entendido na técnica, têm geralmente a fórmula – COΩ, em que Ω é um grupo de saída adequado (por exemplo, succinimidilóxi (–OC4H4O2), sulfosuccinimidilóxi (–OC4H3O2-SO3H), -1-oxibenzotriazolila (– OC6H4N3); ou um grupo arilóxi ou arilóxi substituído uma ou mais vezes por elétrons que retiram substituintes, tais como nitro, fluoro, cloro, ciano ou trifluorometila ou combinações dos mesmos, usados para formar ésteres arílicos ativados; ou um ácido carboxílico ativado por uma carbodi-imida para formar um anidrido ou anidrido misturado –OCORx ou –OCNRxNHRy, em que Rx e Ry, que podem ser iguais ou diferentes, são C1-C6 alquila, C1-C6 perfluoroalquila ou C1-C6 alcóxi; ou ciclo-hexila, 3-dimetilaminopropila ou N-morfolinoetila). **Acil azidas também podem se reorganizar em isocianatos.

[0309]A escolha do grupo reativo usado para fixar um composto de SiR da presente divulgação à substância a ser conjugada depende tipicamente no grupo reativo funcional na substância a ser conjugada e do tipo ou do comprimento de ligação covalente desejada. Os tipos de grupos funcionais tipicamente presentes nas substâncias orgânicas ou inorgânicas (biomolécula ou não biomolécula) incluem, porém sem limitação, aminas, amidas, tióis, álcoois, fenóis, aldeídos, cetonas, fosfatos, imidazóis, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas dissubstituídas, haletos, epóxidos, haletos de silila, ésteres carboxilatos, ésteres sulfonatos, purinas, pirimidinas, ácidos carboxílicos, ligações olefínicas ou uma das combinações desses grupos. Um único tipo de sítio reativo pode estar disponível na substância (típico para polissacarídeos ou sílica) ou uma variedade de sítios pode ocorrer (por exemplo, aminas, tióis, álcoois, fenóis), conforme é típico para proteínas.

[0310]Tipicamente, o grupo reativo vai reagir com uma amina, um tiol, um álcool, um aldeído, uma cetona ou com sílica. De preferência, os grupos reativos reagem com uma amina ou um grupo funcional tiol ou com sílica. Em uma modalidade, o grupo reativo uma acrilamida, um éster ativado de um ácido carboxílico, uma acil azida, um acil nitrila, um aldeído, um haleto de alquila, um haleto de silila, um anidrido, uma anilina, um haleto de arila, uma azida, um aziridina, um boronato, um diazoalcano, uma haloacetamida, uma halotriazina, uma hidrazina (incluindo hidrazidas), um éster imido, um isocianato, um isotiocianato, uma maleimida, uma fosfoaramidita, um complexo de platina reativo, um haleto de sulfonila ou um grupo tiol. Por "complexo de platina reativo" entende-se particularmente complexos de platina quimicamente reativos, conforme descrito na Patente nº U.S. 5.714.327.

[0311]Quando o grupo reativo é um éster ativado de um ácido carboxílico, tal como um éster succinimidílico de um ácido carboxílico, um haleto de sulfonila, um éster tetrafluorofenílico ou um isotiocianatos, o composto resultante é particularmente útil para preparar conjugados de moléculas carreadoras, como proteínas, nucleotídeos, oligonucleotídeos ou haptenos. Quando o grupo reativo é uma maleimida, haloalquila ou haloacetamida (incluindo quaisquer grupos reativos divulgados nas Patentes nº U.S. 5.362.628; U.S. 5.352.803 e U.S. 5.573.904), o composto resultante é particularmente útil para a conjugação a substâncias que contêm tiol. Quando o grupo reativo é uma hidrazida, o composto resultante é particularmente útil para conjugação a carbo- hidratos oxidados com periodato e glicoproteínas e, além disso, é um rastreador polar fixável a aldeído para microinjeção celular. Quando o grupo reativo é um haleto de silila, o composto resultante é particularmente útil para conjugação a superfícies de sílica, particularmente em que a superfície de sílica é incorporada em uma sonda de fibra óptica subsequentemente usada para detecção ou quantificação remota de íons.

[0312]Em um aspecto particular, o grupo reativo é um grupo fotoativável,

de modo que o grupo seja apenas convertido em uma espécie reativa após a iluminação com um comprimento de onda apropriado. Um comprimento de onda apropriado é geralmente um comprimento de onda UV inferior a 400 nm. Esse método fornece a ligação específica apenas às moléculas-alvo, em solução ou imobilizadas em uma matriz sólida ou semissólida. Dessa maneira, os compostos de SiR fornecidos no presente documento que compreendem um grupo reativo fotoativável associado a proteínas aniônicas e podem ser conjugados de maneira covalente às proteínas. Os grupos reativos fotoativáveis incluem, sem limitação, benzofenonas, aril azidas e diazirinas.

[0313]Em determinadas modalidades, o grupo reativo é um grupo fotoativável, éster succinimidílicos de um ácido carboxílico, uma haloacetamida, haloalquila, uma hidrazina, um isotiocianato, um grupo maleimida, uma amina alifática, um haleto de silila, uma cadaverina ou um psoraleno. Em determinadas modalidades, o grupo reativo é um éster succinimidílico de um ácido carboxílico, uma maleimida, uma iodoacetamida ou um haleto de silila. Em uma modalidade particular, o grupo reativo é um éster succinimidílico de um ácido carboxílico, um haleto de sulfonila, um éster tetrafluorofenílico, um iosotiocianato ou uma maleimida.

[0314]A seleção de uma ligação covalente para anexar a molécula repórter à molécula carreadora ou suporte sólido depende tipicamente do grupo quimicamente reativo no componente a ser conjugado. A discussão em relação a grupos reativos na seção imediatamente anterior também é relevante no presente documento. Além do apêndice hidrazinila, grupos reativos exemplificativos tipicamente presentes nos componentes biológicos ou não biológicos incluem, porém sem limitação, aminas, tióis, álcoois, fenóis, aldeídos,

cetonas, fosfatos, imidazóis, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas dissubstituídas, haletos, epóxidos, ésteres de sulfonato, purinas, pirimidinas, ácidos carboxílicos ou uma combinação destes grupos. Um único tipo de sítio reativo pode estar disponível no componente (típico para polissacarídeos) ou uma variedade de sítios pode ocorrer (por exemplo, aminas, tióis, álcoois, fenóis), conforme é típico para proteínas. Uma molécula carreadora ou suporte sólido pode ser conjugada a mais de uma molécula repórter, que pode igual ou diferente, ou a uma substância que é adicionalmente modificada por um hapteno. Embora alguma seletividade possa ser obtida por meio de um controle cuidadoso de condições de reação, a seletividade da identificação é mais bem obtida por seleção de um composto reativo apropriado.

[0315]Quando um conjugado de um composto de SiR da Fórmula (I) é formado, o produto ainda é considerado um composto da Fórmula (I), em que o material recém-conjugado é considerado ligado a uma porção química de SiR por meio de um dentre os grupos pendentes da Fórmula (I), por exemplo, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 ou RN2. MOLÉCULAS CARREADORAS:

[0316]Em outra modalidade exemplificativa, o composto de SiR da presente descrição é ligado de maneira covalente a uma molécula carreadora. Caso o composto tenha um grupo reativo (ou ligante reativo), então, a molécula carreadora pode ser alternativamente ligada ao composto por meio do grupo reativo. O grupo reativo pode conter tanto uma porção química funcional reativa quanto um ligante, ou apenas a porção química funcional reativa.

[0317]Várias moléculas carreadoras são úteis na presente divulgação. As moléculas carreadoras exemplificativas incluem antígenos, esteroides,

vitaminas, fármacos, haptenos, metabólitos, toxinas, poluentes ambientais, aminoácidos, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de ácido nucleico, carbo-hidratos, lipídios e polímeros.

[0318]Em uma modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucleico, um hapteno, um psoraleno, um fármaco, um hormônio, um lipídio, um conjunto de lipídios, um polímero sintético, uma micropartícula polimérica, uma célula biológica, um vírus e combinações dos mesmos. Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora é selecionada a partir de um hapteno, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero de ácido nucleico, uma proteína, um peptídeo ou um polissacarídeo. Em outra modalidade exemplificativa, pelo menos um membro selecionado a partir de R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 ou RN2 compreende uma molécula carreadora. Em outra modalidade exemplificativa, um dentre R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 ou RN2 compreende um grupo carreador ligado através de um grupo alquila substituído ou grupo reativo, tal como um grupo alquil-succinimidila.

[0319]Em uma modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucleico, um hapteno, um psoraleno, um fármaco, um hormônio, um lipídio, um conjunto de lipídios, um polímero sintético, uma micropartícula polimérica, uma célula biológica, um vírus e combinações dos mesmos. Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora é selecionada a partir de um hapteno, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero de ácido nucleico, uma proteína,

um peptídeo ou um polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, a molécula carreadora é um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucleico, um hapteno, um psoraleno, uma fármaco, um hormônio, um lipídio, um lipídio conjunto, uma tiramina, um polímero sintético, uma micropartícula polimérica, uma célula biológica, componentes celulares, uma porção química quelante de íons, um substrato enzimático ou um vírus. Em outra modalidade preferencial, a molécula carreadora é um anticorpo ou fragmento do mesmo, um antígeno, uma avidina ou estreptavidina, uma biotina, um dextrano, uma proteína de ligação ao anticorpo, uma proteína fluorescente, agarose e uma micropartícula não biológica. Tipicamente, a molécula carreadora é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, proteínas de ligação a anticorpos, avidina, estreptavidina, uma toxina, uma lectina ou um fator de crescimento. Os haptenos preferenciais incluem biotina, digoxigenina e proteínas fluorescentes.

[0320]Proteínas de ligação a anticorpos incluem, porém sem limitação, proteína A, proteína G, receptor Fc solúvel, proteína L, lectinas, anti-IgG, anti- IgA, anti-IgM, anti-IgD, anti-IgE ou um fragmento destes.

[0321]Em uma modalidade exemplificativa, o substrato enzimático é selecionado a partir de um aminoácido, peptídeo, açúcar, álcool, ácido alcanoico, ácido 4-guanidinobenzoico, ácido nucleico, lipídio, sulfato, fosfato, - CH2OCOalquila e combinações dos mesmos. Dito isso, os substratos enzimáticos podem ser clivados por enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em peptidase, fosfatase, glicosidase, desalquilase, esterase, guanidinobenzotase, sulfatase, lipase, peroxidase, histona desacetilase, endoglicoceramidase, exonuclease, redutase e endonuclease.

[0322]Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora é um aminoácido (incluindo aqueles que estão protegidos ou são substituídos por fosfatos, hidratos de carbono, ou C1 a C22 de ácidos carboxílicos) ou um polímero de aminoácidos, tais como um peptídeo ou proteína. Em uma modalidade relacionada, a molécula carreadora contém pelo menos cinco aminoácidos, com mais preferência, 5 a 36 aminoácidos. Os peptídeos exemplificativos incluem, porém sem limitação, neuropeptídeos, citocinas, toxinas, substratos de protease e substratos de proteína quinase. Outros peptídeos exemplificativos podem funcionar como peptídeos de localização de organela, isto é, peptídeos que servem para direcionar o composto conjugado para localização dentro de uma subestrutura celular particular por mecanismos de transporte celular. As moléculas carreadoras de proteína preferenciais incluem enzimas, anticorpos, lectinas, glicoproteínas, histonas, albuminas, lipoproteínas, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, ficobiliproteínas e outras proteínas fluorescentes, hormônios, toxinas e fatores de crescimento. Tipicamente, a molécula carreadora de proteína é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, avidina, estreptavidina, uma toxina, uma lectina ou um fator de crescimento.

[0323]Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende uma base de ácido nucleico, nucleosídeo, nucleotídeo ou um polímero de ácido nucleico, contendo opcionalmente um ligante ou espaçador adicional para ligação de um fluoróforo ou outro ligante, tal como uma ligação alquinila (Patente nº U.S. 5.047.519), uma ligação aminoalila (Patente nº U.S.

4.711.955) ou outra ligação. Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora de nucleotídeo é um nucleosídeo ou um desoxinucleosídeo ou um didesoxinucleosídeo.

[0324]As moléculas carreadoras de polímero de ácido nucleico exemplificativas são oligonucleotídeos de DNA ou RNA de fita simples ou de múltiplas fitas, naturais ou sintéticos ou híbridos de DNA/RNA ou incorporando- se um conector incomum, tais como fosfatos derivados de morfolina (AntiVirals, Inc., Corvallis OR), ou ácidos nucleicos de peptídeo, tais como unidades de N- (2-aminoetil)glicina, em que o ácido nucleico contém menos de 50 nucleotídeos, mais tipicamente menos de 25 nucleotídeos.

[0325]Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende um carbo-hidrato ou poliol que é tipicamente um polissacarídeo, tal como dextrano, FICOLL (GE Healthcare, Fairfield, CT), heparina, glicogênio, amilopectina, manana, inulina, amido, agarose e celulose ou é um polímero, tal como um poli(etilenoglicol). Em uma modalidade relacionada, a molécula carreadora de polissacarídeo inclui dextrano, agarose ou FICOLL.

[0326]Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende um lipídio (tipicamente, com 6 a 25 carbonos), incluindo glicolipídios, fosfolipídios e esfingolipídios. Alternativamente, a molécula carreadora compreende uma vesícula lipídica, como um lipossoma, ou é uma lipoproteína (consultar a seguir). Alguns substituintes lipofílicos são úteis para facilitar o transporte do composto do corante conjugado até as células ou organelas celulares.

[0327]Alternativamente, a molécula carreadora são células, sistemas celulares, fragmentos celulares ou partículas subcelulares. Exemplos desse tipo de material conjugado incluem partículas de vírus, partículas bacterianas, componentes de vírus, células biológicas (como células de animais, células de plantas, bactérias ou leveduras) ou componentes celulares. Exemplos de componentes celulares que podem ser identificados ou cujas moléculas constituintes podem ser marcadas, incluem, porém sem limitação, lisossomas, endossomas, citoplasma, núcleos, histonas, mitocôndrias, aparelho de Golgi, retículo endoplasmático e vacúolos.

[0328]Em outra modalidade, a molécula carreadora é uma porção química quelante de metal. Embora qualquer quelador que se liga a um íon de metal de interesse e fornece uma mudança em sua propriedades de fluorescência seja um conjugado adequado, porções químicas quelantes de metal preferenciais são éteres coroas, incluindo éteres cororas diarildiaza, conforme descrito na Patente nº U.S. 5.405.975 de Kuhn et al. (1995); derivados de ácido 1,2-bis-(2-aminofenoxietano)-N,N,N’,N’-tetra-acético (BAPTA), conforme descrito na Patente nº U.S. 5.453.517 de Kuhn et al. (1995) (incorporado a título de referência) e na Patente nº U.S 5.049.673 de Tsien et al. (1991); derivados de ácido 2-carboximeoxi-anilina-N,N-diacético (APTRA), conforme descrito por Raju et al., Am. J. Physiol., 256: C540 (1989); e queladores de íon de metal à base de piridila de fenantrolina, conforme descrito na Patente nº U.S. 5.648.270 de Kuhn et al. (1997).

[0329]Em outra modalidade exemplificativa, a molécula carreadora se associa de maneira não covalente a materiais orgânicos ou inorgânicos. Modalidades exemplificativas da molécula carreadora que possuem um substituinte lipofílico podem ser usadas para ter como alvo conjuntos de lipídios, tais como membranas biológicas ou lipossomas, por meio da incorporação não covalente do composto do corante dentro da membrana, por exemplo, para uso como sondas para estrutura de membrana ou para incorporação em lipossomas, lipoproteínas, filmes, plásticos, microesferas lipofílicas ou materiais semelhantes.

[0330]Em uma modalidade exemplificativa, a molécula carreadora compreende um membro do par de ligação específica em que os presentes compostos são conjugados a um membro do par de ligação específico e são usados para detectar um analito em uma amostra. Alternativamente, a presença do membro do par de ligação específica identificado indica a localização do membro complementar desse par de ligação específica; em que cada membro do par de ligação específica tem uma área na superfície ou em uma cavidade que se liga especificamente e uma organização espacial e polar particular do outro, e é complementar à mesma. Pares de ligação exemplificativos são apresentados na Tabela 2. TABELA 2. PARES DE LIGAÇÃO ESPECÍFICOS REPRESENTATIVOS antígeno anticorpo biotina avidina (ou estreptavidina ou antibiotina) IgG* proteína A ou proteína G fármaco receptor de fármaco folato proteína de ligação a folato toxina receptor de toxina carbo-hidrato receptor de lectina ou carbo-hidrato peptídeo receptor de peptídeo proteína receptor de proteína substrato de enzima enzima DNA (RNA) cDNA (cRNA)† hormônio receptor de hormônio íon quelador anticorpo proteínas de ligação a anticorpos *IgG é uma imunoglobulina †cDNA e cRNA são as fitas complementares usadas para hibridização

SUPORTES SÓLIDOS:

[0331]Em determinadas modalidades, os compostos de SiR divulgados no presente documento são ligados de maneira covalente a um suporte sólido. O suporte sólido pode ser ligado aos compostos de SiR através do fluoróforo ou através de um grupo reativo, caso esteja presente, ou através de uma molécula carreadora, caso esteja presente.

