CN116768790A - 一种阳离子型荧光染料及其制备方法和在细胞染色中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光化合物技术领域，尤其涉及一种阳离子型荧光染料4‑(N,N‑二甲基苯乙烯基)‑N‑(3‑三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐及其制备方法和应用。本发明提供的4‑(N,N‑二甲基苯乙烯基)‑N‑(3‑三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐，具有式Ⅰ所示结构，它是具有AIE性质的荧光分子，能够快速高效进入细胞并且对细胞核、细胞质基质等进行差别染色，可用于活体细胞荧光成像中。
Description
技术领域
本发明涉及荧光化合物技术领域，特别涉及一种阳离子型荧光染料、制备方法和其在细胞染色中的应用。
背景技术
由于荧光信号可在不对样品进行物理损伤的情况下进行信号采集，因此保证了样品的完整性，使得其在生物活体细胞荧光成像及检测中的应用具有明显优势。
具有聚集诱导发光(AIE)性质的发光体系避免了常见荧光分子在高浓度条件下的荧光淬灭，处于聚集态的荧光分子也降低了细胞毒性，同时抗生物体内酶解的性质得到提高。因此，具有AIE性质的荧光染料更适于应用在生物活体的荧光成像领域。
对于生物活体细胞，想要使用荧光分子进行染色，除了需要荧光分子具有良好的染色性能和发光性能外，还需要确保荧光分子具有快速高效进入细胞并对细胞核、细胞质基质进行差别染色的能力。但目前在大量文献中查找到的荧光分子以及医院分子影像学研究室中已实际使用的荧光试剂盒中的荧光染料，要么不具备在活体组织中快速通过并染色组织中细胞的能力，要么不具备同时对不同亚细胞器染色的能力。针对以上问题，以下提出一种解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种阳离子型荧光染料，能够快速高效进入细胞并且对细胞核、细胞质基质等进行差别染色，可用于细胞荧光成像中。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
本发明提供了一种新型阳离子型荧光染料，它具有AIE性质，该新型阳离子型AIE荧光分子为4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐，其化学结构式如式I所示：
本发明还提供了上述技术方案所述的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的制备方法，包括以下步骤：
S1：以4-甲基吡啶和3-溴丙基三甲基溴化铵为原料,溶于适当的有机溶剂中，在80～120℃下，进行烷基化反应，经过后处理得到中间产物4-甲基-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(A)；
S2：惰性气体保护下，将中间产物A与对二甲氨基苯甲醛作为原料，溶于适当的有机溶剂中，加入催化剂，在80～120℃下，进行亲核加成反应，经过后处理得到目标产物4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(B)。
本发明提供的制备上述4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的化学反应方程式如下：
步骤S1中所述的制备中间产物A的烷基化反应原料4-甲基吡啶和3-溴丙基三甲基溴化铵均为商业化产品，直接使用；
步骤S1中所述的化学反应中原料3-溴丙基三甲基溴化铵和4-甲基吡啶的物质的量比为1:1.0～1:2.0，具体比例根据所用溶剂和反应温度选择；
步骤S1中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或乙醇中的一种；
步骤S1所述的反应时间为2～15小时，反应温度为80～120℃；
步骤S1所述的后处理包括旋蒸、洗涤、沉析三个操作步骤；
步骤S1所述的旋蒸操作，是指通过旋转蒸发除去有机溶剂；
步骤S1所述的洗涤操作，是指通过加入有机溶剂进行洗涤，除去未反应的原料杂质。
步骤S1所述的沉析操作，是指将中间产物A溶解后，滴入中间产物A的不良溶剂中沉淀，纯化产物。
步骤S2中所述的化学反应中原料中间产物A与对二甲氨基苯甲醛的物质的量比为1:1.0～1:1.5，具体比例根据所用溶剂和反应温度选择；
步骤S2中所述的化学反应中，催化剂哌啶的用量为中间产物A质量的1％～3％；
步骤S2中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或乙醇中的一种；
步骤S2所述的反应时间为4～15小时，反应温度为80～120℃；
步骤S2所述的后处理包括旋蒸、提纯两个操作步骤；
步骤S2所述的旋蒸操作，是指通过旋转蒸发除去有机溶剂；
步骤S2所述的提纯操作，是指将产物混合物通过硅胶色谱柱分离，淋洗剂为二氯甲烷与石油醚(60～90℃)按照7:3的体积比配制的混合溶剂。
本发明还研究了所述的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的理化性质，主要包括以下几个方面：
1)光物理性质研究：
