KR20210043584A - 규소로 치환된 로다민 염료 및 염료 접합체 - Google Patents

규소로 치환된 로다민 염료 및 염료 접합체 Download PDF

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KR20210043584A
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카일 지
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Abstract

본원에서는 규소로 치환된 로다민 화합물이 개시된다. 또한, SiR 염료의 Si 원자(10번 위치)에 부착된 적어도 1개의 비닐기를 포함하는 SiR 염료도 기재된다. SiR 화합물의 유도체, 작용성화된 이형, 접합체, 키트, 관련 합성 방법 및 용도도 제공된다. 규소-로다민(SiR) 염료는 원적색(far-red) 파장에서 밝은 형광을 제공할 수 있고, 좋은 광안정성을 나타낼 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 생물학적 샘플의 형광 표지화 및 검출에 유용할 수 있다.

Description

규소로 치환된 로다민 염료 및 염료 접합체
본 개시물은 형광 염료 및 그의 접합체 분야에 관한 것이다.
도입 및 요약
많은 분야에서 형광 염료를 사용하여 생물학적 물질을 검출하거나 또는 정량화하는 것이 유용하거나 또는 필요하다. 핵산, 폴리펩티드, 세포 및 막과 같은 생물학적 물질은 다양한 샘플 유형에서, 예를 들어 생물의학, 유전, 발효, 양식, 농업, 법의학 및 환경 응용에서 검출될 수 있다. 특정 응용을 위해 원하는 특성을 가진 염료를 제공하기 위해서, 염료를 작용성화하거나 또는 염료를 특정 성분, 예컨대 주어진 세포내 위치, 세포내 성분(예를 들어, 세포골격 성분 또는 핵산) 또는 에피토프에 표적화하는 모이어티에 염료를 접합시키는 것이 종종 유용하거나 또는 필요하다.
규소-로다민(SiR) 염료는 원적외선 파장에서 밝은 형광을 제공할 수 있고 우수한 광안정성을 나타낼 수 있으며, 따라서 다양한 응용을 위해 그러한 염료를 작용성화하거나 또는 접합시키려는 시도가 이루어졌다. 그러한 시도는 일반적으로 염료의 크산텐 모이어티를 변형하는 데 중점을 두었지만, 그러한 변형은 흡수 및 방출 파장, 양자 수율 및 광안정성과 같은 염료의 광물리학적 특성에 상당한 변화를 가져왔다. 따라서, 흡수 및 방출 파장, 양자 수율 및 광안정성과 같은 염료의 하나 이상의 광물리학적 특성을 개선하도록 변형된 또는 변형될 수 있는 SiR 염료가 필요하다.
본원에서는 SiR 염료의 Si 원자(10번 위치)에 부착된 적어도 하나의 비닐기를 포함하는 SiR 염료 및 그의 유도체, 작용성화된 이형(version), 접합체 및 그의 용도가 기재된다. 또한 관련 합성 방법도 제공된다. 비닐기를 예를 들어 티올-엔 반응을 이용하여 유도체화하여 작용성화된 또는 접합된 SiR 염료를 제공할 수 있다. 비닐을 함유하고 유도체화된 염료는 유리 SiR과 유사한 광물리학적 특성을 가질 수 있고/거나 위에서 언급한 것과 같은 생물학적으로 적절한 표적에 대한 개선된 특성 또는 특징(예를 들어, 특이적 결합 친화도)을 가질 수 있거나, 다른 이익을 제공할 수 있거나, 또는 적어도 대중에게 유용한 선택을 제공할 수 있다.
따라서, 다음은 본원에서 제공되는 실시양태에 속한다. 실시양태 1은 화학식 (I):
Figure pct00001
을 가지고,
여기서:
R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
각 L1은 독립적으로 링커이고;
각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
R3는 -COOH, SO3 -, H, R3a, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R3a는
Figure pct00002
,
Figure pct00003
, 또는 -C(O)N(RN3)(RN4)이고;
RN3는 H, 메틸, C2-6 알킬, 또는 -CH2-A이고, 여기서 A는 적어도 하나의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
RN4는 -L1-RA, 또는 -L1-RB1, 또는 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q는 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
R3b는 -OH 또는 -N(RN5)-L3a-RB이고;
각 L3a는 독립적으로 링커이고;
RB는 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티이고;
RN5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이고;
R4는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
E는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R9은 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 및/또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 및/또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
R13은
Figure pct00004
이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸(Ac), AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이고;
추가로, 여기서 (i) R1이 메틸 또는 C2-6 알킬이면, R2는 메틸 또는 C2-6 알킬이 아니거나, 또는 (ii) R3는 R3a 또는 -L1-RB1인 화합물 또는 그의 스피로락톤 형태 및/또는 염이다.
실시양태 2는 화학식 (P1a)
Figure pct00005
(P1a)
의 화합물 및 화학식 (P1b)
Figure pct00006
(P1b)
의 화합물을 유기리튬 염기 및 그 다음에 SiCl2R1R2와 반응시킴으로써 화학식 (P2)
Figure pct00007
(P2)
의 화합물을 생성하는 것을 포함하고, 여기서:
R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
각 L1은 독립적으로 링커이고;
각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 및/또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 및/또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A2는 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
R13은
Figure pct00008
이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸(Ac), AM, PO3 2, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸인 화학식 (P2)의 화합물의 제조 방법이다.
실시양태 3은 100 ℃ 초과 온도에서 CuBr2 존재 하에서 화학식 (P2)
Figure pct00009
의 화합물과 화학식 (P2a)
Figure pct00010
의 화합물을 반응시킴으로써 화학식 (I)
Figure pct00011
의 화합물을 생성하는 것을 포함하고, 여기서:
R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
각 L1은 독립적으로 링커이고;
각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
R3는 -COOH, SO3 -, H, R3a, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R3a는
Figure pct00012
또는 -C(O)N(RN3)(RN4)이고;
RN3는 H, 메틸, C2-6 알킬, 또는 -CH2-A이고, 여기서 A는 적어도 하나의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
RN4는 -L1-RA, 또는 -L1-RB1, 또는 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q는 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
R3b는 -OH 또는 -N(RN5)-L3a-RB이고;
각 L3a는 독립적으로 링커이고;
RB는 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티이고;
RN5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이고;
R4는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
E는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R9은 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 및/또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 및/또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
R13은
Figure pct00013
이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸, AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이고;
추가로 여기서 (i) R1이 메틸 또는 C2-6 알킬이면, R2는 메틸 또는 C2-6 알킬이 아니거나, 또는 (ii) R3는 R3a 또는 -L1-RB1인 화학식 (I)의 화합물의 제조 방법이다.
실시양태 4는 R1 또는 R2가 비닐 또는 치환된 비닐인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 5는 R1 또는 R2가 비닐인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 6은 R1 또는 R2가 메틸 또는 C2-6 알킬로 치환된 비닐인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 7은 R1 및 R2가 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 8은 고리가 포화된 고리인 실시양태 7의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 9는 고리가 5-, 6-, 또는 7-원 고리인 실시양태 7 또는 8의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 10은 고리가 비치환된 것인 실시양태 7-9 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 11은 R1 또는 R2가 -L1-RA인 실시양태 1-6 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 12는 RA가 -COOH인 실시양태 11의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 13은 RA가
Figure pct00014
(예를 들어, NHS 에스테르 또는 숙신이미딜 에스테르(SE)), 카르복실, 카르복실에스테르, 말레이미드, 아미드, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 아세톡시메틸(AM) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란 및 시클로옥틴-아민인 실시양태 11의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 14는 RA가 가용화 작용기인 실시양태 11의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 15는 가용화 작용기가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 에틸렌 옥사이드 단위를 포함하는 것인 실시양태 14의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 16은 RA가 포스포르아미다이트를 포함하는 것인 실시양태 11의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 17은 R1 또는 R2가 -L1-RB1인 실시양태 1-6 또는 11-16 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 18은 RB1이 핵산 결합 모이어티를 포함하는 것인 실시양태 17의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 19는 RB1이 세포골격 결합 모이어티를 포함하는 것인 실시양태 17의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 20은 RB1이
Figure pct00015
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
를 포함하고, 여기서 물결선이 SiR 모이어티와의 임의로 링커를 통한 연결을 나타내는 것인 실시양태 17의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 21은 RB1이 항체를 포함하는 것인 실시양태 17의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 22는 각 L1이 독립적으로 -(CH2)s-X-L3a-이고, 여기서 s가 독립적으로 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; 각 X가 독립적으로 CH2, S, S(O), 또는 S(O)2이고; 각 L3a가 독립적으로 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 23은 s가 2인 실시양태 22의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 24는 X가 S인 실시양태 22 또는 23의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 25는 X가 S(O)인 실시양태 22 또는 23의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 26은 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 2인 실시양태 22-25 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 27은 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 3인 실시양태 22-25 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 28은 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 4, 5, 또는 6인 실시양태 22-25 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 29는 R3가 -COOH인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 30은 R3가 SO3 -인 실시양태 1-28 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 31은 R3가 H인 실시양태 1-28 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 32는 R3가 R3a인 실시양태 1-28 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 33은 R3a가 -C(O)N(RN3)(RN4)인 실시양태 32의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 34는 RN3가 메틸인 실시양태 33의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 35는 RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 실시양태 33의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 36은 RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 1 개의 -OH, -NH2, -COOH, -NO2, 또는 -SO3 -로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 실시양태 33 또는 35의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 37은 RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고, 이 적어도 2개의 기가 독립적으로 -OH, -NH2, -COOH, -NO2, 또는 -SO3 -인 실시양태 33, 35 또는 36의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 38은 RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 -SO3 -기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 실시양태 35-37 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 39는 A가 치환된 아릴인 실시양태 33 또는 35-38 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 40은 RN4가 -(CH2)3-RB이고, 임의로 여기서 RN4의 RB가 -COOH인 실시양태 33-39 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 41은 RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 2인 실시양태 33-39 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 42는 RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 3인 실시양태 33-39 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 43은 RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 4, 5, 또는 6인 실시양태 33-39 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 44는 R3a가
Figure pct00018
인 실시양태 32의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 45는 R3b가 N(RN5)-L3a-RB인 실시양태 44의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 46은 RN5가 H인 실시양태 45의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 47은 RN5가 메틸인 실시양태 45의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 48은 R3b가 -OH인 실시양태 44-47 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 49는 R3a가
Figure pct00019
인 실시양태 32의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 50은 각 L3a가 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 2인 실시양태 45-49 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 51은 각 L3a가 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 3인 실시양태 45-49 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 52는 각 L3a가 독립적으로 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 4, 5, 또는 6인 실시양태 45-49 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 53은 RB가 반응성 리간드를 포함하고, 임의로 여기서 반응성 리간드가 카르복실, 아민, 말레이미드, 또는 활성 에스테르이고, 추가로 임의로 여기서 활성 에스테르가 NHS 에스테르 또는 숙신이미딜 에스테르(SE), 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르 또는 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 56은 RB가 포스포르아미다이트를 포함하는 것인 실시양태 1-52 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 55는 RB가 핵산 결합 모이어티를 포함하는 것인 실시양태 1-52 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 56은 RB가 세포골격 결합 모이어티를 포함하는 것인 실시양태 1-52 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 57은 RB가
Figure pct00020
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
를 포함하고, 여기서 물결선이 SiR 모이어티와의 임의로 링커를 통한 연결을 나타내는 것인 실시양태 1-52 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 58은 RB가 항체를 포함하는 것인 실시양태 1-52 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 59는 R4가 SO3 -인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 60은 R4가 H인 실시양태 1-58 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 61은 E 및 R9이 각각 클로로인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 62는 E 및 R9이 각각 H인 실시양태 1-60 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 63은 R5가 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 64는 R5가 메틸인 실시양태 1-62 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 65는 R5가 RN1과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-62 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 66은 R6가 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 67은 R6가 메틸인 실시양태 1-65 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 68은 R6가 RN2와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-65 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 69는 R7이 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 70은 R7이 메틸인 실시양태 1-68 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 71은 R7이 RN1과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-68 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 72는 R8이 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 73은 R8이 메틸인 실시양태 1-71 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 74는 R8이 RN2와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-71 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 75는 하나의 또는 각 RN1이 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 76은 하나의 또는 각 RN1이 메틸 또는 C2-4 알킬인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 77은 하나의 또는 각 RN1이 -C(O)OR10인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 78은 RN1이 R5와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-62 또는 65-67 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 79는 RN1이 R7과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-68 또는 71-78 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 80은 하나의 또는 각 RN2가 H인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 81은 하나의 또는 각 RN2가 메틸인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 82는 하나의 또는 각 RN2가 C2-4 알킬인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 83은 하나의 또는 각 RN2가 -C(O)OR10인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 84는 RN2가 R6와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 85는 RN2가 R8과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 실시양태 1-65 또는 68-84 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 86은 R10이 -CH2-A1이고, 여기서 A1이 적어도 1 개의 R11으로 임의로 치환된 아릴인 실시양태 1-72 또는 75-85 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 87은 R11이 메틸인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 88은 R11이 -OR12인 실시양태 1-86 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 89는 R12가 H인 실시양태 1-86 또는 88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 90은 R12가 메틸인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 91은 R12가 아세틸(Ac)인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 92는 R12가 아세톡시메틸(AM)인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 93은 R12가 -PO3 2-인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 94는 R12가 -PO3(AM)2인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 95는 R12가 글리코시드인 실시양태 1-88 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 96은 RN1 또는 RN2가 -C(O)R13이고, 임의로 여기서 RN1 또는 RN2 중 오직 하나가 -C(O)R13인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 97은 R15이 프로테아제에 의해 인지되는 올리고펩티드이고, 임의로 여기서 프로테아제가 카스파제인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 98은 R15이 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥토펩티드, 또는 노나펩티드인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 99는 R15이 아미노산 서열 DVED를 포함하는 것인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 100은 R15이 아미노산 서열 DVEDHN을 포함하는 것인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 101은 R15이 R13의 고리에 C-말단을 통해 연결된 올리고펩티드인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 102는 R1 또는 R2가 메틸 또는 C2-6 알킬인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 103은 다음 중 하나, 둘 또는 셋이 참인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다:
실시양태 104는 R5 및 R6가 동일하다는 것이다;
실시양태 105는 RN1이 RN2와 동일하다는 것이다; 또는
실시양태 106은 R7 및 R8이 동일하다는 것이다.
실시양태 107은 각 RN1이 RN2와 동일한 것인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 108은 화합물이 규소 및 R4를 통과하는 거울 대칭 평면을 가지고, 임의로 R1 및 R2가 반드시 동일하지는 않다는 예외를 가지는 것인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 109는 구조:
Figure pct00023
를 갖는 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물, 또는 그의 개방된 형태, 염, 또는 유리 산 또는 방법이다.
실시양태 110은 화합물이 화학식:
NUC-DYE
를 가지고,
여기서
NUC는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고
DYE는 화합물의 SiR 모이어티이고, NUC 및 DYE는 링커에 의해 연결되고;
여기서 링커는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에서 DYE에 부착되고;
임의로 여기서 NUC가 푸린 염기를 포함하면, 링커는 푸린의 8-위치에 부착되고, NUC가 7-데아자푸린 염기를 포함하면, 링커는 7-데아자푸린의 7-위치에 부착되고, NUC가 피리미딘 염기를 포함하면, 링커는 피리미딘의 5-위치에 부착되는 것인 표지화된 뉴클레오사이드/타이드인 이전 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 111은 NUC가 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 프라이머, 프라이머 연장 생성물, 또는 프로브를 포함하는 것인 실시양태 110의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 112는 화합물의 SiR 모이어티와 에너지 전달 관계의 켄처(quencher) 또는 형광단을 추가로 포함하는 실시양태 110 또는 111의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 113은 NUC가 우라실, 시토신, 데아자아데닌, 및 데아자구아노신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기를 포함하는 것인 실시양태 110-112 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 114는 화합물이 화학식 (L1):
Figure pct00024
의 포스포르아미다이트 화합물이고,
여기서:
X 및 Y는 함께 링커를 형성하고;
B1은 포스파이트 에스테르 보호기이고;
B2　및 B3는 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴, 및 시클로알킬이고;
D는 화합물의 SiR 모이어티이고;
여기서 Y는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에서 D에 부착되는 것인 실시양태 1-108 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 115는 화합물이 화학식 (L2):
Figure pct00025
의 포스포르아미다이트 화합물이고, 여기서:
B1은 포스파이트 에스테르 보호기이고;
B2　및 B3는 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴, 또는 시클로알킬이고;
B5는 수소 또는 산에 의해 절단가능한 히드록실 보호기이고;
B는 뉴클레오사이드/타이드 염기이고;
D는 화합물의 SiR 모이어티이고;
B는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에 링커를 통해 D에 부착되고;
임의로 여기서 B가 푸린 또는 7-데아자푸린이면, 당 모이어티가 푸린 또는 7-데아자푸린의 N9-위치에서 부착되고, B가 피리미딘이면, 당 모이어티가 피리미딘의 N1-위치에서 부착되고,
임의로 여기서 B가 푸린이면, 링커가 푸린의 8-위치에 부착되고, B가 7-데아자푸린이면, 링커가 7-데아자푸린의 7-위치에 부착되고, B가 피리미딘이면, 링커가 피리미딘의 5-위치에 부착되는 것인 실시양태 1-108 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 116은 화합물이 화합물 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 및 59 중 어느 하나, 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산인 실시양태 1-115 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 117은 화합물 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7A, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 및 59 중 어느 하나인 제1 화합물과 표적 결합 모이어티, 뉴클레오사이드/타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 반응시킴으로써 형성되고, 임의로 여기서 제1 화합물이 먼저 그의 모이어티를 표적 결합 모이어티와 반응하는 반응성 리간드로 전환함으로써 활성화되는 것인 화합물, 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산이다..
실시양태 118은 표적 결합 모이어티가 항체, 핵산 결합 모이어티, 또는 세포골격 결합 모이어티인 실시양태 117의 화합물이다.
실시양태 119는 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 실시양태 1 또는 4-117 중 어느 한 실시양태의 화합물과 접촉시키고, 표적 폴리뉴클레오타이드 및 화합물을 포함하는 복합체가 형성되었는지를 결정하는 것을 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 검출 방법이다.
실시양태 120은 표적 폴리뉴클레오타이드 및 화합물을 포함하는 복합체가 형성되었는지를 결정하는 것이 복합체로부터 형광을 검출하거나 또는 복합체 형성으로 인한 형광의 변화를 검출하는 것을 포함하고, 임의로 여기서 복합체 형성으로 인한 형광의 변화가 절단 또는 형태학적 변화로 인해 켄처에 의한 켄칭의 감소인 실시양태 119의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 121은 시퀀싱 반응 동안 폴리뉴클레오타이드와 실시양태 1, 4-108 또는 110-117 중 어느 한 실시양태의 화합물을 접촉시키고, 시퀀싱 생성물을 형성하고, 시퀀싱 생성물로부터 형광을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 화합물이 프라이머 또는 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 방법이다.
실시양태 122는 화합물이 시퀀싱 생성물의 합성을 종결하는 표지화된 종결자 뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드이고, 임의로 여기서 표지화된 종결자 뉴클레오타이드가 표지화된 디데옥시뉴클레오타이드 또는 가역적 종결자 뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드인 실시양태 121의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 123은 화합물이 프라이머이고, 시퀀싱 생성물이 프라이머 연장에 의해 형성된 것인 실시양태 121의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 124는 방법이 형광을 검출하기 전에 시퀀싱 생성물을 다른 시퀀싱 생성물로부터 분리하는 것을 포함하고, 임의로 여기서 분리하는 것이 전기영동에 의한 것이고, 추가로 임의로 여기서 전기영동이 모세관 전기영동인 실시양태 121-123 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 125는 방법이 시퀀싱 생성물을 현장에서 검출하는 것을 포함하는 것인 실시양태 121-123 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 126은 제1 반응성 리간드를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제1 반응성 리간드와의 반응시 결합을 형성할 수 있는 제 2 반응성 리간드를 포함하는 실시양태 1, 4-108 또는 110-117 중 어느 한 실시양태의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 제1 반응성 리간드를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 표지화 방법이다.
실시양태 127은 제2 반응성 리간드가 포스포르아미다이트인 실시양태 126의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 128은 제2 반응성 리간드가 활성 에스테르이고, 임의로 여기서 활성 에스테르가 NHS 에스테르인 실시양태 126의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 129는 폴리뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 결합 모이어티를 포함하는 실시양태 1, 4-108 또는 110-117 중 어느 한 실시양태의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 염색 방법이다.
실시양태 130은 폴리뉴클레오타이드와 비공유결합적으로 연계된 폴리뉴클레오타이드 결합 모이어티를 포함하는 실시양태 1, 4-108 또는 110-117 중 어느 한 실시양태의 화합물을 포함하는 형광 복합체이다.
실시양태 131은 폴리뉴클레오타이드가 약 8 개 내지 약 15 개 뉴클레오타이드, 약 15 개 내지 약 30 개 뉴클레오타이드, 약 30 개 내지 약 50 개 뉴클레오타이드, 약 50 개 내지 약 200 개 뉴클레오타이드, 약 200 개 내지 약 1000 개 뉴클레오타이드, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 5 Mb, 약 5 Mb 내지 약 50 Mb, 또는 약 50 Mb 내지 약 500 Mb의 길이를 갖는 것인 실시양태 129의 방법 또는 실시양태 130의 형광 복합체이다.
실시양태 132는 핵산이 플라스미드, 코스미드, PCR 생성물, 제한 단편, cDNA, 게놈 DNA, 또는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오타이드인 실시양태 119-131 중 어느 한 실시양태의 방법 또는 형광 복합체이다.
실시양태 133은 폴리뉴클레오타이드가 전기영동 겔, 세포, 세포소기관, 바이러스, 바이로이드 또는 생물학적 유체에 있거나, 또는 물 샘플, 흙 샘플, 식료품, 발효 과정 또는 표면 세척에 있거나 또는 그로부터 얻는 것인 실시양태 119-132 중 어느 한 실시양태의 방법 또는 형광 복합체이다.
실시양태 134는
a) 하나 이상의 세포를 함유하는 샘플을 실시양태 1, 4-109 또는 116-118 중 어느 한 실시양태의 화합물과 함께 이 화합물이 손상된 세포막을 갖는 세포에 들어가기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하고;
b) 하나 이상의 세포로부터 검출가능한 형광 신호의 존재에 기초하여 하나 이상의 세포의 세포막 무결성을 결정하고, 여기서 검출가능한 형광 신호의 존재는 세포막 무결성이 손상됨을 나타내고, 검출가능한 형광 신호의 부재는 세포막 무결성이 손상되지 않음을 나타내는 것
을 포함하는 세포막 무결성 결정 방법이다.
실시양태 135는 표적을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 표적에 특이적으로 결합하는 표적 결합 모이어티를 포함하는 실시양태 1, 4-109 또는 116-118 중 어느 한 실시양태의 화합물과 접촉시키고, 표적 및 화합물을 포함하는 복합체로부터 형광을 검출하는 것을 포함하는 표적 검출 방법이다.
실시양태 136은 샘플이 세포를 포함하는 것인 실시양태 135의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 137은 샘플이 생물학적 추출물을 포함하는 것인 실시양태 135의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 138은 형광을 검출하는 것이 형광 현미경, 플레이트 판독기, 형광 스캐너, 형광계 또는 유세포 분석기를 사용하여 수행되는 것인 실시양태 134-137 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 방법이다.