[0332]Os suportes sólidos adequados para uso no presente documento são tipicamente substancialmente insolúveis em fases líquidas. Os suportes sólidos para uso no presente documento não se limitam a um tipo específico de suporte. Em vez disso, inúmeros suportes estão disponíveis e são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Desse modo, os suportes sólidos úteis incluem matrizes sólidas e semissólidas, como aerogéis e hidrogéis, resinas, grânulos, biochips (incluindo biochips revestidos de filme fino), chip microfluídico, um chip de silício, placas de vários poços (também denominados de placas de microtitulação ou microplacas), membranas, metais condutores e não condutores, vidro (incluindo lâminas de microscópio) e suportes magnéticos. Exemplos mais específicos de suportes sólidos úteis incluem géis de sílica, membranas poliméricas, partículas, filmes plásticos derivados, microesferas de vidro, algodão, microesferas de plástico, géis de alumina, polissacarídeos, tais como SEPHAROSE (GE Healtcare, Fairfield, CT), poli(acrilato), poliestireno, poli(acrilamida), poliol, agarose, ágar, celulose, dextrano, amido, FICOLL (GE Healtcare), heparina, glicogênio, amilopectina, manana, inulina, nitrocelulose, diazocelulose, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno (incluindo poli(etilenoglicol)), náilon, microesfera de látex, microesfera magnética, microesfera paramagnética, microesfera superparamagnética, amido e semelhantes.

[0333]Em determinadas modalidades, o suporte sólido pode incluir um grupo funcional reativo de suporte sólido, incluindo, porém sem limitação, hidroxila, carboxila, amino, tiol, aldeído, halogênio, nitro, ciano, amido, ureia, carbonato, carbamato, isocianato, sulfona, sulfonato, sulfonamida, sulfóxido etc., para fixar os compostos de corante divulgados no presente documento. Os grupos reativos úteis são divulgados acima e são igualmente aplicáveis aos grupos funcionais reativos de suporte sólido no presente documento.

[0334]Um suporte de fase sólida adequado pode ser selecionado com base no uso final desejado e adequação para vários protocolos sintéticos. Por exemplo, quando a formação de ligação amida é desejável para fixar os compostos de SiR divulgados no presente documento ao suporte sólido, podem ser empregues resinas geralmente úteis na síntese de peptídeos, tais como poliestireno (por exemplo, resina PAM obtida da Bachem Inc., Peninsula Laboratories etc.), resina POLYHIPE (obtida da Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtida de Peninsula Laboratories), resina de poliestireno enxertada com polietilenoglicol (TENTAGEL, Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha), resina de polidimetil-acrilamida (disponível em Milligen/Biosearch, Califórnia) ou pérolas PEGA (obtidas da Polymer Laboratories).

3.CONJUGADOS A PORÇÕES QUÍMICAS DE LIGAÇÃO A ALVO

[0335]De modo geral, em relação aos compostos descritos no presente documento que compreende uma porção química de SiR e uma porção química conjugada (por exemplo, porção química de ligação a alvo, nucleotídeo, polinucleotídeo, fosforamidita etc.), a porção química de SiR tem a estrutura da Fórmula (I) em que um substituinte do mesmo (por exemplo, R1, R2, R3, R4, E, R5,

R6, R7, R8, R9, RN1 ou RN2) compreende a porção química conjugada, que está opcionalmente conectada à porção química de SiR por meio de um conector. Em algumas modalidades, R1 ou R2 compreende a porção química conjugada. Em algumas modalidades, R3 ou R4 compreende a porção química conjugada.

[0336]Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado no qual uma porção química de SiR é unida a uma porção química de ligação a alvo, tal como um anticorpo, porção química de ligação a citoesqueleto ou porção química de ligação a ácido nucleico. Os compostos de SiR que compreende porções químicas de ligação a alvo podem ser usados para marcar de maneira fluorescente o alvo ligado pela porção química de ligação a alvo, por exemplo, para microscopia de fluorescência e aplicações de microscopia de super- resolução descritas em outro lugar no presente documento.

[0337]Por exemplo, para preparar tais conjugados, um grupo reativo da porção química de ligação a alvo (por exemplo, uma amina em um anticorpo) pode ser reagido com um grupo reativo, tal como um éster NHS, em um composto da Fórmula (I), para fornecer um conjugado de acordo com a divulgação. Em algumas modalidades, um composto divulgado no presente documento é ativado primeiramente convertendo-se uma porção química do mesmo em um ligante reativo que reage com a porção química de ligação a alvo. Os produtos de tais reações de conjugação também são considerados compostos divulgados no presente documento.

[0338]Por conseguinte, em algumas modalidades, um composto da Fórmula (I) compreende uma porção química de ligação a alvo. Em algumas modalidades, a porção química de ligação a alvo é parte de R1, R2, R3 ou R4 da Fórmula (I). A porção química de ligação a alvo pode ser conjugada à porção química de SiR, por exemplo, em uma das posições anteriores, com o uso de procedimentos de derivatização apropriados, por exemplo, começando a partir de um composto da Fórmula (I) em que R1, R2, R3 ou R4 compreende um ligante reativo, por exemplo, uma vinila em R1 ou R2 (ou um grupo reativo diferente, tal como uma carboxila ou amina, que pode ser fornecido, por exemplo, com o uso de uma reação de tiol-eno, conforme discutido ao longo do presente documento; consultar as Figuras 2B a 2D para vias sintéticas exemplificativas que envolvem derivatização em R2, que pode ser aplicada mutatis mutandis à derivatização em R1), ou um ligante reativo, tal como uma carboxila em R3 ou R4. Consultar a Figura 2E para uma rota sintética exemplificativa que envolve a derivatização em R3, que pode ser aplicada mutatis mutandis para derivatização em R4.

[0339]Em algumas modalidades, a porção química de ligação a alvo é uma porção química de ligação a citoesqueleto.

[0340]Em algumas modalidades, a porção química de ligação a citoesqueleto é uma porção química de ligação ao microtúbulo, como docetaxel. Uma estrutura exemplificativa de um docetaxel conjugado é em que a linha ondulada indica a conexão com a porção química de SiR, por exemplo, por meio de um conector. Consultar, por exemplo, o Composto 5.

[0341]Em algumas modalidades, a porção química de ligação a citoesqueleto é um peptídeo de ligação à actina. Uma estrutura exemplificativa de um peptídeo de ligação de actina conjugado é em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, por exemplo, através de um conector. Consultar, por exemplo, o Composto 6.

[0342]Em algumas modalidades, a porção química de ligação a alvo é uma porção química de ligação à actina, como uma faloidina. Um exemplo de conjugado de faloidina pode ser preparado com o uso de uma rodamina de silício, tal como o Composto 7A.

[0343]Em algumas modalidades, a porção química de ligação a alvo é uma porção química de ligação a ácido nucleico, tal como uma porção química de ligação ao DNA. Uma porção química de ligação de ácido nucleico exemplificativo é uma porção química de Hoechst ou porção química de nitro- Hoechst. Uma estrutura exemplificativa de uma porção química de Hoechst conjugada é em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, por exemplo, através de um conector. Consultar, por exemplo, os Compostos 4 e 7. Uma estrutura exemplificativa de uma porção química de nitro-Hoechst conjugada é em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, por exemplo, através de um conector. Consultar, por exemplo, o Composto 7B. Em aplicações que podem envolver outro corante com espectros de fluorescência que se sobrepõem aos de Hoechst, pode ser desejável usar uma porção química de nitro-Hoechst, que tem fluxo de fluorescência reduzido (consultar o Exemplo 4).

[0344]Consultar a Figura 10A para uma ilustração geral de preparação de um conjugado para marcar células fixas, envolvendo a derivatização na posição R3.

4. FOSFORAMIDITAS E NUCLEOSÍDEOS, NUCLEOTÍDEOS E

POLINUCLEOTÍDEOS IDENTIFICADOS

[0345]São fornecidos, também, no presente documento compostos de acordo com a Fórmula (I) que compreendem uma fosforamidita. A fosforamidita pode fazer parte dos grupos R1, R2, R3 ou R4 da Fórmula (I).

[0346]Em algumas modalidades, o composto é um composto de fosforamidita com a Fórmula (L1): (L1)

[0347]em que X e Y formam juntos um conector; B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 considerados separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila e cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; e D é a porção química de corante que contém SiR. Esses compostos são adequados para identificar a extremidade 5’ de um polinucleotídeo sintetizado quimicamente ou um polinucleotídeo sintetizado quimicamente automatizado com o uso de síntese de suporte sólido através da porção de açúcar do nucleotídeo. Y pode estar ligado a D através de uma das posições R1, R2, R3 ou R4 da Fórmula (I). X e Y podem assumir uma variedade de formas, no entanto, a estrutura XY precisa ser de modo que (i) seja estável sob condições de síntese de DNA, (ii) não interfira substancialmente na hibridização do polinucleotídeo-alvo e (iii) não arrefeça bruscamente a fluorescência do corante ao qual está ligado, por exemplo, patentes nº U.S. 5.231.191, nº U.S. 5.258.538 e nº U.S. 4.757.141 e nº U.S. 5.212.304. Em algumas modalidades, X é alquila inferior linear ou cíclico, alquila inferior substituída linear ou cíclico, óxido de polietileno, arila inferior com entre 1 e 8 átomos de carbono, peptídeo ou poliéter. Em algumas modalidades, Y é amido, sulfonamido, ureia, uretano ou tureia. Por exemplo, Y pode ser amido e X pode ser -(CH2)n - em que n varia de 2 a 30, por exemplo, de 2 a 10, como de 2 a 6. Em outro exemplo, Y pode ser amido e X pode ser -(CH2CH2O)n- (isto é, óxido de polietileno linear) em que n varia de 2 a 30, por exemplo, de 2 a 10, tal como de 2 a 6.

[0348]Os compostos de fosforamidita podem ser sintetizados por uma variedade de métodos conhecidos. De modo geral, a síntese procede da seguinte forma. As hidroxilas fenólicas de D, caso haja, são protegidas com grupos de proteção de corante que podem ser removidos com um agente de desproteção de síntese de DNA, por exemplo, amônia, etanolamina, misturas de metilamina/hidróxido de amônio e misturas de t-butilamina/água/metanol (1:2:1), por exemplo, consultar a patente nº U.S. 5.231.191. Os corantes assim protegidos são denominados no presente documento de "derivados protegidos"

do corante. Em algumas modalidades, o grupo de proteção é um éster de ácido benzoico ou ácido piválico. O ligante reativo do corante protegido, por exemplo, ácido carboxílico, é então ativado, por exemplo, com carbodi-imida e reagido com um derivado de conector de álcool, por exemplo, um aminoálcool, por exemplo, etanolamina, hexanol amina ou semelhantes, em N, N- dimetilformamida (DMF) ou outro solvente aprótico semelhante para produzir um corante protegido com uma funcionalidade de álcool livre, por exemplo, derivado álcool-amida. Em seguida, o álcool livre é reagido com um agente de fosfitilação com o uso de procedimentos padrão, por exemplo, di-(N, N-di- isopropilamino)metoxifosfina em acetonitrila que contém quantidades catalíticas de tetrazol di-isopropilamina, para produzir a fosforamidita, por exemplo, Patente nº 5.231.191.

[0349]Em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo identificado com uma porção química de SiR descrita no presente documento. Esse polinucleotídeo pode ser produzido, por exemplo, identificando-se a extremidade 5’ de um polinucleotídeo sintetizado quimicamente ou quimicamente automatizado com o uso da síntese de suporte sólido através da porção de açúcar do nucleotídeo com um composto da Fórmula (L1). Alternativamente, um polinucleotídeo que compreende um primeiro ligante reativo (por exemplo, ligante reativo nucleofílico, tal como uma amina primária) pode ser identificado reagindo-se o mesmo com um composto da Fórmula (I) que compreende um segundo ligante reativo compatível com o primeiro ligante reativo (por exemplo, ligante reativo eletrofílico, como um éster ativo, por exemplo, um éster NHS).

[0350]Em algumas modalidades, é fornecido um composto de fosfoaramidita que tem a Fórmula (L2): (L2) em que os substituintes variáveis são definidos conforme a seguir. B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 considerados separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila ou cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; B5 é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila clivável por ácido; B é uma base de nucleosídeo/nucleotídeo, e D é a porção corante que contém SiR. Quando B é purina ou 7-deazapurina, a porção química de açúcar está ligada na posição N9 da purina ou da 7-deazapurina, e quando B é pirimidina, a porção química de açúcar está ligada na posição N1 da pirimidina. B e D estão ligados através de um conector ligado a D em uma das posições R1, R2, R3 ou R4. Caso B seja uma purina, o conector é fixado à posição 8 da purina, caso B seja 7- deazapurina, o conector é ligado à posição 7 da 7-deazapurina, e caso B seja pirimidina, o conector é ligado à posição 5 da pirimidina.

[0351]Em algumas modalidades, B5 é o radical trifenilmetila ou um derivado substituído doador de elétrons do mesmo, em que, conforme usado no presente documento, o termo "doador de elétrons" denota a tendência de um substituinte liberar elétrons de valência para átomos vizinhos em cuja molécula é uma parte, isto é, é eletropositivo em relação aos átomos vizinhos. Em algumas modalidades, os substituintes doadores de elétrons incluem amino, alquila inferior, arila inferior com entre 1 e 8 átomos de carbono, alcóxi inferior e semelhantes. Com mais preferência, os substituintes doadores de elétrons são metóxi. As tritilas exemplificativas incluem 4,4'-dimetoxitritila, isto é, bis(p- anisil)fenilmetila, monometoxitritila, α-naftildifenilmetila, tri(p-metoxifenil)metila e semelhantes. As condições de ligação e clivagem para essas e outras trililas podem ser encontradas em Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª Edição (John Wiley, Nova York, 1991).

[0352]De modo geral, as fosforamiditas de nucleotídeo da Fórmula (L2) podem ser sintetizadas, conforme descrito na Patente nº U.S. 9.783.560, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0353]Os compostos da Fórmula (L2) são adequados para a identificação interna de polinucleotídeos sintetizados quimicamente. Consequentemente, também é fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende uma base identificada com uma porção química de SiR divulgada no presente documento, por exemplo, em que a base está ligada à porção química de SiR através de R1, R2, R3 ou R4 da Fórmula (I). Tais polinucleotídeos identificados são úteis em uma série de contextos importantes, incluindo como iniciadores de sequenciamento de DNA, iniciadores de PCR, sondas de hibridização de polinucleotídeos, sondas de ligação de polinucleotídeos e semelhantes. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo identificado compreende adicionalmente um segundo corante ou arrefecedor brusco localizado de modo que a transferência de energia de fluorescência ocorra entre um corante doador e um corante aceitador ou arrefecedor brusco. Tais polinucleotídeos de transferência de energia de corante múltiplo ou corante/arrefecedor brusco encontram aplicação são aplicáveis como iniciadores de sequenciamento espectralmente ajustáveis, por exemplo, Ju et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. EUA 92: 4.347 a 4.351 (1995), e como sondas de hibridização, por exemplo, Lee et al. Nucleic Acids Research, 21: 3.761 a 3.766 (1993); Patente nº U.S. 5.723.591 (sondas TaqMan); patente nº U.S. 8.211.644 (sondas de feixe molecular).

[0354]Também é fornecido no presente documento um nucleosídeo/nucleotídeo identificado com a estrutura NUC-DYE em que NUC é um nucleosídeo/nucleotídeo ou análogo de nucleosídeo/nucleotídeo e DYE é uma porção química de corante que contém SiR no presente documento descrita. NUC e DYE podem ser conectados por um conector em que o conector está ligado a DYE através de uma das posições R1 ou R2 da Fórmula (I). Caso NUC compreenda uma base de purina, o conector pode ser fixado à posição 8 da purina; caso NUC compreenda uma base de 7- deazapurina, o conector pode ser ligado à posição 7 da 7-deazapurina; e caso NUC compreenda uma base de pirimidina, o conector pode ser ligado à posição 5 da pirimidina.

[0355]A identificação de nucleosídeos pode ser realizada com o uso de qualquer uma dentre várias técnicas conhecidas de identificação de nucleosídeo/nucleotídeo empregando-se ligantes conhecidos, grupos de ligação e funcionalidades complementares associadas. De modo geral, o conector que liga o composto de SiR e o nucleosídeo deve (i) ser estável sob condições de síntese de polinucleotídeos, (ii) não interferir com a hibridização de polinucleotídeo-alvo, (iii) ser compatível com enzimas relevantes, por exemplo, polimerases, ligases e semelhantes e (iv) não afetar adversamente as propriedades de fluorescência do corante. Os procedimentos de identificação de base exemplificativos adequados para utilização incluem os seguintes: Gibson et al, Nucleic Acids Research, 15:6.455 a 6.467 (1987); Gebeyehu et al, Nucleic Acids Research, 15: 4.513 a 4.535 (1987); Haralambidis et al, Nucleic Acids Research, 15: 4.856 a 4.876 (1987); Nelson et al., Nucleosides and Nucleotides, 5(3): 233 a 241 (1986); Bergstrom, et al., JACS, 111: 374 a 375 (1989); patentes nº U.S. 4.855.225, 5.231.191 e 5.449.767.

[0356]Em algumas modalidades, os conectores compreendem grupos amido acetilênico ou amido alcênico, sendo que o conector entre o corante e a base de nucleosídeo/nucleotídeo é formado reagindo-se um éster N- hidroxisuccinimídico (NHS) ativado do corante com uma base derivatizada de alquinilamino ou de alcenilamino de um nucleosídeo/nucleotídeo. Em outras modalidades, o conector resultante é uma 3-(carboxi)amino-1-propin-1-ila. Em outras modalidades, o conector compreende um grupo propargiletoxiamino substituído que tem a estrutura -C≡C-CH2OCH2CH2NRN6X-, em que X é -C(O)- (CH2)n-N(RN7)- em que n está em uma faixa de 1 a 5, -C(O)-Ar-(CH2)n-N(RN7)- em que n está em uma faixa de 1 a 5 ou -C(O)-C≡C-CH2-N(RN7)-; RN7 é H alquila inferior ou grupo protetor; e RN6 é H ou alquila inferior. Consultar a patente nº U.S. 5.770.716, que é incorporada no presente documento a título de referência.