为了方便后续细胞成像实验，首先需要测试探针分子的光物理性质。本发明所述的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(以下简称化合物B)的固体绝对量子效率为6.03％，该分子的主要用途是生物诊疗，因此测试了化合物B的物质的量浓度为1×10-5mol/L的水溶液中绝对量子效率为4.04％。
为模拟细胞内环境，本发明配制了摩尔浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，以此Tris溶液作为溶剂测定了化合物B的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，如图1A和图1B所示，其在此Tris溶液中的最大吸收波长和发射波长分别为468nm和606nm。通过图1C可以计算出化合物B的斯托克斯(Stokes)位移高达到138nm，这样大的Stokes位移可以有效地分开光激发和光接收的窗口，降低入射光干扰。468nm的吸收峰位适合用488nm的标准光源激发，对细胞或者生物组织的损伤较小。
另外，特别说明：本发明以水为溶剂测试了化合物B的吸收/发射光谱，发现与其在Tris溶液中基本一致，故后续关于AIE性能测试以及溶致变色行为研究等所有测试光谱均用纯水为溶剂。
2)聚集诱导发光(AIE)性质研究：
化合物B中含有两个氮正离子以及明显的D-A结构，理论上应具有明显的聚集诱导发光性质。
本发明采用混合溶剂体系法对其AIE性质测试，即研究化合物B在由不良溶剂和良溶剂组成的混合溶液中，随着混合溶液中不良溶剂体积含量的变化，化合物B的光致发光行为的变化。
a)以四氢呋喃(THF)作为不良溶剂，水(H2O)作为良溶剂，配置化合物B的摩尔浓度为1×10-5mol/L的THF/H2O混合溶液，AIE性质测试实验结果显示：化合物B在纯水中的发射强度很弱，随着THF的加入，THF/H2O混合溶液的荧光发光强度逐渐增强，当THF体积分数达到10％时，THF/H2O混合溶液的荧光强度已经开始快速上升，在THF体积分数50％附近则较为缓和，当THF体积分数达到80％及以上时，THF/H2O混合溶液的发射强度又迅速增强(图2B)，当THF体积含量达到90％时，化合物B的荧光强度为初始的30倍左右，证明该化合物B荧光分子为典型的AIE分子。
b)以甘油作为不良溶剂，水作为良溶剂，配置化合物B的摩尔浓度为1×10-5mol/L的甘油/H2O混合溶液，AIE性质测试实验结果显示：在甘油和水混合溶液体系中，甘油/H2O混合溶液的荧光发光强度同样随着甘油体积含量的增加而逐渐增强，不同的是，在甘油体积含量未超过60％时，甘油/H2O混合溶液的荧光强度增加幅度较为缓和，及甘油体积含量达70％，其荧光强度则迅速增强(图3B)。甘油体积含量90％的混合体系中，化合物B的荧光强度约为纯水中的80倍，表现出典型的聚集诱导发光(AIE)性质。
3)溶致变色行为研究：
化合物B分子结构中吡啶盐部分是高度缺电子的，因此它可以起到电子受体(A)的作用；而二甲氨基可以充当电子给体(D)的角色，D-A结构使得化合物B在受到光激发时，分子内会发生电子跃迁，因此其光致发光光谱会受到溶剂体系极性大小的影响。本发明以不同溶剂的介电常数为参考，测试化合物B在不同极性溶剂中的溶致变色行为。
因化合物B的化学结构带有两个正电荷，极性较强，在非极性溶剂(如甲苯、正己烷等)中难以溶解，所以本发明最终选用四氢呋喃、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、二甲基亚砜和水八种溶剂来进行其溶致变色行为的研究。结果发现：随着溶剂极性的增强(THF→H2O)，化合物B表现正溶致变色效应，即随着溶剂极性的增强，化合物B的荧光发射波长发生红移。
本发明还提供了上述技术方案所述的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐在活体细胞荧光成像领域中的应用。
鉴于本发明提供的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的前述理化性能(如良好的水溶性、AIE特性、合适的量子效率、较大的Stokes位移等)特点，本发明以4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐作为荧光探针分子进行了细胞成像研究，研究发现：所述荧光探针分子具有很好的水溶性、透膜性，其过膜速率较快，经过20min的染色就已经实现充分的细胞内化，且可以染色到细胞核核仁内部。在激光扫描共聚焦显微镜下观察典型的癌细胞——Hela细胞，细胞荧光图像中可以清晰地显示出细胞核核仁的位置、数量和形态。
鉴于上述研究结果，4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐可以作为唯一荧光探针分子单独使用于细胞荧光成像中，或作为荧光探针组合中的荧光分子之一，被用于细胞荧光成像领域。
综上所述，本发明提供的新型阳离子型AIE荧光分子4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(化合物B)是活体细胞荧光成像的良好荧光剂，即化合物B具有快速高效进入细胞并对细胞核、细胞质基质等进行差别染色的能力。显然，化合物B具有替代现有医院分子影像学研究室中已实际使用的荧光试剂盒中的荧光染料的潜力，可作为新型荧光染料用于制备肿瘤病理组织快速诊断用荧光试剂盒等。