실시양태 139는 표적에 특이적으로 결합하도록 구성된 표적 결합 모이어티를 포함하는 실시양태 1 또는 4-117 중 어느 한 실시양태의 화합물을 포함하는 표적 검출 키트이다.
실시양태 140은 표적이 액틴 또는 미세관이고, 표적 결합 모이어티가 액틴 결합 모이어티 또는 미세관 결합 모이어티인 실시양태 139의 키트이다.
실시양태 141은 표적 결합 모이어티가 표적에 특이적인 항체인 실시양태 139의 키트이다.
실시양태 142는 표적이 일차 항체이고, 표적 결합 모이어티가 일차 항체에 특이적인 이차 항체인 실시양태 139의 키트이다.
실시양태 143은 표적이 폴리펩티드, 다당류, 지질 또는 폴리뉴클레오타이드인 실시양태 139-141 중 어느 한 실시양태의 키트이다.
실시양태 144는 실시양태 1 또는 4-118 중 어느 한 실시양태의 화합물을 포함하는 샘플 염색 키트이다.
실시양태 145는 적어도 하나의 반응성 리간드를 포함하는 실시양태 1 또는 4-118 중 어느 한 실시양태의 화합물을 포함하는, 화학식 (I)의 화합물과 표적 결합 모이어티, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 접합시키는 키트이다.
도 1a-1r은 본원에 제공된 예시적인 Si-로다민(SiR) 화합물의 구조를 보여준다. 도 1a는 화합물 1, 1a, 1b, 1c, 2 및 2a의 구조를 보여준다. 도 1b는 화합물 3, 4 및 4a의 구조를 보여준다. 도 1c는 화합물 5 및 6의 구조를 보여준다. 도 1d는 화합물 7, 7a 및 7b의 구조를 보여준다. 도 1e는 화합물 8, 9 및 10a의 구조를 보여준다. 도 1f는 화합물 10b, 11 및 12의 구조를 보여준다. 도 1g는 화합물 13, 14 및 15의 구조를 보여준다. 도 1h는 화합물 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 구조를 보여준다. 도 1i는 화합물 22, 23, 24, 25, 26 및 27의 구조를 보여준다. 도 1j는 화합물 28, 29, 30, 31, 32 및 33의 구조를 보여준다. 도 1k는 화합물 34, 35, 36, 37, 38 및 39의 구조를 보여준다. 도 1l은 화합물 43의 구조를 보여준다. 도 1m은 화합물 45 및 46의 구조를 보여준다. 도 1n은 화합물 47, 48, 49 및 50의 구조를 보여준다. 도 1o는 화합물 51 및 52의 구조를 보여준다. 도 1p는 화합물 53, 54, 55 및 56의 구조를 보여준다. 도 1q는 화합물 57, 58 및 59의 구조를 보여준다. 도 1r은 왼쪽에 일반 SiR 화합물의 형광 양쪽성이온성 개방된 형태 및 오른쪽에 동일한 일반 SiR 화합물의 비형광 스피로 폐쇄된 형태를 도시한다.
도 2a-2e는 다양한 SiR 화합물의 제조를 도시한다. 도 2a는 공지된 방법에 따른 SiR 화합물 합성 경로를 보여준다. 도 2b는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따른 다양한 리간드와의 접합 반응에 사용될 수 있는 본원에 제공된 실시양태에 따른 화합물 1-3의 예시적인 합성 반응식을 보여준다(화합물 3은 공지된 방법을 이용하여 화합물 2의 산화에 의해 생성될 수 있음). 도 2c는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따른 지시된 것과 같은 접합 반응에 사용될 수 있는, 화합물 2로부터 화합물 2A의 예시적인 제조를 도시한다. 도 2d는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따라서 화합물 2로부터 (예를 들어, 화합물 2A를 통해) 제조될 수 있는 살아있는 세포를 위한 핵 염료(화합물 4), 투불린 프로브를 위한 핵 염료(화합물 5), 및 액틴 프로브를 위한 핵 염료(화합물 6)의 구조를 보여준다. 도 2e는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따라서 화합물 7A를 통한 화합물 7B의 예시적인 합성 반응식을 보여준다.
도 3a-3e는 두 상이한 농도에서 SiR-훽스트 (Spirochrome, 스위스) 또는 화합물 4의 살아있는 세포 염색 및 평균 핵 신호 강도의 비교를 보여준다. 양성 염색 세포는 검정색 배경에 회색 내지 흰색 물체로 나타난다. 염색은 화합물 4의 경우가 눈에 띄게 더 밝았다. 도 3a는 1 μM SiR-훽스트로 염색된 세포를 보여준다. 도 3b는 2 μM SiR-훽스트로 염색된 세포를 보여준다. 도 3c는 1 μM 화합물 4로 염색된 세포를 보여준다. 도 3d는 2 μM 화합물 4로 염색된 세포를 보여준다. 도 3e는 SiR-훽스트 및 화합물 4로 염색된 세포의 관찰된 핵 신호 강도를 비교하는 막대 플롯을 보여준다. 핵 신호 강도는 시험된 각 염색제 및 농도에 대해 핵의 형광 강도를 평균함으로써 결정되었다.
도 4a-4d는 도세탁셀(탁솔)을 표적화 리간드로 사용하여 투불린 프로브로 염색된 세포의 비교를 보여준다. 각 염료에 대해 두 개의 필드(field)를 보여준다. 세포를 0.5 μM 화합물 5 또는 SIR-Taxol(Spirochrome, 스위스)로 염색하고, 영상화를 수행하였다. 도 4a-b는 화합물 5로 염색된 세포를 보여준다. 도 4c-d는 SiR-Taxol로 염색된 세포를 보여준다.
도 5a-5d는 화합물 7 및 TO-PRO-3의 형광 강도 및 광안정성의 비교를 보여준다. 고정된 A459 세포를 1μM 화합물 7 또는 TO-PRO-3으로 염색하고, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하여 영상을 수집하였다. 양성 염색 세포는 검정색 배경에 밝은 회색 물체로 나타난다. 도 5a는 1μM TO-PRO-3로 염색한 것을 보여준다. 도 5c는 1μM 화합물 7로 염색한 것을 보여준다. 도 5b는 Cy5 채널로부터의 여기 광에 1 분 노출 후의 TO-PRO-3 형광을 보여준다(형광이 거의 내지 전혀 관찰되지 않음). 도 5d는 Cy5 채널로부터의 여기 광에 1 분 노출 후의 화합물 7 형광을 보여준다.
도 6a-6e는 화합물 7 및 7B의 형광 강도 및 DAPI 채널로부터의 블리드-스루(bleed-through)의 비교를 보여준다. 도 6a-6d는 화합물 7B가 화합물 7보다 Cy5 채널에서 영상화될 때 더 밝고(각각 도 6a 및 6c), DAPI 채널로 더 적은 블리드-스루를 나타낸다(각각 도 6b 및 6d)는 것을 보여준다. 도 6e는 화합물 7B 신호가 화합물 7과 비교했을 때 Cy5 채널에서 12 % 증가했으며(각각 도 6e, #3 및 #1 참조), 화합물 7과 비교할 때 DAPI 채널에서 놀랍게도 50 % 감소한다(도 6e , #4 및 #2)는 것을 입증하는 막대 플롯을 보여준다.
도 7a-7b는 PROLONG™ Diamond ("PLD", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 또는 VECTASHIELDTM 봉입 매질("VSH", Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 슬라이드를 제작한 후의 화합물 10B와 ALEXA FLUOR™ 647 염료("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)의 광안정성을 비교한다. HeLa 세포를 슬라이드 위에 놓고, 50 μM의 화합물 10B 또는 AF647로 염색하였다. 도 7a는 AF647 또는 화합물 10B로 염색되고 PROLONG™ Diamond (PLD) 또는 VECTASHIELD™로 봉입된 시편에 잔류하는 형광의 백분율을 비교한다. AF647 + VECTASHIELD는 완전히 광표백되었다(데이터를 나타내지 않음). 도 7b는 633 nm 레이저를 사용하여 공초점 현미경으로 시편을 영상화하는 방법의 개략도를 보여준다. 3 시야 내의 각 관심 영역을 50 회 스캔하였다.
도 8은 본원에 제공된 일부 실시양태에 따라서 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 표지화하는 데 사용될 수 있는 화합물 54-FAM 프라이머 표지의 생성을 위해 화합물 54-포스포르아미다이트 및 FAM-포스포르아미다이트를 사용하는 것을 예시한다. 프라이머는 650 nm 초과를 방출할 것이다.
도 9는 FAM 및 화합물 59로부터 그의 NHS 에스테르를 통해 유도된 SiR 모이어티에 접합된 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 생성을 도시한다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따라 화합물 59-FAM 프라이머 표지에 의해 표지화된다.
도 10a-10b는 고정 세포 염색 또는 항체 표지화와 같은 실험실 절차에 유용한 예시적인 화합물의 구조를 보여준다. 도 10a는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따른, 본원에서 리간드에 접합된 SiR 염료로 나타낸 고정 세포 염색제로서 유용한 화합물의 제조를 도시한다. 도 10b는 본원에 제공된 일부 실시양태에 따른 수용성 SiR NHS 에스테르 제조 후 그와 항체의 접합을 도시한다.
도 11a-11b는 다양한 화합물과 ALEXA FLUOR™ 647 염료("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)의 흡광도 및 방출 스펙트럼을 비교한다. 도 11A는 화합물 8, 10A 및 12와 AF647의 흡광도 스펙트럼을 비교한다. 도 11b는 화합물 10A 및 12와 AF647의 방출 스펙트럼을 비교한다.
도 12a-12c는 항-투불린 항체 및 ALEXA FLUOR™ 647 염료("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 또는 표지화 정도("DOL") 15로 이차 항체에 접합된 화합물 10A로 염색된 세포의 예를 보여준다. 투불린에 대해 양성 염색 세포는 검정색 배경에 회색 내지 흰색으로 나타난다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 도 12a는 AF647로 염색된 세포를 보여준다. 도 12b는 화합물 10A(DOL = 15)로 세포 염색을 보여준다. 도 12c는 사용된 각 표지화된 이차 시약의 농도에 대해서 AF647, 화합물 10A(DOL = 10), 및 화합물 10A(DOL = 15)의 형광을 비교한다. 화합물 10A 결과에서, 비록 AF647보다 덜 밝지만, 오프-표적(off-target) 형광 또는 배경 형광이 발견되지 않았고, 화합물 10A는 AF647보다 더 좋은 광안정성을 나타냈다.
도 13은 화합물 13, 화합물 14 또는 AF647의 항체 접합체의 광표백 저항 능력의 비교를 보여준다. 화합물 13 및 14는 둘 모두 700 초 초과의 노출 동안 광표백에 대해 실질적으로 저항성이 있는 반면, AF647은 저항성이 없었다. DOL은 표지화 정도를 나타낸다(예를 들어, 항체 당 SiR 염료 모이어티).
도 14는 세포 유형 A549 및 HeLa에서 화합물 4B(하부 PDT) 및 화합물 4C(상부 PDT)로 염색된 세포의 핵 신호 강도를 보여준다.
도 15는 Cy5 및 DAPI 채널에서 SiR-훽스트 및 화합물 4B 및 4C로 염색된 세포의 핵 신호 강도를 비교하는 막대 플롯을 보여준다.
도 16은 부분입체이성질체의 혼합물 및 상업적 SiR-Taxol 화합물과 비교해서 화합물 5의 부분입체이성질체 A 및 B의 신호 강도를 비교하는 막대 그래프를 보여준다.
도 17a는 상이한 유형의 링커로 제조된 화합물 6 액틴 프로브의 평균 신호 강도를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 도 17b는 상이한 유형의 링커로 제조된 화합물 6 액틴 프로브의 신호 대 배경 (S/B) 비를 비교하는 막대 그래프를 보여준다.
도 18A는 화합물 6A, 화합물 6B, 단리된 화합물 6A 및 6B의 혼합물(이성질체 분리 전), 화합물 6의 두 분리된 이성질체의 조합(A/B), 및 SiR-액틴 (Spirochrome)으로 표지화된 세포를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 도 18B는 도 18A에서 시험된 각 화합물의 신호 대 배경 비를 비교하는 막대 그래프를 보여준다.
이제, 본 개시물의 일부 실시양태들을 상세히 언급하고, 그의 예들은 첨부 도면에 도시되어 있다. 일반적인 설명 및 상세한 설명 둘 모두가 예시적이고 설명적인 것일 뿐이며 교시를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 개시물은 예시된 실시양태와 관련하여 기재될 것이지만, 그것들이 본 개시물을 그 실시양태로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 개시물은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 개시물 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
본 교시를 상세하게 기재하기 전에, 개시물이 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않고, 그 자체가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명료하게 다르게 지시하지 않으면 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "염료"의 언급은 복수의 염료를 포함하고, "세포"의 언급은 복수의 세포를 포함한다는 것 등이다. 용어 "또는"은 문맥이 명료하게 다르게 지시하지 않으면 포괄적인 의미로, 즉 "및/또는"과 동등하게 사용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 다르게 지시되지 않으면, 명세서 및 청구범위에 사용된 수량, 백분율, 또는 비율, 및 다른 수치를 표현하는 모든 숫자는 그것들이 이미 그렇게 수식되지 않는 한 모든 경우에서 용어 "약"으로 수식되는 것으로 이해해야 한다. "약"은 기재된 주제의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 예를 들어 10 %, 5 %, 2 % 또는 1 % 이내의 변동 정도를 나타낸다. 따라서, 반대로 지시되지 않으면, 다음 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 얻고자 하는 원하는 특성에 의존해서 달라질 수 있는 근사치이다. 청구범위의 범위에 균등론의 적용을 제한하려는 시도는 아니고 적어도, 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효숫자의 수를 고려하고, 통상의 반올림 기법을 적용하여 해석해야 한다. 또한, "포함하다"(comprise), "포함한다"(comprises), "포함하는"(comprising), "함유하다"(contain), "함유한다"(contains), "함유하는"(containing), "포함하다"(include), "포함한다"(includes), 및 "포함하는"(including)의 사용은 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
상기 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는다면, 다양한 성분을 "포함하는"을 나열하는 본 명세서의 실시양태는 또한 나열된 성분으로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"으로 고려되고; 다양한 성분으로 "이루어지는"을 나열하는 본 명세서의 실시양태는 또한 나열된 성분을 "포함하는" 또는 "본질적으로 이루어지는"으로 고려되고; 다양한 성분으로 "본질적으로 이루어지는"을 나열하는 본 명세서의 실시양태는 또한 나열된 성분으로 "이루어지는" 또는 "포함하는" 것으로 고려된다 (이 호환성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에는 적용하지 않는다).
본원에서 사용된 표제 부문은 오직 체계적 목적을 위한 것이고, 어떠한 방식으로든 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 참고로 포함된 임의의 문헌이 본 명세서에 정의된 임의의 용어와 모순되는 경우, 본 명세서가 지배한다. 본 교시가 다양한 실시양태와 함께 기재되지만, 본 교시가 그러한 실시양태에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 반대로, 본 교시는 관련 분야의 숙련된 자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포함한다.
정의
다르게 언급되지 않으면, 본원에서 사용되는 다음 용어 및 어구는 다음 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "또는 그의 조합"은 이 용어에 선행하는 열거된 용어들의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C 또는 그의 조합"은, A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC, 및 특정 문맥에서 순서가 중요하다면, 또한 BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 이 예를 계속하여, BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합이 분명히 포함된다. 숙련된 당업자는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는다면 전형적으로 임의의 조합에서 항목 또는 용어들의 수에 어떤 제한도 없다는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "키트"는 관련 성분, 예컨대 하나 이상의 화합물 또는 조성물 및 하나 이상의 관련 물질, 예컨대 용매, 용액, 완충제, 설명서 또는 제습제의 패키지화된 세트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 "치환된"은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 비수소 원자, 작용기 또는 모이어티로 대체된 분자를 지칭한다. 예를 들어, 비치환된 질소는 -NH2이고, 반면에 치환된 질소는 -NHCH3이다. 예시적인 치환체는 할로겐, 예를 들어, 플루오린 및 염소, (C1-C8)알킬, 설페이트, 설포네이트, 설폰, 아미노, 암모늄, 아미도, 니트릴, 니트로, 저급 알콕시, 페녹시, 방향족, 페닐, 폴리시클릭 방향족, 헤테로시클, 물 가용화 기, 연결, 및 연결 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치환체는 -X, -R, -OH, -OR, -SR, -SH, -NH2, -NHR, -NR2, -+NR3, -N=NR2, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N2 +, -N3, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)NR2, -S(O)2O-, -S(O)2R, -OS(O)2OR, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)(OR)2, -P(O)(OR)2, -P(O)(O-)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -CO2 -, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -C(NR)NR2를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 여기서 각 X는 독립적으로 할로겐이고, 각 R은 독립적으로 -H, C1-C6 알킬, C5-C14 아릴, 헤테로시클 또는 연결기이다.
다르게 지시되지 않는다면, 본원에서 명시적으로 정의되지 않은 치환체의 명명법은 작용기의 말단 부분을 명명한 다음에 인접 작용기를 부착 지점 쪽으로 명명함으로써 도달된다. 예를 들어, 치환체 "아릴알킬옥시카르보닐"은 (아릴)-(알킬) -O-C(O)-기를 지칭한다.
본원에 정의된 모든 치환된 기에서 추가 치환체를 그 자체에 갖는 치환체들을 정의함으로써 도달된 중합체(예를 들어, 치환된 아릴기로 추가로 치환된, 치환된 아릴기로 그 자체가 치환된, 치환된 아릴기를 치환체로서 갖는 치환된 아릴 등)는 본원에 포함되는 것을 의도하지 않는다. 그러한 경우, 그러한 치환의 최대 수는 3이다. 예를 들어, 치환된 아릴기를 2 개의 다른 치환된 아릴기로 연속 치환은 -치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.
마찬가지로, 본원에 제공된 정의는 허용되지 않는 치환 패턴(예를 들어, 5 개의 플루오로기로 치환된 메틸)을 포함하는 것을 의도하지 않는다는 것을 이해한다. 그러한 허용되지 않는 치환 패턴은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다.
본원에 개시된 화합물은 수화된 형태를 포함하는 용매화된 형태뿐만 아니라 용매화되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 이러한 화합물은 다수의 결정질 또는 비정질 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본원에 기재된 용도에 대해 동등하고, 본 개시물의 범위 내에 있는 것을 의도한다. 본원에 개시된 화합물은 비대칭 탄소 원자(즉, 키랄 중심) 또는 이중 결합을 가질 수 있으며; 본원에 기재된 화합물의 라세미체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체 및 개별 이성질체는 본 개시물의 범위 내에 있다. 본원에 기재된 화합물은 단일 이성질체로서 또는 이성질체의 혼합물로서 제조될 수 있다.
치환체 기들을 그들의 통상적인 화학식에 의해 명시하고 왼쪽에서 오른쪽으로 적는 경우, 그것들은 치환체를 오른쪽에서 왼쪽으로 적기 때문에 일어날 수 있는 화학적으로 동일한 치환체를 똑같이 포함하며, 예를 들어 -CH2O-는 또한 -OCH2-를 나열하는 것을 의도한다.
본원에 개시된 화합물을 정의하는 데 사용되는 화학 구조는 각각의 주어진 구조가 표현될 수 있는 가능한 공명 구조 중 하나의 각각의 표현이라는 것을 이해할 것이다. 게다가, 정의에 의해 공명 구조는 전자 비편재화를 나타내기 위해 관련 분야의 기술을 가진 자에 의해 사용되는 도해적 표현일뿐이며, 본 개시물은 주어진 임의의 구조에 대해 하나의 특정 공명 구조를 보여주는 것에 의해서 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
개시된 화합물이 공액 고리 시스템을 포함하는 경우, 공명 안정화는 형식 전자 전하가 전체 분자에 분포되는 것을 허용할 수 있다. 특정 전하가 특정 고리 시스템 또는 특정 헤테로원자에 편재된 것으로 묘사될 수 있지만, 전하가 화합물의 대안적인 부분에 형식적으로 편재될 수 있는 비견되는 공명 구조를 그릴 수 있는 것으로 흔히 이해한다.
"알킬"은 모(parent) 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 포화 또는 불포화, 분지형, 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 대표적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1 내지 12 개의 포화 및/또는 불포화 탄소로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 알킬은 1 내지 10 개의 탄소 원자, 예를 들면, 1 내지 6 개의 탄소 원자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 탄소 원자를 갖는 일가 포화 지방족 히드로카르빌기이다. "알킬"은 예로서 선형 및 분지형 히드로카르빌기, 예컨대 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 이소프로필((CH3)2CH-), n-부틸(CH3CH2CH2CH2-), 이소부틸((CH3)2CHCH2-), sec-부틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-) 및 네오펜틸((CH3)3CCH2-)을 포함한다.
"치환된 알킬"은 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노설포닐, 아미노설포닐옥시, 아미노설포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르복실, 카르복실알킬, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환된 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환된 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환된 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환된 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환된 헤테로시클릴티오, 니트로, -SO3H, 치환된 설포닐, 설포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오 및 치환된 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5 개, 예를 들어 1 내지 3 개, 또는 1 내지 2 개의 치환체를 갖는 알킬기를 지칭하고, 여기서 상기 치환체는 본원에서 정의된다. 특정 치환된 알킬기는 담체 분자 또는 고체 지지체에 직접 또는 간접 연결을 위한 반응성 기, 예를 들어, 하지만 제한되지 않는 카르복실 또는 카르복실 에스테르 (예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르와 같은 활성화된 에스테르)로 치환된 알킬 및 아미노카르보닐 -CONHR에 의해 치환된 알킬을 포함하고, 여기서 R은 용어 "아미노카르보닐"과 관련하여 아래에 정의된 유기 모이어티, 예를 들어 카르복실, 카르복실에스테르, 말레이미드, 숙신이미딜 에스테르(SE), 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란 및 시클로옥틴-아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는 반응성 기(Rx)로 말단이 치환된 C1-C10 (예를 들어, C1-C6)알킬이다.
"알킬 설포네이트"는 -(CH2)n-SO3H이고, 여기서 n은 1 내지 6의 정수이다.
"알콕시"는 -O-알킬기를 지칭하고, 여기서 알킬은 본원에서 정의된다. 알콕시는 예로서 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시 및 n-펜톡시를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알콕시는 -OR이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬이다.
"치환된 알콕시"는 -O-(치환된 알킬)기를 지칭하며, 여기서 치환된 알킬은 본원에서 정의된다.
"알킬디일"은 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 동일한 또는 두 상이한 탄소 원자로부터 2 개의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 2 개의 1가 라디칼 중심을 갖는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 포화 또는 불포화, 분지형, 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 대표적인 알킬디일 라디칼은 1,2-에틸디일, 1,3-프로필디일, 1,4-부틸디일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"아릴" 또는 "Ar"은 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 6 내지 20 개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 대표적인 아릴기는 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 아릴은 단일 고리(예를 들어, 페닐) 또는 다중 축합 고리(예를 들어, 나프틸 또는 안트릴)를 갖는 6 내지 14 개의 탄소 원자의 1가 방향족 카르복실기이며, 이 축합 고리는 방향족일 수도 있고 아닐 수도 있으며(예를 들어, 2-벤족사졸리논, 2H-1,4-벤족사진-3(4H)-온-7-일 등), 단, 부착 지점은 방향족 탄소 원자에 있다. 바람직한 아릴기는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
"치환된 아릴"은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노설포닐, 아미노설포닐옥시, 아미노설포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환된 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환된 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환된 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환된 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환된 헤테로시클릴티오, 니트로, -SO3H, 치환된 설포닐, 설포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오 및 치환된 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 5 개, 예를 들어, 1 내지 3 개, 또는 1 또는 2 개의 치환체로 치환된 아릴기를 지칭하고, 여기서 상기 치환체는 본원에서 정의된다.
"아릴레노"는 한 화합물의 2 개의 근접한 아릴 탄소에서 융합된 방향족 고리, 즉 모 방향족 고리 시스템의 2 개의 인접한 탄소 원자 각각으로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 2 개의 인접한 1가 라디칼 중심을 갖는 2가 브릿지(bridge) 라디칼을 의미한다. 아릴레노 브릿지 라디칼, 예를 들어 벤제노를 모 방향족 고리 시스템에 부착하면 융합된 방향족 고리 시스템, 예를 들어 나프탈렌이 생성된다. 대표적인 아릴레노기는 [1,2]벤제노, [1,2]나프탈레노 및 [2,3]나프탈레노를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"아릴디일"은 공액 공명 전자 시스템 및 모 아릴 화합물의 두 상이한 탄소 원자로부터 2 개의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 적어도 2 개의 1가 라디칼 중심을 갖는 6-20 개 탄소 원자의 불포화 시클릭 또는 폴리시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다.
"헤테로아릴"은 고리 내의 1 내지 10 개의 탄소 원자 및 1 내지 4 개의 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자의 방향족 기를 지칭한다. 그러한 헤테로아릴기는 단일 고리(예를 들어, 피리디닐 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리(예를 들어, 인돌리지닐 또는 벤조티에닐)를 가질 수 있으며, 여기서 축합 고리는 방향족일 수 있거나 아닐 수 있고/거나 헤테로원자를 함유하고, 단, 부착 지점은 방향족 헤테로아릴기의 원자를 통한다. 한 실시양태에서, 헤테로아릴기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥사이드 (N→O), 설피닐, 또는 설포닐 모이어티를 제공한다. 바람직한 헤테로아릴은 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐 및 푸라닐을 포함한다.
"치환된 헤테로아릴"은 치환된 아릴에 대해 정의된 동일한 군의 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5 개, 예를 들어 1 내지 3 개, 또는 1 내지 2 개의 치환체로 치환된 헤테로아릴기를 지칭한다.
"헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴을 지칭한다.
"치환된 헤테로아릴옥시"는 -O-(치환된 헤테로아릴)기를 지칭한다.
"알케닐"은 2 내지 6 개의 탄소 원자, 예를 들어 2 내지 4 개의 탄소 원자를 가지고 적어도 1 개, 예를 들어 1 내지 2 개의 알케닐 불포화 부위를 갖는 알케닐기를 지칭한다. 그러한 기는 예를 들어 비닐, 알릴, 부트-3-엔-1-일 및 프로페닐로 예시된다.
"치환된 알케닐"은 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노설포닐, 아미노설포닐옥시, 아미노설포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환된 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환된 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환된 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환된 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환된 헤테로시클릴티오, 니트로, -SO3H, 치환된 설포닐, 설포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오 및 치환된 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3 개의 치환체, 예를 들어 1 내지 2 개의 치환체를 갖는 알케닐기를 지칭하고, 여기서 상기 치환체는 본원에서 정의되고, 단 임의의 히드록시 치환은 비닐 (불포화) 탄소 원자에 부착되지 않는다.
"아실"은 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알케닐-C(O)-, 치환된 알케닐-C(O)-, 알키닐-C(O)-, 치환된 알키닐-C(O)-, 시클로알킬-C(O)-, 치환된 시클로알킬-C(O)-, 시클로알케닐-C(O)-, 치환된 시클로알케닐-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로시클릭-C(O)-및 치환된 헤테로시클릭-C(O)-기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다. 아실은 "아세틸"기 CH3C(O)-를 포함한다.
"아실아미노"는 -NRC(O)알킬, -NRC(O)치환된 알킬, -NRC(O)시클로알킬, -NRC(O)치환된 시클로알킬, -NRC(O)시클로알케닐, -NRC(O)치환된 시클로알케닐, -NRC(O)알케닐, -NRC(O)치환된 알케닐, -NRC(O)알키닐, -NRC(O)치환된 알키닐, -NRC(O)아릴, -NRC(O)치환된 아릴, -NRC(O)헤테로아릴, -NRC(O)치환된 헤테로아릴, -NRC(O)헤테로시클릭 및 -NRC(O)치환된 헤테로시클릭기를 지칭하고, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아실옥시"는 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 알케닐-C(O)O-, 치환된 알케닐-C(O)O-, 알키닐-C(O)O-, 치환된 알키닐-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 치환된 아릴-C(O)O-, 시클로알킬-C(O)O-, 치환된 시클로알킬-C(O)O-, 시클로알케닐-C(O)O-, 치환된 시클로알케닐-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O-, 치환된 헤테로아릴-C(O)O-, 헤테로시클릭-C(O)O- 및 치환된 헤테로시클릭-C(O)O-기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노"는 -NH2기를 지칭한다.
"치환된 아미노"는 -NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-알케닐, -SO2-치환된 알케닐, -SO2-시클로알킬 , -SO2-치환된 시클로알킬, -SO2-시클로알케닐, -SO2-치환된 시클로알케닐, -SO2-아릴, -SO2-치환된 아릴, -SO2-헤테로아릴, -SO2-치환된 헤테로아릴, -SO2-헤테로시클릭, 및 -SO2-치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 단, R' 및 R"은 둘 다 수소는 아니고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다. R'이 수소이고, R"이 알킬인 경우, 치환된 아미노기는 본원에서 때때로 알킬아미노라고 부른다. R'및 R"이 알킬인 경우, 치환된 아미노기는 본원에서는 때때로 디알킬아미노라고 부른다. 일치환된 아미노를 지칭할 때는, R' 또는 R"이 수소이지만 둘 모두가 수소는 아니라는 것을 의미한다. 이치환된 아미노를 지칭할 때는, R'도 R"도 수소가 아니라는 것을 의미한다.
"아미노카르보닐"은 -C(O)NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소 원자와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노티오카르보닐"은 -C(S)NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노카르보닐아미노"는 -NRC(O)NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고, R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노티오카르보닐아미노"는 -NRC(S)NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고, R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"는 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노카르보닐옥시"는 -O-C(O)NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노설포닐"은 -SO2NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노설포닐옥시"는 -O-SO2NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미노설포닐아미노"는 -NRSO2NR'R"기를 지칭하고, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고, R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아미디노"는 -C(=NR"')R'R"기를 지칭하고, 여기서 R', R", 및 R"'은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"아릴옥시"는 예로서 페녹시 및 나프톡시를 포함하는 -O-아릴기를 지칭하고, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같다.
"치환된 아릴옥시"는 -O-(치환된 아릴)기를 지칭하고, 여기서 치환된 아릴은 본원에 정의된 바와 같다.
"아릴티오"는 -S-아릴기를 지칭하고, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같다.
"치환된 아릴티오"는 -S-(치환된 아릴)기를 지칭하고, 여기서 치환된 아릴은 본원에 정의된 바와 같다.
"알키닐"은 2 내지 6 개의 탄소 원자 및 예를 들어 2 내지 3 개의 탄소 원자를 가지고 적어도 1 개, 예를 들어 1 내지 2 개의 알키닐 불포화 부위를 갖는 알키닐기를 지칭한다.
"치환된 알키닐"은 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노설포닐, 아미노설포닐옥시, 아미노설포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환된 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환된 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환된 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환된 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환된 헤테로시클릴티오, 니트로, -SO3H, 치환된 설포닐, 설포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오 및 치환된 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3 개의 치환체, 예를 들어 1 내지 2 개의 치환체를 갖는 알키닐기를 지칭하고, 여기서 상기 치환체는 본원에서 정의되고, 단, 임의의 히드록시 치환은 아세틸렌 탄소 원자에 부착되지 않는다.
"카르보닐"은 -C(=O)-와 동등한 2가 기 -C(O)-를 지칭한다.
"카르복실" 또는 "카르복시"는 -COOH 또는 그의 염을 지칭한다.
"카르복실 알킬" 또는 "카르복시알킬"은 -(CH2)nCOOH기를 지칭하며, 여기서 n은 1-6이다.
"카르복실 에스테르" 또는 "카르복시 에스테르"는 -C(O)O-알킬, -C(O)O-치환된 알킬, -C(O)O-알케닐, -C(O)O-치환된 알케닐, -C(O)O-알키닐, -C(O)O-치환된 알키닐, -C(O)O-아릴, -C(O)O-치환된 아릴, -C(O)O-시클로알킬, -C(O)O-치환된 시클로알킬, -C(O)O-시클로알케닐, -C(O)O-치환된 시클로알케닐, -C(O)O-헤테로아릴, -C(O)O-치환된 헤테로아릴, -C(O)O-헤테로시클릭 및 -C(O)O-치환된 헤테로시클릭을 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"(카르복실 에스테르)아미노"는 -NR-C(O)O-알킬, -NR-C(O)O-치환된 알킬, -NR-C(O)O-알케닐, -NR-C(O)O-치환된 알케닐, -NR-C(O)O-알키닐, -NR-C(O)O-치환된 알키닐, -NR-C(O)O-아릴, -NR-C(O)O-치환된 아릴, -NR-C(O)O-시클로알킬, -NR-C(O)O-치환된 시클로알킬, -NR-C(O)O-시클로알케닐, -NR-C(O)O-치환된 시클로알케닐, -NR-C(O)O-헤테로아릴, -NR-C(O)O-치환된 헤테로아릴, -NR-C(O)O-헤테로시클릭 및 -NR-C(O)O-치환된 헤테로시클릭기를 지칭하고, 여기서 R은 알킬 또는 수소이고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"(카르복실 에스테르)옥시"는 -O-C(O)O-알킬, -O-C(O)O-치환된 알킬, -O-C(O)O-알케닐, -O-C(O)O-치환된 알케닐, -O-C(O)O-알키닐, -O-C(O)O-치환된 알키닐, -O-C(O)O-아릴, -O-C(O)O-치환된 아릴, -O-C(O)O-시클로알킬, -O-C(O)O-치환된 시클로알킬, -O-C(O)O-시클로알케닐, -O-C(O)O-치환된 시클로알케닐, -O-C(O)O-헤테로아릴, -O-C(O)O-치환된 헤테로아릴, -O-C(O)O-헤테로시클릭 및 -O-C(O)O-치환된 헤테로시클릭기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"시아노"는 -CN기를 지칭한다.