[0357]Em algumas modalidades, o nucleosídeo/nucleotídeo identificado é um composto da Fórmula (L3): (L3) em que B é uma base de nucleotídeo, por exemplo, uracila, citosina, deaza-adenina ou deazaguanosina; W1 e W2 obtidos separadamente são OH ou um grupo com capacidade para bloquear a polimerização direcionada a molde mediada pela polimerase, por exemplo, H, flúor e semelhantes; W3 representa OH, ou mono, di ou trifosfato ou fosfato analógico; e D é uma porção química de SiR no presente documento descrita, por exemplo, em que B está ligado à porção química de SiR através de R1, R2, R3 ou R4 da Fórmula (I). Por exemplo, o composto pode ser um didesoxinucleotídeo trifosfato em que W3 é um trifosfato e W2 e W1 são H. Os didesoxinucleotídeos identificados são especificamente aplicáveis como agentes de terminação de cadeia, por exemplo, em métodos de sequenciamento de DNA do tipo Sanger com o uso de detecção fluorescente. Como outro exemplo, o composto pode ser um desoxinucleotídeo trifosfato em que W3 é um trifosfato e W2 e W1 são OH e H, respectivamente. Tais desoxinucleotídeos identificados são especificamente aplicáveis à identificação de produtos de extensão de polimerase, por exemplo, em reações de amplificação, tais como PCR ou tradução de Nick.

[0358]A preparação de um iniciador com identificação dupla exemplificativo com o uso de um composto de fosforamidita de acordo com a divulgação é ilustrada na Figura 8. A preparação de um iniciador de marcação dupla exemplificativo com o uso de um composto de éster NHS de acordo com a divulgação é ilustrada na Figura 9.

[0359]Para uma discussão adicional geralmente relevante para o composto de fosforamidita, nucleosídeo e preparação de nucleotídeo, incluindo reagentes úteis e condições de reação, consultar a Patente nº U.S. 6.008.379 e

9.783.560, que são incorporados no presente documento a título de referência.

5. PORÇÕES QUÍMICAS PARA AUMENTAR A SOLUBILIDADE EM

ÁGUA

[0360]O aumento da solubilidade em água de um composto de SiR fornecido no presente documento pode ser desejável, por exemplo, para permitir o uso do composto de SiR em uma concentração mais elevada em um ambiente aquoso e/ou para tornar o composto de SiR impermeável a membranas celulares intactas de células vivas. Desse modo, em algumas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro ou mais dentre R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 e RN2 compreende uma ou mais funcionalidades solubilizantes, que são grupos polares ou carregados (por exemplo, aniônico, catiônico ou zwiteriônicos). Em algumas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro ou mais dentre R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 e RN2 compreendem um ou mais grupos polares, tais como grupos que contêm oxigênio, nitrogênio ou que contêm cloro e/ou doadores ou aceitadores de hidrogênio. Em algumas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro ou mais dentre R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 e RN2 compreendem um ou mais grupos polares, tais como grupos que contêm oxigênio, nitrogênio ou que contêm cloro. Funcionalidades solubilizantes exemplificativas incluem carbóxis, aminas, álcoois, nitros, cloros, carbonilas, ésteres, sulfatos, sulfonatos, fosfatos, fosfonatos, éteres (por exemplo, óxidos de polietileno), amidas, carbonatos, carbamatos e semelhantes.

[0361]Em algumas modalidades, as funcionalidades solubilizantes podem ser fornecidas como parte de um conector. Por exemplo, pode ser fornecido um conector de óxido de polietileno -(CH2CH2O)n- em que, por exemplo, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, tal como pelo menos 3. Em algumas modalidades, tal conector pode compreender um ligante reativo em uma extremidade útil para derivatização adicional, por exemplo, um éster NHS, carboxila, carboxiléster, maleimida, amida, éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP), éster acetoximetílico (AM) ou outro ligante reativo descrito no presente documento.

[0362]Em algumas modalidades, as funcionalidades solubilizantes podem ser fornecidas como substituintes em uma arila ou heteroarila. Em algumas modalidades, um composto compreende uma arila ou heteroarila (por exemplo, fenila) substituída por pelo menos 1, 2 ou 3 funcionalidades solubilizantes que podem ser iguais ou diferentes (por exemplo, sulfonatos). Em algumas modalidades, um composto compreende uma arila ou heteroarila (por exemplo, fenila) substituída por pelo menos 1, por exemplo, pelo menos 2 sulfonatos, tais como 2 sulfonatos em uma orientação meta entre si.

[0363]Um substituinte solubilizante exemplificativo é aquele que compreende um conector de óxido de polietileno, ligante reativo e fenila substituída por 2 sulfonatos, por exemplo, em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR. Consultar, por exemplo, os Compostos 10A a 14. Consultar, também, a Figura 10B. A amina de tal composto pode ser ligada a um ligante reativo, tal como um cloreto de ácido ou outro eletrófilo, por exemplo, gerado pela ativação de uma carboxila. Em algumas modalidades, um substituinte de solubilização tal como quaisquer um daqueles discutidos acima está ligado na posição R3 da Fórmula (I). Em algumas modalidades, um substituinte de solubilização tal como qualquer um daqueles discutidos acima está ligado na posição R4 da Fórmula (I).

6. USOS; MÉTODOS DE MARCAÇÃO E DE DETECÇÃO

[0364]Os compostos e conjugados de SiR fornecidos no presente documento podem ser usados em uma variedade de aplicações biológicas. Verificou-se que os compostos e conjugados de SiR têm propriedades inesperadas, incluindo brilho aumentado e fotoestabilidade sem sacrificar outras características. Constatou-se surpreendentemente que a conjugação dos compostos de SiR na posição R1 ou R2 não afetou adversamente as propriedades fotoquímicas dos compostos; em vez disso, o brilho e a fotoestabilidade aumentaram (consultar, por exemplo, os Compostos 4, 5 e 6).

[0365]Em algumas modalidades, os compostos de SiR fornecidos no presente documento podem ser usados para identificar ou marcar células, estruturas celulares, organelas, moléculas alvo e semelhantes. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para marcar ou identificar de células ou estruturas celulares, sendo que os métodos compreendem: a) colocar uma amostra que contém uma ou mais células ou estruturas celulares em contato com um composto de SiR da Fórmula (I) para formar uma amostra contatada; b) incubar a amostra contactada durante um período de tempo apropriado para formar uma amostra incubada; c) iluminar a amostra com um comprimento de onda apropriado para formar uma amostra iluminada; e d) detectar a emissão de fluorescência da amostra iluminada.

[0366]Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para detectar moléculas-alvo, sendo que os métodos compreendem: a) colocar uma amostra que contém, ou que é considerada como contendo, uma molécula-alvo em contato com um composto de SiR da Fórmula (I) para formar uma amostra contatada; b) incubar a amostra contactada durante um período de tempo apropriado para formar uma amostra incubada; c) iluminar a amostra com um comprimento de onda apropriado para formar uma amostra iluminada; e d) detectar a emissão de fluorescência da amostra iluminada, em que a emissão de fluorescência é usada para detectar a molécula-alvo.

[0367]Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para detectar uma estrutura biológica, sendo que os métodos compreendem: a) combinar uma amostra que contém, ou que é considerada como contendo, uma estrutura biológica específica com um composto de SiR da Fórmula (I), em que a dita estrutura biológica contém ácidos nucleicos; b) incubar a amostra combinada e o composto de SiR durante um tempo suficiente para que o composto de SiR seja combinado com os ácidos nucleicos na estrutura biológica a fim de formar um padrão de complexos de SiR-ácido nucleico que têm um sinal fluorescente detectável correspondente à estrutura biológica; e c) detectar o sinal fluorescente correspondente à estrutura biológica.

[0368]Em algumas modalidades, os compostos usados nos métodos fornecidos no presente documento são selecionados a partir de 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59 ou uma forma aberta ou espirolactona e/ou sal ou ácido livre dos mesmos.

[0369]Anticorpos Identificados. Em algumas modalidades, as porções químicas de SiR fornecidas no presente documento podem ser conjugadas a anticorpos, conforme descrito no presente documento, para fornecer o compostos da Fórmula (I) que compreendem um anticorpo. Desse modo, são fornecidos métodos para marcar ou detectar um antígeno ou células, componentes celulares, tecidos etc. que compreendem um antígenos, sendo que os métodos compreendem o colocar uma amostra suspeita de compreender o antígeno em contato com um composto da Fórmula (I) que compreende um anticorpo específico para o antígeno. Além disso, são fornecidos no presente documento métodos para marcar ou detectar um antígeno ou células, componentes celulares, tecidos etc. que compreendem um antígeno, sendo que os métodos compreendem colocar uma amostra suspeita de compreender o antígeno em contato com um anticorpo primário específico para o antígeno, e o contato do anticorpo primário com um composto da Fórmula (I) que compreende um anticorpo específico para o anticorpo primário (isto é, um anticorpo secundário identificado com uma porção química de SiR divulgada no presente documento). Usos correspondentes de tais compostos da Fórmula (I), tais como anticorpos primários ou secundários para marcar ou detectar um antígeno de interesse ou células, componentes celulares, tecidos etc. que compreende o antígeno também são fornecidos. Tais métodos e usos abrangem imunofluorescência, imuno-histoquímica, citometria de fluxo (por exemplo, FACS), Western blotting, fluorescência ELISA e qualquer outra abordagem em que anticorpos identificados com fluorescência podem ser usados.

[0370]Marcação Citoesquelática. Em algumas modalidades, as porções químicas de SiR da presente divulgação podem ser conjugadas a uma porção química de ligação a citoesqueleto, conforme descrito no presente documento, a fim de fornecer compostos da Fórmula (I) que compreendem uma porção química de ligação a citoesqueleto. Desse modo, são fornecidos métodos para marcar ou detectar um componente do citoesqueleto (por exemplo, actina ou microtúbulos) que compreende colocar uma amostra celular (por exemplo, que compreende células permeabilizadas e/ou fixas) em contato com um composto da Fórmula (I) que compreende uma porção química de ligação a citoesqueleto (por exemplo, uma porção química de ligação de actina ou microtúbulo, tal como qualquer uma dentre aquelas descritas no presente documento).

[0371]Marcação e detecção de ácido nucleico. Em algumas modalidades, as porções químicas de SiR da presente divulgação podem ser conjugadas a uma porção química de ligação a ácido nucleico, conforme descrito no presente documento, a fim de fornecer compostos da Fórmula (I) que compreendem uma porção química de ligação a ácido nucleico. Em algumas modalidades, as porções químicas de SiR da presente divulgação podem ser fixas a um polinucleotídeo ou a um nucleotídeo que é incorporado em um polinucleotídeo que pode, então, servir como um iniciador ou sonda identificada. Tais compostos podem ser combinados com uma amostra que contém, ou que é considerada como contendo, um polímero de ácido nucleico e, em seguida, a mistura de composto e amostra é incubada por um tempo suficiente para que o composto seja combinado com polímeros de ácido nucleico na amostra para formar um ou mais complexos composto-ácido nucleico com um sinal fluorescente detectável. O ácido nucleico pode ser DNA, por exemplo, dsDNA ou ssDNA. O ácido nucleico também pode ser RNA ou um híbrido de RNA-DNA. Os compostos podem ser usados para marcar ou detectar ácidos nucleicos em uma ampla variedade de amostras, tais como em soluções aquosas, reações de sequenciamento ou de amplificação, tais como PCR, amostras celulares (por exemplo, para FISH ou marcação geral nuclear ou cromossômica) e géis eletroforéticos. As pessoas versadas na técnica reconhecerão quando devem ser usados os compostos que compreendem porções químicas gerais de ligação a ácido nucleico ou a DNA e quando devem ser usadas sondas ou iniciadores que têm como alvo sequências específicas.

[0372]Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para marcar ácidos nucleicos, sendo que os métodos compreendem: combinar uma amostra que contém, ou é considerada como tendo, um ácido nucleico com um composto da Fórmula (I); e incubar a amostra e o composto por um tempo suficiente para que o composto seja combinado com o ácido nucleico na amostra para formar um ou mais complexos composto-ácido nucleico que fornecem um sinal fluorescente detectável. Em algumas modalidades, os compostos são selecionados a partir de 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 e 59, ou uma forma aberta ou espirolactona e/ou sal ou ácido livre dos mesmos.

[0373]Um polinucleotídeo-alvo pode ser detectado especificamente, por exemplo, com o uso de um composto de SiR descrito no presente documento com capacidade para se ligar especificamente ao polinucleotídeo-alvo e determinar se um complexo que compreende o polinucleotídeo-alvo e o composto de SiR foi formado, por exemplo, detectando-se a fluorescência do complexo ou detecção de uma mudança na fluorescência resultante da formação do complexo, opcionalmente em que a mudança na fluorescência resultante da formação do complexo é uma redução da extinção por um arrefecedor brusco devido à clivagem ou uma mudança conformacional.

[0374]As características do complexo composto de SiR-ácido nucleico, incluindo a presença, localização, intensidade, excitação e espectros de emissão, polarização de fluorescência, tempo de vida de fluorescência e outras propriedades físicas do sinal fluorescente podem ser usadas para detectar, diferenciar, classificar, quantificar e/ou analisar aspectos ou porções da amostra. Os compostos da divulgação são opcionalmente usados em combinação com um ou mais reagentes adicionais (por exemplo, reagentes fluorescentes detectavelmente diferentes), incluindo compostos da mesma classe com diferentes propriedades espectrais (consultar, por exemplo, a discussão de mudanças na emissão e corantes infravermelhos próximos em outro lugar no presente documento).

[0375]Além disso, são fornecidos métodos de sequenciamento de um polinucleotídeo com o uso de compostos de SiR divulgados no presente documento. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá as várias maneiras pelas quais porções químicas fluorescentes podem ser empregues em métodos de sequenciamento, por exemplo, como marcadores em iniciadores, nucleotídeos de terminação de cadeia, tais como didesoxinucleotídeos ou nucleotídeos de terminação reversível ou dinucleotídeos (consultar, por exemplo, Patente nº U.S. 8.017.338, Publicação PCT nº WO2008/037568 e a Patente nº U.S. 7.476.504 para discussões gerais de nucleotídeos terminadores reversíveis e dinucleotídeos). Podem ser usados métodos de sequenciamento em que um produto da reação de sequenciamento é separado antes da detecção, por exemplo, por eletroforese, tal como a eletroforese capilar. Alternativamente, métodos de sequenciamento nos quais os produtos são detectados in situ podem ser usados (consultar, por exemplo, os documentos citados acima).

[0376]Ensaios de células vivas/mortas. Determinadas modalidades fornecem um método, uso ou composição para marcar células e/ou avaliar a viabilidade celular, sendo compatível para uso, por exemplo, com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Tais métodos e usos podem compreender incubar uma célula ou mistura de células com um composto de SiR divulgado no presente documento; fornecer um estímulo à célula ou mistura de células para eliciar um sinal fluorescente; e medir o sinal fluorescente. Métodos e usos podem compreender adicionalmente quantificar a quantidade de células vivas e/ou mortas, por exemplo, determinando-se se o grau de fluorescência excede um limite predeterminado (indicando inviabilidade) ou agrupando-se os resultados em populações vivas e mortas (em que as populações de células mortas mostram uma extensão maior de marcação, dada sua integridade da membrana comprometida).

[0377]Em algumas modalidades, o composto de SiR da presente divulgação é entregue ou passa para células eucarióticas não viáveis, por exemplo, células de mamíferos, tais como células humanas. Quando as células são iluminadas com uma fonte de luz, as emissões de fluorescência podem ser coletadas, detectadas, analisadas ou medidas. As células no ensaio podem ser tratadas com uma substância ou reagente que induz a morte celular, por exemplo, camptotecina ou estaurosporina. Os dados podem ser adquiridos com o uso de qualquer aparelho de detecção de fluorescência apropriado, tal como um leitor de placas, microscópio de fluorescência ou citômetro de fluxo.

[0378]Em algumas modalidades, a célula ou mistura de células são incubadas com pelo menos uma, duas, três ou quatro moléculas fluorescentes adicionais, em que pelo menos uma, duas, três ou quatro moléculas fluorescentes adicionais são espectralmente distinguíveis do composto de acordo com a presente divulgação e os sinais fluorescentes são medidos a partir da medição da uma, duas, três ou quatro moléculas fluorescentes adicionais. A fluorescência de duas fontes é considerada espectralmente distinguível, caso os máximos de emissão sejam separados por pelo menos 30 nm ou caso a fluorescência das fontes possa ser distinguida com o uso de filtros ópticos, por exemplo, um par de filtros em que a fluorescência de pelo menos uma das moléculas é diferencialmente reduzida por pelo menos um dos filtros.

[0379]Em outra modalidade, pode ser conduzido o método de ensaio no qual as células estão contidas em uma pluralidade de recipientes. Em qualquer recipiente, as células podem ser de um tipo ou de diferentes tipos de células. As células podem ser do mesmo tipo cultivado em diferentes condições, por exemplo, na presença de meios diferentes. Algumas das células podem ser tratadas com um indutor de apoptose ou um inibidor de caspase. A pluralidade de recipientes, um arranjo, pode ser iluminada por uma fonte de luz, por exemplo, uma fonte de luz de varredura. As células podem ser do mesmo organismo ou de organismos diferentes.