"시클로알킬"은 융합, 브릿지된 및 스피로 고리 시스템을 포함하는 단일 또는 다중 시클릭 고리를 갖는 3 내지 10 개의 탄소 원자의 시클릭 알킬기를 지칭한다. 적당한 시클로알킬기의 예는 예를 들어 아다만틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로옥틸을 포함한다.
"시클로알케닐"은 단일 또는 다중 시클릭 고리를 가지고 적어도 하나의 >C=C< 고리 불포화, 예를 들어, 1 내지 2 개의 >C=C< 고리 불포화 부위를 갖는 3 내지 10 개의 탄소 원자의 비방향족 시클릭 알킬기를 지칭한다.
"치환된 시클로알킬" 및 "치환된 시클로알케닐"은 옥소, 티온, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노설포닐, 아미노설포닐옥시, 아미노설포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환된 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환된 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환된 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환된 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환된 헤테로시클릴티오, 니트로, -SO3H, 치환된 설포닐, 설포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오 및 치환된 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5 개, 예를 들어 1 내지 3 개의 치환체를 갖는 시클로알킬 또는 시클로알케닐기를 지칭하고, 여기서 상기 치환체는 본원에서 정의된다.
"시클로알킬옥시"는 -O-시클로알킬을 지칭한다.
"치환된 시클로알킬옥시"는 -O-(치환된 시클로알킬)을 지칭한다.
"시클로알킬티오"는 -S-시클로알킬을 지칭한다.
"치환된 시클로알킬티오"는 -S-(치환된 시클로알킬)을 지칭한다.
"시클로알케닐옥시"는 -O-시클로알케닐을 지칭한다.
"치환된 시클로알케닐옥시"는 -O-(치환된 시클로알케닐)을 지칭한다.
"시클로알케닐티오"는 -S-시클로알케닐을 지칭한다.
"치환된 시클로알케닐티오"는 -S-(치환된 시클로알케닐)을 지칭한다.
"구아니디노"는 -NHC(=NH)NH2 기를 지칭한다.
"치환된 구아니디노"는 -NRC(=NR)N(R)2를 지칭하고, 여기서 각 R은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 공통 구아니디노 질소 원자에 부착된 2 개의 R 기는 임의로 그에 결합된 질소와 함께 연접되어 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭기를 형성하고, 단, 적어도 하나의 R은 수소가 아니고, 여기서 상기 치환체는 본원에 정의된 바와 같다.
"H"는 수소를 나타낸다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
"히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 기를 지칭한다.
"헤테로아릴"은 고리 내의 1 내지 10 개의 탄소 원자 및 1 내지 4 개의 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자의 방향족기를 지칭한다. 그러한 헤테로아릴기는 단일 고리(예를 들어, 피리디닐 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리(예를 들어, 인돌리지닐 또는 벤조티에닐)를 가질 수 있으며, 여기서 축합 고리는 방향족일 수 있거나 아닐 수 있고/거나 헤테로원자를 함유하고, 단, 부착 지점은 방향족 헤테로아릴기의 원자를 통한다. 한 실시양태에서, 헤테로아릴기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥사이드 (N→O), 설피닐 또는 설포닐 모이어티를 제공한다. 바람직한 헤테로아릴은 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐 및 푸라닐을 포함한다.
"치환된 헤테로아릴"은 치환된 아릴에 대해 정의된 동일한 군의 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5 개, 예를 들어, 1 내지 3 개 또는 1 내지 2 개의 치환체로 치환된 헤테로아릴기를 지칭한다.
"헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴을 지칭한다.
"치환된 헤테로아릴옥시"는 -O-(치환된 헤테로아릴)기를 지칭한다.
"헤테로아릴티오"는 -S-헤테로아릴기를 지칭한다.
"치환된 헤테로아릴티오"는 -S-(치환된 헤테로아릴)기를 지칭한다.
"헤테로시클" 또는 "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클로알킬" 또는 "헤테로시클릴"은 고리에 적어도 하나의 비탄소 원자, 예를 들어 질소, 산소 및 황을 갖는 임의의 고리 시스템을 의미한다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클은 고리 내의 1 내지 10 개의 탄소 원자 및 1 내지 4 개의 질소, 황 또는 산소로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로 원자의 단일 고리 또는 융합, 브릿지된 및 스피로 고리 시스템을 포함하는 다중 축합 고리를 갖는 포화 또는 불포화 기이고, 여기서 융합 고리 시스템에서는, 하나 이상의 고리가 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있으며, 단, 부착 지점은 비방향족 고리를 통한다. 한 실시양태에서, 헤테로시클릭기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥사이드, 설피닐, 설포닐 모이어티를 제공한다. 헤테로시클은 피롤, 인돌, 푸란, 벤조푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 2-이미다졸, 4-이미다졸, 3-피라졸, 4-피라졸, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 3-(1,2,4-N)-트리아졸릴, 5-(1,2,4-N)-트리아졸릴, 5-테트라졸릴, 4-(1-O,3-N)-옥사졸, 5-(1-O,3-N)-옥사졸, 4-(1-S,3-N)-티아졸, 5-(1-S, 3-N)-티아졸, 2-벤족사졸, 2-벤조티아졸, 4-(1,2,3-N)-벤조트리아졸 및 벤즈이미다졸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"치환된 헤테로시클릭" 또는 "치환된 헤테로시클로알킬" 또는 "치환된 헤테로시클릴"은 치환된 시클로알킬에 대해 정의된 바와 같은 동일한 치환체 1 내지 5 개, 예를 들어 1 내지 3 개로 치환된 헤테로시클릴기를 지칭한다.
헤테로시클 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 디히드로인돌, 인다졸, 푸린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 이소티아졸, 페나진, 이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다 졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐(또한 티아모르폴리닐이라고도 부름), 1,1-디옥소티오 모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리딘 및 테트라히드로푸라닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"헤테로시클릴옥시"는 -O-헤테로시클릴기를 지칭한다.
"치환된 헤테로시클릴옥시"는 -O-(치환된 헤테로시클릴)기를 지칭한다.
"헤테로시클릴티오"는 -S-헤테로시클릴기를 지칭한다.
"치환된 헤테로시클릴티오"는 -S-(치환된 헤테로시클릴)기를 지칭한다.
"히드라지닐"은 -NHNH2- 또는 =NNH- 기를 지칭한다.
"치환된 히드라지닐"은 알킬기와 같은 비수소 원자가 히드라지닐 아민기 중 하나 또는 둘 모두에 부가된 히드라지닐기를 지칭하고, 치환된 히드라지닐의 예는 -N(알킬)-NH2 또는 =N+(알킬)-NH2이다.
"니트로"는 -NO2 기를 지칭한다.
"옥소"는 원자 (=O) 또는 (-O-)을 지칭한다.
"스피로시클릴"은 다음 구조:
Figure pct00026
로 예시되는 바와 같이 스피로 유니온(union)(이 유니온은 고리들의 유일한 공통 구성원인 단일 원자에 의해 형성된 유니온)과 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴 고리를 갖는 3 내지 10 개의 탄소 원자의 2가 포화 시클릭기를 지칭한다.
"설포닐"은 2가 기 -S(O)2-를 지칭한다.
"치환된 설포닐"은 -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-알케닐, -SO2-치환된 알케닐, -SO2-시클로알킬, -SO2-치환된 시클로알킬, -SO2-시클로알케닐, -SO2-치환된 시클로알케닐, -SO2-아릴, -SO2-치환된 아릴, -SO2-헤테로아릴, -SO2-치환된 헤테로아릴, -SO2-헤테로시클릭, -SO2-치환된 헤테로시클릭기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다. 치환된 설포닐은 메틸-SO2-, 페닐-SO2- 및 4-메틸페닐-SO2-와 같은 기를 포함한다.
"설포닐옥시"는 -OSO2-알킬, -OSO2-치환된 알킬, -OSO2-알케닐, -OSO2-치환된 알케닐, -OSO2-시클로알킬, -OSO2-치환된 시클로알킬, -OSO2-시클로알케닐, -OSO2-치환된 시클로알케닐, -OSO2-아릴, -OSO2-치환된 아릴, -OSO2-헤테로아릴, -OSO2-치환된 헤테로아릴, -OSO2-헤테로시클릭, -OSO2-치환된 헤테로시클릭기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"티오아실"은 H-C(S)-, 알킬-C(S)-, 치환된 알킬-C(S)-, 알케닐-C(S)-, 치환된 알케닐-C(S)-, 알키닐-C(S)-, 치환된 알키닐-C(S)-, 시클로알킬-C(S)-, 치환된 시클로알킬-C(S)-, 시클로알케닐-C(S)-, 치환된 시클로알케닐-C(S)-, 아릴-C(S)-, 치환된 아릴-C(S)-, 헤테로아릴-C(S)-, 치환된 헤테로아릴-C(S)-, 헤테로시클릭 -C(S)- 및 치환된 헤테로시클릭 -C(S)-기를 지칭하고, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다.
"티올"은 -SH기를 지칭한다.
"티오카르보닐"은 -C(=S)-와 동등한 2가 기 -C(S)-를 지칭한다.
"티온"은 원자 (=S)를 지칭한다.
"알킬티오"는 -S-알킬기를 지칭하고, 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같다.
"치환된 알킬티오"는 -S-(치환된 알킬)기를 지칭하고, 여기서 치환된 알킬은 본원에 정의된 바와 같다.
본원에서 사용된 용어 "검출가능한 반응"은 관찰에 의해 또는 도구에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호의 발생 또는 변화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 반응은 파장 분포 패턴 또는 흡광도 또는 형광 강도의 변화 또는 광 산란, 형광 수명, 형광 편광, 또는 상기 매개변수의 조합의 변화를 초래하는 광학 반응이다.
본원에 사용된 용어 "염료"는 빛을 방출하여 관찰가능한 검출가능한 신호를 생성하는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형광원성"은 관심있는 생물학적 화합물 또는 분석물에 결합시 및/또는 효소에 의한 절단시 형광의 변화를 나타내는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형광단"은 여기시 빛을 방출할 수 있는 모이어티 또는 화합물을 지칭하고, 관심있는 생물학적 화합물 또는 분석물에 결합시 및/또는 효소에 의한 절단시 형광을 나타내는 형광원성 형광단을 포함한다. 본 개시물의 형광단은 형광단의 용해도, 스펙트럼 특성 또는 물리적 특성을 변경하기 위해 치환될 수 있다.
본원에 사용된 "제약학상 허용되는 염" 또는 "생물학적으로 적합한 염"은 사용될 때 독성이 없고 생물분자에 실질적으로 해로운 영향을 미치지 않는 반대 이온이다. 그러한 염의 예는 그 중에서도 K+, Na+, Cs+, Li+, Ca2+, Mg2+, Cl-, AcO- 및 알킬암모늄 또는 알콕시암모늄 염을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "링커" 또는 "L"은 단일 공유 결합 또는 일련의 안정한 공유 결합을 포함하는 모이어티를 지칭하며, 이 모이어티는 종종 형광원성 또는 형광 화합물을 화학적 반응성 기 또는 생물학적 및 비생물학적 성분과 같은 또 다른 모이어티에 공유결합적으로 부착하는 C, N, O, S 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 1-40 개의 복수 원자가 원자를 포함한다. 링커에서 복수 원자가 원자의 수는 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30 또는 최대 40 또는 그 초과까지의 더 큰 수일 수 있다. 링커는 선형 또는 비선형일 수 있고; 일부 링커는 펜던트 측쇄 또는 펜던트 작용기, 또는 둘 모두를 가진다. 그러한 펜던트 모이어티의 예는 친수성 개질기, 예를 들어 설포(-SO3H 또는 -SO3-) 같은 가용화 기이다. 일부 실시양태에서, L은 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 질소-질소 결합, 탄소-산소 결합 및 탄소-황 결합의 임의의 조합으로 이루어진다. 예시적인 연결 구성원은 -C(O)NH-, -C(O)O-, -NH-, -S-, -O- 등을 포함하는 모이어티를 포함한다. 링커는 예로서 알킬; -C(O)NH-; -C(O)O-; -NH-; -S-; -O-; -C(O)-; n이 0, 1 또는 2인 -S(O)n-; 5- 또는 6-원 모노시클릭 고리; 및 임의의 펜던트 작용기, 예를 들어 설포, 히드록시 및 카르복시로부터 선택된 모이어티의 조합으로 이루어질 수 있다. 반응성 기 또는 반응성 링커(Rx)에 결합된 링커에 의해 형성된 모이어티는 -L-Rx로 명명될 수 있다. 반응성 기는 그와 반응성인 물질과 반응할 수 있으며, 이에 따라 링커는 접합된 물질(Sc)에 결합되고, -L-Sc로 명명될 수 있거나, 또는 일부 경우에서, 링커는 반응성 기의 잔기(예를 들어, 에스테르의 카르보닐기)를 함유할 수 있고, "-LR"로 명명될 수 있다. "절단가능한 링커"는 반응 또는 조건의 결과에 의해 파괴될 수 있는 하나 이상의 절단가능한 기를 갖는 링커이다. 용어 "절단가능한 기"는 방출되는 모이어티를 접합체의 나머지에 연결하는 결합을 절단함으로써 접합체의 나머지로부터 접합체의 일부, 예를 들어 형광원성 또는 형광 모이어티의 방출을 허용하는 모이어티를 지칭한다. 그러한 절단은 본질적으로 화학적이거나, 또는 효소에 의해 매개된다. 예시적인 효소에 의해 절단가능한 기는 천연 아미노산 또는 천연 아미노산으로 끝나는 펩티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "반응성 리간드"(또는 "Rx")라고도 불리는 용어 "반응성 기"는 또 다른 화학적 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 즉, 적절한 반응 조건 하에서 공유결합적 반응성인 기를 지칭하고, 일반적으로 또 다른 물질의 부착 지점을 나타낸다. 반응성 기는 상이한 화합물의 작용기와 화학적으로 반응하여 공유결합적 연결을 형성할 수 있는 본 개시물의 화합물 상의 모이어티, 예컨대 카르복실산 또는 숙신이미딜 에스테르이다. 반응성 기는 일반적으로 친핵체, 친전자체 및 광활성화가능 기를 포함한다.
예시적인 반응성 기는 올레핀, 아세틸렌, 알콜, 페놀, 에테르, 옥사이드, 할라이드, 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 히드라진, 히드라존, 히드라지드, 디아조, 디아조늄, 니트로, 니트릴, 메르캅탄, 설피드, 디설피드, 설폭시드, 설폰, 설폰산, 설핀산, 아세탈, 케탈, 안하이드라이드, 설페이트, 설펜산 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니트론, 히드록실아민, 옥심, 히드록삼산, 티오히드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 설파이트, 엔아민, 인아민, 우레아, 슈도우레아, 세미카르바지드, 카르보디이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 아족시 화합물 및 니트로소 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 반응성 작용기는 또한 생물접합체를 제조하는 데 사용되는 것, 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르(또는 숙신이미딜 에스테르(SE)), 말레이미드, 설포디클로로페닐 (SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란, 시클로옥틴-아민 등을 포함한다. 이 작용기 각각을 제조하는 방법은 관련 분야에 잘 알려져 있고, 특정 목적에 그의 응용 또는 특정 목적을 위한 그의 변형은 관련 분야의 기술을 가진 자의 능력 내에 있다(예를 들어, SandleRand Karo, eds., Organic Functional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989). 예시적인 반응성 기 또는 반응성 리간드는 NHS 에스테르, 포스포르아미다이트 및 아래 표 1에 열거된 다른 모이어티를 포함한다. 또한 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 및 사카라이드(예를 들어, 리보실 및 데옥시리보실)는 적어도 효소 촉매작용을 통해 포스포디에스테르 결합을 형성하는 그의 능력 때문에 반응성 리간드로 간주된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 포화 알킬기는 반응성 리간드로 간주되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "담체 분자"는 본원에 개시된 세포-추적물질 화합물에 공유결합적으로 결합되는 또는 결합된 생물학적 또는 비생물학적 성분을 지칭한다. 그러한 성분은 아미노산, 펩티드, 단백질, 다당류, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 합텐, 소랄렌, 약물, 호르몬, 지질, 지질 어셈블리, 합성 중합체, 중합체 마이크로입자, 생물학적 세포, 바이러스 및 그의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 담체 분자가 적어도 4 개의 복수 원자가 원자 및 종종 10 개 초과의 복수 원자가 원자(즉, 수소 및 할로 이외의 원자), 예를 들어 적어도 20 개의 그러한 원자를 갖는 모이어티의 경우에서와 같이 적어도 15 개의 그러한 원자를 갖는 유기 모이어티를 포함하는 실시양태가 포함된다.
용어 "접합되는 물질" 또는 "Sc"는 담체 분자 또는 고체 지지체를 지칭한다.
본원에 사용된 "표적 결합 모이어티"는 화합물에 특이적 결합 활성 및 형광 또는 형광원성 특성 둘 모두를 제공하기 위해 형광단에 부착되거나 또는 부착될 수 있는 모이어티를 지칭한다. 예시적인 표적 결합 모이어티는 탁솔 또는 액틴 결합 펩티드와 같은 세포골격 결합 모이어티; 훽스트 또는 니트로-훽스트와 같은 DNA 결합 모이어티; 폴리뉴클레오타이드(상보적 서열에 혼성화할 수 있음); 및 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "고체 지지체"는 액체 상에 실질적으로 불용성이고 관심 분자 또는 입자와 결합할 수 있는 매트릭스 또는 매질을 의미한다. 본원에서 사용하기에 적당한 고체 지지체는 반고체 지지체를 포함하며, 특정 유형의 지지체로 제한되지 않는다. 유용한 고체 지지체는 고체 및 반고체 매트릭스, 예컨대 에어로겔 및 히드로 겔, 수지, 비드, 바이오칩(박막 코팅된 바이오칩 포함), 마이크로유체 칩, 규소 칩, 멀티-웰 플레이트(마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로플레이트라고도 함), 막, 전도성 및 비전도성 금속, 유리(현미경 슬라이드 포함) 및 자기 지지체를 포함한다. 유용한 고체 지지체의 보다 구체적인 예는 실리카겔, 중합체 막, 입자, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 알루미나 겔, 다당류, 예컨대 SEPHAROSE®(GE Healthcare), 폴리(아크릴레이트), 폴리스티렌, 폴리(아크릴아미드), 폴리올, 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 덱스트란, 전분, FICOLL®(GE Healthcare), 헤파린, 글리코겐, 아밀로펙틴, 만난, 이눌린, 니트로셀룰로오스, 디아조셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌(폴리(에틸렌 글리콜) 포함), 나일론, 라텍스 비드, 자기 비드, 상자성 비드, 초상자성 비드, 전분 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "염색"은 현미경 영상에서 대비를 향상시키기 위해 현미경에서 사용되는 기술이다. 염색제 및 염료는 생물학적 조직 및 세포의 구조를 강조하는 데 자주 사용된다. 염색은 또한 단백질, 핵산, 지질 또는 탄수화물과 같은 특정 화합물의 존재를 정량화하거나 또는 정성화하기 위해 기질에 염료를 첨가하는 것을 포함한다. 생물학적 염색은 또한 유세포 분석에서 세포를 표지화하고 겔 전기영동에서 단백질 또는 핵산을 플래그(flag)하는 데 사용된다. 염색은 생물학적 물질에 제한되지 않으며 반결정질 중합체 및 블록 공중합체와 같은 다른 물질의 형태학을 연구하는 데 사용할 수 있다.
"저급 알킬"은 1 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 및 분지형 탄화수소 모이어티, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 네오펜틸, tert-펜틸 등을 나타낸다. "저급 할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자 치환체, 일반적으로 플루오린, 클로로, 브로모 또는 아이오도를 갖는 저급 치환된 알킬을 나타낸다.
"저급 알켄"은 탄소-탄소 결합 중 하나 이상이 이중 결합인 1 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소를 나타낸다.
"저급 알킨"은 하나 이상의 탄소가 삼중 결합으로 결합된 1 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소를 나타낸다.
"뉴클레오사이드"는 1' 위치에서 오탄당에 연결된, 푸린, 데아자푸린, 또는 피리미딘 뉴클레오사이드 염기, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 데아자아데닌, 데아자구아노신 등으로 이루어진 화합물을 지칭한다. 뉴클레오사이드 염기가 푸린 또는 7-데아자푸린인 경우에는 당 모이어티가 푸린 또는 데아자푸린의 N9-위치에 부착되고, 뉴클레오사이드 염기가 피리미딘인 경우에는 당 모이어티가 피리미딘의 N1 위치에 부착되고, 예를 들어, Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992).
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스테르, 예를 들어, 트리포스페이트 에스테르를 지칭하고, 여기서 에스테르화의 가장 흔한 부위는 오탄당의 C-5 위치에 부착된 히드록실기이다. 본원에 사용된 용어 "뉴클레오사이드/타이드"는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 둘 모두 및 그들의 유사체를 포함하는 화합물의 집합을 지칭한다. 뉴클레오사이드/타이드와 관련하여 "유사체"는 변형된 염기 모이어티, 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 포스페이트 모이어티를 갖는 합성 유사체를 포함하며, 예를 들어 Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980)에 의해 일반적으로 기재된다. 포스페이트 유사체는 인 원자가 +5 산화 상태로 있고 산소 원자 중 하나 이상이 비산소 모이어티로 대체된 포스페이트의 유사체를 포함하고, 예시적인 유사체는 반대 이온이 존재하는 경우에는 연계된 반대 이온, 예를 들어 H+ , NH4 + , Na+ 등을 포함하는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트, 보로노포스페이트 등을 포함한다. 예시적인 염기 유사체는 2,6-디아미노푸린, 하이포크산틴, 슈도우리딘, C-5-프로핀, 이소시토신, 이소구아닌, 2-티오피리미딘 및 다른 유사한 유사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 당 유사체는 2'-변형을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 여기서 2'-위치는 수소, 히드록시, 알콕시, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 알릴옥시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시 및 페녹시, 아미노 또는 알킬아미노, 플루오로, 클로로, 및 브로모이다. 용어 "표지화된 뉴클레오사이드/타이드"는 화학식 (I)의 염료 화합물에 임의로 링커를 통해 공유결합적으로 부착된 뉴클레오사이드/타이드를 지칭한다.
"폴리뉴클레오타이드"("올리고뉴클레오타이드"를 포함함)는 이중 및 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 그의 α-아노머 형태 등을 포함하는 천연 뉴클레오타이드 모노머 또는 그의 유사체의 선형 중합체를 의미한다. 통상적으로 뉴클레오사이드 단량체는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되며, 여기서 본원에서 사용된 용어 "포스포디에스테르 연결"은 반대 이온이 존재하는 경우에는 연계된 반대 이온, 예를 들어 H+, NH4 +, Na+ 등을 포함하는 포스포디에스테르 결합 또는 그의 포스페이트 유사체를 포함하는 결합을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 대표적으로 크기가 수 개, 예를 들어 8 내지 40 개의 단량체성 단위부터 수천 개의 단량체성 단위의 범위이다. 폴리뉴클레오타이드를 문자열로 나타낼 때는 언제나, 다르게 언급되지 않는다면, 뉴클레오타이드가 왼쪽에서 오른쪽으로 5'-> 3' 순서이고, "A"가 데옥시아데노신을 나타내고, "C"가 데옥시시티딘을 나타내고, "G"가 데옥시구아노신을 나타내고, "T"가 티미딘을 나타낸다는 것을 이해할 것이다.
"물 가용화 기"는 수용액에서 본 발명의 화합물의 용해도를 증가시키는 치환체를 의미한다. 예시적인 물 가용화 기는 사차 아민, 설페이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 폴리에테르, 폴리히드록실, 보로네이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸렌 옥사이드 반복 단위(-(CH2CH2O)-)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시 화합물, 조성물, 방법, 용도 및 키트
본원에서는 규소-로다민(SiR) 염료 및 그의 접합체, 그러한 염료를 포함하는 키트 및 조성물, 뿐만 아니라 생물학적 물질을 검출하고 정량화하기 위해 그러한 염료를 사용하는 방법, 그러한 염료의 제조 및/또는 작용성화 또는 접합 방법이 제공된다.
1. 염료 및 접합체
상기 실시양태 1에 제시된 화학식 (I):
Figure pct00027
을 가지고,
여기서:
R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
각 L1은 독립적으로 링커이고;
각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
R3는 -COOH, SO3 -, H, R3a, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
R3a는
Figure pct00028
,
Figure pct00029
, 또는 -C(O)N(RN3)(RN4)이고;
RN3는 H, 메틸, C2-6 알킬, 또는 -CH2-A이고, 여기서 A는 적어도 하나의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
RN4는 -L1-RA, 또는 -L1-RB1, 또는 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q는 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
R3b는 -OH 또는 -N(RN5)-L3a-RB이고;
각 L3a는 독립적으로 링커이고;
RB는 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티이고;
RN5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이고;
R4는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
E는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
R9은 SO3, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 및/또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, -C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 및/또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
R13은
Figure pct00030
이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸(Ac), AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이고;
추가로, 여기서 (i) R1이 메틸 또는 C2-6 알킬이면, R2는 메틸 또는 C2-6 알킬이 아니거나, 또는 (ii) R3는 R3a 또는 -L1-RB1인 화합물 또는 그의 스피로락톤 형태 및/또는 염이 개시된다.
또한 도 1a-1q에 나타낸 화합물 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 및 59도 개시된다. 트리에틸아민과 같은 반대 이온을 화합물 10A-13과 같은 일부 화합물과 함께 나타내지만, 그러한 화합물의 언급은 명시적으로 지시되지 않으면 특정 반대 이온을 포함하지 않는다. 이와 같이, 예를 들어, "화합물 10A"는 다른 양이온과의 염 뿐만 아니라 상응하는 유리 설폰산(설포닐 히드록사이드)을 포함한다. 마찬가지로, 일부 경우에, 전구체, 부산물, 시약 등이 예를 들어 화합물 45와 함께 예시되고; 이것은 정보 제공 목적만을 위한 것이고, 화합물의 구조 자체를 제한하지 않는다. R1, R2 등과 같은 치환체는 위에서 제시된 실시양태 중 어느 하나 및 청구범위에 제시된 값, 예를 들어 실시양태 1에서 화학식 (I)에 대해 제시된 값을 가질 수 있다.
또한 R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 또는 RN2가 위에서 제시된 실시양태 중 어느 하나 및 청구범위에 제시된 값을 갖는 화합물도 개시된다.
화합물 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 및 59로 열거된 선택된 화합물이 본 개시물의 염료의 배타적 목록임을 의도하지 않는다. 본 개시물의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 치환체 및 화합물 구조에서 많은 변형, 치환 및 변경이 가능하다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 또한 본원에 기재된 화합물의 접합체도 제공된다.
페닐 고리(즉, 화학식 (I)에서 R3 위치)에 2'-카르복실기를 포함하는 본 개시물의 SiR 화합물은 스피로락톤(비형광일 수 있음)과 형광 형태(예를 들어, 양쪽성이온) 사이에서 평형 상태로 존재할 수 있다. 도 1R을 참조한다. 스피로락톤 형태로의 이성질화는 SiR 화합물을 세포 투과성이 되게 할 수 있다. 따라서, 또한 본원에 개시된 SiR 화합물의 스피로락톤 형태, 예를 들어 본원에 개시된 페닐 고리에 2'-카르복실기를 포함하는 SiR 화합물의 스피로락톤 형태도 본원에 제공된다. 스피로락톤화는 염료가 비결합될 때 선호될 수 있지만(임의의 특정 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 아마도 유리 염료 분자의 소수성 응집 때문일 것임), 형광 양쪽성이온성 상태는 표적과 연계될 때 선호될 수 있다. 따라서, 염료는 비형광 스피로락톤 형태가 표적 결합시 형광 양쪽성이온으로 전환된다는 점에서 표적 결합 의존 형광원성을 나타낼 수 있다.
대안으로, 2'-카르복실기 이외의 R3 치환체는 스피로락톤화를 방지할 수 있고, 그 결과로 염료가 형광 상태에서 벗어나서 이성질화할 수 없고/거나 본 개시물의 SiR 염료를 살아있는 세포에 대해 불침투성이게 할 수 있다. 그러한 염료는 살아있는/죽은 세포 구별에 유용할 수 있다. 추가로, 그러한 염료는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 표적 결합 모이어티에 접합될 수 있으며, 이는 투과성 및/또는 죽은 세포 내부에서의 체류 시간 및/또는 살아있는/죽은 세포 구별 실험에서 형광 차이를 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 근적외선 형광을 나타내는 화합물이 제공된다. 본 개시물의 SiR 화합물의 형광은 SiR의 융합 고리 시스템에 추가 고리를 포함함으로써 적색 편이될 수 있다. 예를 들어, RN1 및 R5는 함께 고리를 형성할 수 있고, R6 및 RN2는 함께 고리를 형성할 수 있다. RN1 및 R5 및 R6 및 RN2에 의해 형성된 고리는 각각 적어도 하나의 추가 고리에 추가로 융합될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, RN1 및 R7은 함께 고리를 형성할 수 있고, R8 및 RN2는 함께 고리를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 5 개의 고리를 포함하는 융합 고리 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 7 개의 고리를 포함하는 융합 고리 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 9 개의 고리를 포함하는 융합 고리 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전술한 융합 고리 시스템 중 임의의 하나는 5- 및 6-원 고리로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 전술한 융합 고리 시스템 중 임의의 하나는 6-원 고리로 이루어진다. 5 개 이상의 고리의 융합 고리 시스템을 포함하는 예시적인 화합물은 화합물 18-37 및 45-59이다. 일부 실시양태에서, 전술한 화합물 중 임의의 하나의 융합 고리 시스템은 또 다른 SiR 화합물의 R1, R2, R3 및 R4 또는 임의의 번호를 매긴 실시양태 또는 청구범위에 정의된 R1, R2, R3 및 R4를 포함하여 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같은 또는 본원에 개시된 임의의 실시양태에 제시된 바와 같은 R1, R2, R3 및 R4와 조합된다.
일부 실시양태에서, 화합물은 화학식 (I)의 규소 및 R4를 통과하는 거울 대칭 평면을 가지며, 임의로 R1 및 R2가 반드시 동일하지는 않다는 예외를 가진다. RN1에 부착된 질소 또는 RN2에 부착된 질소 상의 형식 전하 및 공명을 통해 재배열할 수 있거나 또는 분자 궤도 또는 공액 파이 시스템에서 비편재화할 수 있는 이중 결합의 형식적 위치가 대칭을 파괴한다고 여기지 않는다. 추가로, R3 및 E는 일반적으로 이들이 결합된 고리와 규소를 포함하는 고리 시스템 사이의 결합의 회전을 통해 대칭 평면을 차지할 수 있을 정도로 대칭을 파괴하지 않는다. 따라서, 예를 들면, 화합물 1A는 화학식 (I)의 규소 및 R4를 통과하는 거울 대칭 평면을 가지며, 화합물 1은 화학식 (I)의 규소 및 R4를 통과하는 거울 대칭 평면을 가지고, R1 및 R2가 동일하지 않다는 예외를 가진다.
관련 분야의 기술을 가진 자는 화합물이 호변 이성질체, 형태 이성질체, 기하 이성질체 및/또는 입체 이성질체 현상을 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 내의 화학식 그림이 모든 가능한 호변 이성질체, 형태 이성질체, 거울상 이성질체 또는 기하 이성질체 형태를 반드시 나타낼 수는 없기 때문에, 본 개시물이 본원에 기재된 하나 이상의 유용성을 갖는 화합물의 임의의 호변 이성질체, 형태 이성질체, 거울상 이성질체 및/또는 기하 이성질체 형태를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
추가로, 또한 화합물은 무엇보다도 그의 환경의 pH에 의존해서 많은 상이한 양성자화 상태로 존재할 수 있다는 것이 분명할 것이다. 본원에 제공된 구조식은 화합물을 몇 가지 가능한 양성자화 상태 중 오직 한 상태로만 묘사하지만, 이 구조들은 예시하는 것일 뿐이며, 본 개시물이 임의의 특정 양성자화 상태로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. SiR 화합물의 임의의 및 모든 양성자화된 형태가 본 개시물의 범위 내에 속하는 것을 의도한다.
게다가, 본 개시물의 화합물은 다수의 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 효소 기질과 연계된 반대 이온은 대표적으로 화합물을 얻는 합성 및/또는 단리 방법에 의해 결정된다. 전형적인 반대 이온은 암모늄, 나트륨, 칼륨, 리튬, 할라이드, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트 등 및 그들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 연계된 반대 이온의 정체성은 본 개시물의 중요한 특징이 아니며, 본 개시물은 달리 명시되지 않으면 임의의 유형의 반대 이온과 연계된 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 개시물의 일부 실시양태에서는, 본원에 제공된 임의의 화합물 및 적어도 하나의 용매를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 용매는 물 또는 DMSO, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 배양 배지를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서는, a) 하나 이상의 본원에 제공된 화합물; 및 b) 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서는, a) 하나 이상의 본원에 제공된 화합물; 및 b) 분석물을 포함하는 조성물이 제공된다.
2. 반응성 기, 담체 분자 및 고체 지지체
예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 SiR 화합물은 아크릴아미드, 카르복실산의 활성화된 에스테르, 아실 아지드, 아실 니트릴, 알데히드, 알킬 할라이드, 안하이드라이드, 아닐린, 아릴 할라이드, 아지드, 아지리딘, 보로네이트, 카르복실산, 디아조알칸, 할로아세트아미드, 할로트리아진, 히드라진, 히드라지드, 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 반응성 백금 착물, 설포닐 할라이드, 티올기 및 광활성화가능한 기로부터 선택되는 구성원인 반응성 기 또는 반응성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 또 다른 분자와의 접합에 유용한 반응성 기 또는 반응성 리간드를 포함한다. 예시적인 반응성 기 및/또는 리간드는 N-히드록시 숙신이미드(NHS) 에스테르, 카르복실, 카르복실 에스테르, 말레이미드, 아미드, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 아세톡시메틸(AM) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란 및 시클로옥틴-아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이들 반응성 기는 반응성 기 함유 SiR 화합물을 제공하기 위해 본원에 제공된 SiR 화합물의 합성 동안에 또는 합성 후에 공유결합적으로 부착될 수 있다. 이러한 방식으로, 반응성 기 함유 SiR 화합물은 적당한 반응성을 갖는 작용기를 함유하거나 또는 함유하도록 변형된 다양한 담체 분자 또는 고체 지지체에 공유결합적으로 부착될 수 있고, 그 결과로 성분들의 화학적 부착이 초래된다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 개시된 SiR 화합물의 반응성 기 및 고체 지지체의 담체 분자의 작용기는 그들 사이의 공유결합적 연결을 생성할 수 있는 친전자체 및 친핵체를 포함한다. 대안으로, 반응성 기는 광활성화가능한 기를 포함하고, 그것은 적절한 파장의 빛으로 조명한 후에만 화학적으로 반응성이 된다. 대표적으로, 반응성 기와 담체 분자 또는 고체 지지체 사이의 접합 반응의 결과로 반응성 기의 하나 이상의 원자가 담체 분자 또는 고체 지지체에 SiR 화합물을 부착하는 새로운 연결에 포함된다.
예를 들어, NHS 에스테르를 친핵성 기(예를 들어, 아미노기 또는 설프히드릴)를 갖는 링커 또는 분자에 접합하기 위한 일반적인 프로토콜은 NHS 에스테르를 수성 아세토니트릴에 물 중의 링커(또는 링커가 소수성인 경우에는 수성 아세토니트릴 용액)와 함께 용해하는 것을 수반한다(아세토니트릴의 백분율은 용해도를 얻기 위해 염료의 소수성에 의해 결정됨). 소용돌이 치게 하거나 또는 흔들면서 수성 중탄산나트륨 완충액(1M)을 용액에 첨가하여 0.1M 완충제 농도를 달성한다. 혼합물을 실온에서 10 분 내지 30 분 동안 흔들어 준다. 반응 혼합물 중의 조 접합체는 역상 HPLC로 정제할 수 있다.
작용기 및 연결의 선택된 예는 하기 표 1에 나타나 있으며, 여기서 친전자성 기와 친핵성 기의 반응은 공유결합적 연결을 생성한다. 관련 분야의 숙련된 자는 접합되는 화합물의 정체성, 그러한 화합물의 다른 모이어티의 반응성(예를 들어, 원하지 않는 부산물을 피하기 위해), 및 공유결합적 연결을 위해 원하는 특성에 의존해서 적절한 쌍의 기를 선택할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반응성 리간드는 표 1에 열거된 친전자성 기 또는 친핵성 기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화합물의 반응성 기 또는 반응성 리간드는 표 1에 열거된 친전자성 기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화합물의 반응성 기 또는 반응성 리간드는 표 1에 열거된 친핵성 기로부터 선택된다.
표 1. 유용한 공유결합적 연결에 이르는 일부 경로의 예
Figure pct00031
Figure pct00032
접합될 물질에 본 개시물의 SiR 화합물을 부착하는 데 사용되는 반응성 기의 선택은 대표적으로 접합될 물질의 반응성 기 또는 작용기 및 원하는 공유결합적 연결의 유형 또는 길이에 의존한다. 유기 또는 무기 물질(생물분자 또는 비생물분자)에 대표적으로 존재하는 작용기의 유형은 아민, 아미드, 티올, 알콜, 페놀, 알데히드, 케톤, 포스페이트, 이미다졸, 히드라진, 히드록실아민, 이치환된 아민, 할라이드, 에폭시드, 실릴 할라이드, 카르복실레이트 에스테르, 설포네이트 에스테르, 푸린, 피리미딘, 카르복실산, 올레핀 결합, 또는 이들 기의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단일 유형의 반응성 부위가 물질 상에서 이용가능할 수 있거나(다당류 또는 실리카의 경우에 대표적임), 또는 단백질의 경우에 대표적인 것처럼 다양한 부위가 존재할 수 있다(예를 들어, 아민, 티올, 알콜, 페놀).
대표적으로 반응성 기는 아민, 티올, 알콜, 알데히드, 케톤 또는 실리카와 반응할 것이다. 바람직하게는, 반응성 기는 아민 또는 티올 작용기 또는 실리카와 반응한다. 한 실시양태에서, 반응성 기는 아크릴아미드, 카르복실산의 활성화된 에스테르, 아실 아지드, 아실 니트릴, 알데히드, 알킬 할라이드, 실릴 할라이드, 안하이드라이드, 아닐린, 아릴 할라이드, 아지드, 아지리딘, 보로네이트, 디아조알칸, 할로아세트아미드, 할로트리아진, 히드라진 (히드라지드를 포함함), 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 반응성 백금 착물, 설포닐 할라이드, 또는 티올기이다. "반응성 백금 착물"은 특히 미국 특허 번호 5,714,327에 기재된 것과 같은 화학적 반응성 백금 착물을 의미한다.
반응성 기가 카르복실산의 활성화된 에스테르, 예컨대 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르, 설포닐 할라이드, 테트라플루오로페닐 에스테르 또는 이소티오시아네이트인 경우, 결과적으로 얻는 화합물은 담체 분자, 예컨대 단백질, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 합텐의 접합체를 제조하는 데 특히 유용하다. 반응성 기가 (미국 특허 번호 5,362,628; 5,352,803 및 5,573,904에 개시된 임의의 반응성 기를 포함해서) 말레이미드, 할로알킬 또는 할로아세트아미드인 경우, 결과적으로 얻는 화합물은 티올 함유 물질과의 접합에 특히 유용하다. 반응성 기가 히드라지드인 경우, 결과적으로 얻는 화합물은 퍼아이오데이트로 산화된 탄수화물 및 당 단백질과의 접합에 특히 유용하고, 추가로, 세포 미세주입을 위한 알데히드로 고정가능한 극성 추적자이다. 반응성 기가 실릴 할라이드인 경우에는, 특히 실리카 표면이 후속적으로 원격 이온 검출 또는 정량화에 사용되는 광섬유 프로브에 포함되는 경우, 결과적으로 얻는 화합물은 실리카 표면과의 접합에 특히 유용하다.
특정 양태에서, 반응성 기는 활성화가능한 기이고, 따라서 이 기는 적절한 파장으로 조명한 후에만 반응성 종으로 전환된다. 적절한 파장은 일반적으로 400 nm 미만의 UV 파장이다. 이 방법은 용액 중의 또는 고체 또는 반고체 매트릭스에 고정화된 표적 분자에만 특이적 부착을 제공한다. 이 방식으로, 광활성화가능한 반응성 기를 포함하는 본원에 제공된 SiR 화합물은 음이온성 단백질과 연계되어 그 단백질에 공유결합적으로 접합될 수 있다. 광활성화가능한 반응성 기는 제한없이 벤조페논, 아릴 아지드 및 디아지린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 반응성 기는 광활성화가능한 기, 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르, 할로아세트아미드, 할로알킬, 히드라진, 이소티오시아네이트, 말레이미드기, 지방족 아민, 실릴 할라이드, 카다베린 또는 소랄렌이다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 아이오도아세트아미드 또는 실릴 할라이드이다. 특정 실시양태에서 반응성 기는 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르, 설포닐 할라이드, 테트라플루오로페닐 에스테르, 아이오소 티오시아네이트 또는 말레이미드이다.
리포터 분자를 담체 분자 또는 고체 지지체에 부착하기 위한 공유결합적 연결의 선택은 대표적으로 접합될 성분의 화학적 반응성 기에 의존한다. 바로 앞 섹션에서 반응성 기에 관한 논의는 여기에서도 관련 있다. 히드라지닐 부속물 외에도, 생물학적 또는 비생물학적 성분에 대표적으로 존재하는 예시적인 반응성 기는 아민, 티올, 알콜, 페놀, 알데히드, 케톤, 포스페이트, 이미다졸, 히드라진, 히드록실아민, 이치환된 아민, 할라이드, 에폭시드, 설포네이트 에스테르, 푸린, 피리미딘, 카르복실산, 또는 이들 기의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단일 유형의 반응성 부위가 성분 상에서 이용가능하거나(다당류의 경우에 대표적임), 또는 단백질의 경우에 대표적인 바와 같이 다양한 부위가 존재할 수 있다(예를 들어, 아민, 티올, 알콜, 페놀). 담체 분자 또는 고체 지지체가 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 하나 초과의 리포터 분자, 또는 합텐에 의해 추가 변형된 물질에 접합될 수 있다. 반응 조건을 조심스럽게 제어함으로써 약간의 선택성을 얻을 수 있지만, 표지화의 선택성은 적절한 반응성 화합물의 선택에 의해 가장 잘 얻을 수 있다.
화학식 (I)의 SiR 화합물의 접합체가 형성되는 경우, 생성물은 여전히 화학식 (I)의 화합물로 간주되며, 여기서 새로 접합된 물질은 화학식 (I)의 펜던트 기, 예를 들어 R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 또는 RN2 중 하나를 통해 SiR 모이어티에 결합된 것으로 간주된다.
담체 분자:
또 다른 예시적인 실시양태에서, 본 설명의 SiR 화합물은 담체 분자에 공유결합적으로 결합된다. 화합물이 반응성 기(또는 반응성 리간드)를 가지면, 대안으로 담체 분자는 반응성 기를 통해 화합물에 연결될 수 있다. 반응성 기는 반응성 작용성 모이어티 및 링커 둘 모두를 함유할 수 있거나, 또는 반응성 작용성 모이어티만 함유할 수 있다.
다양한 담체 분자가 본 개시물에 유용하다. 예시적인 담체 분자는 항원, 스테로이드, 비타민, 약물, 합텐, 대사산물, 독소, 환경 오염 물질, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 핵산 중합체, 탄수화물, 지질 및 중합체를 포함한다.
예시적 실시양태에서, 담체 분자는 아미노산, 펩티드, 단백질, 다당류, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 합텐, 소랄렌, 약물, 호르몬, 지질, 지질 어셈블리, 합성 중합체, 중합체 마이크로입자, 생물학적 세포, 바이러스 및 그의 조합을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 담체 분자는 합텐, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산 중합체, 단백질, 펩티드 또는 다당류로부터 선택된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 또는 RN2로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원은 담체 분자를 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서 R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 또는 RN2 중 하나는 치환된 알킬기 또는 반응성 기, 예컨대 알킬-숙신이미딜기를 통해 결합된 담체 기를 포함한다.
예시적 실시양태에서, 담체 분자는 아미노산, 펩티드, 단백질, 다당류, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 합텐, 소랄렌, 약물, 호르몬, 지질, 지질 어셈블리, 합성 중합체, 중합체 마이크로입자, 생물학적 세포, 바이러스 및 그의 조합을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 담체 분자는 합텐, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산 중합체, 단백질, 펩티드 또는 다당류로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서 담체 분자는 아미노산, 펩티드, 단백질, 다당류, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 합텐, 소랄렌, 약물, 호르몬, 지질, 지질 어셈블리, 티라민, 합성 중합체, 중합체 마이크로입자, 생물학적 세포, 세포 성분, 이온 킬레이트화 모이어티, 효소 기질 또는 바이러스이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 담체 분자는 항체 또는 그의 단편, 항원, 아비딘 또는 스트렙타비딘, 비오틴, 덱스트란, 항체 결합 단백질, 형광 단백질, 아가로스, 및 비생물학적 마이크로입자이다. 대표적으로, 담체 분자는 항체, 항체 단편, 항체 결합 단백질, 아비딘, 스트렙타비딘, 독소, 렉틴 또는 성장 인자이다. 바람직한 합텐은 비오틴, 디곡시게닌 및 형광 단백질을 포함한다.
항체 결합 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 가용성 Fc 수용체, 단백질 L, 렉틴, 항-IgG, 항-IgA, 항-IgM, 항-IgD, 항-IgE 또는 그의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적 실시양태에서, 효소 기질은 아미노산, 펩티드, 당, 알콜, 알칸산, 4-구아니디노벤조산, 핵산, 지질, 설페이트, 포스페이트, -CH2OCO알킬 및 그의 조합으로부터 선택된다. 따라서, 효소 기질은 펩티다제, 포스파타제, 글리코시다제, 데알킬라제, 에스테라제, 구아니디노벤조타제, 설파타제, 리파제, 퍼옥시다제, 히스톤 데아세틸라제, 엔도글리코세라미다제, 엑소뉴클레아제, 리덕타제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소에 의해 절단될 수 있다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 담체 분자는 아미노산(포스페이트, 탄수화물, 또는 C1 내지 C22 카르복실산에 의해 보호되거나 또는 치환된 것을 포함함), 또는 아미노산의 중합체, 예컨대 펩티드 또는 단백질이다. 관련된 실시양태에서, 담체 분자는 적어도 5 개의 아미노산, 더 바람직하게는 5 내지 36 개의 아미노산을 함유한다. 예시적인 펩티드는 신경펩티드, 사이토카인, 독소, 프로테아제 기질 및 단백질 키나제 기질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 펩티드는 세포소기관 위치화 펩티드, 즉, 세포 수송 메카니즘에 의해 특정 세포 하위구조 내에 위치화를 위해 접합된 화합물을 표적화하는 역할을 하는 펩티드로서 기능할 수 있다. 바람직한 단백질 담체 분자는 효소, 항체, 렉틴, 당단백질, 히스톤, 알부민, 지단백질, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 피코빌리단백질 및 다른 형광 단백질, 호르몬, 독소 및 성장 인자를 포함한다. 대표적으로, 단백질 담체 분자는 항체, 항체 단편, 아비딘, 스트렙타비딘, 독소, 렉틴 또는 성장 인자이다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 담체 분자는 핵산 염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 핵산 중합체를 포함하고, 임의로 형광단 또는 다른 리간드의 부착을 위한 추가의 링커 또는 스페이서, 예컨대 알키닐 연결(미국 특허 번호 5,047,519), 아미노알릴 연결(미국 특허 번호 4,711,955) 또는 다른 연결을 함유한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 뉴클레오타이드 담체 분자는 뉴클레오사이드 또는 데옥시뉴클레오사이드 또는 디데옥시뉴클레오사이드이다.
예시적인 핵산 중합체 담체 분자는 단일 또는 다중 가닥, 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드 또는 DNA/RNA 하이브리드이거나, 또는 이례적인 링커, 예컨대 모르폴린 유도체화된 포스페이트 (AntiVirals, Inc., Corvallis OR), 또는 펩티드 핵산, 예컨대 N-(2-아미노에틸)글리신 단위를 포함하고, 여기서 핵산은 50 개 미만의 뉴클레오타이드, 더 대표적으로 25 개 미만의 뉴클레오타이드를 함유한다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 담체 분자는 대표적으로 다당류, 예컨대 덱스트란, FICOLL (GE Healthcare, Fairfield, CT), 헤파린, 글리코겐, 아밀로펙틴, 만난, 이눌린, 전분, 아가로스 및 셀룰로스인 탄수화물 또는 폴리올을 포함하거나, 또는 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 관련된 실시양태에서, 다당류 담체 분자는 덱스트란, 아가로스 또는 FICOLL을 포함한다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 담체 분자는 당지질, 인지질 및 스핑고지질을 포함하는 지질(대표적으로 6-25 개의 탄소를 가짐)을 포함한다. 대안으로, 담체 분자는 리포좀과 같은 지질 소포를 포함하거나, 또는 지단백질이다 (아래 참조). 일부 친지성 치환체는 세포 또는 세포의 세포소기관으로의 접합된 염료 화합물의 수송을 용이하게 하는 데 유용하다.
대안으로, 담체 분자는 세포, 세포 시스템, 세포 단편 또는 세포하 입자이다. 이 유형의 접합된 물질의 예는 바이러스 입자, 박테리아 입자, 바이러스 성분, 생물학적 세포(예컨대, 동물 세포, 식물 세포, 박테리아 또는 효모) 또는 세포 성분을 포함한다. 표지화될 수 있거나 또는 구성 분자가 표지화될 수 있는 세포 성분의 예는 리소좀, 엔도좀, 세포질, 핵, 히스톤, 미토콘드리아, 골지체, 소포체 및 액포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서 담체 분자는 금속 킬레이트화 모이어티이다. 관심 금속 이온에 결합하여 그의 형광 특성의 변화를 주는 임의의 킬레이트화제가 적당한 접합체이지만, 바람직한 금속 킬레이트화 모이어티는 Kuhn et al.의 미국 특허 번호 5,405,975(1995)에 기재된 바와 같은 디아릴디아자 크라운 에테르를 포함하는 크라운 에테르; Kuhn et al.의 미국 특허 번호 5,453,517(1995)(참고로 포함됨) 및 Tsien et al.의 미국 특허 번호 5,049,673(1991)에 기재된 바와 같은 1,2-비스-(2-아미노페녹시에탄)-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA)의 유도체; Raju et al., Am. J. Physiol., 256 : C540 (1989)에 기재된 바와 같은 2-카르복시메톡시-아닐린-N,N-디아세트산(APTRA)의 유도체; 및 Kuhn et al.의 미국 특허 번호 5,648,270.(1997)에 기재된 바와 같은 피리딜 기반 및 페난트롤린 금속 이온 킬레이트화제이다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 담체 분자는 유기 또는 무기 물질과 비공유결합적으로 연계된다. 친지성 치환체를 가지는 담체 분자의 예시적인 실시양태는 예를 들어 막 구조를 위한 프로브로서 사용하기 위해 또는 리포좀, 지단백질, 필름, 플라스틱, 친지성 마이크로스피어 또는 유사한 물질에 포함시키기 위해 막 내에 염료 화합물의 비공유결합적 포함에 의해 지질 어셈블리, 예컨대 생물학적 막 또는 리포좀을 표적화하는 데 이용될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 담체 분자는 특이적 결합 쌍 구성원을 포함하며, 여기서 본 화합물은 특이적 결합 쌍 구성원에 접합되고, 샘플에서 분석물을 검출하는 데 사용된다. 대안으로, 표지화된 특이적 결합 쌍 구성원의 존재는 그 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원의 위치를 나타내고; 각 특이적 결합 쌍 구성원은 다른 한 구성원의 특정 공간 및 극성 조직에 특이적으로 결합하고 그와 상보적인 영역을 표면 상에 또는 캐비티 안에 갖는다. 예시적인 결합 쌍은 표 2에 제시되어 있다.
표 2. 대표 특이적 결합 쌍
Figure pct00033
고체 지지체
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 SiR 화합물은 고체 지지체에 공유결합적으로 결합된다. 고체 지지체는 형광단을 통해, 또는 존재하는 경우 반응성 기를 통해, 또는 존재하는 경우 담체 분자를 통해 SiR 화합물에 부착될 수 있다.
본원에서 사용하기에 적당한 고체 지지체는 대표적으로 액체상에서 실질적으로 불용성이다. 본원에서 사용하기 위한 고체 지지체는 특정 유형의 지지체에 제한되지 않는다. 오히려, 많은 지지체가 이용가능하며 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있다. 따라서 유용한 고체 지지체는 고체 및 반고체 매트릭스, 예컨대 에어로겔 및 히드로겔, 수지, 비드, 바이오칩 (박막 코팅된 바이오칩 포함), 마이크로유체 칩, 규소 칩, 멀티-웰 플레이트 (마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로플레이트라고도 부름), 막, 전도성 및 비전도성 금속, 유리(현미경 슬라이드 포함) 및 자기 지지체를 포함한다. 유용한 고체 지지체의 더 구체적인 예는 실리카겔, 중합체 막, 입자, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 알루미나 겔, 다당류, 예컨대 SEPHAROSE (GE Healthcare, Fairfield, CT), 폴리(아크릴레이트), 폴리스티렌, 폴리(아크릴아미드), 폴리올, 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 덱스트란, 전분, FICOLL (GE Healthcare), 헤파린, 글리코겐, 아밀로펙틴, 만난, 이눌린, 니트로셀룰로오스, 디아조셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌(폴리(에틸렌 글리콜) 포함), 나일론, 라텍스 비드, 자기 비드, 상자성 비드, 초상자성 비드, 전분 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체는 본원에 개시된 염료 화합물에 부착하기 위한 히드록실, 카르복실, 아미노, 티올, 알데히드, 할로겐, 니트로, 시아노, 아미도, 우레아, 카르보네이트, 카르바메이트, 이소시아네이트, 설폰, 설포네이트, 설폰아미드, 설폭시드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고체 지지체 반응성 작용기를 포함할 수 있다. 유용한 반응성 기는 위에 개시되어 있으며, 본원의 고체 지지체 반응성 작용기에 동일하게 적용될 수 있다.
적당한 고체상 지지체는 원하는 최종 용도 및 다양한 합성 프로토콜에 대한 적합성을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 SiR 화합물을 고체 지지체에 부착하기 위해 아미드 결합 형성이 바람직한 경우, 펩티드 합성에 일반적으로 유용한 수지, 예컨대 폴리스티렌(예를 들어, Bachem Inc., Peninsula Laboratories로부터 얻는 PAM-수지 등), POLYHIPE 수지(캐나다 Aminotech로부터 얻음), 폴리아미드 수지(Peninsula Laboratories로부터 얻음), 폴리에틸렌글리콜로 그래프트된 폴리스티렌 수지(TENTAGEL, Rapp Polymere, Tubingen, Germany), 폴리디메틸-아크릴아미드 수지(캘리포니아 Milligen/Biosearch로부터 얻음) 또는 PEGA 비드 (Polymer Laboratories로부터 얻음)가 이용될 수 있다.
3. 표적 결합 모이어티와의 접합체
일반적으로, SiR 모이어티 및 접합되는 모이어티(예를 들어, 표적 결합 모이어티, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 포스포르아미다이트 등)를 포함하는 본원에 기재된 화합물에 관해서, SiR 모이어티는 치환체(예를 들어, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 또는 RN2)가 임의로 링커를 통해 SiR 모이어티에 연결되는 접합되는 모이어티를 포함하는 화학식 (I)의 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서는, R1 또는 R2가 접합되는 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서는, R3 또는 R4가 접합되는 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, SiR 모이어티가 표적 결합 모이어티, 예컨대 항체, 세포골격 결합 모이어티 또는 핵산 결합 모이어티에 연접된 접합체가 제공된다. 표적 결합 모이어티를 포함하는 SiR 화합물은 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기재된 형광 현미경 및 초고해상도 현미경 응용을 위해 표적 결합 모이어티에 의해 결합된 표적을 형광 염색하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 그러한 접합체를 제조하기 위해, 표적 결합 모이어티의 반응성 기(예를 들어, 항체 상의 아민)는 화학식 (I)의 화합물의 NHS 에스테르와 같은 반응성 기와 반응하여 본 개시물에 따른 접합체를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에 개시된 화합물이 먼저 그의 모이어티를 표적 결합 모이어티와 반응하는 반응성 리간드로 전환함으로써 활성화된다. 그러한 접합 반응의 생성물은 또한 본원에 개시된 화합물로 간주된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 표적 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 모이어티는 화학식 (I)의 R1, R2, R3, 또는 R4의 일부이다. 표적 결합 모이어티는 적절한 유도체화 절차를 이용하여, 예를 들어 R1, R2, R3, 또는 R4가 R1 또는 R2에 반응성 리간드, 예를 들어 비닐(또는 예를 들어 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 티올-엔 반응을 이용하여 제공될 수 있는 카르복실 또는 아민과 같은 상이한 반응성 기; 예를 들면, R2에서의 유도체화를 포함하는 예시적인 합성 경로에 대해서는 도 2B-2D를 참조하고, 이것은 R1에서의 유도체화에 준용될 수 있다), 또는 R3 또는 R4에 반응성 리간드, 예컨대 카르복실을 포함하는 화학식 (I)의 화합물로부터 시작하여 예를 들어 전술한 위치 중 하나에서 SiR 모이어티에 접합될 수 있다. R3에서의 유도체화를 포함하는 예시적인 합성 경로에 대해서는 도 2E를 참조하고, 이것은 R4에서의 유도체화에 준용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 결합 모이어티는 세포골격 결합 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 세포골격 결합 모이어티는 도세탁셀과 같은 미세관 결합 모이어티이다. 접합되는 도세탁셀의 예시적인 구조는
Figure pct00034
이고, 여기서 물결선은 예를 들어 링커를 통한 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어, 화합물 5를 참조한다.
일부 실시양태에서, 세포골격 결합 모이어티는 액틴 결합 펩티드이다. 접합되는 액틴 결합 펩티드의 예시적인 구조는
Figure pct00035
이고, 여기서 물결선은 예를 들어 링커를 통한 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어, 화합물 6을 참조한다.
일부 실시양태에서, 표적 결합 모이어티는 팔로이딘과 같은 액틴 결합 모이어티이다. 예시적인 팔로이딘 접합체는 화합물 7A와 같은 규소 로다민을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 결합 모이어티는 DNA 결합 모이어티와 같은 핵산 결합 모이어티이다. 예시적인 핵산 결합 모이어티는 훽스트 모이어티 또는 니트로-훽스트 모이어티이다. 접합되는 훽스트 모이어티의 예시적인 구조는
Figure pct00036
이고, 여기서 물결선은 예를 들어 링커를 통한 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어 화합물 4 및 7을 참조한다. 접합되는 니트로-훽스트 모이어티의 예시적인 구조는
Figure pct00037
이고, 여기서 물결선은 예를 들어 링커를 통한 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어 화합물 7B를 참조한다. 훽스트의 형광 스펙트럼과 겹치는 형광 스펙트럼을 갖는 또 다른 염료를 포함할 수 있는 응용에서는, 감소된 형광 블리드-스루(bleed-through)를 갖는 니트로-훽스트 모이어티를 사용하는 것이 바람직할 수 있다 (실시예 4 참조).
R3 위치에서의 유도체화를 포함하는 고정 세포를 염색하기 위한 접합체의 제조의 일반적인 예시에 대해서는 도 10a를 참조한다.
4. 포스포르아미다이트 및 표지화된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드
또한 포스포르아미다이트를 포함하는 화학식 (I)에 따른 화합물이 본원에 제공된다. 포스포르아미다이트는 화학식 (I)의 R1, R2, R3, 또는 R4 기의 일부일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물은 화학식 (L1):
Figure pct00038
을 가지고, 여기서 X 및 Y가 함께 링커를 형성하고; B1이 포스파이트 에스테르 보호기이고; B2 및 B3가 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴, 및 시클로알킬이고; D가 SiR 함유 염료 모이어티인 포스포르아미다이트 화합물이다. 그러한 화합물은 뉴클레오타이드의 당 부분을 통한 고체 지지체 합성을 이용하여 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드 또는 화학적으로 자동화가능하게 합성된 폴리뉴클레오타이드의 5'-말단을 표지화하는 데 적당하다. Y는 화학식 (I)의 위치 R1, R2, R3 또는 R4 중 하나를 통해 D에 부착될 수 있다. X 및 Y는 다양한 형태를 취할 수 있지만, 구조 X-Y는 (i) 그것이 DNA 합성 조건에 안정하고, (ii) 폴리뉴클레오타이드-표적 혼성화를 실질적으로 방해하지 않으며, (iii) 그것이 부착된 염료의 형광을 켄칭하지 않는 것이어야 하고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,231,191, 5,258,538, 및 4,757,141, 및 5,212,304를 참조한다. 일부 실시양태에서, X는 선형 또는 시클릭 저급 알킬, 선형 또는 시클릭 치환된 저급 알킬, 폴리에틸렌 옥사이드, 1 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 저급 아릴, 펩티드 또는 폴리에테르이다.　 일부 실시양태에서, Y는 아미도, 설폰아미도, 우레아, 우레탄 또는 토우레아이다.　 예를 들어, Y는 아미도일 수 있고, X는 -(CH2)n-일 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 30, 예를 들어 2 내지 10, 예컨대 2 내지 6의 범위이다. 또 다른 예에서, Y는 아미도일 수 있고, X는 -(CH2CH2O)n- (즉, 선형 폴리에틸렌 옥사이드)일 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 30, 예를 들어 2 내지 10, 예컨대 2 내지 6의 범위이다.
포스포르아미다이트 화합물은 다양한 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 일반적으로, 합성은 다음과 같이 진행된다. D의 페놀성 히드록실이 있는 경우 이것은 DNA 합성 탈보호제, 예를 들어 암모니아, 에탄올아민, 메틸아민/수산화암모늄 혼합물, 및 t-부틸아민/물/메탄올(1:2:1)의 혼합물로 제거될 수 있는 염료 보호기로 보호되고, 예를 들어 미국 특허 번호 5,231,191을 참조한다. 그렇게 보호된 염료는 본원에서는 염료의 "보호된 유도체"라고 부른다. 일부 실시양태에서, 보호기는 벤조산 또는 피발산의 에스테르이다. 그 다음에 보호된 염료의 반응성 리간드, 예를 들어 카르복실산을 예를 들어, 카르보디이미드로 활성화하고, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 또는 또 다른 유사한 비양성자성 용매에서 알콜 링커 유도체, 예를 들어 아미노 알콜, 예를 들어 에탄올아민, 헥산올아민 등과 반응시켜서 유리 알콜 작용기를 갖는 보호된 염료, 예를 들어 알콜-아미드 유도체를 생성한다. 그 다음에 유리 알콜을 표준 절차를 이용하여 포스피틸화제, 예를 들어 촉매량의 테트라졸 디이소프로필아민을 함유하는 아세토니트릴 중의 디-(N,N-디이소프로필아미노)메톡시포스핀과 반응시켜 포스포르아미다이트를 생성하고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,231,191을 참조한다.
일부 실시양태에서는, 본원에 기재된 SiR 모이어티로 표지화된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 화학적으로 합성된 또는 화학적으로 자동화가능하게 합성된 폴리뉴클레오타이드의 5'-말단을 뉴클레오타이드의 당 부분을 통한 고체 지지체 합성을 이용하여 화학식 (L1)의 화합물로 표지화함으로써 생성될 수 있다. 대안으로, 제 1 반응성 리간드(예를 들어, 1 차 아민과 같은 친핵성 반응성 리간드)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 그것을 제 1 반응성 리간드와 상용성이 있는 제 2 반응성 리간드(예를 들어, 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르와 같은 친전자성 반응성 리간드)를 포함하는 화학식 (I)의 화합물 과 반응시킴으로써 표지화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 (L2):
Figure pct00039
를 가지고, 여기서 가변 치환체가 다음과 같이 정의되는 포스포르아미다이트 화합물이 제공된다. B1은 포스파이트 에스테르 보호기이고; B2 및 B3는 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴 또는 시클로알킬이고; B5는 수소 또는 산에 의해 절단가능한 히드록실 보호기이고; B는 뉴클레오사이드/타이드 염기이고, D는 SiR 함유 염료 모이어티이다. B가 푸린 또는 7-데아자푸린인 경우, 당 모이어티는 푸린 또는 7-데아자푸린의 N9-위치에 부착되고, B가 피리미딘인 경우, 당 모이어티는 피리미딘의 N1-위치에 부착된다. B 및 D는 위치 R1, R2, R3 또는 R4 중 하나에서 D에 부착되는 링커를 통해 연결된다. B가 푸린이면, 링커는 푸린의 8-위치에 부착되고, B가 7-데아자푸린이면, 링커는 7-데아자푸린의 7-위치에 부착되고, B가 피리미딘이면, 링커는 피리미딘의 5-위치에 부착된다.
일부 실시양태에서, B5는 트리페닐메틸 라디칼 또는 그의 전자 공여 치환된 유도체이고, 여기서 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "전자 공여"는 치환체가 원자가 전자를 그것이 일부인 분자 내의 이웃하는 원자로 방출하는 경향을 나타내고, 즉, 그것은 이웃하는 원자에 대해 전기양성이다. 일부 실시양태에서, 전자 공여 치환체는 아미노, 저급 알킬, 1 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 저급 아릴, 저급 알콕시 등을 포함한다. 더 바람직하게는, 전자 공여 치환체는 메톡시이다. 예시적인 트리틸은 4,4'-디메톡시트리틸, 즉 비스(p-아니실)페닐메틸, 모노메톡시트리틸, α-나프틸디페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸 등을 포함한다. 이 트리틸 및 다른 트리틸의 부착 및 절단 조건은 Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition (John Wiley, New York, 1991)에서 찾을 수 있다.
일반적으로, 화학식 (L2)의 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트는 본원에서 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 번호 9,783,560에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
화학식 (L2)의 화합물은 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드의 내부 표지화에 적당하다. 따라서, 또한 본원에 개시된 SiR 모이어티로 표지화된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에서 제공되며, 예를 들어 염기는 화학식 (I)의 R1, R2, R3, 또는 R4를 통해 SiR 모이어티에 결합된다. 그러한 표지화된 폴리뉴클레오타이드는 DNA 시퀀싱 프라이머, PCR 프라이머, 폴리뉴클레오타이드 혼성화 프로브, 폴리뉴클레오타이드 결찰 프로브 등을 포함하는 많은 중요한 정황에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 표지화된 폴리뉴클레오타이드는 형광 에너지 전달이 공여체 염료와 수용체 염료 또는 켄처 사이에서 발생하도록 위치하는 제 2 염료 또는 켄처를 추가로 포함한다. 그러한 다중 염료 또는 염료/켄처 에너지 전달 폴리뉴클레오타이드는 스펙트럼으로 조정가능한 시퀀싱 프라이머로서의 응용, 예를 들어 Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4347-4351 (1995), 및 혼성화 프로브로서의 응용, 예를 들어 Lee et al. Nucleic Acids Research, 21: 3761-3766 (1993); 미국 특허 번호 5,723,591 (TaqMan 프로브); 미국 특허 번호 8,211,644 (분자 비콘 프로브)이 발견된다.
또한 본원에서는 구조:
NUC-DYE
를 가지고, 여기서 NUC는 뉴클레오사이드/타이드 또는 뉴클레오사이드/타이드 유사체이고, DYE는 본원에 기재된 SiR 함유 염료 모이어티인 표지화된 뉴클레오사이드/타이드가 제공된다. NUC 및 DYE는 링커에 의해 연결될 수 있으며, 여기서 링커는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나를 통해 DYE에 부착된다. NUC가 푸린 염기를 포함하면, 링커는 푸린의 8-위치에 부착될 수 있고; NUC가 7-데아자푸린 염기를 포함하면, 링커는 7-데아자푸린의 7-위치에 부착될 수 있으며; NUC가 피리미딘 염기를 포함하면, 링커는 피리미딘의 5-위치에 부착될 수 있다.
뉴클레오사이드 표지화는 공지된 링커, 연결기 및 연계되는 상보적 작용기를 이용하는 많은 공지된 뉴클레오사이드/타이드 표지화 기술 중 임의의 하나를 이용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, SiR 화합물 및 뉴클레오사이드를 연결하는 링커는 (i) 폴리뉴클레오타이드 합성 조건에 안정해야 하고, (ii) 폴리뉴클레오타이드-표적 혼성화를 방해하지 않아야 하며, (iii) 관련있는 효소, 예를 들어 중합효소, 리가제 등과 상용성이 있어야 하고, 및 (iv) 염료의 형광 특성에 악영향을 미치지 않아야 한다. 사용에 적당한 예시적인 염기 표지화 절차는 다음을 포함한다: Gibson et al, Nucleic Acids Research, 15: 6455-6467 (1987); Gebeyehu et al, Nucleic Acids Research, 15: 4513-4535 (1987); Haralambidis et al, Nucleic Acids Research, 15: 4856-4876 (1987); Nelson et al., Nucleosides and Nucleotides, 5(3): 233-241 (1986); Bergstrom, et al., JACS, 111: 374-375 (1989); 미국 특허 번호 4,855,225, 5,231,191 및 5,449,767.
일부 실시양태에서, 링커는 아세틸렌성 아미도 또는 알켄성 아미도기를 포함하고, 염료와 뉴클레오사이드/타이드 염기 사이의 링커는 염료의 활성화된 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르와 뉴클레오사이드/타이드의 알키닐아미노- 또는 알케닐아미노-유도체화된 염기를 반응시켜 형성된다. 추가 실시양태에서, 결과적으로 얻는 링커는 3-(카르복시)아미노-1-프로핀-1-일이다. 다른 실시양태에서, 링커는 구조 -C≡C-CH2OCH2CH2NRN6X-를 가지고, 여기서 X는 n이 1 내지 5의 범위인 -C(O)-(CH2)n-N(RN7)-, n이 1 내지 5의 범위인 -C(O)-Ar-(CH2)n-N(RN7)-, 또는 -C(O)-C≡CH2-N(RN7)-이고; RN7은 H, 저급 알킬 또는 보호기이고; RN6은 H 또는 저급 알킬인 치환된 프로파르길에톡시아미도기를 포함한다. 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 5,770,716을 참조한다.
일부 실시양태에서, 표지화된 뉴클레오사이드/타이드는 화학식 (L3):
Figure pct00040
을 가지고, 여기서 B는 뉴클레오타이드 염기, 예를 들어 우라실, 시토신, 데아자아데닌 또는 데아자구아노신이고; W1 및 W2는 개별적으로 취할 때 OH 또는 중합효소 매개 템플레이트 지향 중합을 차단할 수 있는 기, 예를 들어 H, 플루오린 등이고; W3는 OH, 또는 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 포스페이트 유사체이고; D는 본원에 기재된 SiR 모이어티이며, 예를 들어 여기서 B는 화학식 (I)의 R1, R2, R3, 또는 R4를 통해 SiR 모이어티에 결합되는 것인 화합물이다. 예를 들어, 화합물은 W3가 트리포스페이트이고, W2 및 W1이 H인 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트일 수 있다. 표지화된 디데옥시 뉴클레오타이드는 예를 들어 형광 검출을 이용하는 생거형(Sanger-type) DNA 시퀀싱 방법에서 사슬종결제로서 특별한 응용이 발견된다. 또 다른 예로서, 화합물은 W3가 트리포스페이트이고, W2 및 W1이 각각 OH 및 H인 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트일 수 있다. 그러한 표지화된 데옥시뉴클레오타이드는 중합효소 연장 생성물 표지화에서, 예를 들어 PCR 또는 닉(nick)-번역과 같은 증폭 반응에서 특별한 응용이 발견된다.
본 개시물에 따른 포스포르아미다이트 화합물을 사용한 예시적인 이중-표지화된 프라이머의 제조는 도 8에 도시되어 있다. 본 개시물에 따른 NHS 에스테르 화합물을 사용한 예시적인 이중 표지화된 프라이머의 제조는 도 9에 도시되어 있다.
유용한 시약 및 반응 조건을 포함하여 포스포르아미다이트 화합물, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 제조와 일반적으로 관련된 추가 논의를 위해서는 미국 특허 번호 6,008,379 및 9,783,560을 참조하고, 이 특허들은 본원에 참고로 포함된다.