[0380]Imageamento de super-resolução e microscopia; localização de molécula única. Em algumas modalidades, um composto descrito no presente documento é usado em imageamento ou microscopia de super-resolução. Para revisões de imagem de super-resolução e microscopia, consultar Huang et al., Annu Rev Biochem. 2009; 78: 993 a 1.016; Leung et al., Applied Spectroscopy 2011; 65: 967 a 980; e Schermelleh et al., J. Cell Biol. 2010; 190: 165 a 175. Em algumas modalidades, um composto descrito no presente documento é usado em microscopia de localização de molécula única (por exemplo, em células vivas). Para uma discussão detalhada sobre microscopia de localização de molécula única, consultar Patterson et al., Annu. Rev. Phys. Chem. 2010; 61: 345 a 367; Qu et al., Proc Natl Acad Sci EUA 2004; 101: 11.298 a 11.303; e Shtengel et al., Proc Natl Acad Sci EUA 2009; 106: 3.125 a 3.130. Em qualquer método ou uso, uma amostra pode ser colocada em contato com um composto descrito no presente documento (por exemplo, que compreende uma porção química de ligação a alvo) sob condições permissivas para a marcação da amostra ou de um componente de interesse da mesma com o composto. A amostra marcada pode, então, ser imageada de acordo com uma super- resolução ou localização de uma única molécula ou técnica de microscopia.

[0381]Solução de marcação. Em algumas modalidades, o composto de SiR da presente divulgação é preparado para uso dissolvendo-se o composto de SiR em uma solução de marcação, por exemplo, uma solução aquosa ou miscível em água que é compatível com a amostra e o uso destinado. Para amostras biológicas, em que a perturbação mínima da morfologia ou fisiologia celular é desejada, a solução de marcação é selecionada de modo correspondente. Para ensaios de solução, a solução de marcação em algumas modalidades não prejudica a conformação nativa do material-alvo que está sendo avaliado. Altas concentrações de solventes orgânicos, cátions e agentes oxidantes também reduzem de modo geral a fluorescência, assim como o detergente iônico dodecil sulfato de sódio (SDS) em concentrações ≥0,01%. Vários aditivos de solução de marcação, no entanto, não interferem com a fluorescência do complexo composto-ácido nucleico (por exemplo, ureia até 8 M; CsCl até 1 g/ml; formamida até 50% da solução; e sacarose até 40%). De modo geral, os compostos de SiR fornecidos no presente documento têm maior estabilidade em soluções tamponadas do que apenas em água; e agentes que reduzem os níveis de radicais livres de oxigênio, tais como β-mercaptoetanol, contribuem para a estabilidade dos compostos.

[0382]Uma solução de marcação pode ser feita dissolvendo-se o composto de SiR da presente divulgação diretamente em um solvente aquoso, tal como água, uma solução-tampão, tal como solução salina tamponada (em algumas modalidades não fosfato para algumas aplicações de discriminação de viabilidade), um tampão de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) (por exemplo, que contém EDTA) ou um solvente orgânico miscível em água, tal como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) ou um álcool inferior, tal como metanol ou etanol. O composto de SiR pode ser preliminarmente dissolvido em um solvente orgânico (em algumas modalidades DMSO a 100%) a uma concentração maior ou igual a cerca de 100 vezes a usada na solução de marcação, em seguida, pode ser diluído uma ou mais vezes com um solvente aquoso, tal como água ou tampão, de modo que o composto de SiR esteja presente em uma quantidade eficaz.

[0383]Uma quantidade eficaz de composto de SiR da presente divulgação é a quantidade suficiente para gerar uma resposta de fluorescência detectável em combinação com o material-alvo. A concentração do composto de SiR na solução deve ser suficiente para colocar o material-alvo na amostra e gerar um sinal detectável, porém uma quantidade muito grande do composto pode causar problemas com a fluorescência em segundo plano. A concentração e composição ideais da solução de marcação são determinadas pela natureza da amostra (incluindo propriedades físicas, biológicas, bioquímicas e fisiológicas), pela natureza da interação entre o composto de SiR e a amostra (incluindo a taxa de transporte do composto para o local de os ácidos nucleicos) e pela natureza da análise que está sendo realizada e podem ser determinadas de acordo com procedimentos padrão, tais como aqueles descritos nos exemplos abaixo.

[0384]Tipos de Amostra. O composto de SiR é combinado com uma amostra que contém, ou é suspeita de conter, um material biológico de interesse, por exemplo, célula (que pode ser de um tipo específico), antígeno, componente celular ou ácido nucleico.

[0385]A amostra é opcionalmente uma estrutura biológica (isto é, um organismo ou uma unidade discreta de um organismo), ou uma solução (incluindo soluções que contêm estruturas biológicas) ou um material sólido ou semissólido. Consequentemente, o material de amostra usado para praticar a divulgação é opcionalmente livre em solução, imobilizado em um material sólido ou semissólido, ou sobre o mesmo, extraído de uma estrutura biológica (por exemplo, de células lisadas, tecidos, organismos ou organelas) ou permanece encerrado dentro uma estrutura biológica. O material-alvo também pode ser encontrado no citosol de uma célula, no citoplasma de uma célula ou pode ser extracelular. Para que o alvo se ligue aos compostos de SiR, o alvo pode ser fornecido em um ambiente aquoso para entrar em contato com o composto de SiR, até mesmo se os ácidos nucleicos não estiverem incluídos em uma estrutura biológica.

[0386]A amostra pode ser natural ou sintética e pode ser obtida de uma ampla variedade de fontes. A presença do material-alvo na amostra pode ser devido a processos biológicos naturais ou a um resultado de uma síntese ou metodologia experimental bem ou mal sucedida, a uma contaminação indesejável ou a um estado de doença. O material-alvo pode ser endógeno em relação à fonte natural ou pode ser introduzido como material estranho, tal como por infecção, transfecção ou tratamento terapêutico. O material-alvo pode estar presente em toda uma amostra, ou apenas em parte da mesma, e a presença de material-alvo pode ser usada para distinguir amostras individuais ou diferenciar uma porção ou região dentro de uma única amostra ou identificar a amostra ou características da amostra.

[0387]Em algumas modalidades, a amostra que contém material-alvo é uma célula ou é uma solução aquosa ou miscível em água que é obtida diretamente de uma fonte líquida ou como uma lavagem de um material sólido (orgânico ou inorgânico) ou um meio de crescimento no qual as células foram introduzidas para cultura ou uma solução-tampão na qual o material-alvo foi colocado para avaliação. Quando o material-alvo está em células, as células são, opcionalmente, células únicas, incluindo microrganismos ou células múltiplas associadas a outras células em camadas bi ou tridimensionais, incluindo organismos multicelulares, embriões, tecidos, biópsias, filamentos, biofilmes etc. Alternativamente, a amostra é um sólido, opcionalmente, uma mancha ou raspagem, ou um retentado removido de um líquido ou vapor por meio de filtração. Em um aspecto da divulgação, a amostra é obtida de um fluido biológico, incluindo fluidos biológicos separados ou não filtrados, como urina, fluido cefalorraquidiano, sangue, fluidos linfáticos, homogenato de tecido, fluido intersticial, extratos celulares, muco, saliva, expectoração, fezes, secreções fisiológicas ou outros fluidos semelhantes. Alternativamente, a amostra é obtida de uma fonte ambiental, tal como solo, água ou ar; ou de uma fonte industrial,

como retirado de um fluxo de resíduos, uma fonte de água, uma linha de abastecimento ou um lote de produção. Fontes industriais também incluem meios de fermentação, tais como de um reator biológico ou processo de fermentação de alimentos, tais como a fabricação de cerveja; ou alimentos, como carne, ganho, produtos ou produtos lácteos.

[0388]Quando o material-alvo está presente em uma solução, a solução de amostra pode variar de um de material-alvo purificado ou sintético a misturas em bruto, como extratos celulares ou homogenatos ou outros fluidos biológicos ou soluções diluídas de fontes biológicas, industriais ou ambientais. Em alguns casos, é desejável separar o material-alvo de uma mistura de outras biomoléculas ou fluidos na solução antes da combinação com o composto. Há inúmeras técnicas para separação e purificação de vários materiais-alvo, tais como ácidos nucleicos, polipeptídeos, metabólitos, oligo e polissacarídeos, lipídios e combinações dos mesmos a partir de misturas geralmente brutas com outras moléculas biológicas. Isso inclui meios como técnicas cromatográficas e técnicas eletroforéticas, com o uso de uma variedade de suportes ou soluções ou em um fluxo contínuo. Alternativamente, misturas de biomoléculas podem ser tratadas com enzimas degradativas apropriadas (por exemplo, RNase, DNase e/ou protease) de modo que o material não alvo seja degradado e possa ser removido mais facilmente.

[0389]A fonte e o tipo de amostra, assim como o uso do composto de SiR, determinarão quais características do composto e, portanto, quais compostos de SiR, serão mais úteis para a marcação de uma amostra particular. Quando a fluorescência do composto é detectada com o uso de iluminação sustentada de alta intensidade (por exemplo, microscopia), os compostos de SiR com taxa de fotobranqueamento inferior aos compostos comumente usados (por exemplo, fluoresceína) são preferenciais, particularmente para uso em células vivas. A toxicidade relativamente baixa dos compostos para sistemas vivos geralmente permite o exame de ácidos nucleicos em amostras vivas com pouca ou nenhuma perturbação causada pelo próprio composto. Quando o composto deve penetrar nas membranas celulares ou em um gel, os compostos de SiR mais permeáveis são preferenciais, embora algumas células absorvam prontamente compostos que se mostram impermeáveis a outras células por meios diferentes da difusão passiva através das membranas celulares, por exemplo, por fagocitose ou outro tipos de ingestão. Os compostos que penetram rápida e prontamente nas células não necessariamente penetram rapidamente nos géis. Em aplicações que os ácidos nucleicos são marcados em um gel, o composto de SiR também é selecionado para ter uma alta afinidade de ligação (por exemplo, Kd ≥10-6 M); ao passo que em aplicações que o ácido nucleico será pré-marcado antes de passar por uma etapa de separação, como gel ou eletroforese capilar, é preferencial uma afinidade de ligação ainda mais alta (por exemplo, Kd ≥10-8 M) para garantir uma boa separação. Na marcação de ácidos nucleicos em solução, a alta afinidade de ligação é traduzida em maior sensibilidade a pequenas quantidades de ácido nucleico, porém os compostos com uma afinidade de ligação moderada (por exemplo, 10-6 M ≤ Kd ≤10-8 M) são mais eficazes em relação a uma faixa dinâmica maior. A fotoestabilidade, toxicidade, afinidade de ligação, rendimento quântico e intensificação da fluorescência de compostos de SiR são determinados de acordo com métodos padrão conhecidos na técnica.

[0390]Reagentes Adicionais. Os compostos de SiR da presente divulgação podem ser usados em combinação com um ou mais reagentes adicionais que são detectáveis separadamente.

Os reagentes adicionais podem ser detectáveis separadamente caso sejam usados separadamente, por exemplo, usados para marcar diferentes alíquotas da mesma amostra ou caso marquem diferentes partes ou componentes de uma amostra, independentemente de o sinal dos reagentes adicionais ser detectavelmente diferente do fluorescente sinal do complexo composto-ácido nucleico.

Alternativamente, o composto de SiR da divulgação é selecionado para gerar uma resposta detectável que é diferente daquela de outros reagentes cujo uso é desejado em combinação com os compostos de SiR.

Em algumas modalidades, o reagente ou reagentes adicionais são fluorescentes e têm propriedades espectrais diferentes daquelas do complexo composto-ácido nucleico.

Por exemplo, os compostos de SiR descritos no presente documento podem ser usados em combinação com anticorpos fluorescentes comumente usados, tais como aqueles marcados com isotiocianato de fluoresceína ou ficoeritrina.

Qualquer sistema de detecção de fluorescência (incluindo inspeção visual) pode ser usado para detectar diferenças nas propriedades espectrais entre compostos, com diferentes níveis de sensibilidade.

Essas diferenças incluem, porém sem limitação, uma diferença nos máximos de excitação, uma diferença nos máximos de emissão, uma diferença nos tempos de vida de fluorescência, uma diferença na intensidade de emissão de fluorescência no mesmo comprimento de onda de excitação ou em um comprimento de onda diferente, uma diferença na absortividade, uma diferença na polarização de fluorescência, uma diferença no aumento da fluorescência em combinação com materiais-alvo ou combinações dos mesmos.

O composto detectavelmente diferente é opcionalmente um dos compostos de SiR da divulgação que têm diferentes propriedades espectrais e diferentes seletividade. Em um aspecto da divulgação, o complexo composto-ácido nucleico e os reagentes de detecção adicionais têm os espectros de excitação ou iguais sobrepostos, porém possuem espectros de emissão visivelmente diferentes, por exemplo, tendo máximos de emissão separados por ≥10 nm, ≥20 nm ou ≥ 50 nm. A excitação simultânea de todos os reagentes fluorescentes pode exigir a excitação da amostra em um comprimento de onda que seja subideal para cada reagente individualmente, porém ideal para a combinação de reagentes. Alternativamente, o reagente adicional (ou reagentes adicionais) pode ser excitado simultânea ou sequencialmente em um comprimento de onda que é diferente daquele usado para excitar o complexo composto-ácido nucleico em questão.

[0391]Os compostos adicionais são usados opcionalmente para diferenciar amostras biológicas, por exemplo, que contêm células ou seus componentes, de acordo com o tamanho, forma, estado metabólico, condição fisiológica, genótipo ou outros parâmetros biológicos ou combinações dos mesmos. O reagente adicional é opcionalmente seletivo para uma característica particular da amostra para uso em combinação com um reagente não seletivo para a mesma característica ou é seletivo para uma característica da amostra para uso em combinação com um reagente que é seletivo para outra característica da amostra. Em um aspecto da divulgação, o composto ou compostos adicionais são metabolizados de maneira intracelular para gerar um produto fluorescente no interior de determinadas células, porém não no interior de outras células, de modo que a resposta de fluorescência do composto de cianina da divulgação predomine apenas quando tal processo metabólico não esteja ocorrendo. Alternativamente, o composto ou compostos adicionais são específicos para algum componente externo da célula, tal como proteínas ou receptores de superfície celular, por exemplo, lectinas fluorescentes ou anticorpos. Ainda em outro aspecto da divulgação, o composto ou compostos adicionais atravessam ativamente ou passivamente a membrana celular e são usados para indicar a integridade ou funcionamento da membrana celular (por exemplo, calceína AM ou BCECF AM). Em outro aspecto, os reagentes adicionais se ligam seletivamente a ácidos nucleicos ricos em AT e são usados para indicar bandas cromossômicas. Em outro aspecto da divulgação, o reagente adicional é uma marcação de organela, isto é, uma marcação que é seletiva para uma organela particular, por exemplo, o reagente adicional (ou reagentes adicionais) pode ser selecionado para potencial absorção sensível na mitocôndria (por exemplo, rodamina 123 ou tetrametil rosamina) ou para absorção devido ao gradiente de pH em uma organela de uma célula viva (por exemplo, Diwu, et al., CYTOMETRY supp.7, página 77, Resumo 426B (1994)).

[0392]Os compostos adicionais são adicionados à amostra que é analisada como presente em uma quantidade eficaz, com a concentração ótima de composto determinada por procedimentos padrão geralmente conhecidos na técnica. Cada composto é opcionalmente preparado em uma solução separada ou combinado em uma solução, dependendo do uso destinado. Após a iluminação das células tingidas em um comprimento de onda adequado, como acima, as células são analisadas de acordo com sua resposta de fluorescência à iluminação. Além disso, a resposta de fluorescência diferencial pode ser usada como base para classificar as células ou ácidos nucleicos para análise ou experimentação posterior. Por exemplo, todas as células que "sobrevivem" a um determinado procedimento são classificadas ou todas as células de um determinado tipo em uma amostra são classificadas. As células podem ser classificadas manualmente ou com o uso de uma técnica automatizada, tal como citometria de fluxo, de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tais como na Patente nº 4.665.024 de Mansour, et al. (1987).

7. KITS

[0393]Em outro aspecto, são fornecidos kits que compreendem um composto de SiR divulgado no presente documento (que pode ser, porém não necessariamente é, um conjugado divulgado no presente documento) e um ou mais outros reagentes. Qualquer modalidade de um composto de SiR descrito no presente documento pode ser fornecida em um kit. Em algumas modalidades, pelo menos um reagente adicional descrito acima está incluído em um kit com um composto de acordo com esta divulgação. Em determinadas modalidades, os kits compreendem adicionalmente um ou mais dentre os seguintes: um agente tampão, um meio de purificação ou um frasco que compreende uma amostra. Em algumas modalidades, um kit compreende adicionalmente um agente citotóxico, indutor de apoptose, células, um solvente ou um dessecante. Os kits também podem incluir reagentes úteis para conduzir os métodos da divulgação, por exemplo, métodos de conjugação, métodos de ensaio ou métodos sintéticos. Como um exemplo do último, um composto que compreende um grupo vinila pode ser fornecido com reagentes para realizar uma reação de tiol-eno para derivatizar o composto com um substituinte; ou um composto que compreende um ligante reativo, tal como um éster NHS ou outro ligante reativo descrito no presente documento, pode ser dotado de reagentes para realizar uma reação de substituição nucleofílica para derivatizar o composto com um substituinte. Em algumas modalidades, os kits compreendem pelo menos um dentre um solvente orgânico e um dessecante. Em algumas modalidades, o solvente é DMSO. Em algumas modalidades, os kits compreendem adicionalmente pelo menos uma substância adicional, tal como um solvente, tampão, estabilizador, agente de ajuste de pH etc. Em algumas modalidades, o kit compreende adicionalmente um reagente antidesvanescimento.

[0394]O kit também pode incluir células eucarióticas. Em algumas modalidades, o kit é compatível para uso com citometria de fluxo. Em algumas modalidades, o kit é compatível para uso com microscopia de fluorescência. Em algumas modalidades, o kit compreende reagentes para conjugar um composto a um anticorpo.