5. 수용해도를 증가시키는 모이어티
예를 들어, 수성 환경에서 더 높은 농도로 SiR 화합물의 사용을 허용하기 위해 및/또는 SiR 화합물을 살아있는 세포의 무손상 세포막에 대해 불투과성이 되게 하기 위해, 본원에 제공된 SiR 화합물의 수용해도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이, 일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 및 RN2 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 초과는 극성 또는 하전된(예를 들어, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성이온성) 기인 하나 이상의 가용화 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 및 RN2 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 초과는 하나 이상의 극성 기, 예컨대 산소, 질소 또는 염소 함유 기 및/또는 수소 결합 공여체 또는 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 및 RN2 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 초과는 하나 이상의 극성 기, 예컨대 산소, 질소 또는 염소 함유 기를 포함한다. 예시적인 가용화 작용기는 카르복실, 아민, 알콜, 니트로, 클로로, 카르보닐, 에스테르, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 포스포네이트, 에테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드), 아미드, 카르보네이트, 카르바메이트 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가용화 작용기는 링커의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드 링커 -(CH2CH2O)n-가 제공될 수 있으며, 예를 들어 여기서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과, 예컨대 3 이상이다. 일부 실시양태에서, 그러한 링커는 한쪽 말단에 추가 유도체화에 유용한 반응성 리간드, 예를 들어 NHS 에스테르, 카르복실, 카르복실에스테르, 말레이미드, 아미드, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 아세톡시메틸(AM) 에스테르 또는 본원에 기재된 다른 반응성 리간드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가용화 작용기는 아릴 또는 헤테로아릴에서의 치환체로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 적어도 1, 2 또는 3 개의 가용화 작용기(예를 들어, 설포네이트)로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴(예를 들어, 페닐)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 1 개, 예를 들어 적어도 2 개의 설포네이트, 예를 들어 서로에 대해 메타 배향의 2 개의 설포네이트로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴(예를 들어, 페닐)을 포함한다.
예시적인 가용화 치환체는 폴리에틸렌 옥사이드 링커, 반응성 리간드, 및 2 개의 설포네이트로 치환된 페닐을 포함하는 것, 예를 들어
Figure pct00041
이고, 여기서 물결선은 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어, 화합물 10A-14를 참조한다. 또한 도 10b도 참조한다. 그러한 화합물의 아민은 예를 들어 카르복실의 활성화에 의해 생성된 산 클로라이드 또는 다른 친전자체와 같은 반응성 리간드에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가용화 치환체, 예컨대 임의의 상기 논의된 것은 화학식 (I)의 R3 위치에 부착된다. 일부 실시양태에서, 가용화 치환체, 예컨대 임의의 상기 논의된 것은 화학식 (I)의 R4 위치에 부착된다.
6. 용도; 염색 및 검출 방법
본원에 제공된 SiR 화합물 및 접합체는 다양한 생물학적 응용에 사용될 수 있다. SiR 화합물 및 접합체가 다른 특징을 희생하지 않으면서 증가된 밝기 및 광안정성을 포함해서 예상치 못한 특성을 갖는다는 것이 발견되었다. 놀랍게도 R1 또는 R2 위치에서 SiR 화합물의 접합이 화합물의 광화학적 특성에 악영향을 미치지 않는다는 것이 발견되었고; 오히려 밝기 및 광안정성이 증가한다는 것을 알아냈다 (예를 들어, 화합물 4, 5 및 6을 참조한다).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 SiR 화합물은 세포, 세포 구조, 세포소기관, 표적 분자 등을 표지화하거나 또는 염색하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, a) 하나 이상의 세포 또는 세포 구조를 함유하는 샘플을 화학식 (I)의 SiR 화합물과 접촉시켜 접촉된 샘플을 형성하고; b) 접촉된 샘플을 적절한 양의 시간 동안 인큐베이션하여 인큐베이션된 샘플을 형성하고; c) 샘플을 적절한 파장으로 조명하여 조명된 샘플을 형성하고; d) 조명된 샘플로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는 세포 또는 세포 구조를 염색하거나 또는 표지화하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, a) 표적 분자를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 화학식 (I)의 SiR 화합물과 접촉시켜 접촉된 샘플을 형성하고; b) 접촉된 샘플을 적절한 양의 시간 동안 인큐베이션하여 인큐베이션된 샘플을 형성하고; c) 샘플을 적절한 파장으로 조명하여 조명된 샘플을 형성하고; d) 조명된 샘플로부터 형광 방출을 검출하고, 여기서 형광 방출이 표적 분자를 검출하는 데 사용되는 것을 포함하는 표적 분자 검출 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, a) 특이적 생물학적 구조를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 화학식 (I)의 SiR 화합물과 조합하고, 여기서 상기 생물학적 구조가 핵산을 함유하고; b) 조합된 샘플 및 SiR 화합물을 SiR 화합물이 생물학적 구조 중의 핵산과 조합하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하여 생물학적 구조에 상응하는 검출가능한 형광 신호를 갖는 SiR-핵산 복합체의 패턴을 형성하고; c) 생물학적 구조에 상응하는 형광 신호를 검출하는 것을 포함하는 생물학적 구조 검출 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용되는 화합물은 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 및 59, 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산으로부터 선택된다.
표지화된 항체. 일부 실시양태에서는, 본원에 제공된 SiR 모이어티가 본원에 기재된 항체에 접합되어 항체를 포함하는 화학식 (I)의 화합물을 제공할 수 있다. 이와 같이, 항원을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 항원에 특이적인 항체를 포함하는 화학식 (I)의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 항원, 또는 항원을 포함하는 세포, 세포 성분, 조직 등을 염색하거나 또는 검출하는 방법이 제공된다. 또한 본원에서는 항원을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 항원에 특이적인 일차 항체와 접촉시키고, 일차 항체를 일차 항체에 특이적인 항체(즉, 본원에 개시된 SiR 모이어티로 표지화된 이차 항체)를 포함하는 화학식 (I)의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 항원, 또는 항원을 포함하는 세포, 세포 성분, 조직 등을 염색하거나 또는 검출하는 방법이 제공된다. 또한, 관심 항원, 또는 그 항원을 포함하는 세포, 세포 성분, 조직 등을 염색하거나 또는 검출하기 위한 일차 또는 이차 항체로서 그러한 화학식 (I)의 화합물의 상응하는 용도가 제공된다. 그러한 방법 및 용도는 면역형광, 면역조직화학, 유세포 분석 (예를 들어, FACS), 웨스턴 블롯팅, 형광 ELISA 및 형광 표지화된 항체가 사용될 수 있는 임의의 다른 접근법을 포함한다.
세포골격 염색. 일부 실시양태에서는, 본 개시물의 SiR 모이어티가 본원에 기재된 바와 같은 세포골격 결합 모이어티에 접합되어 세포골격 결합 모이어티를 포함하는 화학식 (I)의 화합물을 제공할 수 있다. 이와 같이, 세포 샘플(예를 들어, 투과화된 및/또는 고정 세포를 포함함)을 세포골격 결합 모이어티(예를 들어, 액틴 또는 미세관 결합 모이어티, 예컨대 임의의 본원에 기재된 것)를 포함하는 화학식 (I)의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포골격 성분(예를 들어, 액틴 또는 미세관) 염색 또는 검출 방법이 제공된다.
핵산 염색 및 검출. 일부 실시양태에서는, 본 개시물의 SiR 모이어티가 본원에 기재된 바와 같은 핵산 결합 모이어티에 접합되어 핵산 결합 모이어티를 포함하는 화학식 (I)의 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시물의 SiR 모이어티는 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드에 포함되는 뉴클레오타이드에 부착될 수 있으며, 그 다음에 그것은 표지화된 프라이머 또는 프로브로 쓰일 수 있다. 그러한 화합물은 핵산 중합체를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 샘플과 조합될 수 있으며, 그 다음에 화합물 및 샘플의 혼합물을 화합물이 샘플 중의 핵산 중합체와 조합하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하여 검출가능한 형광 신호를 갖는 하나 이상의 화합물-핵산 복합체를 형성한다. 핵산은 DNA, 예를 들어 dsDNA 또는 ssDNA일 수 있다. 핵산은 또한 RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드일 수 있다. 화합물은 폭넓은 다양한 샘플에서, 예컨대 수용액, 시퀀싱 또는 증폭 반응, 예컨대 PCR, 세포 샘플(예를 들어, FISH 또는 일반 핵 또는 염색체 염색 용) 및 전기영동 겔에서 핵산을 표지화하거나 또는 검출하는 데 사용될 수 있다. 관련 분야의 숙련된 자는 일반적인 핵산 또는 DNA 결합 모이어티를 포함하는 화합물을 사용할 때 및 특이적 서열을 표적화하는 프로브 또는 프라이머를 사용할 때를 인식할 것이다.
일부 실시양태에서는, 핵산을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 화학식 (I)의 화합물과 조합하고; 샘플 및 화합물을 화합물이 샘플 중의 핵산과 결합하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하여 검출가능한 형광 신호를 제공하는 하나 이상의 화합물-핵산 복합체를 형성하는 것을 포함하는 핵산 염색 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 및 59, 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산으로부터 선택된다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 기재된 SiR 화합물을 사용하고, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오타이드 및 SiR 화합물을 포함하는 복합체로부터 형광을 검출하거나 또는 복합체 형성으로 인한 형광 변화를 검출함으로써 복합체가 형성되었는지를 결정하여 특이적으로 검출될 수 있고, 임의로 여기서 복합체 형성으로 인한 형광 변화는 절단 또는 형태학적 변화로 인해 켄처에 의한 켄칭의 감소이다.
형광 신호의 존재, 위치, 강도, 여기 및 방출 스펙트럼, 형광 편광, 형광 수명 및 다른 물리적 특성을 포함한 SiR 화합물-핵산 복합체의 특징을 이용하여 샘플의 양태 또는 부분을 검출, 구별, 분류, 정량화, 및/또는 분석할 수 있다. 임의로, 본 개시물의 화합물은 상이한 스펙트럼 특성을 갖는 동일한 부류의 화합물(예를 들어, 본원의 다른 곳에서의 방출 및 근적외선 염료의 이동에 관한 논의 참조)을 포함하는 하나 이상의 추가 시약(예를 들어, 검출가능하게 상이한 형광 시약)과 함께 사용된다.
또한 본원에 개시된 SiR 화합물을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법이 제공된다. 관련 분야의 숙련된 자는 형광 모이어티가 시퀀싱 방법에서 예를 들어 프라이머, 디데옥시 뉴클레오타이드와 같은 사슬 종결 뉴클레오타이드, 또는 가역적 종결자 뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드에서의 표지로서 이용될 수 있는 다양한 방법을 인식할 것이다(가역적 종결자 뉴클레오타이드 및 디뉴클레오타이드에 관한 일반적인 논의에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 번호 8,017,338, PCT 공개 번호 WO2008/037568 및 미국 특허 번호 7,476,504를 참조한다). 시퀀싱 반응 생성물을 검출 전에 예를 들어, 모세관 전기영동과 같은 전기영동에 의해 분리하는 시퀀싱 방법이 이용될 수 있다. 대안으로, 생성물이 현장에서 검출되는 시퀀싱 방법이 이용될 수 있다(예를 들어, 위에 인용된 문헌 참조).
살아있는/죽은 세포 분석. 일부 실시양태는 예를 들어 유세포 분석 및 형광 현미경과 함께 사용하는 데에 있어서 상용성이 있는 세포 염색 및/또는 세포 생존력 평가를 위한 방법, 용도, 또는 조성물을 제공한다. 그러한 방법 및 용도는 세포 또는 세포 혼합물을 본원에 개시된 SiR 화합물과 인큐베이션하고; 세포 또는 세포 혼합물에 자극을 제공하여 형광 신호를 유도해내고; 형광 신호를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 방법 및 용도는 예를 들어 형광 정도가 미리 결정된 문턱값을 초과하는지(생존불가능을 지시함)를 결정함으로써, 또는 결과를 살아있는 집단 및 죽은 집단으로 그룹화함으로써(여기서 죽은 세포 집단은 그의 손상된 막 무결성을 고려할 때 더 큰 정도의 염색을 보여줌) 살아있는 및/또는 죽은 세포의 양을 정량화하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시물의 SiR 화합물은 생존불가능한 진핵 세포, 예를 들어 인간 세포와 같은 포유동물 세포로 전달되거나 또는 그러한 세포의 일부가 된다. 세포를 광원으로 조명할 때, 그 다음에 형광 방출을 수집할 수 있거나, 검출할 수 있거나, 분석할 수 있거나, 또는 측정할 수 있다. 그 분석에서 세포는 세포 사멸을 유발하는 물질 또는 시약, 예를 들어 캄프토테신 또는 스타우로스포린으로 처리될 수 있다. 플레이트 판독기, 형광 현미경 또는 유세포 분석기와 같은 임의의 적절한 형광 검출 장치를 사용하여 데이터를 획득할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 세포 또는 세포 혼합물을 적어도 1, 2, 3 또는 4 종의 추가 형광 분자와 함께 인큐베이션하고, 여기서 적어도 1, 2, 3 또는 4 종의 추가 형광 분자는 스펙트럼에 의해 본 개시물에 따른 화합물과 식별할 수 있고, 적어도 1, 2, 3 또는 4 종의 추가 형광 분자로부터 측정하여 형광 신호를 측정한다. 방출 최대값이 30 nm 이상 이격되는 경우에 또는 분자들 중 적어도 하나로부터의 형광이 필터들 중 적어도 하나에 의해 구별되게 감소되어 소스(source)로부터의 형광이 광학 필터, 예를 들어 1 쌍의 필터의 사용을 통해 식별될 수 있는 경우에 두 소스로부터의 형광이 스펙트럼으로 식별할 수 있는 것으로 간주된다.
또 다른 실시양태에서, 분석 방법은 세포가 복수의 용기에 함유된 경우 수행될 수 있다. 임의의 용기에서, 세포는 한 유형의 또는 상이한 유형들의 세포일 수 있다. 세포는 상이한 조건 하에서, 예를 들어 상이한 배지의 존재 하에서 성장한 동일한 유형일 수 있다. 일부 세포는 세포사멸 유도제 또는 카스파제 억제제로 처리될 수 있다. 복수의 용기, 어레이는 광원, 예를 들어 스캐닝 광원에 의해 조명될 수 있다. 세포는 동일하거나 또는 상이한 유기체일 수 있다.
초고해상도 영상화 및 현미경; 단일 분자 위치화. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 초고해상도 영상화 또는 현미경에 사용된다. 초고해상도 영상화 및 현미경의 검토를 위해서는 Huang et al., Annu Rev Biochem. 2009; 78: 993-1016; Leung 등, Applied Spectroscopy 2011; 65: 967-980; 및 Schermelleh 등, J. Cell Biol. 2010; 190: 165-175를 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 단일 분자 위치화 현미경에 (예를 들어, 살아있는 세포에서) 사용된다. 단일 분자 위치화 현미경에 대한 자세한 논의를 위해서는 Patterson et al., Annu. Rev. Phys. Chem. 2010; 61: 345-367; Qu et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 11298-11303; 및 Shtengel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 3125-3130을 참조한다. 임의의 그러한 방법 또는 용도에서는, 샘플 또는 그의 관심 성분을 화합물로 염색하기 위해 허용되는 조건 하에서 샘플을 본원에 기재된 화합물(예를 들어, 표적 결합 모이어티를 포함함)과 접촉시킬 수 있다. 그 다음에 염색된 샘플을 초고해상도 또는 단일 분자 위치화 영상화 또는 현미경 기술에 따라 영상화할 수 있다.
염색 해결책. 일부 실시양태에서는, 본 개시물의 SiR 화합물은 SiR 화합물을 염색 용액, 예를 들어 샘플 및 의도된 용도와 상용성이 있는 수용액 또는 수혼화성 용액에 용해함으로써 사용을 위해 준비된다. 생물학적 샘플의 경우, 세포 형태학 또는 생리학의 최소 교란이 요망되는 경우에 그에 따라서 염색 용액이 선택된다. 용액 분석의 경우, 일부 실시양태에서의 염색 용액은 평가 중인 표적 물질의 자연 입체형태를 교란하지 않는다. 또한 고농도의 유기 용매, 양이온 및 산화제도 일반적으로 ≥ 0.01 % 농도의 이온성 세제 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 마찬가지로 형광을 감소시킨다. 그러나 많은 염색 용액 첨가제는 화합물-핵산 복합체의 형광을 방해하지 않는다(예를 들어, 우레아 최대 8M; CsCl 최대 1g/mL; 포름아미드 용액의 최대 50%; 및 수크로스 최대 40%). 본원에서 제공되는 SiR 화합물은 일반적으로 물 단독에서보다 완충된 용액에서 더 큰 안정성을 가지고; β-메르캅토에탄올과 같은 자유 산소 라디칼 수준을 감소시키는 작용제가 화합물의 안정성에 기여한다.
염색 용액은 본 개시물의 SiR 화합물을 수성 용매, 예컨대 물, 완충제 용액, 예컨대 완충된 식염수(일부 실시양태에서는 일부 생존력 판별 응용을 위한 비-포스페이트), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 완충제(예를 들어, EDTA 함유), 또는 수혼화성 유기 용매, 예컨대 디메틸설폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 또는 저급 알콜, 예컨대 메탄올 또는 에탄올에 직접 용해함으로써 제조할 수 있다. SiR 화합물을 염색 용액에 사용된 것의 약 100 배 이상의 농도로 유기 용매(일부 실시양태에서는 100% DMSO)에 예비 용해할 수 있고, 그 다음에 SiR 화합물이 유효량으로 존재하도록 수성 용매, 예컨대 물 또는 완충제로 1 회 이상 희석할 수 있다.
본 개시물의 SiR 화합물의 유효량은 표적 물질과 조합하여 검출가능한 형광 반응을 제공하기에 충분한 양이다. 용액에서의 SiR 화합물 농도는 샘플 중의 표적 물질과 접촉하여 검출가능한 신호를 제공하기에 충분해야 하지만, 너무 많은 화합물은 배경 형광으로 인해 문제를 일으킬 수 있다. 염색 용액의 최적 농도 및 조성은 샘플의 성질 (물리적, 생물학적, 생화학적 및 생리학적 특성을 포함함), SiR 화합물-샘플 상호작용의 성질 (핵산의 부위로의 화합물 수송률을 포함함) 및 수행되는 분석의 성질에 의해 결정되고, 아래 예에 기재된 것과 같은 표준 절차에 따라 결정될 수 있다.
샘플 유형. SiR 화합물은 관심 생물학적 물질, 예를 들어 세포 (특정 유형일 수 있음), 항원, 세포 성분 또는 핵산을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 생각되는 샘플과 조합된다.
샘플은 임의로 생물학적 구조(즉, 유기체 또는 유기체의 개별 단위), 또는 용액(생물학적 구조를 함유하는 용액을 포함함), 또는 고체 또는 반고체 물질이다. 결과적으로, 본 개시물을 실시하는 데 사용되는 샘플 물질은 임의로 용액에서 자유롭거나, 고체 또는 반고체 물질 내에 또는 상에 고정화되거나, 생물학적 구조로부터(예를 들어, 용해된 세포, 조직, 유기체 또는 세포소기관으로부터) 추출되거나, 또는 생물학적 구조 내에 둘러싸인 채로 있다. 표적 물질은 또한 세포의 세포기질, 세포의 세포질에서 발견될 수 있거나, 또는 세포외일 수 있다. 표적이 SiR 화합물과 결합하기 위해서는, 비록 핵산이 생물학적 구조 내에 둘러싸여 있지 않더라도, 표적이 SiR 화합물과 접촉하도록 수성 환경에 제공될 수 있다.
샘플은 천연 또는 합성일 수 있으며, 다양한 소스로부터 얻을 수 있다. 샘플에 표적 물질의 존재는 자연적인 생물학적 과정, 또는 성공적인 또는 실패한 합성 또는 실험 방법론의 결과, 바람직하지 않은 오염, 또는 질병 상태 때문일 수 있다. 표적 물질은 천연 소스에 내인성일 수 있거나 또는 이물질로서 예컨대 감염, 형질감염 또는 치료적 처치에 의해 도입될 수 있다. 표적 물질은 샘플 전부에 또는 일부에만 존재할 수 있고, 표적 물질의 존재는 개별 샘플들을 식별하거나, 또는 단일 샘플 내의 한 부분 또는 영역을 구별하거나, 또는 샘플 또는 샘플의 특징을 확인하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 물질을 함유하는 샘플은 세포이거나 또는 액체 소스로부터 직접 또는 고체 물질 (유기 또는 무기)로부터의 세척액 또는 배양을 위해 세포가 도입된 성장 배지 또는 평가를 위해 표적 물질을 넣은 완충제 용액으로서 얻는 수성 또는 수혼화성 용액이다. 표적 물질이 세포 내에 있는 경우, 세포는 임의로 미생물을 포함하는 단세포, 또는 다세포 유기체, 배아, 조직, 생검, 필라멘트, 생물막 등을 포함하는 2 차원 또는 3 차원 층으로 다른 세포와 연계된 다세포이다. 대안으로, 샘플은 고체, 임의로 도말 또는 찰과, 또는 여과에 의해 액체 또는 증기로부터 제거된 잔류물이다. 본 개시물의 한 양태에서, 샘플은 분리된 또는 여과되지 않은 생물학적 유체, 예컨대 소변, 뇌척수액, 혈액, 림프액, 조직 균질물, 간질액, 세포 추출물, 점액, 타액, 가래, 대변, 생리적 분비물 또는 다른 유사한 유체를 포함하는 생물학적 유체로부터 얻는다. 대안으로, 샘플은 환경적 소스, 예컨대 흙, 물 또는 공기로부터 또는 폐기물 스트림, 수원, 공급 라인 또는 생산 로트로부터 얻는 것과 같은 산업적 소스로부터 얻는다. 산업적 소스는 또한 생물학적 반응기 또는 양조와 같은 식품 발효 공정과 같은 발효 매질; 또는 육류, 게인(gain), 농산물 또는 유제품과 같은 식료품을 포함한다.
표적 물질이 용액에 존재하는 경우, 샘플 용액은 정제된 또는 합성 표적 물질 중 하나에서부터 조 혼합물, 예컨대 세포 추출물 또는 균질물 또는 다른 생물학적 유체, 또는 생물학적, 산업적 또는 환경적 소스로부터의 묽은 용액에 이르기까지 다양할 수 있다. 일부 경우에, 화합물과 조합하기 전에 용액 중의 다른 생물분자 또는 유체의 혼합물로부터 표적 물질을 분리하는 것이 바람직하다. 다른 생물학적 분자와의 일반적으로 조악한 혼합물로부터 다양한 표적 물질, 예컨대 핵산, 폴리펩티드, 대사산물, 올리고당류 및 다당류, 지질 및 그의 조합의 분리 및 정제를 위한 많은 기술이 존재한다. 이것은 다양한 지지체 또는 용액을 사용하여 또는 유동하는 스트림에서 크로마토그래피 기술 및 전기영동 기술과 같은 수단을 포함한다. 대안으로, 생물분자의 혼합물은 비표적 물질이 분해되고 더 쉽게 제거될 수 있도록 적절한 분해 효소(예를 들어, RN아제, DN아제 및/또는 프로테아제)로 처리될 수 있다.
샘플의 소스 및 유형, 뿐만 아니라 SiR 화합물의 용도가 어느 화합물 특징, 및 따라서 어느 SiR 화합물이 특정 샘플을 염색하기에 가장 유용할지 결정할 것이다. 화합물의 형광이 지속적인 고강도 조명(예를 들어, 현미경)을 사용하여 검출되는 경우, 특히 살아있는 세포에 사용하기에는 흔히 사용되는 화합물(예를 들어, 플루오레세인)보다 낮은 광표백률을 갖는 SiR 화합물이 바람직하다. 살아있는 계에 대한 화합물의 상대적으로 낮은 독성은 일반적으로 화합물 자체에 의해 야기되는 교란이 거의 또는 전혀 없이 살아있는 샘플에서의 핵산 검사를 가능하게 한다. 화합물이 세포막 또는 겔을 투과해야 하는 경우, 일부 세포가 세포막을 가로지르는 수동적 확산 이외의 수단에 의해 예를 들어 식균 작용 또는 다른 유형의 섭취에 의해 다른 세포에 불투과성인 것으로 밝혀진 화합물을 쉽게 흡수하긴 하지만, 더 투과성인 SiR 화합물이 바람직하다. 세포를 빠르고 쉽게 침투하는 화합물이 반드시 빠르게 겔을 침투하지는 않는다. 핵산이 겔 상에서 염색되는 응용에서는, SiR 화합물은 또한 높은 결합 친화도(예를 들어, Kd ≥ 10-6 M)를 갖도록 선택되고; 반면에 겔 또는 모세관 전기영동과 같은 분리 단계를 거치기 전에 핵산이 미리 염색되는 응용에서는, 좋은 분리를 보장하기 위해 훨씬 더 높은 결합 친화도(예를 들어, Kd ≥ 10-8 M)가 바람직하다. 용액에서 핵산을 염색할 때는, 높은 결합 친화도가 소량의 핵산에 대한 더 큰 감도로 나타나지만, 중간 정도의 결합 친화도(예를 들어, 10-6 M≤ Kd ≤ 10-8 M)를 갖는 화합물이 더 큰 동적 범위에서 더 효과적이다. SiR 화합물의 광안정성, 독성, 결합 친화도, 양자 수율 및 형광 향상은 관련 분야에 알려진 표준 방법에 따라 결정된다.
추가 시약. 본 개시물의 SiR 화합물은 개별적으로 검출가능한 하나 이상의 추가 시약과 함께 사용될 수 있다. 추가 시약의 신호가 화합물-핵산 복합체의 형광 신호와 검출가능하게 상이한지 여부에 관계없이, 추가 시약은 그것들이 개별적으로 사용되는 경우, 예를 들어 동일한 샘플의 상이한 분취량을 염색하는 데 사용되는 경우 또는 그것이 한 샘플의 상이한 부분 또는 성분을 염색하는 경우 개별적으로 검출될 수 있다. 대안으로, 본 개시물의 SiR 화합물은 SiR 화합물과 조합하여 사용되기를 원하는 다른 시약의 검출가능한 반응과 상이한 검출가능한 반응을 제공하도록 선택된다. 일부 실시양태에서 추가 시약 또는 시약들은 형광성이고, 화합물-핵산 복합체의 스펙트럼 특성과 상이한 스펙트럼 특성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 SiR 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코에리트린으로 표지화된 것과 같은 흔히 사용되는 형광 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 상이한 감도 수준을 갖는 화합물 간의 스펙트럼 특성의 차이를 검출하는 데는 임의의 형광 검출 시스템(시각적 검사 포함)이 사용될 수 있다. 그러한 차이는 여기 최대값의 차이, 방출 최대값의 차이, 형광 수명의 차이, 동일한 여기 파장 또는 상이한 파장에서의 형광 방출 강도의 차이, 흡광계수의 차이, 형광 편광의 차이, 표적 물질과의 조합에서 형광 향상의 차이, 또는 그의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검출가능하게 상이한 화합물은 임의로 상이한 스펙트럼 특성 및 상이한 선택성을 갖는 본 개시물의 SiR 화합물 중 하나이다. 본 개시물의 한 양태에서, 화합물-핵산 복합체 및 추가의 검출 시약은 동일한 또는 중첩되는 여기 스펙트럼을 갖지만, 예를 들어 ≥10 nm, ≥20 nm, 또는 ≥50 nm 이격된 방출 최대값을 갖는 가시적으로 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다. 모든 형광 시약의 동시 여기는 각 시약에 대해서는 개별적으로 부최적이지만 시약의 조합에 대해서는 최적인 파장에서 샘플의 여기를 요구할 수 있다. 대안으로, 추가 시약(들)은 대상 화합물-핵산 복합체를 여기시키는 데 사용되는 파장과 상이한 파장에서 동시에 또는 순차적으로 여기될 수 있다.
추가 화합물은 크기, 모양, 대사 상태, 생리학적 조건, 유전자형 또는 다른 생물학적 매개변수 또는 그의 조합에 따라 예를 들어 세포 또는 그의 성분을 함유하는 생물학적 샘플을 구별하기 위해 임의로 사용된다. 추가 시약은 동일한 특징에 대해 비선택적 시약과 함께 사용하기 위해서 샘플의 특정 특징에 대해 임의로 선택적이거나, 또는 샘플의 또 다른 특징에 대해 선택적인 시약과 함께 사용하기 위해서 샘플의 한 특징에 대해 선택적이다. 본 개시물의 한 양태에서, 추가 화합물 또는 화합물들은 일부 세포 내부에서는 형광 생성물을 제공하지만 다른 세포 내부에서는 형광 생성물을 제공하지 않도록 세포내에서 물질대사되고, 이렇게 해서 본 개시물의 시아닌 화합물의 형광 반응은 그러한 대사 과정이 일어나고 있지 않는 경우에만 우세하다. 대안으로, 추가 화합물 또는 화합물들은 세포 표면 단백질 또는 수용체, 예를 들어 형광 렉틴 또는 항체와 같은 세포의 일부 외부 성분에 대해 특이적이다. 본 개시물의 또 다른 양태에서는, 추가 화합물 또는 화합물들이 능동적으로 또는 수동적으로 세포막을 가로지르는 세포막의 무결성 또는 기능을 나타내는 데 사용된다(예를 들어, 칼세인 AM 또는 BCECF AM). 또 다른 양태에서는, 추가 시약이 AT 풍부 핵산에 선택적으로 결합하여 염색체 분염을 나타내는 데 사용된다. 본 개시물의 또 다른 양태에서는, 추가 시약이 세포소기관 염색제, 즉 특정 세포소기관에 대해 선택적인 염색제이고, 예를 들어 추가 시약(들)이 미토콘드리아 내로의 잠재적 민감성 흡수를 위해 선택될 수 있거나(예를 들어, 로다민 123 또는 테트라메틸 로사민) 또는 살아있는 세포의 세포소기관 내에서 pH 구배로 인한 흡수를 위해 선택될 수 있다(예를 들어, Diwu, et al., CYTOMETRY supp. 7, p77, Abstract 426B (1994)).
추가 화합물은 분석되는 샘플에 유효량으로 존재하도록 첨가되며, 화합물의 최적 농도는 관련 분야에 일반적으로 알려진 표준 절차에 의해 결정된다. 각 화합물은 의도된 용도에 의존하여 임의로 한 개별 용액으로 제조되거나 또는 한 용액으로 조합된다. 위에서와 같이 염색된 세포를 적당한 파장으로 조명한 후, 세포들을 조명에 대한 그들의 형광 반응에 따라 분석한다. 추가로, 시차 형광 반응이 추가의 분석 또는 실험을 위해 세포 또는 핵산을 분류하기 위한 기초로 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 절차에서 "살아남은" 모든 세포가 분류되거나, 또는 한 샘플에서 특정 유형의 모든 세포가 분류된다. 세포는 Mansour, et al.의 미국 특허 번호 4,665,024(1987)에서와 같은 관련 분야에 알려진 절차에 따라서 수작업으로 또는 자동화 기술, 예컨대 유세포 분석을 이용해서 분류될 수 있다.
7. 키트
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 SiR 화합물(본원에 개시된 접합체일 수 있지만 반드시 그렇지는 않음) 및 하나 이상의 다른 시약을 포함하는 키트가 제공된다. 본원에 기재된 SiR 화합물의 임의의 실시양태가 키트에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 위에 기재된 적어도 하나의 추가 시약이 본 개시물에 따른 화합물과 함께 키트에 포함된다. 일부 실시양태에서, 키트는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 완충제, 정제 배지, 또는 샘플을 포함하는 바이알. 일부 실시양태에서, 키트는 세포독성제, 세포사멸 유발제, 세포, 용매 또는 제습제를 추가로 포함한다. 키트는 또한 본 개시물의 방법, 예를 들어 접합 방법, 분석 방법, 또는 합성 방법을 수행하는 데 유용한 시약을 포함할 수 있다. 후자의 예로서, 비닐기를 포함하는 화합물은 화합물을 치환체로 유도체화하기 위해 티올-엔 반응을 수행하기 위한 시약과 함께 제공될 수 있거나; 또는 반응성 리간드, 예컨대 NHS 에스테르 또는 본원에 기재된 다른 반응성 리간드를 포함하는 화합물은 화합물을 치환체로 유도체화하기 위해 친핵성 치환 반응을 수행하기 위한 시약과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 유기 용매 및 제습제 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용매는 DMSO이다. 일부 실시양태에서, 키트는 적어도 하나의 추가 물질, 예컨대 용매, 완충제, 안정화제, pH 조절제 등을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 색바램 방지(antifade) 시약을 추가로 포함한다.
키트는 또한 진핵 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 유세포 분석과 함께 사용하는 데에 있어서 상용성이 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 형광 현미경과 함께 사용하는 데에 있어서 상용성이 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 화합물을 항체와 접합시키기 위한 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트 내의 SiR 화합물은 항체에 접합되고, 이것은 예를 들어 이차 항체(예를 들어 인간, 마우스 또는 토끼와 같은 제2 종의 항체에 특이적인 토끼 또는 염소와 같은 제1 종으로부터의 항체이고, 여기서 제2 종은 제1 종과 상이함)로서 사용하기에 적당할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 핵산 합성 반응, 예를 들어 PCR, qPCR, 또는 rtPCR과 같은 증폭 반응, 또는 DNA 시퀀싱과 함께 사용하는 데에 있어서 상용성이 있다. 그러한 키트는 NTP 또는 dNTP, 중합효소, 및 하나 이상의 프라이머를 포함할 수 있다. NTP/dNTP 또는 프라이머 중 적어도 하나가 본원에 개시된 화합물로 표지화될 수 있거나, 또는 키트는 본원에 개시된 화합물로 표지화된 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 표지화된 프로브는 규소-로다민 모이어티를 위한 켄처 또는 에너지 전달 파트너를 추가로 포함하며, 예를 들어 이것은 프로브를 SiR 모이어티에 의해 형광을 변화시키는(예를 들어, 증가시키는) 프로브의 분해, 절단, 또는 형태학적 변화를 포함하는 분석, 예컨대 TaqMan 분석 또는 분자 비콘 프로브를 사용한 분석에 사용하기에 적당하도록 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상 및 이 하나 이상의 화합물을 저장하기 위한 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법 또는 하나 이상의 SiR 화합물을 함유하는 조성물을 제조하는 방법 및 화합물 또는 화합물을 함유하는 조성물을 투여하는 방법에 대한 설명서를 임의로 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 방법이다. 키트는 주사기, 피펫, 피펫 벌브, 주걱, 바이알, 주사기 바늘, 및 그의 다양한 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 SiR 화합물 또는 SiR 화합물을 함유하는 조성물을 전달하기 위한 하나 이상의 장비를 추가로 포함할 수 있다.
8. SiR 화합물 및 관련 중간체의 제조 방법
본원에 기재된 화합물 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 4A, 5, 6, 7, 7A, 7B, 8, 9, 10A, 10B, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 및 59를 포함하는 화학식 (I)의 화합물의 제조 방법이 제공된다. 또한 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 데 유용한 합성 중간체를 제조하는 방법이 제공된다.
많은 작용성화된 SiR 염료는 상이한 생물학적 응용을 위해, 특히 초고해상도 영상화 및 세포내 표적화를 위해 크산텐 모이어티를 변형함으로써 합성되었다. 그러나, 크산텐 모이어티의 변형은 통상적으로 흡수 및 방출 파장, 양자 수율 및 광안정성과 같은 염료의 광물리학적 특성에 상당한 변화를 초래한다. 이 이유 때문에, 본원에서는 SiR 염료 화합물에 10 번 위치 규소에 작용기(들) 또는 반응성 기(들)를 도입하는 새로운 합성 전략이 제공된다. 구체적으로, 하나 이상의 비닐기가 10번 위치에 도입되어 모노-비닐 및 비스-비닐 SiR 염료를 형성하고, 이것을 티올-엔 반응에 의해 추가로 유도체화하여 작용기(들) 또는 반응성 기(들)를 도입할 수 있다. 본원에 제공된 합성 방법에는 Si-크산톤 중간체가 포함되지 않는다 (도 2b 및 2e 참조).
추가로, SiR 유도체를 제조하는 현재 합성 절차의 대부분은 매우 위험한 시약(예를 들어, tert-부틸리튬, sec-부틸리튬, 염화티오닐 및 6N HCl)을 사용할 뿐만 아니라 오래 걸리고 힘든 합성 단계들을 요구한다. 대조적으로, 본원에서 제공되는 합성 접근법은 핵심 SiR 코어 구조를 만드는 오직 2 개의 단계, 그 다음에 표적 세포소기관의 다양한 리간드와 커플링될 수 있는 본원에서 "에틸설퍼프로피온산 링커" 또는 "ESP 링커"로도 불리는 링커를 제공하는 최종 티올-엔 반응을 필요로 한다(도 2b - 2e 참조). 이 ESP 링커를 포함하는 본 개시물의 SiR 화합물은 증가된 밝기 및 광안정성을 포함하는 예상치 못한 특성을 갖는다.
게다가, 메틸비닐-SiR(화합물 1)과의 티올-엔 반응은 4 내지 12 개 원자 범위의 상이한 길이의 링커를 제공할 수 있다. 표적 리간드에 대한 형광단의 근접성이 SiR 살아있는 세포 형광 프로브의 설계에 중요하다.
화학식 (I)의 화합물을 제조하기 위한 유용한 전구체 또는 합성 중간체를 나타내는 화학식 P1a, P1b, P2 및 P2a를 아래에 나타낸다. 이 경로에 따른 예시적인 화합물 및 단계를 도 2b - e에 나타낸다.
간단히 말하면, 끝에서부터 처음까지 기재된 첫 번째 합성 경로에서는, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (P2)의 화합물 및 화학식 (P2a)의 화합물로부터 제조될 수 있다. 화학식 (P2a)의 화합물은 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 화학식 (P2)의 화합물은 화학식 (P1a) 및 (P1b)의 화합물(동일하거나 또는 상이할 수 있음) 및 SiCl2R1R2로부터 제조될 수 있다. 화학식 (P1a) 및 (P1b)의 화합물 및 SiCl2R1R2는 모두 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 100 ℃ 초과의 온도에서 CuBr2 존재 하에서 화학식 (P2)
Figure pct00042
의 화합물과 화학식 (P2a)
Figure pct00043
의 화합물을 반응시킴으로써 화학식 (I)의 화합물을 생성하는 것을 포함하고, 여기서 R1, R2, R3, R4, E, R5, R6, R7, R8, R9, RN1, 및 RN2가 본원에 기재된 값을 가지는 것인 화학식 (I)의 화합물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서는, 화학식 (P1a)
Figure pct00044
및 화학식 (P1b)
Figure pct00045
의 화합물을 유기 리튬 염기, 예컨대 부틸리튬과 반응시키고, 그 다음에 SiCl2R1R2 와 반응시키는 것을 포함하고, 여기서 R1, R2, R5, R6, R7, R8, RN1, 및 RN2가 본원에 기재된 값을 가지는 것인 화학식 (P2)
Figure pct00046
(P2)
의 화합물의 제조 방법이 제공된다. 화학식 (P2)의 화합물을 사용하는 방법은 또한 위에서 제시된 바와 같은 화학식 (P2)의 화합물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
화학식 (I)의 일부 화합물의 합성 경로는 예를 들어, 원하는 치환체가 화학식 (I)의 초기 화합물에 이르는 단계들과의 상용성이 더 적은 경우에, 추가 단계를 추가로 포함한다.
예를 들어, R1 및/또는 R2는 화학식 (I)의 초기 화합물에서 비닐일 수 있고, 그 다음에 티올-엔 반응 및 임의로 추가 단계를 통해 유도체화되어 본원에 기재된 R1 및/또는 R2의 다른 값을 제공할 수 있다. 티올-엔 반응은 티올, 예를 들어 Z가 반응성 기, 예를 들어 카르복실 또는 아민과 같은 본원에 기재된 반응성 기인 HS-링커-Z와 R1 및/또는 R2가 비닐인 화학식 (I)의 화합물을 반응시켜서 R1 및/또는 R2가 반응성 기 Z에 연결된 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 것을 포함할 수 있다. Z는 화합물을 추가로 유도체화하기 위해 예를 들어, 표적 결합 모이어티, 예를 들어 본원에 기재된 표적 결합 모이어티, 예컨대 핵산 결합 모이어티, 세포골격 결합 모이어티 등과의 접합체를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특히 화합물 4-6을 참조한다.