[0395]Em algumas modalidades, o composto de SiR no kit é conjugado a um anticorpo, que pode, por exemplo, ser adequado para uso como um anticorpo secundário (por exemplo, um anticorpo de uma primeira espécie, tal como coelho ou cabra, específico para um anticorpo de uma segunda espécie, tal como humano, camundongo ou coelho, em que a segunda espécie difere da primeira espécie).

[0396]Em algumas modalidades, o kit é compatível para uso com uma reação de síntese de ácido nucleico, por exemplo, uma reação de amplificação, como PCR, qPCR ou rtPCR ou sequenciamento de DNA. Esses kits podem compreender NTPs ou dNTPs, uma polimerase e um ou mais iniciadores. Pelo menos um dentre os NTPs/dNTPs ou iniciadores pode ser identificado com um composto divulgado no presente documento, ou o kit pode compreender adicionalmente uma sonda marcada com um composto divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, tal sonda identificada compreende adicionalmente um arrefecedor brusco ou parceiro de transferência de energia para a porção química de silício-rodamina, por exemplo, que pode tornar a sonda adequada para uso em ensaios que envolvem degradação, clivagem ou mudanças conformacionais de uma sonda que muda (por exemplo, aumenta) fluorescência pela porção química de SiR, tais como ensaios TaqMan ou ensaios que usam sondas de feixe molecular.

[0397]Em determinadas modalidades, os kits divulgados no presente documento compreendem um ou mais dos compostos descritos no presente documento e um ou mais recipientes nos quais o um ou mais compostos devem ser armazenados. O kit contém opcionalmente instruções sobre como preparar o um ou mais compostos ou como preparar uma composição que contém o um ou mais compostos de SiR e como administrar o composto ou composição que contém o composto. Em determinadas modalidades, o kit compreende instruções para realizar um método divulgado no presente documento. Em determinadas modalidades, o método é um método in vitro. O kit pode compreender adicionalmente uma ou mais peças de equipamento para entregar o composto de SiR ou a composição que contém o composto incluindo, porém sem limitação, seringas, pipetas, lâmpadas de pipeta, espátulas, frascos, agulhas de seringa e várias combinações dos mesmos.

8. MÉTODOS PREPARATIVOS PARA COMPOSTOS DE SIR E

INTERMEDIÁRIOS RELACIONADOS

[0398]São fornecidos métodos para preparar compostos da Fórmula (I), incluindo os Compostos 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58 e 59 descritos no presente documento. Além disso, são fornecidos métodos para preparar intermediários sintéticos úteis para preparar compostos de fórmula (I).

[0399]Muitos corantes de SiR funcionalizados foram sintetizados modificando-se a porção química de xanteno para diferentes aplicações biológicas, especialmente para imagem de super-resolução e direcionamento intracelular. No entanto, a modificação da porção química de xanteno geralmente resulta em mudanças significativas nas propriedades fotofísicas do corante, tais como comprimentos de onda de absorção e emissão, rendimento quântico e fotoestabilidade. Por esse motivo, no presente documento é fornecida uma nova estratégia sintética para introduzir grupo funcional ou reativo (ou grupos funcionas ou reativos) aos compostos de corante de SiR no silício de posição 10. Especificamente, um ou mais grupos vinila são introduzidos na posição 10 para formar corantes de SiR monovinílicos e bis-vinílicos que podem ser posteriormente derivatizados por reação de tiol-eno para introduzir grupo funcional ou reativo (ou grupos funcionais ou reativos). No método sintético fornecido no presente documento, não há Si-xantona intermediária envolvida (consultar as Figuras 2B e 2E).

[0400]Além disso, a maioria dos procedimentos sintéticos atuais para fazer derivados de SiR usam reagentes extremamente perigosos (por exemplo, terc-butilituna, sec-butil-lítio, cloreto de tionila e HCl a 6 N), assim como precisam de etapas sintéticas longas e trabalhosas. Em contrapartida, a abordagem sintética fornecida no presente documento precisa de apenas duas etapas para produzir a estrutura de núcleo de SiR principal, seguida por uma reação de tiol- eno final que fornece um conector, denominado no presente documento de

"conector de ácido EtilSulfurPropiônico" ou "conector ESP", que pode ser acoplado a vários ligantes para organelas-alvo (consultar as Figuras 2B a 2E). Os compostos de SiR da presente divulgação que compreendem esse conector ESP têm propriedades inesperadas, incluindo brilho aumentado e fotoestabilidade.

[0401]Além disso, uma reação de tiol-eno com o metilvinil-SiR (Composto 1) pode fornecer ligantes de diferentes comprimentos em uma faixa de 4 a 12 átomos. A proximidade do fluoróforo aos ligantes alvo é importante na concepção de sondas fluorescentes de células vivas SiR

[0402]As fórmulas P1a, P1b, P2 e P2a, que representam precursores úteis ou intermediários sintéticos para a preparação de compostos da Fórmula (I), são mostradas abaixo. Compostos exemplificativos e etapas de acordo com essa rota são mostrados nas Figuras 2B a 2E.

[0403]Em suma, em uma primeira rota sintética, descrita do fim ao início, um composto da Fórmula (I) pode ser preparado a partir de um composto da Fórmula (P2) e um composto da Fórmula (P2a). Um composto da Fórmula (P2a) pode ser preparado por métodos conhecidos. Um composto da Fórmula (P2) pode ser preparado a partir de compostos das Fórmulas (P1a) e (P1b) (que podem ser iguais ou diferentes) e SiCl2R1R2. Todo os compostos da Fórmula (P1a) e (P1b) e SiCl2R1R2 podem ser preparados por métodos conhecidos.

[0404]Em algumas modalidades, é fornecido um método para preparar um composto da Fórmula (I) que compreende reagir um composto da Fórmula (P2)

(P2) com um composto da Fórmula (P2a) (P2a) na presença de CuBr2 a uma temperatura acima de 100 ºC, em que R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1 e RN2 têm valores descritos no presente documento, desse modo, produzindo um composto da Fórmula (I).

[0405]Em algumas modalidades, é fornecido um método para preparar um composto da Fórmula (P2): (P2), sendo que o método compreende reagir os compostos da Fórmula (P1a) (P1a) e da Fórmula (P1b)

(P1b) com uma base de organolítio, tal como butil-lítio, e em seguida com SiCl2R1R2, em que R1, R2, R5, R6, R7, R8, RN1 e RN2 têm valores descritos no presente documento. Um método com o uso de um composto da Fórmula (P2) pode também compreender preparar o composto da Fórmula (P2), conforme estabelecido acima.

[0406]As vias sintéticas para determinados compostos da Fórmula (I) compreendem adicionalmente etapas adicionais, por exemplo, em que os substituintes desejados são menos compatíveis com as etapas que levam a um composto inicial da Fórmula (I).

[0407]Por exemplo, R1 e/ou R2 podem ser uma vinila no composto inicial da Fórmula (I) e pode ser, então, derivatizado por meio de uma reação de tiol- eno e, opcionalmente, etapas adicionais para fornecer outros valores de R1 e/ou R2 descrito no presente documento. Uma reação de tiol-eno pode compreender reagir um tiol, por exemplo, HS-conector-Z, em que Z é um grupo reativo, por exemplo, um grupo reativo descrito no presente documento como uma carboxila ou amina, com um composto da Fórmula (I) em que R1 e/ou R2 é vinila para fornecer um composto da Formula (I) na qual R1 e/ou R2 é ligado ao grupo reativo Z. Z pode ser usado para submeter o composto à derivatização adicional, por exemplo, a fim de fornecer um conjugado a uma porção química de ligação a alvo, por exemplo, uma porção química de ligação a alvo descrita no presente documento, tal como uma porção química de ligação a ácido nucleico, uma porção química de ligação a citoesqueleto etc. Consultar, por exemplo, os

Compostos 4 a 6, entre outros.

[0408]Alternativa ou adicionalmente, R3 ou R4 podem ser uma carboxila no composto inicial da Fórmula (I) e, em seguida, podem ser submetidos adicionalmente à derivatização, por exemplo, para fornecer um conector e um ligante reativo ou porção química de ligação a alvo. Por exemplo, a carboxila pode ser convertida em um cloreto de acila com POCl3 e, em seguida, ainda substituído com o uso de química conhecida (por exemplo, que compreende a substituição nucleofílica do cloreto) para obter compostos como os Compostos 7 e 7B (consultar a Figura 2E).

[0409]Detalhes adicionais e etapas opcionais úteis para fornecer vários compostos da Fórmula (I) são descritos ao longo do presente documento, por exemplo, nas Figuras, nos Exemplos e na descrição de conjugados, ligantes reativos, fosforamiditos, nucleotídeos e nucleosídeos e porções químicas para aumentar a solubilidade acima.

EXEMPLOS

[0410]Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determinadas modalidades divulgadas e não devem ser interpretados como limitativos do escopo da presente divulgação de modo algum. EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS SÍNTESE DE 3,3'-(METIL(VINIL)SILANODI-IL)BIS(N,N- DIMETILANILINA)

[0411]A um frasco de fundo redondo com três gargalos de 1 l bem seco foi adicionada 3-bromo-N,N-dimetilanilina (25 g, 125,0 mmol). O THF (300 ml) foi transferido para o frasco. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente a -78 ºC e mantida sob temperatura durante 30 min. Foi adicionado n-BuLi (59,8 ml de n-BuLi 2,3 M em hexanos, 137 mmol) a um funil adicional e adicionado à mistura de reação por gotejamento durante 45 min. Após agitação durante 1 h sob a mesma temperatura, foi adicionado metilvinildiclorosilano (10,61 ml, 81,2 mmol) à mistura de reação a -78 ºC. O banho de gelo seco foi removido para aumentar a temperatura até a temperatura ambiente (RT), e agitação adicional por 90 minutos à RT. A mistura de reação foi extinta com água, e a maior parte do THF foi removida com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi diluído com EtOAc (150 ml), e a camada aquosa extraída com EtOAc (2 X 150 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (Hex:EtOAc = 9:1) a fim de gerar a 3,3'-(metil(vinil)silanodi-il)bis(N,N- dimetilanilina) (12,6 g, 65%). SÍNTESE DO COMPOSTO 1

[0412]A um vaso de pressão de 75 ml foram adicionados 3,3'- (metil(vinil)silanodi-il)bis(N,N-dimetilanilina) (3,8 g, 12,24 mmol), 2- carboxibenzaldeído (3,67 g, 24,48 mmol) e CuBr2 (273 mg, 1,22 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 3 horas a 120 ºC. Após resfriamento até a temperatura ambiente, o produto bruto azul intenso foi diluído em CHCl3 (150 ml) e água (150 ml). A camada aquosa foi ainda extraída com CHCl3 (100 ml x 2), e a camada orgânica combinada foi transferida para um funil de separação. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (Hex:EtOAc = 9:1) a fim de gerar o Composto 1 (890 mg, 17%). SÍNTESE DO COMPOSTO 2

[0413]A um frasco de quartzo de 250 ml que contém o Composto 1 (400 mg, 0,91 mmol) foram adicionados ácido 3-mercptopropiônico (154 mg, 1,45 mmol), DMPA (58 mg, 0,23 mmol) e THF (20 ml). O frasco foi conectado a um balão de argônio. A reação foi iluminada com luz ultravioleta de comprimento de onda longo durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação de fotólise foi concentrada com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 9:1) a fim de fornecer o Composto 2 (350 mg, 71%) e Composto 3 (46 mg, 9%). SÍNTESE DO COMPOSTO 2A

[0414]A um frasco que contém o Composto 2 (330 mg, 0,6 mmol) foram adicionados DMF (10 ml), trietilamina (252 µl, 1,81 mmol) e TSTU (363 mg, 1,21 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1,5 hora à RT. O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 9:1) a fim de gerar o Composto 2A (243 mg, 62%). SÍNTESE DO COMPOSTO 4

[0415]A uma solução de 2′-(4-hidroxifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-2,5′- bi(1H-benzimidazol) (28 mg, 66,0 µmol) em DMF (2 ml) foram adicionados K2CO3 (25 mg, 0,18 mmol) e brometo de 4-(Boc-amino)butila (21,6 mg, 85,7 mmol), e a mistura de reação foi aquecida a 60 ºC durante 24 horas. O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 3:1) para gerar um intermediário (15 mg, 38%).

[0416]20% de TFA em DCM (1,0 ml) foi adicionado ao intermediário (14 mg, 23,5 µmol) e agitado durante 15 minutos à temperatura ambiente. O solvente foi removido com o uso de um rotavapor para gerar o intermediário desprotegido com Boc. A uma solução do Composto 2A (12 mg, 18,6 µmol) em DMF (2,0 ml) foram adicionados DIEA (12 mg, 93,2 µmol) e o intermediário desprotegido com Boc em DMF (1,0 ml), e a reação foi agitada durante 2 horas sob RT. O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por meio de Biotage em coluna C-18 (MeOH/H2O, 0% a 95% de gradiente) a fim de gerar o Composto 4 (10,5 mg, 44%).

[0417]O Composto 4 pode existir como uma mistura de dois diastereômeros devido ao centro estéreo no átomo de silício e espiro- lactonização. Durante a purificação por Biotage C-18, dois diastereômeros (Composto 4B e Composto 4C) foram isolados. Um diastereômero correu mais lentamente em TLC do que o Composto 4C, então, esse diastereômero é denominado nas figuras de "inferior", e o Composto 4C é denominado de “superior”. No entanto, a Requerente observa que essa designação é arbitrária uma vez que a configuração dos dois diaestereômeros foi atribuída. SÍNTESE DO COMPOSTO 5

[0418]A uma solução do Composto 2A (200 mg, 0,31 mmol) em DMSO(8 ml) foi adicionada uma solução de ácido 6-amino-hexanoico (61 mg, 0,47 mmol) e DIEA (120 mg, 0,93 mmol) em DMSO/ H2O (1:1, 8 ml), e agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. O produto bruto foi purificado por Biotage em coluna C-18 (MeOH/H2O, 0% a 95% de gradiente) para gerar um intermediário (80 mg).

[0419]Docetaxel (117 mg, 0,15 mmol) foi dissolvido em ácido fórmico (3,0 ml), agitado durante 20 minutos, e o solvente foi removido para gerar 3'-

aminodocetaxel. A uma solução do intermediário (80 mg, 0,12 mmol), DIEA (73 mg, 0,61 mmol) e PyAOP (95 mg, 0,18 mmol) em DMF (4 ml) foi adicionado o 3'- aminodocetaxel em DMF (2 ml). O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 9:1) a fim de gerar o Composto 5 (65 mg, 15%).

[0420]Cada diaestereômero do Composto 5 foi isolado durante a purificação final por cromatografia em coluna. O Composto 5B correu mais lentamente em TLC do que o Composto 5C, então, esse diasterômero é denominado nas figuras de “inferior" e o Composto 5C é denominado de “superior". No entanto, a configuração correta de dois diastereômeros ainda não foi atribuída. SÍNTESE DO COMPOSTO 6

[0421]2,2,2-trifluoroacetato de (4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-indol-3- il)metil)-10-(4-aminobutil)-4-(4-hidroxifenil)-8,13,15,19-tetrametil-1-oxa-5,8,11- triazaciclononadec-15-eno-2,6,9,12-tetraona1 (2,0 mg, 2,5 µmol,) foi dissolvido em 0,3 ml de DMF seco, contendo N,N-di-isopropil-N-etilamina (3,3 mg, 0,025 mmol.). Composto 2A (2,5 mg, 3,8 µmol.) foi dissolvido em 0,1 ml de clorofórmio e adicionado a uma solução de peptídeo. A solução foi mantida à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida, evaporada até secura. O resíduo foi purificado em uma placa de TCL reforçada com alumínio com o uso de uma mistura de CHCl3/MeOH (10:1). A dobra do produto foi cortada da placa de TLC e extraída várias vezes com mistura de CHCl3-MeOH. O extrato combinado foi filtrado, e o solvente foi evaporado para fornecer o Composto 6 (2,0 mg, 66%).

[0422]Milroy, Lech-Gustav et al., “Selective Chemical Imaging of Static Actin in Live Cells” J. Am. Chem. Soc., volume 134, 4 de abril de 2012, páginas

8.480 a 8.486.

[0423]O Composto 6A foi sintetizado de acordo com o esquema de reação mostrado abaixo.

SÍNTESE DO COMPOSTO 6A

[0424]A uma solução de 2A (100 mg, 0,155 mmol) em DMF (1,5 ml) foi adicionada uma solução de ácido amino-PEG4 (43 mg, 0,17 mmol) em água DI (0,5 ml) e DIEA (60 mg, 0,47 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 30 minutos e removeu o solvente. O produto bruto foi purificado por meio de Biotage em coluna C-18 (MeOH/H2O, 0% a 80% de gradiente) para gerar um intermediário (50 mg, 40%).

[0425]A uma solução do intermediário (61 mg, 76,20 µmol), DIEA (41 mg, 0,32 mmol) e PyAOP (50 mg, 0,095 mmol) em DMF (2 ml) foi adicionado o 2,2,2-trifluoroacetato de (4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-indol-3-il)metil)-10-(4- aminobutil)-4-(4-hydroxyphenil)-8,13,15,19-tetrametil-1-oxa-5,8,11- triazaciclononadec-15-eno-2,6,9,12-tetraona (50 mg, 63,5 µmol). A mistura de reação foi agitada durante 30 minutos à RT, e o solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por meio de Biotage em coluna C-18 (MeOH/H2O, 0% a 90% de gradiente) para gerar o Composto 6A (51 mg, 55%).

[0426]Cada diasterômero do Composto 6A foi isolado durante a purificação final por cromatografia em coluna. O Composto 6A-A correu mais lentamente em TLC do que o Composto 6A-B, então, esse diasterômero é denominado nas Figuras de "ESP-PEG4-A" e o Composto 6A-B é denominado de "ESP-PEG4-B". No entanto, a configuração correta dos dois diastereômeros ainda não foi atribuída. O Composto 6B que contém um conector PEG12 foi preparado de acordo com o procedimento acima. SÍNTESE DO COMPOSTO 6B

[0427]A síntese do Composto 6C é mostrada abaixo. SÍNTESE DO COMPOSTO 6C

[0428]O Composto 6C que contém um conector C6 foi preparado de acordo com o procedimento para produzir o Composto 6 descrito acima. SÍNTESE DE 3,3'-(DIMETILSILANODI-IL)BIS(N,N-DIMETILANILINA)

[0429]A um frasco de fundo redondo de três gargalos de 500 ml bem seco foram adicionados 3-bromo-N,N-dimetilanilina (6,01 g, 30,0 mmol) e THF (60 ml). A mistura de reação foi arrefecida bruscamente a -78 ºC e mantida à temperatura durante 30 minutos. n-BuLi (12,0 ml de n-BuLi 2,5 M em hexanos, 30,0 mmol) foi adicionado à mistura de reação por gotejamento com o uso de uma seringa durante 5 minutos a -78 ºC. Após agitação durante 30 minutos à mesma temperatura, dimetildiclorossilano (1,51 ml, 12,5 mmol) foi adicionado à mistura de reação a -78 ºC. O banho de gelo seco foi removido para aumentar a temperatura até a temperatura ambiente, e a agitação adicional durante 90 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reação foi extinta com solução saturada de NH4Cl e diluída com água DI (60 ml). A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 60 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (100 ml), seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (Hex:EtOAc = 9:1) para gerar 3,3'-(dimetilsilanodi-il)bis(N,N-dimetilanilina) (2,92 g, 65%). SÍNTESE DE 2-(7-(DIMETILAMINO)-3-(DIMETILIMINIO)-5,5-DIMETIL- 3,5-DI-HIDRODIBENZO[B,E]SILIN-10-IL)BENZOATO

[0430]A um vaso de pressão de 75 ml foram adicionados 3,3'- (metil(vinil)silanodi-il)bis(N,N-dimetilanilina) (2,8 g, 9,38 mmol), 2- carboxibenzaldeído (4,23 g, 28,14 mmol) e CuBr2 (210 mg, 0,94 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 3 horas a 120 ºC. Após o arrefecimento brusco até a RT, o produto bruto azul intenso foi dissolvido em CHCl3 (100 ml), e lavado com NaOH 2 N (120 ml). A camada aquosa foi extraída, também, com CHCl3 (60 ml X 2), a camada orgânica combinada foi transferida a um funil de separação. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (Hex:EtOAc = 9:1) para gerar 2-(7-(dimetilamino)-3-(dimetiliminio)-5,5- dimetil-3,5-di-hidrodibenzo[b,e] silin-10-il)benzoato (828 mg, 21%). SÍNTESE DO COMPOSTO 7A

[0431]A uma solução de 2-(7-(dimetilamino)-3-(dimetiliminio)-5,5-dimetil- 3,5-di-hidrodibenzo[b,e]silin-10-il)benzoato (300 mg, 0,70 mmol) em 1,2- dicloroetano (4 ml) foi adicionado POCl3 (1,96 ml, 21,0 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 4 horas. O material volátil foi removido no evaporador rotativo sob vácuo para gerar o produto bruto acilado.

[0432]Cloridrato de Piperidina-4-carboxilato de terc-butila (186 mg, 0,84 mmol) e DCM/MeCN (1:1, 14 ml) foram adicionados ao frasco que contém o produto bruto acilado acima. A essa solução foi adicionada trietilamina (1,95 ml, 14,0 mmol) a 0 ºC e agitada adicionalmente durante 15 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi purificado por Biotage em coluna C-18 (Di-água (0,1% TFA)/acetonitrila (0,1% TFA), gradiente de 0 a 95%) para gerar o composto éster (287 mg).

[0433]50% de TFA em DCM foi adicionado ao composto de éster e agitado durante 2 horas. O material volátil foi removido por um rotavapor, e o produto bruto foi purificado por Biotage em coluna C-18 (Di-água (0,1% TFA)/acetonitrila (0,1% TFA), gradiente de 0 a 95%) para gerar o Composto 7A (188 mg, 41% ao longo de 3 etapas). SÍNTESE DO COMPOSTO 7B

[0434]Uma solução de 4-[6-(4- metil-1-piperazinil)-1H-benzimidazol-2-il]- 2-benzenodiamina (50 mg, 0,16 mmol) e 4-hidroxi-3-nitrobenzaldeído (39 mg, 0,23 mmol) em AcOH (5,0 ml) foi aquecido a 130 ºC durante 3 horas. O solvente foi removido com o uso de um rotavapor. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 3:1) a fim de fornecer o Intermediário 1 (22 mg, 18%).

[0435]O intermediário 1 (20 mg, 42,6 µmol), brometo de 4-(Boc- amino)butil(14 mg, 55,4 µmol) e K2CO3 (15,9 mg, 0,12 mmol) foram dissolvidos em DMF (1 ml). A mistura de reação foi agitada durante 5 horas. O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (CHCl3:MeOH = 4:1) a fim de fornecer o Intermediário 2 (8 mg, 29%).

[0436]Uma solução de Intermediário 2 (4,4 mg, 6,87 µmol) em 30% de TFA em DCM (1 ml) foi agitada durante 10 minutos. O solvente foi removido com o uso de um rotavapor. A uma solução do Composto 7A (5,0 mg, 8,7 µmol) em DMF (1,0 ml) foram adicionados PyAOP (5,4 mg, 10,3 µmol) e DIEA (4,4 mg. 34,3 µmol). Após 5 minutos de agitação à temperatura ambiente, o intermediário desprotegido em DMF (1,0 ml) foi adicionado à solução acima. A mistura de reação foi agitada durante 2 horas à RT. O solvente foi removido com o uso de uma bomba de alto vácuo por meio de evaporação rotativa. O produto bruto foi purificado por Biotage em coluna C-18 (Di-água (0,1% TFA)/aceconitrila (0,1% TFA), gradiente de 0 a 95%) para gerar Composto 7B (5,5 mg, 53%). EXEMPLO 2. MARCAÇÃO NUCLEAR

[0437]A fim de demonstrar a aplicabilidade de materiais fluorescentes à base do Composto 2, um corante nuclear de célula viva foi sintetizado incorporando-se uma porção química Hoechst no sítio de ligação de corante ESP. Inesperadamente, as sondas à base do Composto 2 aprimoraram consideravelmente o brilho do fluoróforo sem sacrificar outras propriedades desejadas.

[0438]A intensidade de fluorescência do Composto 4 foi comparada com SiR-Hoechst (Espirocromo, Suíça) com o uso de microscopia de fluorescência. As células HeLa vivas foram marcadas com SiR-Hoechst ou com o Composto 4 a 1 µM ou 2 µM durante 30 minutos a 37 ºC. Após a lavagem com tampão LCIS para remover o excesso do corante, as imagens de 5 réplicas foram coletadas com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência e analisadas com o uso do software HCS Studio. Imagens representativas de células são mostradas nas Figuras 3A a 3B (manchadas com SiR-Hoechst) e as Figuras 3C a 3D (manchadas com o Composto 4). A Figura 3E mostra um gráfico de barras que compara a intensidade do sinal nuclear de células marcadas com SiR- Hoechst e com o Composto 4. A intensidade média do sinal nuclear foi 48% maior nas células marcadas com Composto 4 do que nas células marcadas com SiR-Hoechst, com base na média das razões entre intensidade e fluorescência a 1 µM e 2 µM. EXEMPLO 3. MARCAÇÃO CITOESQUELÉTICA

[0439]A fim de demonstrar ainda mais a aplicabilidade de materiais fluorescentes à base de Composto 2, uma sonda de tubulina também foi feita com o uso de um ligante de direcionamento, docetaxel. Inesperadamente, as sondas à base do Composto 2 aprimoraram consideravelmente o brilho do fluoróforo sem sacrificar outras propriedades desejadas. A intensidade de fluorescência do Composto 5 (uma sonda de tubulina com o uso de docetaxel como a porção química de ligação a alvo) foi comparada a SiR-Taxol (Spirochrome, Suíça). As células HeLa vivas foram marcadas com 0,5 µM de Composto 5 ou SiR-Taxol durante 30 minutos a 37 ºC e preparadas para imageamento. As imagens são mostradas nas Figuras 4A a 4B (marcadas com Composto 5), e as Figuras 4C a 4D (marcadas com SiR-Taxol). As células marcadas com o Composto 5 mostraram um sinal mais brilhante do que as células marcadas com SiR-Taxol. EXEMPLO 4. COLORAÇÃO NUCLEAR EM CÉLULAS VIVAS E FIXAS E FOTOESTABILIDADE DO COMPOSTO 7

[0440]Os derivados de SiR existem em equilíbrio por meio do grupo 2'- carboxila no anel fenila entre uma espirolactona não fluorescente e um zwitterion fluorescente. A forma de espirolactona é uma forma predominante que permite a permeabilidade das células SiR. Para produzir um corante de SiR impermeável às células, uma amina secundária volumosa, como piperidina, foi incorporada ao grupo 2'-carboxila, evitando assim a espirolactonização e resultando em corantes de SiR sempre fluorescentes ou "ligados”. O Composto 7A foi sintetizado e acoplado com Hoechst para fazer o Composto 7 ou com nitroHoechst para produzir o Composto 7B (Figura 2E).

[0441]A intensidade de fluorescência e fotoestabilidade do Composto 7 foram comparadas com TO-PRO-3, uma marcação de ácido nucleico de células fixas com fluorescência vermelho extremo. As células HeLa fixas foram marcadas com 1 µM de Composto 7 ou TO-PRO-3 durante 30 minutos à temperatura ambiente e preparadas para geração de imagens com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência. Conforme mostrado na Figura 5C, a marcação do Composto 7 foi inesperadamente mais brilhante que a marcação TO-PRO-3 mostrada na Figura 5A. O Composto 7 reteve, também, a fluorescência substancial, conforme mostrado na Figura 5D, após uma exposição de 1 minuto à luz de excitação, ao passo que a marcação de TO-PRO- 3 diminuiu mais, conforme mostrado na Figura 5B.

[0442]Devido ao fato de que o corante Hoechst é fluorescente no canal azul, há uma possibilidade de vazamento no canal azul dos corantes de SiR conjugados a Hoechst. A adição de um grupo nitro à porção química de Hoescht resultando no Composto 7B, o vazamento foi surpreendentemente reduzido em cerca de 50% no canal DAPI. Além disso, o sinal no canal Cy5 foi surpreendentemente aumentado em cerca de 12%.

[0443]As células HeLa foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5 k/poço e deixadas de um dia para o outro (o/n) na incubadora de CO2. Em seguida, as células foram fixadas com formaldeído e permeabilizadas com detergente. Em seguida, as células foram marcadas com concentração final de 0,5 μM do Composto 7 ou Composto 7B. Em seguida, as células foram lavadas e fotografadas em um instrumento de imageamento de alto conteúdo CellInsight CX5. As Figuras 6A a 6D mostram que o Composto 7B é mais brilhante que o Composto 7 quando visualizado no canal Cy5 (Figura 6A e 6C, respectivamente) e mostram menos vazamento no canal DAPI (Figuras 6B e 6D, respectivamente). A Figura 6E mostra que o sinal de fluorescência do Composto 7B aumentou 12% no canal Cy5 quando comparado ao Composto 7 (consultar a Figura 6E, nº 3 e nº 1, respectivamente), e o sinal de fluorescência do Composto 7B diminuiu surpreendentemente em 50% no canal DAPI quando comparado ao Composto 7 (Figura 6E, nº 4 e nº 2, respectivamente). EXEMPLO 5. FOTOESTABILIDADE DO COMPOSTO 10B

[0444]A fixação de um conector solúvel em água a compostos de SiR da presente divulgação aumenta sua solubilidade em água, o que é útil para identificar o anticorpo e outras aplicações. Os corantes de SiR solúveis em água da presente divulgação e seus conjugados foram extremamente fotoestáveis em comparação aos conjugados AlexaFluor 647.

[0445]As células Hela foram colocadas em lâminas e marcadas com 50 µM de Composto 10B ou ALEXA FLUOR™ 647 DYE (“AF647”, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) durante 60 minutos a 25 ºC. As lâminas foram montadas com PROLONG™ Diamond ("PLD", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ou VECTASHIELDTM (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para reduzir fotodegradação e deslizamento de cobertura. A Figura 7B mostra como cada amostra foi criada e como, para cada amostra, as regiões de interesse dentro de 3 campos de visão foram selecionadas para digitalização. Cada região foi submetida à varredura 50 vezes com um microscópio confocal com o uso do laser de 633 nm e, em seguida, fotografada. O AF647 e o VECTASHIELD foram completamente fotobranqueados (dados não mostrados). Conforme mostrado na Figura 7A, a porcentagem de fluorescência restante após 50 varreduras em amostras marcadas com Composto 10B foi maior que nas amostras marcadas com AF647, independentemente do meio de montagem usado. EXEMPLO 6. CARACTERÍSTICAS DE FLUORESCÊNCIA DOS

COMPOSTOS DE SIR DIVULGADOS

[0446]As características de fluorescência de vários compostos divulgados e do corante ALEXA FLUOR™647 (AF647) dissolvidas em água (apenas corante) ou como conjugados de IgG de cabra anticamundongo (GAM) dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram determinadas. Três repetições foram realizadas para determinar os máximos de excitação e emissão e rendimento quântico. O rendimento quântico foi medido apenas para as amostras de corante. Os dados são apresentados na Tabela 3 (ND = não determinado). Tabela 3: Máximo de Excitação e de Emissão dos compostos dissolvidos em água apenas ou como conjugados de IgG de GAM dissolvidos em PBS Conjugado de IgG de GAM Tingir apenas em água em PBS Comp Rendiment Abs. Máxima Em. Máxima Abs. Máxima Em. Máxima osto o quântico (nm) (nm) (nm) (nm) 2A ND ND ND 664 683 10A/B 0,41 666 678 667 688 8 ND ND ND 664 684 12 0,45 661 673 662 681

Tabela 3: Máximo de Excitação e de Emissão dos compostos dissolvidos em água apenas ou como conjugados de IgG de GAM dissolvidos em PBS Conjugado de IgG de GAM Tingir apenas em água em PBS Comp Rendiment Abs. Máxima Em. Máxima Abs. Máxima Em. Máxima osto o quântico (nm) (nm) (nm) (nm) 11 0,38 670 683 671 693 14 ND ND ND 665 685 13 0,5 630 642 635 655 AF647 0,32 650 675 651 673

[0447]Determinados compostos foram testados quando dissolvidos em solventes. Três repetições foram realizadas para determinar os máximos de excitação e emissão. Os dados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4: Excitação e emissões máximas de compostos dissolvidos em solventes Composto Abs. Máxima (nm) Em. Máxima (nm) Solvente 7A 657 682 MeOH 5 650 676 MeOH/HCl 7 672 678 TE EXEMPLO 7. FOSFORAMIDITAS DE SIR DE EMISSÃO DE

INFRAVERMELHO PRÓXIMO E POLINUCLEOTÍDEOS MARCADOS

[0448]A substituição de silila geralmente fornece aos corantes de rodamina um desvio espectral de 75 nm em direção ao vermelho. Para a síntese de nucleotídeos marcados e polinucleotídeos (por exemplo, iniciadores e sondas) que emitem acima de 650 nm, a substituição de silila é incorporada em fosforamiditas de dicloro-rodamina a fim de criar os Compostos 51 a 54. Os máximos de emissão calculados são mostrados abaixo na Tabela 5.

Tabela 5. Máxima de emissão calculada de fosforamiditas de SiR Composto Calculada Emissão máxima (nm) Composto 51 656 Composto 52 678 Composto 53 693 Composto 54 711

[0449]A geração de um iniciador marcado com FAM e SiR com o uso do Composto 54-Fosforamidita e FAM Fosforamidita é ilustrada na Figura 8. O Composto 54 (e compostos semelhantes) pode ser usado para automatizar a síntese de estruturas multicromóforo para uso em ensaios FRET. A geração de um iniciador marcado com FAM e uma porção química de SiR a partir de um éster NHS do Composto 59 é ilustrada na Figura 9. EXEMPLO 8. MARCAÇÕES DE CÉLULAS FIXAS; CONJUGAÇÃO DE

ANTICORPOS

[0450]Os compostos de SiR existem em equilíbrio entre a forma zwitteriônica (aberta) e a forma espiro (fechada), conforme observado ao longo do presente documento. A ligação de uma porção química de ligação a alvo à sua sonda até o alvo do ligante, como células fixas ou anticorpo, pode favorecer a forma aberta mais fluorescente, ao passo que as sondas de SiR livres e não ligadas podem existir principalmente na forma fechada, por exemplo, estabilizado por agregação hidrofóbica reversível.

[0451]As vias que fornecem compostos de SiR que podem ser usados para diferentes aplicações são mostradas nas Figuras 10A a 10B. A preparação de um composto de SiR com capacidade para colorir células fixas é mostrada na Figura 10A.

[0452]Uma vez que alguns corantes de SiR podem não ser suficientemente solúveis em água para alguns usos sem funcionalidades solubilizantes, um conector solúvel em água pode ser fixado a um SiR para facilitar a conjugação, tal como identificação de anticorpo. Um substituinte solubilizante exemplificativo é aquele que compreende um conector de óxido de polietileno, ligante reativo e fenila substituída por 2 sulfonatos, por exemplo, em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR. Consultar, por exemplo, os Compostos 10A a 14. Uma rota sintética exemplificativa para um SiR solúvel em água para identificação de anticorpo é mostrada na Figura 10B.