대안으로 또는 추가로, R3 또는 R4는 화학식 (I)의 초기 화합물에서 카르복실 일 수 있고, 그 다음에 추가로 유도체화되어 예를 들어 링커 및 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티를 제공할 수 있다. 예를 들어, 카르복실기는 POCl3로 아실 클로라이드로 전환될 수 있고, 그 다음에 공지 화학(예를 들어, 클로라이드의 친핵성 치환을 포함함)을 이용해서 추가로 치환되어 화합물 7 및 7B와 같은 화합물에 도달할 수 있다 (도 2e 참조).
다양한 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 데 유용한 추가 세부사항 및 임의적 단계가 본원의 다른 곳에서, 예를 들어, 도면, 실시예, 및 접합체, 반응성 리간드, 포스포르아미다이트, 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드, 및 용해도를 증가시키는 모이어티에 대한 상기 설명에서 기재된다.
실시예
다음 실시예는 일부 개시된 실시양태를 예시하기 위해 제공되고, 어떠한 방식으로든 본 개시물의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 화합물 제조
3,3'-(메틸(비닐)실란디일)비스( N,N- 디메틸아닐린)의 합성
Figure pct00047
잘 건조된 1L 3구 둥근 바닥 플라스크에 3-브로모-N,N-디메틸아닐린(25g, 125.0 mmol)을 첨가하였다. THF(300 mL)를 플라스크로 옮겼다. 반응 혼합물을 -78 ℃로 냉각시키고, 이 온도를 30 분 동안 유지시켰다. n-BuLi(헥산 중 2.3 M n-BuLi 59.8 mL, 137 mmol)을 첨가 깔때기에 첨가하고, 반응 혼합물에 45 분 동안 적가하였다. 동일한 온도에서 1 시간 동안 교반한 후, 메틸비닐디클로로실란 (10.61 mL, 81.2 mmol)을 -78 ℃에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 드라이아이스조를 제거하여 온도를 실온(RT)으로 증가시키고, 추가로 RT에서 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 켄칭시키고, 회전증발기를 사용하여 대부분의 THF를 제거하였다. 조 물질을 EtOAc(150 mL)로 희석하고, 수성 층을 EtOAc(2 X 150 mL)로 추가로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Hex : EtOAc = 9 : 1)로 정제하여 3,3'-(메틸(비닐)실란디일)비스(N,N-디메틸아닐린)(12.6g, 65%)을 제공하였다.
화합물 1의 합성
Figure pct00048
화합물 1
75mL 압력 용기에 3,3'-(메틸(비닐)실란디일)비스(N,N-디메틸아닐린)(3.8 g, 12.24 mmol), 2-카르복시벤즈알데히드(3.67g, 24.48 mmol), 및 CuBr2(273 mg, 1.22 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 120 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. RT까지 냉각시킨 후, 진한 청색 조 물질을 CHCl3(150 mL) 및 물(150 mL)에 희석하였다. 수성 층을 추가로 CHCl3(100 mL Х 2)로 추출하고, 합한 유기층을 분별 깔때기로 옮겼다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 회전증발기를 사용하여 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Hex : EtOAc = 9 : 1)로 정제하여 화합물 1 (890 mg, 17 %)을 제공하였다.
화합물 2의 합성
Figure pct00049
Figure pct00050
화합물 1 화합물 2 화합물 3
화합물 1(400 mg, 0.91 mmol)을 함유하는 250 mL 석영 플라스크에 3-메르캅토프로피온산(154 mg, 1.45 mmol), DMPA(58 mg, 0.23 mmol) 및 THF(20 mL)를 첨가하였다. 플라스크를 아르곤 풍선과 연결하였다. 반응을 RT에서 2 시간 동안 장파장 UV 광으로 조명하였다. 광분해 반응 혼합물을 회전증발기를 사용하여 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 : MeOH = 9 : 1)로 정제하여 화합물 2(350 ㎎, 71 %) 및 화합물 3(46 ㎎, 9 %)을 제공였다.
화합물 2A의 합성
Figure pct00051
Figure pct00052
화합물 2 화합물 2A
화합물 2(330 mg, 0.6 mmol)를 함유하는 플라스크에 DMF(10 mL), 트리에틸아민(252 μL, 1.81 mmol) 및 TSTU(363 mg, 1.21 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 : MeOH = 9 : 1)로 정제하여 화합물 2A(243 ㎎, 62 %)를 제공하였다.
화합물 4의 합성
Figure pct00053
DMF(2mL) 중의 2'-(4-히드록시페닐)-5-(4-메틸-1-피페라지닐)-2,5'-비(1H-벤즈이미다졸)(28mg, 66.0μmol)의 용액에 K2CO3(25 mg, 0.18 mmol) 및 4-(Boc-아미노)부틸 브로마이드(21.6 mg, 85.7 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 24 시간 동안 60 ℃에서 가열하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 : MeOH = 3 : 1)로 정제하여 중간체(15 ㎎, 38 %)를 제공하였다.
DCM(1.0 mL) 중의 20 % TFA를 중간체(14 mg, 23.5 μmol)에 첨가하고, 15 분 동안 RT에서 교반하였다. 회전증발기를 사용하여 용매를 제거하여 Boc-탈보호된 중간체를 제공하였다. DMF(2.0mL) 중의 화합물 2A(12 mg, 18.6 μmol)의 용액에 DIEA(12 mg, 93.2 μmol) 및 DMF(1.0 mL) 중의 Boc 탈보호된 중간체를 첨가하고, 반응을 RT에서 2 시간 동안 교반하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(MeOH/H2O, 0 % 내지 95 % 구배)에서 Biotage에 의해 정제하여 화합물 4(10.5 mg, 44 %)를 제공하였다.
화합물 4는 규소 원자 상의 입체 중심 및 스피로-락톤화로 인해 두 부분입체이성질체의 혼합물로 존재할 수 있다. Biotage C-18 정제 동안, 두 부분입체이성질체(화합물 4B 및 화합물 4C)가 단리되었다. 하나의 부분입체이성질체가 TLC에서 화합물 4C보다 느리게 이동하였고, 따라서 도면에서는 이 부분입체이성질체를 "하부", 화합물 4C를 "상부"라고 부른다. 그러나, 출원인은 두 부분입체이성질체의 배위가 이미 지정되었기 때문에 이 표기가 임의적이라는 것을 언급한다.
화합물 5의 합성
Figure pct00054
DMSO(8 mL) 중의 화합물 2A(200 mg, 0.31 mmol)의 용액에 DMSO/H2O(1 : 1, 8 mL) 중의 6-아미노헥산산(61 mg, 0.47 mmol) 및 DIEA(120 mg, 0.93 mmol)의 용액을 첨가하고, RT에서 2 시간 동안 교반하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(MeOH/H2O, 0 % 내지 95 % 구배)에서 Biotage에 의해 정제하여 중간체(80 mg)를 제공하였다.
도세탁셀(117 mg, 0.15 mmol)을 포름산(3.0 mL)에 용해하고, 20 분 동안 교반하고, 용매를 제거하여 3'-아미노도세탁셀을 제공하였다. DMF(4 mL) 중의 중간체(80 mg, 0.12 mmol), DIEA(73 mg, 0.61 mmol) 및 PyAOP(95 mg, 0.18 mmol)의 용액에 DMF (2 mL) 중의 상기 3'-아미노도세탁셀을 첨가하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CHCl3 : MeOH = 9 : 1)로 정제하여 화합물 5(65 ㎎, 15 %)를 제공하였다.
최종 컬럼 크로마토그래피 정제 동안에 화합물 5의 각 부분입체이성질체가 단리되었다. 화합물 5B는 TLC에서 화합물 5C보다 더 느리게 이동하였고, 따라서 도면에서는 이 부분입체이성질체를 "하부", 화합물 5C를 "상부"라고 부른다. 그러나, 두 부분입체이성질체의 정확한 배위는 아직 지정하지 않았다.
화합물 6의 합성
Figure pct00055
(4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-인돌-3-일)메틸)-10-(4-아미노부틸)-4-(4-히드록시페닐)-8,13,15,19-테트라메틸-1-옥사-5,8,11-트리아자시클로노나데스-15-엔-2,6,9,12-테트라온 2,2,2-트리플루오로아세테이트1(2.0 mg, 2.5 μmol,)를 N,N-디이소프로필-N-에틸아민(3.3 mg, 0.025 mmol.)을 함유하는 건조 DMF 0.3 mL에 용해하였다. 화합물 2A(2.5 mg, 3.8 μmol.)를 클로로포름 0.1 mL에 용해하고, 펩티드 용액에 첨가하였다. 용액을 RT에서 1 시간 동안 유지한 다음 증발 건조시켰다. 잔류물을 CHCl3/MeOH (10:1) 혼합물을 사용하여 분석용 알루미늄 지지 TLC 플레이트에서 정제하였다. 생성물의 벤드(bend)를 TLC 플레이트에서 잘라내고, CHCl3-MeOH 혼합물로 여러 번 추출하였다. 합한 추출물을 여과하고, 용매를 증발시켜 화합물 6(2.0 mg, 66 %)을 제공하였다.
Milroy, Lech-Gustav 등, "Selective Chemical Imaging of Static Actin in Live Cells" J. Am. Chem. Soc., vol. 134, Apr. 4, 2012, pp 8480-8486.
화합물 6A를 아래에 나타낸 반응식에 따라 합성하였다.
Figure pct00056
화합물 6A의 합성
DMF(1.5 mL) 중의 2A(100 mg, 0.155 mmol)의 용액에 탈이온수(0.5 mL) 중의 아미노-PEG4 산(43 mg, 0.17 mmol)의 용액, 및 DIEA(60 mg, 0.47mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 교반하고, 용매를 제거하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(MeOH/H2O, 0 % 내지 80 % 구배)에서 Biotage에 의해 정제하여 중간체 (50 mg, 40 %)를 제공하였다.
DMF(2 mL) 중의 중간체(61 mg, 76.20 μmol), DIEA(41 mg, 0.32 mmol) 및 PyAOP(50 mg, 0.095 mmol)의 용액에 (4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-인돌-3-일)메틸)-10-(4-아미노부틸)-4-(4-히드록시페닐)-8,13,15,19-테트라메틸-1-옥사-5,8,11-트리아자시클로노나데스-15-엔-2,6,9,12-테트라온 2,2,2-트리플루오로아세테이트(50 mg, 63.5 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 30 분 동안 교반하고, 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(MeOH/H2O, 0 % 내지 90 % 구배)에서 Biotage에 의해 정제하여 화합물 6A(51 mg, 55 %)를 제공하였다.
최종 컬럼 크로마토그래피 정제 동안에 화합물 6A의 각 부분입체이성질체가 단리되었다. 화합물 6A-A는 TLC에서 화합물 6A-B보다 더 느리게 이동하였고, 따라서 도면에서는 이 부분입체이성질체를 "ESP-PEG4-A"라고 부르고, 화합물 6A-B를 "ESP-PEG4-B"라고 부른다. 그러나, 두 부분입체이성질체의 정확한 배위는 아직 지정하지 않았다. PEG12 링커를 함유하는 화합물 6B는 상기 절차에 따라 제조하였다.
화합물 6B의 합성
Figure pct00057
화합물 6C의 합성을 아래에 나타낸다.
화합물 6C의 합성
Figure pct00058
위에 기재된 화합물 6의 제조 절차에 따라서 C6 링커를 함유하는 화합물 6C를 제조하였다.
3,3'-(디메틸실란디일)비스( N,N- 디메틸아닐린)의 합성
Figure pct00059
잘 건조된 500 mL 3 구 둥근 바닥 플라스크에 3-브로모-N,N-디메틸아닐린(6.01 g, 30.0 mmol), 및 THF(60 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78 ℃로 냉각시키고, 이 온도를 30 분 동안 유지시켰다. n-BuLi(헥산 중 2.5 M n-BuLi 12.0 mL, 30.0 mmol)를 주사기를 사용하여 -78 ℃에서 5 분 동안 반응 혼합물에 적가하였다. 동일한 온도에서 30 분 동안 교반한 후, 디메틸디클로로실란(1.51 mL, 12.5 mmol)을 -78 ℃에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 드라이아이스조를 제거하여 온도를 RT로 증가시키고, RT에서 90 분 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액으로 켄칭시키고, 탈이온수(60 mL)로 희석하였다. 수성 층을 EtOAc(3 X 60 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Hex : EtOAc = 9 : 1)로 정제하여 3,3'-(디메틸실란디일)비스(N,N-디메틸아닐린)(2.92 g, 65 %)을 제공하였다.
2-(7-(디메틸아미노)-3-(디메틸이미니오)-5,5-디메틸-3,5-
디히드로디벤조[b,c]실린-10-일)벤조에이트의 합성
Figure pct00060
75 mL 압력 용기에 3,3'-(메틸(비닐)실란디일)비스(N,N-디메틸아닐린)(2.8 g, 9.38 mmol), 2-카르복시벤즈알데히드(4.23 g, 28.14 mmol) 및 CuBr2(210 mg, 0.94 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 120 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. RT까지 냉각시킨 후, 진한 청색 조 물질을 CHCl3(100 mL)에 용해시키고, 2 N NaOH(120 mL)로 세척하였다. 수성 층을 CHCl3(60 mL X 2)로 추가로 추출하고, 합한 유기 층을 분별 깔때기로 옮겼다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 회전증발기를 사용하여 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Hex : EtOAc = 9 : 1)로 정제하여 2-(7-(디메틸아미노)-3-(디메틸이미니오)-5,5-디메틸 -3,5-디히드로디벤조[b,e]실린-10-일)벤조에이트(828 mg, 21 %)를 제공하였다.
화합물 7A의 합성
Figure pct00061
화합물 7A
1,2-디클로로에탄(4 mL) 중의 2-(7-(디메틸아미노)-3-(디메틸이미니오)-5,5-디메틸-3,5-디히드로디벤조[b,e]실린-10-일)벤조에이트(300 mg, 0.70 mmol)의 용액에 POCl3(1.96 mL, 21.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 하우스 진공(house vacuum) 하에 회전증발기로 제거하여 아실화된 조 물질을 제공하였다.
tert-부틸 피페리딘-4-카르복실레이트 히드로클로라이드(186 mg, 0.84 mmol) 및 DCM/MeCN(1 : 1, 14 mL)을 상기 아실화된 조 물질을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 이 용액에 0 ℃에서 트리에틸아민(1.95 mL, 14.0 mmol)을 첨가하고, 추가로 RT에서 15 시간 동안 교반하였다. 회전증발기를 사용하여 용매를 제거하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(탈이온수(0.1 % TFA)/아세토니트릴(0.1 % TFA), 0 내지 95 % 구배)에서 Biotage로 정제하여 에스테르 화합물(287 mg)을 제공하였다.
DCM 중의 50 % TFA를 에스테르 화합물에 첨가하고, 2 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 회전증발기로 제거하고, 조 물질을 C-18 컬럼(탈이온수(0.1 % TFA)/아세토니트릴(0.1 % TFA), 0 내지 95 % 구배)에서 Biotage로 정제하여 화합물 7A (188 mg, 3 단계에 걸쳐 41 %)를 제공하였다.
화합물 7B의 합성
Figure pct00062
AcOH (5.0 mL) 중의 4-[6-(4-메틸-1-피페라지닐)-1H-벤즈이미다졸-2-일]- 2-벤젠디아민(50 ㎎, 0.16 mmol) 및 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드(39 mg, 0.23 mmol)의 용액을 130 ℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 회전증발기를 사용하여 용매를 제거하였다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 : MeOH = 3 : 1)로 정제하여 중간체 1(22 ㎎, 18 %)을 제공하였다.
중간체 1(20 ㎎, 42.6 μmol), 4-(Boc-아미노)부틸 브로마이드(14 ㎎, 55.4 μmol) 및 K2CO3(15.9 ㎎, 0.12 mmol)을 DMF(1 mL)에 용해하였다. 반응 혼합물을 5 시간 동안 교반하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl3 : MeOH = 4 : 1)로 정제하여 중간체 2(8 ㎎, 29 %)를 얻었다.
DCM(1 mL) 중의 30 % TFA 중의 중간체 2(4.4mg, 6.87μmol)의 용액을 10 분 동안 교반하였다. 회전증발기를 사용하여 용매를 제거하였다. DMF(1.0 mL) 중의 화합물 7A(5.0 mg, 8.7 μmol)의 용액에 PyAOP(5.4 mg, 10.3 μmol) 및 DIEA(4.4 mg. 34.3 μmol)을 첨가하였다. RT에서 5 분 동안 교반한 후, DMF(1.0 mL) 중의 탈보호된 중간체를 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2 시간 동안 교반하였다. 고진공 펌프를 사용하여 회전 증발을 통해 용매를 제거하였다. 조 물질을 C-18 컬럼(탈이온수(0.1 % TFA)/아세토니트릴(0.1 % TFA), 0 내지 95 % 구배)에서 Biotage에 의해 정제하여 화합물 7B(5.5 mg, 53 %)를 제공하였다.
실시예 2. 핵 염색
화합물 2 기반 형광 물질의 응용가능성을 입증하기 위해, ESP-염료 링커 부위에 훽스트 모이어티를 포함시킴으로써 살아있는 세포 핵 염료를 합성하였다. 예상치 않게, 화합물 2 기반 프로브는 다른 원하는 특성을 희생하지 않고 형광단 밝기를 크게 개선하였다.
화합물 4의 형광 강도를 형광 현미경을 사용하여 SiR-훽스트(Spirochrome, 스위스)와 비교하였다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 1μM 또는 2μM의 SiR-훽스트 또는 화합물 4로 염색하였다. LCIS 완충제로 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하여 5 회 반복실험으로부터 영상을 수집하고, HCS Studio 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포의 대표 영상들을 도 3a-3b(SiR-훽스트로 염색됨) 및 도 3c-3d(화합물 4로 염색됨)에 나타낸다. 도 3e는 SiR-훽스트 및 화합물 4로 염색된 세포의 핵 신호 강도를 비교하는 막대 플롯을 보여준다. 평균 핵 신호 강도는 1μM 및 2μM에서 형광 강도의 비의 평균에 기초해서 SiR-훽스트로 염색된 세포에서보다 화합물 4로 염색된 세포에서 48 % 더 높았다.
실시예 3. 세포골격 염색
화합물 2 기반 형광 물질의 응용가능성을 추가로 입증하기 위해, 또한 표적화 리간드인 도세탁셀을 사용하여 투불린 프로브를 제조하였다. 예상치 않게, 화합물 2 기반 프로브는 다른 원하는 특성을 희생하지 않고 형광단 밝기를 크게 개선하였다. 화합물 5(표적 결합 모이어티로 도세탁셀을 사용하는 투불린 프로브)의 형광 강도를 SiR-탁솔(Spirochrome, 스위스)과 비교하였다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 0.5 μM 화합물 5 또는 SiR-탁솔로 염색하고, 영상화를 위해 준비하였다. 영상은 도 4a-4b(화합물 5로 염색됨), 및 도 4c-4d(SiR-탁솔로 염색됨)에 나타낸다. 화합물 5로 염색된 세포가 SiR-탁솔로 염색된 세포보다 더 밝은 신호를 나타냈다.
실시예 4. 화합물 7의 살아있는 세포 및 고정 세포에서의 핵 염색 및 광안정성
SiR 유도체는 페닐 고리의 2'-카르복실기를 통해 비형광 스피로락톤과 형광 양쪽성이온 사이에서 평형 상태로 존재한다. 스피로락톤 형태가 SiR 세포 투과성을 가능하게 하는 우세한 형태이다. 세포 불투과성 SiR 염료를 만들기 위해, 피페리딘과 같은 부피가 큰 이차 아민을 2'-카르복실기에 포함시키고, 이렇게 함으로써 스피로락톤화를 방지하고, 그 결과로 SiR 염료는 항상 형광이거나 또는 "온" 상태이다. 화합물 7A를 합성하고, 훽스트와 커플링하여 화합물 7을 제조하거나 또는 니트로훽스트와 커플링하여 화합물 7B를 제조하였다(도 2e).
화합물 7의 형광 강도 및 광안정성을 원적외선 형광을 갖는 고정 세포 핵산 염색제 TO-PRO-3과 비교하였다. 고정 HeLa 세포를 RT에서 30 분 동안 1μM 화합물 7 또는 TO-PRO-3으로 염색하고, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하는 영상화를 위해 준비하였다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 화합물 7 염색이 도 5a에 나타낸 TO-PRO-3 염색보다 예상치 않게 더 밝았다. 화합물 7은 도 5d에 나타낸 바와 같이 여기 광에 1 분 노출 후 여전히 상당한 형광을 보유하였지만, TO-PRO-3 염색은 도 5b에 나타낸 바와 같이 더 감소되었다.
훽스트 염료는 청색 채널에서 형광성이기 때문에, 훽스트-접합된 SiR 염료의 청색 채널로의 블리드 스루의 가능성이 있다. 훽스트 모이어티에 니트로기 첨가는 결과적으로 화합물 7B를 생성하기 때문에, 블리드 스루가 DAPI 채널에서 놀랍게도 약 50 % 감소하였다. 추가로, Cy5 채널에서의 신호는 놀랍게도 약 12 % 증가하였다.
HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 5k/웰의 밀도로 플레이팅하고, CO2 인큐베이터에서 밤새(o/n) 그대로 두었다. 그 다음에 세포를 포름알데히드로 고정하고, 세제를 투과시켰다. 그 다음에 세포를 0.5 μM 최종 농도의 화합물 7 또는 화합물 7B로 염색하였다. 그 다음에 세포를 세척하고, CellInsight CX5 고함량 영상화 기기로 영상화하였다. 도 6a-6d는 Cy5 채널에서 영상화될 때 화합물 7B가 화합물 7보다 더 밝고(각각 도 6a 및 6c), DAPI 채널로의 블리드 스루가 더 적음을 나타낸다는 것을 보여준다(각각 도 6b 및 6d). 도 6e는 화합물 7과 비교할 때 화합물 7B 형광 신호가 Cy5 채널에서 12 % 증가하였고(각각 도 6E, #3 및 #1 참조), 화합물 7과 비교할 때 화합물 7B 형광 신호가 DAPI 채널에서 놀랍게도 50 % 감소하였다(각각 도 6E, #4 및 #2)는 것을 나타낸다.
실시예 5. 화합물 10B의 광안정성
수용성 링커를 본 개시물의 SiR 화합물에 부착하는 것은 그의 수용해도를 증가시키며, 이는 항체 표지화 및 다른 응용에 유용하다. 본 개시물의 수용성 SiR 염료 및 그의 접합체는 AlexaFluor647 접합체에 비해 극도로 광안정성이었다.
Hela 세포를 슬라이드 위에 놓고, 25 ℃에서 60 분 동안 50 μM의 화합물 10B 또는 ALEXA FLUOR™ 647 DYE("AF647", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 염색하였다. 광표백을 감소시키기 위해 슬라이드를 PROLONGTM Diamond ("PLD", Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 또는 VECTASHIELDTM (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 봉입하고, 커버 슬립을 덮었다. 도 7b는 각 시편이 어떻게 영상화되었는지 및 각 샘플에 대해 3 개 시야 내의 관심 영역이 스캔을 위해 어떻게 선택되었는지를 나타낸다. 각 영역을 633 nm 레이저를 사용하여 공초점 현미경으로 50 회 스캔한 다음 영상화하였다. AF647 + VECTASHIELD는 완전히 광표백되었다(데이터를 나타내지 않음). 도 7a에 나타낸 바와 같이, 화합물 10B로 염색된 시편에서 50 회 스캔 후 잔류하는 형광의 백분율은 사용된 봉입 매질에 관계없이 AF647로 염색된 시편에서보다 컸다.
실시예 6. 개시된 SiR 화합물의 형광 특징
물에 용해된(염료 단독), 또는 염소 항-마우스(GAM) IgG 접합체로서포스페이트 완충된 식염수(PBS)에 용해된 다양한 개시된 화합물 및 ALEXA FLUOR™ 647 염료 (AF647)의 형광 특징을 결정하였다. 여기 및 방출 최대값 및 양자 수율을 결정하기 위해 3회 반복실험을 수행하였다. 양자 수율은 염료 단독 샘플에 대해 측정하였다. 데이터를 표 3에 나타낸다(ND = 결정되지 않음).
표 3
Figure pct00063
일부 화합물은 용매에 용해될 때 시험하였다. 여기 및 방출 최대값을 결정하기 위해 3회 반복실험을 수행하였다. 데이터를 표 4에 나타낸다.
표 4.
Figure pct00064
실시예 7. 근적외선 방출 SiR 포스포르아미다이트 및 표지화된 폴리뉴클레오타이드
실릴 치환은 일반적으로 로다민 염료에 적색 쪽으로 75 nm 스펙트럼 편이를 제공한다. 650 nm 초과를 방출하는 표지화된 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 프라이머 및 프로브) 합성의 경우, 실릴 치환을 디클로로-로다민 포스포르아미다이트에 포함시켜서 화합물 51-54를 생성한다. 계산된 방출 최대값을 아래 표 5에 나타낸다.
표 5.
Figure pct00065
화합물 54-포스포르아미다이트 및 FAM 포스포르아미다이트를 사용한 FAM- 및 SiR-표지화된 프라이머의 생성은 도 8에 도시되어 있다. FRET 분석에 사용하기 위한 다중 발색단 구조의 합성을 자동화하기 위해 화합물 54 (및 유사한 화합물)를 사용할 수 있다. 화합물 59의 NHS 에스테르로부터 FAM 및 SiR 모이어티로 표지화된 프라이머의 생성은 도 9에 도시되어 있다.
실시예 8. 고정 세포 염색; 항체 접합
SiR 화합물은 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이 양쪽성이온성 (개방된) 형태와 스피로 (폐쇄된) 형태 사이에서 평형 상태로 존재한다. 프로브에 대한 표적 결합 모이어티와 고정 세포 또는 항체와 같은 리간드의 표적의 결합은 형광 개방된 형태를 더 선호할 수 있고, 반면에 자유로운 비결합된 SiR 프로브는 주로 폐쇄된 형태로 예를 들어 가역적 소수성 응집에 의해 안정화되어 존재할 수 있다.
상이한 응용에 사용될 수 있는 SiR 화합물을 제공하는 경로는 도 10a - 10b에 나타낸다. 고정 세포를 염색할 수 있는 SiR 화합물의 제조는 도 10a에 나타낸다.
일부 SiR 염료는 가용화 작용기가 없으면 일부 용도를 위해 충분히 수용성이 아닐 수 있기 때문에, 수용성 링커가 SiR에 부착되어 항체 표지화와 같은 접합을 촉진할 수 있다. 예시적인 가용화 치환체는 폴리에틸렌 옥사이드 링커, 반응성 리간드, 및 2 개의 설포네이트로 치환된 페닐을 포함하는 것, 예를 들어
Figure pct00066
이고, 여기서 물결선은 SiR 모이어티와의 연결을 나타낸다. 예를 들어, 화합물 10A-14를 참조한다. 항체 표지화를 위한 수용성 SiR의 예시적인 합성 경로를 도 10B에 나타낸다.
본원에 제공된 SiR 화합물의 수용해도는 또한 하나 이상의 설포네이트기의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, 화합물 8을 참조한다.
실시예 9. SiR 화합물의 형광 특징에 대한 치환 및 접합의 효과
화합물 10A, 11, 12 및 13을 사용하여 흡수 최대값에 대한 상이한 SiR 치환 패턴의 효과를 조사하기 위해 실험을 수행하였다. 화합물 10A 및 12에서는 각각 화합물 11의 비닐기 중 하나 또는 둘 모두가 메틸로 대체된다. 화합물 13에서는, 화합물 12와 비교해서 2 개의 엑소시클릭 아민 각각에서 1 개의 메틸기가 제거되었다. 각 비닐기가 메틸로 바뀔 때 흡수 최대값이 청색으로 약 5 nm 편이되었다는 것을 발견하였다. 2 개의 엑소시클릭 아민 각각에서 하나의 메틸기가 제거되었을 때 30 nm 편이가 관찰되었다(표 6). 따라서, SiR 모이어티에 Si를 통해 연결되는 기를 사용하는 SiR 염료의 변형은 메틸기 제거보다 더 적은 효과를 가진다.
표 6.
Figure pct00067
SiR, 본 실시예에서는 화합물 8, 10A 및 12와 IgG의 접합의 흡광도(도 11a에 나타냄) 및 방출 최대값(도 11b에 나타냄)에 대한 효과를 IgG-AF647과 비교하였다. SiR-접합체의 흡수 및 방출 최대값(665 nm/690 nm)은 AF647 접합체와 비교해서 대략 20 nm 적색 편이된다. 방출 최대값은 적색으로 15 nm 편이되었다. 이 편이 때문에 Cy5 필터를 사용할 때 신호가 AF647보다 더 적었다.
HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 7.5k/웰의 밀도로 플레이팅하고, CO2 인큐베이터에 밤새 그대로 두었다. 세포를 50 μM로 에토포시드로 처리하였다. 그 다음에 세포를 PBS로 3X 세척하고, 세포를 4 % 포름알데히드에서 15 분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 3X 세척하고, 그 다음에 PBS 중의 0.25 % Triton X-100으로 15 분 동안 투과시켰다. 세포를 PBS로 3X 세척하고, 그 다음에 1 시간 동안 PBS 중의 1 % BSA에서 블록킹하였다. 세포를 PBS로 1X 세척하고, 그 다음에 1 : 1000으로 희석된 일차 항체(Enzo, ADI-KAM-CC255-F)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3X 세척하고, 그 다음에 5 ㎍/mL에서 접합된 AF647(DOL 4.9) 또는 화합물 10A(DOL 5.4)를 갖는 이차 항체 표지와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3X 세척하고, DAPI로 대조염색하였다.　 Thermo Fisher Scientific Cellomics ArrayScan VTI 기기로 영상화하였다. 데이터 분석/도식화를 Prism에서 수행하였다.
형광 현미경을 사용하여 SiR 접합체, 화합물 10A(DOL = 15) 및 화합물 10A(DOL = 10)의 형광 강도를 AF647 접합체와 비교하였고, 여기서 DOL은 표지화 정도이다. 살아있는 마우스 세포를 AF647에 접합된 마우스 항-투불린(도 12a에 나타냄), 또는 화합물 10A와 접합된 마우스 항-투불린(DOL = 15, 도 12b에 나타냄)으로 25 ℃에서 60 분 동안 증가하는 농도로 염색하였다. 과량의 염료를 제거하기 위해 PBS 완충제로 세척한 후, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하여 영상을 수집하고, 통합 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포의 영상을 도 12a-12b에 나타낸다. 도 12c는 형광 대 표지화된 이차 시약의 농도를 비교하는 그래프를 나타낸다. SiR 염료는 Cy5 채널에서 AF647보다 6 - 8 배 더 희미한 영상을 제공하였고, 위에서 논의된 편이된 최대값과 일치한다. SiR 염료-접합체는 좋은 표적 특이성을 보였으며, 오프-표적 또는 배경 형광이 관찰되지 않았다. 영상화 동안에 광표백이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다.
화합물 13 및 14(도 1g에 나타낸 구조)로부터 제조된 SiR-염소 항-마우스(GAM) 접합체의 형광 강도 및 광안정성을 AF647과 비교하였다.
A549 세포를 Greiner 96 웰 플레이트에 웰당 5,000 개 세포의 밀도로 플레이 팅하고, 밤새 부착하도록 그대로 두었다. 다음날, 그것을 항체 프로빙(probing)을 위한 pH2AX의 포스포릴화를 유도하기 위해 50 μM 에토포시드로 37 ℃에서 2 시간 동안 처리하고, 그 다음에 PBS에서 제조된 4 % PFA에서 실온에서 20 분 동안 고정시켰다. 고정 후, 세포를 PBS에서 3X 린싱(rinsng)하고, PBS에 제조된 0.1 % Triton X-100으로 20 분 동안 투과시켰다. 트리톤 처리 후, 세포를 PBS에서 3X 세척하고, PBS 중의 3 % BSA로 제조된 블록킹 용액에 넣었다. 각 플레이트를 블록킹 용액에서 5 μg/mL로 제조된 일차 항체로 실온에서 1 시간 동안 4 ℃에서 처리하였다. 일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 PBS에서 3X 세척하고, 이차 항체로 프로빙하기 전에 블록킹 용액에 저장하였다.　 화합물 13(DOL 4.7); 화합물 14(DOL 4.0) 또는 AF647(DOL 4.9)로 표지화된 이차 항체를 블록킹 용액 중의 5 μg/mL로부터 제조하였고, 세포를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, PBS에서 3X 세척하고, 신호의 정량화를 위해 플레이트를 CX-5 CellInsight로 옮겼다. 형광 신호 데이터를 700 초 초과 기간 동안 매초 수집하였다. 데이터 분석/도식화를 Prism에서 수행하였다.
여기 광에 약 12 분의 노출 기간 동안 색바램방지 매질 없이 봉입된 샘플에서 형광 강도를 모니터링하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 화합물 13 및 14 둘 모두가 AF647에 비해 시간 경과 전반에 걸쳐서 광표백에 대해 훨씬 더 저항성이 있었다.
실시예 10. 근적외선 형광을 내는 SiR 염료
화합물 18, 20, 22, 24 및 26 (도 1i에 나타냄), 화합물 28, 29, 30, 31 및 32 (도 1j에 나타냄), 화합물 45 및 46 (도 1m에 나타냄), 및 화합물 47, 48, 49 및 50 (도 1n에 나타냄)을 포함하는 근적외선 형광을 내는 SiR 염료를 합성하고, 방출 최대값에 대해 시험한다. 방출 최대값이 화합물 1과 같은 화합물에 비해 적색 파장 쪽으로 편이된다는 것이 발견된다.
실시예 11. 핵산 분석
화합물 51-54와 같은 SiR-포스포르아미다이트 화합물을 폴리뉴클레오타이드 합성 반응에 사용해서 형광 표지화된 프라이머 및 프로브를 제공한다. 프라이머 및 프로브를 증폭 및 시퀀싱 반응에 사용하여 반응 생성물의 표지화 및/또는 검출을 제공한다.
화합물 51-54를 고체 지지체 합성을 이용한 폴리뉴클레오타이드의 화학적 자동화가능 합성에 사용하여 형광 표지화된 프라이머 및 프로브를 제공할 수 있다.
시퀀싱 반응 생성물은 모세관 전기영동으로 분해되고 검출될 수 있다.
증폭 반응 생성물은 이중 표지화된 프로브(예를 들어, 에너지 전달 파트너, 예를 들어 켄처, 예컨대 TaqManTM 또는 분자 비콘 프로브를 포함함)를 사용하여 실시간으로 검출될 수 있고, 그 결과로 혼성화 의존적 절단 또는 형태학적 변화를 통해 생성물 의존적 형광이 얻어진다.
실시예 12. ESP-SiR 이성질체로 핵 염색
화합물 2(에틸설포프로필-규소로다민, ESP-SiR) 기반 형광 물질의 상이한 부분입체이성질체의 응용가능성을 입증하기 위해, ESP-SiR 염료 링커 부위에 훽스트 모이어티를 포함시킴으로써 살아있는 세포 핵 염료를 합성하였다. 예상치 않게, 두 이성질체 중 하나(화합물 4B)를 사용하여 제조된 프로브가 다른 원하는 특성을 희생하지 않고 형광단 밝기를 크게 개선하였다.
화합물 4의 각 이성질체(화합물 4B 및 화합물 4C)의 형광 강도를 형광 현미경을 사용하여 비교하였다. DMSO 스톡 용액(1mM)을 사용하여 프로베네시드를 함유하는 PBS 중의 5, 2.5, 1.25 및 0.6 μM의 최종 농도로 각 이성질체의 용액을 제조하였다.
살아있는 HeLa 또는 A549 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 각 농도의 이성질체로 염색하였다. LCIS 완충제로 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하여 5 회 반복실험으로부터 영상을 수집하고, HCS Studio 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 14는 화합물 4B 및 4C로 염색된 세포의 핵 신호 강도를 나타낸다. 평균 핵 신호 강도는 시험된 각 농도에서 화합물 4C로 염색된 세포에서보다 화합물 4B로 염색된 두 세포 유형 모두에서 거의 2 배 더 높았다.
화합물 4B 및 4C의 형광 강도를 형광 현미경을 사용하여 SiR-훽스트 (Spirochrome, 스위스)와 비교하였다. 살아있는 HeLa 세포를 1μM의 SiR-훽스트 또는 화합물 4B 또는 4C로 37 ℃에서 30 분 동안 염색하였다. LCIS 완충제로 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 형광 현미경의 Cy5 및 DAPI 채널을 사용하여 5 회 반복실험으로부터 영상을 수집하고, HCS Studio 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 15는 SiR-훽스트 및 화합물 4B 및 4C로 염색된 세포의 핵 신호 강도를 비교하는 막대 플롯을 나타낸다. 화합물 4B는 Cy5 채널에서 Spirochrome(스위스)의 SiR 염료에 비해 더 높은 신호 강도를 보인 반면, 세 화합물 모두가 DAPI 채널에서 신호가 거의 관찰되지 않았다.
실시예 13. ESP-SiR 이성질체로 투불린 염색
화합물 2 기반 형광 물질의 응용가능성을 추가로 입증하기 위해, 표적화 리간드인 도세탁셀을 사용하여 투불린 프로브(화합물 5)도 또한 제조하였다. 예상치 않게, 화합물 2의 부분입체이성질체 중 하나를 사용하여 제조된 프로브(화합물 5A)는 다른 원하는 특성을 희생하지 않고 형광단 밝기를 크게 개선하였다. 화합물 5의 두 부분입체이성질체 및 두 이성질체의 혼합물의 형광 강도를 SiR-탁솔 (Spirochrome, 스위스)과 비교하였다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 0.5 μM의 각 화합물로 염색하고, 영상화를 위해 준비하였다. 도 16은 시험 된 각 화합물 및 부분입체이성질체 혼합물의 신호 강도를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 화합물 5A(탁솔-Red(B)); TLC 상의 하부 지점)는 화합물 5B(탁솔-Red(A) TLC 상의 상부 지점), A 및 B의 혼합물, 및 Spirochrome으로부터의 SiR-탁솔 화합물에 비해 투불린에 대해 훨씬 더 좋은 결합을 가진다.
실시예 14. ESP-SiR 이성질체의 세포 염색에 대한 링커의 효과
화합물 2 기반 형광 물질의 성능을 추가로 입증하기 위해, 표적 결합 모이어티로서 시클릭 펩티드를 사용하여 액틴 프로브를 합성하였다. 예상치 않게, 화합물 2 기반 프로브(화합물 6)는 다른 원하는 특성을 희생하지 않고 형광단 밝기를 크게 개선하였다. 화합물 6의 형광 강도를 SiR-액틴(Spirochrome, 스위스)과 비교하였다.
세포 염색 효능에 대한 링커 유형의 효과를 비교하기 위해 화합물 6의 유도체를 시험하였다. PEG4 또는 PEG12 링커를 포함하는 유도체를 C6 링커(X-링커)를 포함하는 화합물 6; 링커를 갖지 않는 액틴 프로브 접합체; 및 SiR-액틴(Spirochrome, 스위스)과 비교하였다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 1μM의 각 화합물로 염색하고, 본원에 기재된 바와 같은 영상화를 위해 준비하였다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 각 농도의 이성질체로 염색하였다. LCIS 완충제로 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 형광 현미경의 Cy5 채널을 사용하여 5 회 반복실험으로부터 영상을 수집하고, HCS Studio 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 17a 및 도 17b는 각각 시험된 각 화합물에 대해 평균 신호 강도 및 신호 강도 대 배경 (S/B)을 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 전반적으로, PEG4 링커를 갖는 화합물 6의 유도체는 살아있는 세포 및 고정 세포 둘 모두에서 가장 낮은 배경(가장 높은 S/B) 및 가장 균일한 염색을 나타냈고, 반면에 PEG12는 눈에 띄게 더 높은 배경 및 고르지 않은 염색을 나타냈다.
또한, 액틴 염색에 대한 화합물 6의 상이한 이성질체-PEG4의 효과를 시험하였다. 살아있는 HeLa 세포를 1μM의 각 화합물로 37 ℃에서 30 분 동안 염색하고, 위에서 기재된 바와 같이 영상화를 준비하였다. 도 18a는 화합물 6A-A (ESP-PEG4-A), 화합물 6A-B (ESP-PEG4-B), 단리된 화합물 6A-A 및 6A-B의 혼합물(이성질체 분리 전) 및 화합물 6A-A 및 6A-B의 분리된 두 이성질체의 조합의 평균 신호 강도를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 신호 강도는 SiR-액틴(Spirochrome)으로 표지화된 세포들에 대비하여 비교하였다. 도 18b는 시험된 각 화합물의 신호 대 배경 비를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 화합물 6A-A가 화합물 6A-B보다 약 3 배 더 밝지만, 둘 모두 동일한 위치화 특이성을 공유한다.