[0453]A solubilidade em água dos compostos de SiR fornecidos no presente documento também pode ser aumentada adicionando-se um ou mais grupos sulfonato. Consultar, por exemplo, Composto 8. EXEMPLO 9. EFEITO DAS SUBSTITUIÇÕES E CONJUGAÇÃO NAS CARACTERÍSTICAS DE FLUORESCÊNCIA DOS COMPOSTOS DE SiR

[0454]Os experimentos foram realizados para se examinar o efeito de diferentes padrões de substituição de SiR nos máximos de absorção com o uso dos Compostos 10A, 11, 12 e 13. Um dentre ou ambos os grupos vinila do Composto 11 são substituídos por metila nos Compostos 10A e 12,

respectivamente. No Composto 13, um grupo metila em cada uma das duas aminas exocíclicas foi eliminado com relação ao Composto 12. Verificou-se que os máximos de absorção deslocaram aproximadamente 5 nm para azul quando cada grupo vinila foi alterado para metila. Um deslocamento de 30 nm foi observado quando um grupo metila em cada uma das duas aminas exocíclicas foi eliminado (Tabela 6). Portanto, a modificação de corantes de SiR com o uso de grupos ligados à porção química de SiR através do Si tem um efeito menor que a remoção de grupos metila. Tabela 6: Máximo de Excitação e Emissão de compostos dissolvidos apenas em água ou como conjugados de IgG dissolvidos em PBS Si, Si-Divinil- Si-vinil-Si- Si, Si-dimetil- Si, Si- AF647 N, N- metil-N, N- N, N- dimetil-N, tetrametil- tetrametil- tetrametil- N-dimetil- SiR (11) SiR (10A) SiR (12) SiR (13) Absorção em 670 nm 666 nm 661 nm 630 nm 650 água (λabs) nm Emissão em 683 nm 678 nm 673 nm 642 nm 670 água (λem) nm Rendimento 38% 41% 45% 50% 32% Quântico Absorção de 671 nm 668 nm 664 nm 635 nm 650 Conjugados de nm IgG Emissão de 692 nm 688 nm 683 nm 655 nm conjugados de IgG

[0455]O efeito da conjugação de um SiR, nesse exemplo, os Compostos 8, 10A e 12, a IgG nos máximos de absorbância (mostrada na Figura 11A) e de emissão (mostrada na Figura 11B) foi comparada à IgG-AF647. Os máximos de absorção e de emissão dos conjugados SiR (665 nm/690 nm) foram deslocados aproximadamente para o vermelho aproximadamente 20 nm em comparação ao conjugado AF647. O máximo de emissão deslocou 15 nm para o vermelho. Esse deslocamento resultou em menos sinal que o AF647 com o uso de um filtro Cy5.

[0456]As células HeLa foram colocadas em placas a uma densidade de 7,5 k/poço em uma placa de 96 poços e deixadas em uma incubadora de CO2 de um para o outro. As células foram tratadas com etoposido a 50 µM. Em seguida, as células foram lavadas 3X com PBS e as células fixadas em formaldeído a 4% durante 15 minutos. As células foram lavadas 3X com PBS e depois permeabilizadas com Triton X-100 a 0,25% em PBS durante 15 minutos. As células foram lavadas 3X com PBS e, em seguida, bloqueadas em BSA a 1% em PBS durante 1 hora. As células foram lavadas 1X com PBS e, em seguida, incubadas com anticorpo primário diluído de 1 a 1.000 (Enzo, ADI-KAM-CC255- F). As células foram lavadas 3X com PBS e, em seguida, com marcador de anticorpo secundário com AF647 (DOL 4,9) ou o Composto 10A (DOL 5,4) conjugado a 5 µg/ml por 1 hora. As células foram lavadas 3X com PBS e contrastadas com DAPI. Imagem obtida no instrumento Thermo Fisher Scientific Cellomics ArrayScan VTI. A análise/representação dos dados foi realizada no Prism.

[0457]A intensidade de fluorescência de conjugados SiR, Composto 10A (DOL = 15) e Composto 10A (DOL = 10), em que DOL é o grau de identificação, foi comparada a um conjugado AF647 com o uso de microscopia de fluorescência. Células de camundongo vivas foram marcadas com antitubulina de camundongo conjugado com AF647 (mostrado na Figura 12A), ou antitubulina de camundongo conjugado com Composto 10A (DOL = 15 mostrado na Figura 12B) em concentrações crescentes durante 60 minutos a 25 ºC. Após lavagem com tampão PBS para remover o excesso de corante, as imagens foram coletadas com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência e analisadas com o uso de software integrado. Imagens de células são mostradas nas Figuras 12A a 12B. A Figura 12C mostra um gráfico que compara a fluorescência versus a concentração do reagente secundário marcado. Os corantes SiR forneceram às imagens dímeros com 6 a 8 dobras que AF647 no canal Cy5, consistentes com os máximos deslocados discutidos acima. Os conjugados de corante de SiR mostraram boa especificidade para o alvo e nenhuma fluorescência fora do alvo ou de em segundo plano foi observada. Pouco ou nenhum fotobranqueamento foi observado durante a imagem.

[0458]A intensidade de fluorescência e fotoestabilidade de conjugados de SiR de cabra anticamundongo (GAM) produzidos a partir dos Compostos 13 e 14 (estruturas mostradas na Figura 1G) foram comparadas a AF647.

[0459]As células A549 foram colocadas em placa a uma densidade de

5.000 células por poço em placas de 96 poços Greiner e deixadas aderir de um dia para o outro. No dia seguinte, foram tratadas durante duas horas a 37 ºC com etoposido 50 µM para induzir a fosforilação de pH2AX para sondagem de anticorpos, em seguida, fixadas durante 20 minutos à temperatura ambiente em PFA a 4%, preparadas em PBS. Após a fixação, as células foram enxaguadas 3X em PBS e permeabilizadas durante 20 minutos com Triton X-100 0,1%, preparado em PBS. Após o tratamento com Triton, as células foram lavadas 3X em PBS e colocadas em solução de bloqueio, produzida com BSA a 3% em PBS. Cada placa foi tratada com anticorpo primário, preparado em solução de bloqueio a 5 µg/ml, seja à temperatura ambiente por uma hora a 4 ºC. Após a incubação com o anticorpo primário, as células foram lavadas 3X em PBS e armazenadas em solução de bloqueio antes da sondagem com o anticorpo secundário. O anticorpo secundário marcado com Composto 13 (DOL 4,7); o Composto 14 (DOL 4,0) ou AF647 (DOL 4,9) foi preparado a partir de 5 µg/ml em solução de bloqueio e as células foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente antes de lavar 3X em PBS e mover as placas para o CX-5 CellInsight para quantificação do sinal. Os dados do sinal fluorescente foram coletados a cada segundo durante o período superior a 700 segundos. A análise/representação dos dados foi realizada no Prism.

[0460]A intensidade de fluorescência foi monitorada em amostras montadas sem meio antidesvanescimento durante um período de aproximadamente 12 minutos de exposição à luz de excitação. Conforme mostrado na Figura 13, ambos os compostos 13 e 14 foram muito mais resistentes ao fotobranqueamento ao longo do tempo em comparação a AF647. EXEMPLO 10. CORANTES DE SiR FLUORESCENTES DE

INFRAVERMELHO PRÓXIMO

[0461]Corantes de SiR fluorescentes de infravermelho próximo, incluindo os Compostos 18, 20, 22, 24 e 26 (mostrados na Figura 1I), os Compostos 28, 29, 30, 31 e 32 (mostrados na Figura 1J), os Compostos 45 e 46 (mostrado na Figura 1M), e os Compostos 47, 48, 49 e 50 (mostrados na Figura 1N) são sintetizados e testados para os máximos de emissão. Verificou-se que os máximos de emissão são deslocados em direção aos comprimentos de onda do vermelho em relação a compostos tais como o Composto 1. EXEMPLO 11. ANÁLISE DE ÁCIDO NUCLEICO

[0462]Os Compostos de SiR-fosforamidita, tais como os Compostos 51 a 54, são usados em reações de síntese de polinucleotídeos para fornecer iniciadores e sondas marcadas com fluorescência. Os iniciadores e sondas são usados em reações de amplificação e sequenciamento para fornecer identificação e/ou detecção de produtos de reação.

[0463]Os Compostos 51 a 54 podem ser usados na síntese quimicamente automatizada de polinucleotídeos com o uso de síntese de suporte sólido para fornecer iniciadores e sondas marcados com fluorescência

[0464]Os produtos da reação de sequenciamento podem ser resolvidos por eletroforese capilar e detectados.

[0465]Os produtos da reação de amplificação podem ser detectados em tempo real com o uso de sondas duplas (por exemplo, que compreende um parceiro de transferência de energia, por exemplo, arrefecedor brusco, tal como TaqManTM ou sondas de feixe molecular) que resultam em fluorescência dependente de produto através de clivagem dependente de hibridização ou mudanças conformacionais. EXEMPLO 12. COLORAÇÃO NUCLEAR COM ISÔMEROS DE ESP- SiR

[0466]A fim de demonstrar a aplicabilidade de diferentes diasterômeros de materiais fluorescentes à base de Composto 2 (etilsulfopropil- siliconrodamina, ESP-SiR), um corante nuclear de célula viva foi sintetizado incorporando-se uma porção química de Hoechst no sítio de ligação do corante ESP-SiR. Inesperadamente, uma sonda preparada com o uso de um dos dois isômeros (Composto 4B) aprimorou consideravelmente o brilho do fluoróforo sem sacrificar outras propriedades desejadas.

[0467]A intensidade de fluorescência de cada isômero do Composto 4 (Composto 4B e Composto 4C) foi comparada com o uso de microscopia de fluorescência. Uma solução-mãe de DMSO (1 mM) foi usada para preparar soluções de cada isômero para uma concentração final de 5, 2,5, 1,25 e 0,6 µM em PBS que contém probenecida.

[0468]As células HeLa ou A549 vivas foram marcadas com cada concentração de isômero durante 30 minutos a 37 ºC. Após lavagem com tampão LCIS para remover o excesso de corante, as imagens de 5 réplicas foram coletadas com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência e analisadas com o uso do software HCS Studio. A Figura 14 mostra a intensidade do sinal nuclear de células marcadas com Composto 4B e 4C. A intensidade média do sinal nuclear foi quase 2 vezes maior em ambos os tipos de células marcadas com Composto 4B do que nas células marcadas com Composto 4C em cada uma das concentrações testadas.

[0469]A intensidade de fluorescência do Composto 4B e 4C foi comparada com SiR-Hoechst (Spirochrome, Suíça) com o uso de microscopia de fluorescência. As células HeLa vivas foram marcadas com SiR-Hoechst ou com o Composto 4B ou 4C a 1 µM durante 30 minutos a 37 ºC. Após lavagem com tampão LCIS para remover o excesso de corante, as imagens de 5 réplicas foram coletadas com o uso dos canais Cy5 e DAPI de um microscópio de fluorescência e analisados com o uso do software HCS Studio. A Figura 15 mostra gráficos de barras comparando-se a intensidade do sinal nuclear de células marcadas com SiR-Hoechst e com o Composto 4B e 4C. O Composto 4B exibiu maior intensidade de sinal em comparação ao corante de SiR da Spirochrome (Suíça) no canal Cy5, ao passo que quase nenhum sinal foi observado no canal DAPI para todos os três compostos. EXEMPLO 13. COLORAÇÃO DE TUBULINA COM ISÔMEROS ESP-

SiR

[0470]A fim de demonstrar ainda mais a aplicabilidade de materiais fluorescentes à base de Composto 2, uma sonda de tubulina (Composto 5) também foi feita com o uso de um ligante de direcionamento, docetaxel. Inesperadamente, uma sonda (Composto 5A) preparada com o uso de um dentre os diastereômeros do Composto 2 aprimorou consideravelmente o brilho do fluoróforo sem sacrificar outras propriedades desejadas. A intensidade de fluorescência de dois diasterômeros do Composto 5 e uma mistura de dois isômeros foi comparada a SiR-Taxol (Spirochrome, Suíça). As células HeLa vivas foram marcadas com 0,5 µM de cada composto durante 30 minutos a 37 ºC e preparadas para imagiologia. A Figura 16 mostra um gráfico de barras que compara as intensidades de sinal de cada composto testado e uma mistura de diasterômeros. O Composto 5A (vermelho Taxol (B)); ponto inferior em TLC) se liga muito melhor à tubulina em comparação ao Composto 5B (vermelho Taxol (A) ponto superior em TLC), uma mistura de A e B e o composto SiR-Taxol da Spirochrome. EXEMPLO 14. EFEITO DE LIGANTES NA MARCAÇÃO CELULAR DE ISÔMEROS DE ESP-SiR

[0471]A fim de demonstrar ainda mais o desempenho de materiais fluorescentes à base de Composto 2, uma sonda de actina foi sintetizada com o uso de um peptídeo cíclico como a porção química de ligação a alvo. Inesperadamente, as sondas à base do Composto 2 (Composto 6) aprimoraram consideravelmente o brilho do fluoróforo sem sacrificar outras propriedades desejadas. A intensidade de fluorescência do Composto 6 foi comparada a SiR- Actina (Spirochrome, Suíça).

[0472]Os derivados do Composto 6 foram testados para comparar o efeito do tipo de conector na eficácia da de marcação celular. Os derivados que incluem um conector PEG4 ou PEG12 foram comparados ao Composto 6 incluindo um conector C6 (Conector-X); um conjugado de sonda de actina sem nenhum conector; e SiR-Actina (Spirochrome, Suíça). As células HeLa vivas foram marcadas com 1 µM de cada composto durante 30 minutos a 37 ºC e preparadas para imagiologia, conforme descrito no presente documento. As células HeLa ou A549 vivas foram marcadas com cada concentração de isômero durante 30 minutos a 37 ºC. Após lavagem com tampão LCIS para remover o excesso de corante, as imagens de 5 réplicas foram coletadas com o uso do canal Cy5 de um microscópio de fluorescência e analisadas com o uso do software HCS Studio. A Figura 17A e Figura 17B mostram gráficos de barras que comparam a intensidade média do sinal e a intensidade de sinal em relação ao segundo plano (S/B) para cada composto testado, respectivamente. De modo geral, o derivado do Composto 6 com o conector PEG4 exibiu o segundo plano mais baixo (S/B mais alta) e a marcação mais uniforme em ambas as células vivas e fixas, ao passo que o PEG12 exibiu segundo plano visivelmente mais alto e marcação irregular.

[0473]O efeito de diferentes isômeros do Composto 6-PEG4 na marcação com actina também foi testado. As células HeLa vivas foram marcadas com 1 µM de cada composto durante 30 minutos a 37 ºC e preparadas para imagiologia, conforme descrito acima. A Figura 18A mostra um gráfico de barras que compara a intensidade média do sinal, Composto 6A-A (ESP-PEG4-A), Composto 6A-B (ESP-PEG4-B), uma mistura do Composto 6A-A e 6A-B isolados (antes de separação de isômero) e uma combinação dos dois isômeros separados do Composto 6A-A e 6A-B.

A intensidade do sinal foi comparada com células marcadas com SiR-Actina (Spirochrome). A Figura 18B mostra um gráfico de barras que compara a relação sinal-segundo plano para cada um dos compostos testados.

O Composto 6A-A é aproximadamente três vezes mais brilhante que o Composto 6A-B, embora os dois compartilhem a mesma especificidade de localização.

Claims (142)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto da fórmula (I): R4 R9 R3

E R5 R6 (RN1)2N Si N(RN2)2 R1 R2 R7 R8 (I) CARACTERIZADO pelo fato de que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, um porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R3 é -COOH, SO3-, H, R3a, -L1-RA ou -L1-RB1; R3a é , ou -C(O)N(RN3)(RN4); RN3 é H, metila, C2-6 alquila ou -CH2-A em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um grupo polar ou carregado; RN4 é -L1-RA ou -L¹-RB1 ou -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2, 3, 4, 5 ou 6;

R3b é -OH ou -N(RN5)-L3a-RB; cada L3a é independentemente um conector; RB é um ligante reativo ou uma porção química de ligação a alvo; RN5 é H, metila ou C2-6 alquila; R4 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; E é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R9 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; cada RN1 é independentemente H, metila, C2-4 alquila, C(O)R13, -C(O)R13 ou forma um anel com R5 ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, C(O)R10, -C(O)R13 ou forma um anel com R6 ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo;

R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ representa um grupo acetila, AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo e AM é acetoximetila; adicionalmente, em que (i) R2 não é metila ou C2-6 alquila, caso R1 seja metila ou C2-6 alquila, OR (ii) R3 é R3a ou -L¹-RB1; ou uma forma de espirolactona e/ou sal do mesmo.

2. Método para preparar um composto da Fórmula (P2):

(P2), sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende reagir os compostos da fórmula P1a

(P1a) e P1b

(P1b) com uma base de organo-lítio e, em seguida, com SiCl2R1R2, em que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, um porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1;

R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; cada RN1 é independentemente H, metila, C2-4 alquila, C(O)R13, -C(O)R13 ou forma um anel com R5 ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, C(O)R10, -C(O)R13 ou forma um anel com R6 ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo; R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ representa um grupo acetila, AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo e AM é acetoximetila; desse modo, produzindo o composto da Fórmula (P2).