Claims (142)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 스피로락톤 형태 및/또는 염:
    Figure pct00068

    여기서:
    R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
    R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
    또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
    각 L1은 독립적으로 링커이고;
    각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    R3는 -COOH, SO3 -, H, R3a, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
    R3a는
    Figure pct00069
    ,
    Figure pct00070
    , 또는 -C(O)N(RN3)(RN4)이고;
    RN3는 H, 메틸, C2-6 알킬, 또는 -CH2-A이고, 여기서 A는 적어도 하나의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    RN4는 -L1-RA, 또는 -L1-RB1, 또는 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q는 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
    R3b는 -OH 또는 -N(RN5)-L3a-RB이고;
    각 L3a는 독립적으로 링커이고;
    RB는 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티이고;
    RN5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이고;
    R4는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    E는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    R9은 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
    각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
    R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
    R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
    R13은
    Figure pct00071
    이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸, AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이고;
    추가로, 여기서 (i) R1이 메틸 또는 C2-6 알킬이면, R2는 메틸 또는 C2-6 알킬이 아니거나, 또는 (ii) R3는 R3a 또는 -L1-RB1이다.
  2. 하기 화학식 (P1a)
    Figure pct00072
    (P1a)
    의 화합물 및 하기 화학식 (P1b)
    Figure pct00073
    (P1b)
    의 화합물을 유기리튬 염기 및 그 다음에 SiCl2R1R2와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (P2)
    Figure pct00074
    (P2)
    의 화합물을 제조하는 방법:
    식 중,
    R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
    R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
    또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
    각 L1은 독립적으로 링커이고;
    각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
    각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
    R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
    R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
    R13은
    Figure pct00075
    이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸, AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이다.
  3. 100 ℃ 초과 온도에서 CuBr2 존재 하에서 하기 화학식 (P2)
    Figure pct00076

    의 화합물과 하기 화학식 (P2a)
    Figure pct00077

    의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (I)
    Figure pct00078

    의 화합물을 제조하는 방법:
    식 중,
    R1은 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
    R2는 메틸, C2-6 알킬, 비닐, 치환된 비닐, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이거나;
    또는 R1 및 R2는 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
    각 L1은 독립적으로 링커이고;
    각 RA는 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    각 RB1은 독립적으로 반응성 리간드, 가용화 작용기, 표적 결합 모이어티 또는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고;
    R3는 -COOH, SO3 -, H, R3a, -L1-RA, 또는 -L1-RB1이고;
    R3a는
    Figure pct00079
    또는 -C(O)N(RN3)(RN4)이고;
    RN3는 H, 메틸, C2-6 알킬, 또는 -CH2-A이고, 여기서 A는 적어도 하나의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    RN4는 -L1-RA, 또는 -L1-RB1, 또는 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q는 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
    R3b는 -OH 또는 -N(RN5)-L3a-RB이고;
    각 L3a는 독립적으로 링커이고;
    RB는 반응성 리간드 또는 표적 결합 모이어티이고;
    RN5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이고;
    R4는 SO3, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    E는 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    R5는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R6는 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    R7은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN1과 함께 고리를 형성하고;
    R8은 H, 메틸, 또는 C2-6 알킬이거나, 또는 RN2와 함께 고리를 형성하고;
    R9은 SO3 -, 메틸, 클로로, C2-6 알킬, 또는 H이고;
    각 RN1은 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R5 또는 R7과 함께 고리를 형성하고;
    각 RN2는 독립적으로 H, 메틸, C2-4 알킬, C(O)R10, -C(O)R13이거나, 또는 R6 또는 R8과 함께 고리를 형성하고;
    R10은 -C(O)-CF3 또는 -O-CH2-A1이고, 여기서 A1은 적어도 하나의 R11으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    R11은 메틸, C2-6 알킬, 또는 -OR12이고;
    R12는 H, 메틸, 아세틸(Ac), 아세톡시메틸(AM), -PO3 2-, -PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고;
    R13은
    Figure pct00080
    이고, 여기서 R15은 올리고펩티드 또는 -OR'이고, 여기서 R'은 아세틸, AM, PO3 2-, PO3(AM)2, 또는 글리코시드이고, AM은 아세톡시메틸이고;
    추가로 여기서 (i) R1이 메틸 또는 C2-6 알킬이면, R2는 메틸 또는 C2-6 알킬이 아니거나, 또는 (ii) R3는 R3a 또는 -L1-RB1이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 비닐 또는 치환된 비닐인 화합물 또는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 비닐인 화합물 또는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 메틸 또는 C2-6 알킬로 치환된 비닐인 화합물 또는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 그것들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고리가 포화된 고리인 화합물 또는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 고리가 5-, 6-, 또는 7-원 고리인 화합물 또는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리가 비치환된 것인 화합물 또는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 -L1-RA인 화합물 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서, RA가 -COOH인 화합물 또는 방법.
  13. 제11항에 있어서, RA가
    Figure pct00081
    , NHS 에스테르 또는 숙신이미딜 에스테르(SE), 카르복실, 카르복실에스테르, 말레이미드, 아미드, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 아세톡시메틸(AM) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란 및 시클로옥틴-아민인 화합물 또는 방법.
  14. 제11항에 있어서, RA가 가용화 작용기인 화합물 또는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 가용화 작용기가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 에틸렌 옥사이드 단위를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  16. 제11항에 있어서, RA가 포스포르아미다이트를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  17. 제1항 내지 제6항 및 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 -L1-RB1인 화합물 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, RB1이 핵산 결합 모이어티를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  19. 제17항에 있어서, RB1이 세포골격 결합 모이어티를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  20. 제17항에 있어서, RB1이
    Figure pct00082

    Figure pct00083
    또는
    Figure pct00084

    를 포함하고, 여기서 물결선이 SiR 모이어티와의 임의로 링커를 통한 연결을 나타내는 것인 화합물 또는 방법.
  21. 제17항에 있어서, RB1이 항체를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L1이 독립적으로 -(CH2)s-X-L3a-이고, 여기서 s가 독립적으로 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; 각 X가 독립적으로 CH2, S, S(O), 또는 S(O)2이고; 각 L3a가 독립적으로 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 화합물 또는 방법.
  23. 제22항에 있어서, s가 2인 화합물 또는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, X가 S인 화합물 또는 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, X가 S(O)인 화합물 또는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 2인 화합물 또는 방법.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 3인 화합물 또는 방법.
  28. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 -(CH2) p -이고, 여기서 p가 4, 5, 또는 6인 화합물 또는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, R3가 -COOH인 화합물 또는 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, R3가 SO3 -인 화합물 또는 방법.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, R3가 H인 화합물 또는 방법.
  32. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, R3가 R3a인 화합물 또는 방법.
  33. 제32항에 있어서, R3a가 -C(O)N(RN3)(RN4)인 화합물 또는 방법.
  34. 제33항에 있어서, RN3가 메틸인 화합물 또는 방법.
  35. 제33항에 있어서, RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 극성 또는 하전된 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 화합물 또는 방법.
  36. 제33항 또는 제35항에 있어서, RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 1 개의 -OH, -NH2, -COOH, -NO2, 또는 -SO3 -로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 화합물 또는 방법.
  37. 제33항, 제35항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고, 이 적어도 2개의 기가 독립적으로 -OH, -NH2, -COOH, -NO2, 또는 -SO3 -인 화합물 또는 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, RN3가 -CH2-A이고, 여기서 A가 적어도 2 개의 -SO3 -로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴인 화합물 또는 방법.
  39. 제33항 및 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, A가 치환된 아릴인 화합물 또는 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, RN4가 -(CH2)3-RB이고, 임의로 여기서 RN4의 RB가 -COOH인 화합물 또는 방법.
  41. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 2인 화합물 또는 방법.
  42. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 3인 화합물 또는 방법.
  43. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, RN4가 -(CH2CH2O)q-C(O)O-RB이고, 여기서 q가 4, 5, 또는 6인 화합물 또는 방법.
  44. 제32항에 있어서, R3a가
    Figure pct00085
    인 화합물 또는 방법.
  45. 제44항에 있어서, R3b가 N(RN5)-L3a-RB인 화합물 또는 방법.
  46. 제45항에 있어서, RN5가 H인 화합물 또는 방법.
  47. 제45항에 있어서, RN5가 메틸인 화합물 또는 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R3b가 -OH인 화합물 또는 방법.
  49. 제32항에 있어서, R3a가
    Figure pct00086
    인 화합물 또는 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 2인 화합물 또는 방법.
  51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 3인 화합물 또는 방법.
  52. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 각 L3a가 독립적으로 -(CH2) p- 이고, 여기서 p가 4, 5, 또는 6인 화합물 또는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가 반응성 리간드를 포함하고, 임의로 여기서 반응성 리간드가 카르복실, 아민, 또는 활성 에스테르이고, 추가로 임의로 여기서 활성 에스테르가 NHS 에스테르 또는 숙신이미딜 에스테르(SE), 카르복실 에스테르, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르 및 아세톡시메틸(AM) 에스테르인 화합물 또는 방법.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가 포스포르아미다이트를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  55. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가 핵산 결합 모이어티를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  56. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가 세포골격 결합 모이어티를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  57. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가
    Figure pct00087

    Figure pct00088
    또는
    Figure pct00089

    를 포함하고, 여기서 물결선이 SiR 모이어티와의 임의로 링커를 통한 연결을 나타내는 것인 화합물 또는 방법.
  58. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RB가 항체를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 SO3 -인 화합물 또는 방법.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 H인 화합물 또는 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, E 및 R9이 각각 클로로인 화합물 또는 방법.
  62. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, E가 H인 화합물 또는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 H인 화합물 또는 방법.
  64. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 메틸인 화합물 또는 방법.
  65. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 RN1과 함께 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, R6가 H인 화합물 또는 방법.
  67. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, R6가 메틸인 화합물 또는 방법.
  68. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, R6가 RN2와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 H인 화합물 또는 방법.
  70. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 메틸인 화합물 또는 방법.
  71. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 RN1과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, R8이 H인 화합물 또는 방법.
  73. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, R8이 메틸인 화합물 또는 방법.
  74. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, R8이 RN2와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN1이 H인 화합물 또는 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN1이 메틸인 화합물 또는 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN1이 C(O)OR10인 화합물 또는 방법.
  78. 제1항 내지 제62항 및 제65항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, RN1이 R5와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  79. 제1항 내지 제68항 및 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, RN1이 R7과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN2가 H인 화합물 또는 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN2가 메틸인 화합물 또는 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN2가 C2-4 알킬인 화합물 또는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 또는 각 RN2가 C(O)OR10인 화합물 또는 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, RN2가 R6와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  85. 제1항 내지 제65항 및 제68항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, RN2가 R8과 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하는 것인 화합물 또는 방법.
  86. 제1항 내지 제72항 및 제75항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, R10이 -CH2-A1이고, 여기서 A1이 적어도 1 개의 R11으로 임의로 치환된 아릴인 화합물 또는 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, R11이 메틸인 화합물 또는 방법.
  88. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, R11이 -OR12인 화합물 또는 방법.
  89. 제1항 내지 제86항 및 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 H인 화합물 또는 방법.
  90. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 메틸인 화합물 또는 방법.
  91. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 아세틸(Ac)인 화합물 또는 방법.
  92. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 아세톡시메틸(AM)인 화합물 또는 방법.
  93. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 -PO3 2-인 화합물 또는 방법.
  94. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 -PO3(AM)2인 화합물 또는 방법.
  95. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 글리코시드인 화합물 또는 방법.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, RN1 또는 RN2가 -C(O)R13이고, 임의로 여기서 RN1 또는 RN2 중 오직 하나가 -C(O)R13인 화합물 또는 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, R15이 프로테아제에 의해 인지되는 올리고펩티드이고, 임의로 여기서 프로테아제가 카스파제인 화합물 또는 방법.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, R15이 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥토펩티드, 또는 노나펩티드인 화합물 또는 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, R15이 아미노산 서열 DVED를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, R15이 아미노산 서열 DVEDHN을 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, R15이 R13의 고리에 C-말단을 통해 연결된 올리고펩티드인 화합물 또는 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 메틸 또는 C2-6 알킬인 화합물 또는 방법.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 다음:
    a. R5 및 R6가 동일하다;
    b. RN1이 RN2와 동일하다; 또는
    c. R7 및 R8이 동일하다
    중 하나, 둘 또는 셋이 참인 화합물 또는 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RN1이 RN2와 동일한 것인 화합물 또는 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 규소 및 R4를 통과하는 거울 대칭 평면을 가지고, 임의로 R1 및 R2가 반드시 동일하지는 않다는 예외를 가지는 것인 화합물 또는 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 구조:
    Figure pct00090

    를 갖는 화합물 또는 그의 개방된 형태, 염, 또는 유리 산 또는 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식:
    NUC-DYE
    를 가지고,
    여기서
    NUC는 뉴클레오사이드/타이드 모이어티이고
    DYE는 화합물의 SiR 모이어티이고, NUC 및 DYE는 링커에 의해 연결되고;
    여기서 링커는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에서 DYE에 부착되고;
    임의로 여기서 NUC가 푸린 염기를 포함하면, 링커는 푸린의 8-위치에 부착되고, NUC가 7-데아자푸린 염기를 포함하면, 링커는 7-데아자푸린의 7-위치에 부착되고, NUC가 피리미딘 염기를 포함하면, 링커는 피리미딘의 5-위치에 부착되는 것인 표지화된 뉴클레오사이드/타이드인 화합물 또는 방법.
  108. 제107항에 있어서, NUC가 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 프라이머, 프라이머 연장 생성물, 또는 프로브를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 화합물의 SiR 모이어티와 에너지 전달 관계의 켄처 또는 형광단을 추가로 포함하는 화합물 또는 방법.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, NUC가 우라실, 시토신, 데아자아데닌, 및 데아자구아노신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  111. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (L1):
    Figure pct00091

    의 포스포르아미다이트 화합물이고,
    여기서:
    X 및 Y는 함께 링커를 형성하고;
    B1은 포스파이트 에스테르 보호기이고;
    B2　및 B3는 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴, 및 시클로알킬이고;
    D는 화합물의 SiR 모이어티이고;
    여기서 Y는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에서 D에 부착되는 것인 화합물 또는 방법.
  112. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (L2):
    Figure pct00092

    의 포스포르아미다이트 화합물이고, 여기서:
    B1은 포스파이트 에스테르 보호기이고;
    B2　및 B3는 개별적으로 취할 때 10 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬, 저급 알켄, 아릴, 또는 시클로알킬이고;
    B5는 수소 또는 산에 의해 절단가능한 히드록실 보호기이고;
    B는 뉴클레오사이드/타이드 염기이고;
    D는 화합물의 SiR 모이어티이고;
    B는 화학식 (I)의 위치 R1 또는 R2 중 하나에 링커를 통해 D에 부착되고;
    임의로 여기서 B가 푸린 또는 7-데아자푸린이면, 당 모이어티가 푸린 또는 7-데아자푸린의 N9-위치에서 부착되고, B가 피리미딘이면, 당 모이어티가 피리미딘의 N1-위치에서 부착되고,
    임의로 여기서 B가 푸린이면, 링커가 푸린의 8-위치에 부착되고, B가 7-데아자푸린이면, 링커가 7-데아자푸린의 7-위치에 부착되고, B가 피리미딘이면, 링커가 피리미딘의 5-위치에 부착되는 것인 화합물 또는 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화합물:
    Figure pct00093
    ,
    Figure pct00094

    화합물 1 화합물 1A
    Figure pct00095
    ,
    Figure pct00096

    화합물 1B 화합물 1C
    Figure pct00097
    ,
    Figure pct00098

    화합물 2 화합물 2A

    Figure pct00099

    화합물 3
    Figure pct00100

    화합물 4A
    Figure pct00101

    화합물 4
    Figure pct00102

    화합물 5
    Figure pct00103

    화합물 6
    Figure pct00104

    화합물 6

    Figure pct00105

    화합물 6A
    Figure pct00106

    화합물 6B

    Figure pct00107

    화합물 6C
    Figure pct00108

    화합물 7

    Figure pct00109

    화합물 7A
    Figure pct00110

    Figure pct00111

    Figure pct00112

    Figure pct00113

    Figure pct00114

    Figure pct00115

    Figure pct00116

    Figure pct00117

    Figure pct00118

    중 어느 하나, 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산이고, 여기서 R1, R2, R5, R6, R7, R8, R15, 및 RN1이 제1항에서 정의된 바와 같은 것인 화합물 또는 방법.
  114. 하기 화합물:
    Figure pct00119
    ,
    Figure pct00120

    화합물 1 화합물 1A
    Figure pct00121
    ,
    Figure pct00122

    화합물 1B 화합물 1C
    Figure pct00123
    ,
    Figure pct00124

    화합물 2 화합물 2A
    Figure pct00125

    화합물 3
    Figure pct00126

    화합물 4A
    Figure pct00127

    화합물 4
    Figure pct00128

    화합물 5
    Figure pct00129

    화합물 6
    Figure pct00130

    화합물 6A
    Figure pct00131

    화합물 6B
    Figure pct00132

    화합물 6C
    Figure pct00133

    화합물 7
    Figure pct00134

    화합물 7A
    Figure pct00135

    Figure pct00136

    Figure pct00137

    Figure pct00138

    Figure pct00139

    Figure pct00140

    Figure pct00141

    Figure pct00142

    Figure pct00143

    Figure pct00144

    중 어느 하나이고, 여기서 R1, R2, R5, R6, R7, R8, R15, 및 RN1이 제1항에서 정의된 바와 같은 것인 제1 화합물과 표적 결합 모이어티, 뉴클레오사이드/타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 반응시킴으로써 형성되고, 임의로 여기서 제1 화합물이 먼저 그의 모이어티를 표적 결합 모이어티와 반응하는 반응성 리간드로 전환함으로써 활성화되는 것인 화합물; 또는 그의 개방된 또는 스피로락톤 형태 및/또는 염 또는 유리 산.
  115. 제114항에 있어서, 상기 표적 결합 모이어티가 항체, 핵산 결합 모이어티, 또는 세포골격 결합 모이어티인 화합물.
  116. 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항 및 제4항 내지 제114항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키고, 표적 폴리뉴클레오타이드 및 화합물을 포함하는 복합체가 형성되었는지를 결정하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 검출 방법.
  117. 제116항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오타이드 및 화합물을 포함하는 복합체가 형성되었는지를 결정하는 것이 복합체로부터 형광을 검출하거나 또는 복합체 형성으로 인한 형광의 변화를 검출하는 것을 포함하고, 임의로 여기서 복합체 형성으로 인한 형광의 변화가 절단 또는 형태학적 변화로 인해 켄처에 의한 켄칭의 감소인 화합물 또는 방법.
  118. 시퀀싱 반응 동안 폴리뉴클레오타이드와 제1항, 제4항 내지 제105항 및 제107항 내지 제114항 중 어느 한 항의 화합물을 접촉시키고, 시퀀싱 생성물을 형성하고, 시퀀싱 생성물로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하되, 상기 화합물이 프라이머 또는 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 화합물이 시퀀싱 생성물의 합성을 종결하는 표지화된 종결자 뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드이고, 임의로 여기서 표지화된 종결자 뉴클레오타이드가 표지화된 디데옥시뉴클레오타이드 또는 가역적 종결자 뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드인 화합물 또는 방법.
  120. 제118항에 있어서, 상기 화합물이 프라이머이고, 시퀀싱 생성물이 프라이머 연장에 의해 형성된 것인 화합물 또는 방법.
  121. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 형광을 검출하기 전에 시퀀싱 생성물을 다른 시퀀싱 생성물로부터 분리하는 것을 포함하고, 임의로 여기서 분리하는 것이 전기영동에 의한 것이고, 추가로 임의로 여기서 전기영동이 모세관 전기영동인 화합물 또는 방법.
  122. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시퀀싱 생성물을 현장에서 검출하는 것을 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  123. 제1 반응성 리간드를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제1 반응성 리간드와의 반응시 결합을 형성할 수 있는 제 2 반응성 리간드를 포함하는 제1항 및 제4항 내지 제105항 및 제107항 내지 제114항 중 어느 한 항의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 제1 반응성 리간드를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 표지화 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 제2 반응성 리간드가 포스포르아미다이트인 화합물 또는 방법.
  125. 제123항에 있어서, 상기 제2 반응성 리간드가 활성 에스테르이고, 임의로 여기서 활성 에스테르가 NHS 에스테르인 화합물 또는 방법.
  126. 폴리뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 결합 모이어티를 포함하는 제1항, 제4항 내지 제105항 및 제107항 내지 제114항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 염색 방법.
  127. 폴리뉴클레오타이드와 비공유결합적으로 연계된 폴리뉴클레오타이드 결합 모이어티를 포함하는 제1항, 제4항 내지 제105항 및 제107항 내지 제114항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 형광 복합체.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 약 8 개 내지 약 15 개 뉴클레오타이드, 약 15 개 내지 약 30 개 뉴클레오타이드, 약 30 개 내지 약 50 개 뉴클레오타이드, 약 50 개 내지 약 200 개 뉴클레오타이드, 약 200 개 내지 약 1000 개 뉴클레오타이드, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 5 Mb, 약 5 Mb 내지 약 50 Mb, 또는 약 50 Mb 내지 약 500 Mb의 길이를 갖는 것인 방법 또는 형광 복합체.
  129. 제116항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드, 코스미드, PCR 생성물, 제한 단편, cDNA, 게놈 DNA, 또는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오타이드인 방법 또는 형광 복합체.
  130. 제116항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 전기영동 겔, 세포, 세포소기관, 바이러스, 바이로이드 또는 생물학적 유체에 있거나, 또는 물 샘플, 흙 샘플, 식료품, 발효 과정 또는 표면 세척에 있거나 또는 그로부터 얻는 것인 방법 또는 형광 복합체.
  131. 세포막 무결성을 결정하는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 세포를 함유하는 샘플을 적어도 하나의 하전된 기를 포함하는 제1항, 제4항 내지 제106항 및 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항의 화합물과 함께 이 화합물이 손상된 세포막을 갖는 세포에 들어가기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계;
    b) 하나 이상의 세포로부터 검출가능한 형광 신호의 존재에 기초하여 하나 이상의 세포의 세포막 무결성을 결정하는 단계로서, 여기서 검출가능한 형광 신호의 존재는 세포막 무결성이 손상됨을 나타내고, 검출가능한 형광 신호의 부재는 세포막 무결성이 손상되지 않음을 나타내는 것인, 단계
    를 포함하는 방법.
  132. 표적 항원을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 표적에 특이적으로 결합하는 표적 결합 모이어티를 포함하는 제1항, 제4항 내지 제106항, 및 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키고, 표적 및 화합물을 포함하는 복합체로부터 형광을 검출하는 것을 포함하는 표적 검출 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 샘플이 세포를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  134. 제132항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 추출물을 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광을 검출하는 것이 형광 현미경, 플레이트 판독기, 형광 스캐너, 형광계 또는 유세포 분석기를 사용하여 수행되는 것인 화합물 또는 방법.
  136. 표적에 특이적으로 결합하도록 구성된 표적 결합 모이어티를 포함하는 제1항 및 제4항 내지 제115항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 표적 검출 키트.
  137. 제136항에 있어서, 상기 표적이 액틴 또는 미세관이고, 상기 표적 결합 모이어티가 액틴 결합 모이어티 또는 미세관 결합 모이어티인 키트.
  138. 제136항에 있어서,상기 표적 결합 모이어티가 표적에 특이적인 항체인 키트.
  139. 제136항에 있어서, 상기 표적이 일차 항체이고, 상기 표적 결합 모이어티가 일차 항체에 특이적인 이차 항체인 키트.
  140. 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적이 폴리펩티드, 다당류, 지질 또는 폴리뉴클레오타이드인 키트.
  141. 제1항 및 제4항 내지 제115항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 샘플 염색 키트.
  142. 적어도 하나의 반응성 리간드를 포함하는 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 화학식 (I)의 화합물과 표적 결합 모이어티, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 접합시키는 키트.
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