3. Método para preparar um composto da Fórmula (I) R4 R9 R3

E R5 R6 (RN1) 2N Si N(RN2) 2 R1 R2 R7 R8 (I) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende reagir um composto da Fórmula (P2)

(P2) com um composto da Fórmula (P2a)

(P2a) na presença de CuBr2 a uma temperatura acima de 100 ºC, em que: R1 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; R2 é metila, C2-6 alquila, vinila, vinila substituída, -L1-RA ou -L1-RB1; ou R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados; cada L1 é independentemente um conector; cada RA é, independentemente, um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, um porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; cada RB1 é independentemente um ligante reativo, uma funcionalidade de solubilização, uma porção química de ligação a alvo ou uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; R3 é -COOH, SO3-, H, R3a, -L1-RA ou -L1-RB1;

R3a é , ou -C(O)N(RN3)(RN4); RN3 é H, metila, C2-6 alquila ou -CH2-A em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um grupo polar ou carregado; RN4 é -L1-RA ou -L¹-RB1 ou -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 2, 3, 4, 5 ou 6;

R3b é -OH ou -N(RN5)-L3a-RB; cada L3a é independentemente um conector; RB é um ligante reativo ou uma porção química de ligação a alvo; RN5 é H, metila ou C2-6 alquila; R4 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; E é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; R5 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R6 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R7 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN1; R8 é H, metila ou C2-6 alquila ou forma um anel com um RN2; R9 é SO3-, metila, cloro, C2-6 alquila ou H; cada RN1 é independentemente H, metila, C2-4 alquila, C(O)R13, -C(O)R13 ou forma um anel com R5 ou R7; cada RN2 é, independentemente, H, metila, C2-4 alquila, C(O)R10, -C(O)R13 ou forma um anel com R6 ou R8; R10 é -C(O)-CF3 ou -O-CH2-A1 em que A1 é uma arila ou heteroarila opcionalmente substituída por pelo menos um R11; R11 é metila, C2-6 alquila ou -OR12; e R12 é H, metila, acetila (Ac), acetoximetila (AM), -PO32-, -PO3(AM)2 ou um glicosídeo;

R13 é em que R15 é um oligopeptídeo ou -OR’ em que R’ representa um grupo acetila, AM, PO32-, PO3(AM)2 ou um glicosídeo e AM é acetoximetila; adicionalmente, em que (i) R2 não é metila ou C2-6 alquila, caso R1 seja metila ou C2-6 alquila, OR (ii) R3 é R3a ou -L¹-RB1; desse modo, produzindo o composto da Fórmula (I).

4. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é vinila ou vinila substituída.

5. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é vinila.

6. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é vinila substituída com metila ou C2-6 alquila.

7. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 formam um anel junto do silício ao qual estão ligados.

8. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anel é um anel saturado.

9. Composto ou método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anel é um anel com 5, 6 ou 7 membros.

10. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anel é não substituído.

11. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é -L¹-RA.

12. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que RA é -COOH.

13. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que RA é , éster NHS ou éster succinimidílico (SE), carboxila, carboxiléster, maleimida, amida, éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP), éster acetoximetílico (AM), ácido nitrilotriacético, (NTA) aminodextrano e ciclo-octilina-amina.

14. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que RA é uma funcionalidade de solubilização.

15. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a funcionalidade de solubilização compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de óxido de etileno.

16. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que RA compreende uma fosforamidita.

17. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 11 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é -L¹-RB1.

18. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que RB1 compreende uma porção química de ligação a ácido nucleico.

19. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que RB1 compreende uma porção química de ligação a citoesqueleto.

20. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que RB1 compreende , , ou

, em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, opcionalmente por meio de um conector.

21. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que RB1 compreende um anticorpo.

22. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L1 é independentemente - (CH2)s-XL3a-, em que s é independentemente 2, 3, 4, 5 ou 6; cada X é independentemente CH2, S, S(O)ou S(O)2; e cada L3a é independentemente -(CH2)p- em que p é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

23. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que s é 2.

24. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, CARACTERIZADO pelo fato de que X é S.

25. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, CARACTERIZADO pelo fato de que X é S(O).

26. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 2.

27. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 3.

28. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 4, 5 ou 6.

29. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é -COOH.

30. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é SO3-.

31. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é H.

32. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é R3a.

33. Composto ou método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que R3a é -C(O)N(RN3)(RN4).

34. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que RN3 é metila.

35. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que RN3 é -CH2-A, em que A é um grupo arila ou heteroarila substituída por pelo menos dois grupos polares ou carregados.

36. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 33 ou 35, CARACTERIZADO pelo fato de que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos um -OH, -NH2, -COOH, -NO2 ou -SO3-.

37. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 33, 35 ou 36, CARACTERIZADO pelo fato de que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos dois grupos que são independentemente -OH, -NH2, - COOH, -NO2 ou -SO3-.

38. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que RN3 é -CH2-A, em que A é uma arila ou heteroarila substituída por pelo menos dois -SO3-.

39. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 ou 35 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que A é uma arila substituída.

40. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que RN4 é –(CH2)3-RB, opcionalmente em que o RB de RN4 é -COOH.

41. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é

2.

42. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é

3.

43. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que RN4 é –(CH2CH2O)q-C(O)O-RB em que q é 4, 5 ou 6.

44. Composto ou método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que R3a é .

45. Composto ou método de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que R3b é N(RN5)-L3a-RB.

46. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que RN5 é H.

47. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que RN5 é metila.

48. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que R3b é -OH.

49. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que R3a é .

50. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 2.

51. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é -(CH2)p- em que p é 3.

52. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que cada L3a é independentemente -(CH2)p- em que p é 4, 5 ou 6.

53. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende um ligante reativo, opcionalmente, em que o ligante reativo é um carboxila, amina ou éster ativo, ainda opcionalmente em que o éster ativo é um éster NHS ou éster succinimidílico (SE), éster carboxílico, éster sulfodiclorofenílico (SDP), éster sulfotetrafluorofenílico (STP), éster tetrafluorofenílico (TFP), éster pentafluorofenílico (PFP) e éster acetoximetílico (AM).

54. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende uma fosforamidita.

55. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende uma porção química de ligação a ácido nucleico.

56. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende uma porção química de ligação a citoesqueleto.

57. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende , , ou

, em que a linha ondulada indica a conexão à porção química de SiR, opcionalmente por meio de um conector.

58. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que RB compreende um anticorpo.

59. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 é SO3-.

60. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 é H.

61. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que E e R9 são, cada um, cloro.

62. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, CARACTERIZADO pelo fato de que E é H.

63. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é H.

64. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é metila.

65. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 forma um anel com um RN1.

66. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R6 é H.

67. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, CARACTERIZADO pelo fato de que R6 é metila.

68. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, CARACTERIZADO pelo fato de que R6 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN2.

69. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 é H.

70. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 é metila.

71. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN1.

72. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 é H.

73. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 é metila.

74. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 forma um anel de 5 ou 6 membros com um RN2.

75. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN1 é H.

76. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN1 é H.

77. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN1 é C(O)OR10.

78. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62 ou 65 a 77, CARACTERIZADO pelo fato de que um RN1 forma um anel com 5 ou 6 membros com R5.

79. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68 ou 71 a 78, CARACTERIZADO pelo fato de que um RN1 forma um anel com 5 ou 6 membros com R7.

80. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN2 é H.

81. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN2 é metila.

82. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN2 é C2-4 alquila.

83. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN2 é C(O)OR10.

84. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que um RN2 forma um anel de 5 ou 6 membros com R6.

85. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65 ou 68 a 84, CARACTERIZADO pelo fato de que um RN2 forma um anel com 5 ou 6 membros com R8.

86. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72 ou 75 a 85, CARACTERIZADO pelo fato de que R10 é -CH2-A1, em que A1 é uma arila opcionalmente substituída por pelo menos um R11.

87. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R11 é metila.

88. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, CARACTERIZADO pelo fato de que R11 é -OR12.

89. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86 ou 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é H.

90. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é metila.

91. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é acetila (Ac).

92. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é acetoximetila (AM).

93. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é -PO32-.

94. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é -PO3(AM)2.

95. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é um glicosídeo.

96. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que um RN1 ou RN2 é -C(O)R13, opcionalmente em que apenas um dentre RN1 ou RN2 é -C(O)R13.

97. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é um oligopeptídeo reconhecido por uma protease, opcionalmente em que a protease é uma caspase.

98. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é um tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octopeptídeo ou nonapeptídeo.

99. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 compreende a sequência de aminoácidos DVED.

100. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 compreende a sequência de aminoácidos DVEDHN.

101. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é um oligopeptídeo ligado, por meio de sua extremidade C, ao anel de R13.

102. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 ou R2 é metila ou C2-6 alquila.

103. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que um, dois ou três dos seguintes são verdadeiros: a. R5 e R6 são idênticos; b. um RN1 é idêntico a um RN2; ou c. R7 e R8 são idênticos.

104. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que RN1 é idêntico a um RN2.

105. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que tem um plano de simetria de espelho que passa através do silício e R4, opcionalmente com a exceção de que R1 e R2 não são necessariamente idênticos.

106. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que tem a estrutura: ou uma forma aberta, sal ou ácido livre do mesmo.

107. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é um nucleosídeo/nucleotídeo que tem a fórmula: NUC-DYE em que NUC é uma porção química de nucleosídeo/nucleotídeo; DYE é a porção química de SiR do composto, em que NUC e DYE são conectados por um conector;

em que o conector está ligado a DYE em uma das posições R1 ou R2 da Fórmula (I); opcionalmente, em que caso o NUC compreenda uma base de purina, a conector está ligada à posição 8 da purina, caso NUC compreenda uma base de 7- deazapurina, a conector está ligada à posição 7 da 7-deazapurina e caso o NUC compreenda uma base de pirimidina, a conector é ligada à posição 5 da pirimidina.

108. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que NUC compreende um trifosfato de nucleotídeo, iniciador, produto de extensão de iniciador ou sonda.

109. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 107 ou 108, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente um arrefecedor brusco ou fluoróforo em uma relação de transferência de energia com a porção química de SiR do composto.

110. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 107 a 109, CARACTERIZADO pelo fato de que NUC compreende uma base selecionada a partir do grupo que consiste em uracila, citosina, deazaadenina e deazaguanosina.

111. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 105, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de fosforamidita da Fórmula (L1): (L1) em que: X e Y juntos formam um conector; B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 obtidos separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila e cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; e D é a porção química de SiR do composto; em que Y está ligado a D em uma das posições R1 ou R2 da Fórmula (I).

112. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 105, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de fosforamidita da Fórmula (L2): (L2) em que: B1 é um grupo protetor de éster de fosfito; B2 e B3 considerados separadamente são alquila inferior, alceno inferior, arila ou cicloalquila que contém até 10 átomos de carbono; B5 é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila clivável por ácido; B é uma base de nucleosídeo/nucleotídeo; D é a porção química de SiR do composto; B está ligado a D através de um conector a uma dentre as posições R1 ou R2 da Fórmula (I); opcionalmente, em que caso B seja purina ou 7-deazapurina, a porção química de açúcar está ligada na posição N9 da purina ou 7-deazapurina, e caso B seja pirimidina, a porção química de açúcar está ligada na posição N1 da pirimidina; opcionalmente, em que caso B seja uma purina, a conector é fixada à posição 8 da purina, caso B seja 7-deazapurina, a conector é ligada à posição 7 da 7- deazapurina e caso B seja pirimidina, o conector está ligado à posição 5 da pirimidina.

113. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 112, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é qualquer um dentre os compostos

, ,

,

,

,

,

,

,

,

, , ,

,

,

,

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,

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,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

, ,

,

,

,

, , ,

, e

, ou uma forma aberta ou de espirolactona e/ou sal ou ácido livre dos mesmos, em que R1, R2, R5, R6, R7, R8, R15 e RN1 são conforme definidos reivindicação 1.

114. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é formado reagindo-se um primeiro composto que é qualquer um dentre compostos

, ,

, , ,

, ,

,

,

,

,

,

,

,

, , ,

,

,

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,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

, ,

,

,

,

,

, ,

, e

, em que R1, R2, R5, R6, R7, R8, R15 e RN1 são conforme definido na reivindicação 1, com uma porção química de ligação a alvo, a nucleosídeo/nucleotídeo ou a polinucleotídeo, opcionalmente em que o primeiro composto é ativado primeiramente convertendo-se uma porção química do mesmo em um ligante reativo que reage com a porção química de ligação a alvo; ou uma forma aberta ou espirolactona e/ou sal do mesmo ou ácido livre do mesmo.

115. Composto, de acordo com a reivindicação 114, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de ligação a alvo é um anticorpo, porção química de ligação a ácido nucleico ou porção química de ligação a citoesqueleto.

116. Método para detectar um polinucleotídeo-alvo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar uma amostra que compreende, ou com suspeita de compreender, o polinucleotídeo-alvo em contato com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4 a 114, que tem capacidade para se ligar especificamente ao polinucleotídeo-alvo e determinar se um complexo que compreende o polinucleotídeo-alvo e o composto foi formado.

117. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 116, CARACTERIZADO pelo fato de que a determinação da possibilidade de um complexo que compreende o polinucleotídeo-alvo e o composto ter sido formado compreende detectar a fluorescência do complexo ou detectar uma mudança na fluorescência resultante da formação do complexo, opcionalmente, em que a mudança na fluorescência resultante da formação do complexo é uma redução do arrefecimento brusco por um arrefecedor brusco devido à clivagem ou uma mudança conformacional.

118. Método para sequenciar um polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar o polinucleotídeo em contato com o composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 a 105 ou 107 a 114, durante uma reação de sequenciamento, formação de um produto de sequenciamento e detecção de fluorescência do produto de sequenciamento, em que o composto compreende um iniciador ou trifosfato de nucleotídeo.

119. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 118, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é um nucleotídeo ou dinucleotídeo terminador identificado que termina a síntese do produto de sequenciamento, opcionalmente em que o nucleotídeo terminador identificado é um didesoxinucleotídeo identificado ou um nucleotídeo terminador reversível ou dinucleotídeo.

120. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 118, sendo que o composto é CARACTERIZADO pelo fato de que é um iniciador e o produto de sequenciamento é formado por extensão do iniciador.

121. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 120, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende separar o produto de sequenciamento de outros produtos de sequenciamento antes de detectar fluorescência, opcionalmente em que a separação ocorre por eletroforese, ainda opcionalmente em que a eletroforese é eletroforese capilar.

122. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 120, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende detectar o produto de sequenciamento in situ.

123. Método para identificar um nucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende um primeiro ligante reativo, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende reagir o nucleotídeo ou polinucleotídeo com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4 a 105 ou 107 a 114, que compreende um segundo ligante reativo com capacidade para formar uma ligação por meio da reação com o primeiro ligante reativo.

124. Composto ou método de acordo com a reivindicação 123, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo ligante reativo é uma fosforamidita.

125. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 123, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo ligante reativo é um éster ativo, opcionalmente, em que o éster ativo é um éster NHS.

126. Método para marcar um polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar o polinucleotídeo em contato com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 a 105 ou 107 a 114, que compreende uma porção química de ligação ao polinucleotídeo.

127. Complexo fluorescente que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 a 105 ou 107 a 114, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma porção química de ligação a polinucleotídeo associada de maneira não covalente a um polinucleotídeo.

128. Método, de acordo com a reivindicação 126, ou complexo fluorescente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo tem um comprimento de cerca de 8 a cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 30 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 50 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 5 Mb, cerca de 5 Mb a cerca 50 Mb, ou cerca de 50 Mb a cerca de 500 Mb.

129. Método ou complexo fluorescente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 116 a 128, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico é um plasmídeo, cosmídeo, produto de PCR, fragmento de restrição, cDNA, DNA genômico ou um oligonucleotídeo natural ou sintético.

130. Método ou complexo fluorescente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 116 a 128, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo está em um gel de eletroforese, uma célula, uma organela, vírus, viroide ou fluido biológico ou está em ou foi obtido de uma amostra de água, amostra de solo, alimentos, processo de fermentação ou lavagem de superfície.

131. Método para determinar a integridade da membrana celular, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) incubar uma amostra que contém uma ou mais células com um composto de qualquer uma das reivindicações 1, 4 a 106 ou 113 a 115 que compreende pelo menos um grupo carregado durante um tempo suficiente para que o composto entre nas células com membranas celulares comprometidas; e b) determinar a integridade da membrana celular de uma ou mais células com base na presença de um sinal fluorescente detectável de uma ou mais células, em que a presença do sinal fluorescente detectável indica que a integridade da membrana celular está comprometida e a ausência do sinal fluorescente detectável indica que a integridade da membrana celular está intacta.

132. Método para detectar um alvo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar uma amostra que compreende, ou suspeita de compreender, o antígeno-alvo em contato com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 a 106 ou 113 a 115, que compreende uma porção química de ligação a alvo que se liga especificamente ao alvo e detecta fluorescência de um complexo que compreende o alvo e o composto.

133. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 132, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra compreende células.

134. Composto ou método, de acordo com a reivindicação 132, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra compreende um extrato biológico.

135. Composto ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131 a 134, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção de fluorescência é realizada com o uso de um microscópio de fluorescência, leitor de placas, dispositivo de varredura de fluorescência, fluorímetro ou citômetro de fluxo.

136. Kit para detectar um alvo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4 a 115, que compreende uma porção química de ligação a alvo configurada para se ligar especificamente ao alvo.

137. Kit, de acordo com a reivindicação 136, CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo é actina ou microtúbulos e a porção química de ligação a alvo é uma porção química de ligação a actina ou uma porção química de ligação a microtúbulos.

138. Kit, de acordo com a reivindicação 136, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de ligação a alvo é um anticorpo específico para o alvo.

139. Kit, de acordo com a reivindicação 136, CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo é um anticorpo primário e a porção química de ligação a alvo é um anticorpo secundário específico para o anticorpo primário.

140. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 136 a 138, CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo é um polipeptídeo, polissacarídeo, lipídio ou polinucleotídeo.

141. Kit para marcar uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4 a

115.

142. Kit para conjugar um composto da Fórmula (I) a uma porção química de ligação a alvo, nucleotídeo ou polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 115, que compreende pelo menos um ligante reativo.