附图说明
图1A为化合物B在水中和Tris溶液中的的紫外可见吸收光谱；
图1B为化合物B在水中和Tris溶液中的光致发光光谱；
图1C为化合物B在Tris溶液中的紫外可见吸收光谱和光致发光光谱的归一化谱图；
图2为化合物B在THF和H2O混合体系中的聚集诱导发光性质测试结果；
图3为化合物B在甘油和H2O混合体系中的聚集诱导发光性质测试结果；
图4A为化合物B在不同极性溶剂中的紫外可见吸收光谱；
图4B为化合物B不同极性溶剂中的光致发光光谱；
图5为化合物B的细胞荧光成像图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
化合物B的合成路线如下：
将4-甲基吡啶(0.5mL,5.1mmol)和3-溴丙基三甲基溴化铵(1.3g,5mmol)溶解在装有N,N-二甲基甲酰胺(8mL)的50mL两口瓶中，加热至100℃，反应2h后得到棕黄色沉淀。沉淀用二氯甲烷多次洗涤后，溶解在少量二甲基亚砜中后加入大量二氯甲烷使其沉淀析出，放入烘箱烘干后得淡黄色固体，即化合物A，1.48g，产率83.9％。
元素分析(C12H22N2Br2)测定值(％)：C，40.11；H，6.58；N，7.32；理论值(％)：C，40.70；H，6.26；N，7.91。
IR(KBr),v/cm–1:3022,2994,2943,2856,1644,1624,1568,1519,1317。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ/ppm):9.07(d,J＝8.0Hz,2H),8.06(d,J＝8.0Hz,2H),4.66(t,J＝7.0Hz,2H),3.46(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,9H),2.63(s,3H),2.48-2.42(m,2H)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δ/ppm):159.3,143.8,128.4,61.6，56.6，52.4,24.3,21.5。
m/z([M-H]+)，实验值：193.1701；理论值：193.1783。
将上述所得的中间体A(1.06g,3mmol)与对二甲氨基苯甲醛(0.45g,3mmol)混合放入50mL三口瓶中。抽真空换氮气三次后，用针头注入约10mL乙醇，并且加入0.03g哌啶。反应体系在氮气保护下80℃回流12小时。反应结束后，待体系冷却，将三口瓶内所得溶液和沉淀溶解于乙醇中，加入碱性氧化铝柱层析硅胶后进行旋蒸。以二氯甲烷：石油醚＝7:3作为展开剂进行柱层析分离，得红色固体，即化合物B，1.38g，产率90.9％。
元素分析(C21H31N3Br2)测定值(％)：C，51.23；H，6.69；N，8.56；理论值(％)：C，51.97；H，6.44；N，8.66。
IR(KBr),v/cm–1:3028,2926,2822,1644,1581,1528,1470,1374,1332,1180。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ/ppm):8.90(d,J＝6.8Hz,2H),8.15(d,J＝6.8Hz,2H),8.02(d,J＝16.0Hz,1H),7.63(d，J＝9.0Hz，2H),7.24(d,J＝16.0Hz,1H),6.79(d,J＝9.0Hz,2H),4.56(t,J＝7.2Hz,2H),3.47(t,J＝8.3Hz,2H),3.13(s,9H),3.03(s,6H),2.49-2.42(m,2H)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δ/ppm):154.1,151.9,143.6,142.5,130.3,122.5,122.4,117.1,111.9,72.2,61.7,55.9,52.4,24.1。
m/z([M]2+)，实验值：162.6255；理论值：162.6259。
测试例1
为模拟细胞内环境，本发明配制了摩尔浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，以此Tris溶液作为溶剂配置化合物B溶液，其中化合物B的物质的量浓度为1×10-5mol/L。
迅速将上述溶液转移到紫外光谱仪和荧光光谱仪的样品架上进行光谱测试，选择激发波长的依据为溶液的紫外可见吸收光谱的最高能量的吸收峰的波长。测试仪器为Shimadzu UV-1800紫外-可见吸收光谱仪和Shimadzu RF-5301PC光致发光光谱仪，测得的荧光光谱图归纳在图1中。
另，相同方法测定相同浓度化合物B(1×10-5mol/L)水溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。
图1A为化合物B(1×10-5mol/L)在水中和Tris溶液(0.05mol/L)中的紫外可见吸收光谱；图1B为化合物B在水中和Tris溶液(0.05mol/L)中的中的光致发光光谱(λex＝468nm)，由图1A和图1B可知，化合物B的吸收/发射光谱曲线与其在Tris溶液中基本一致，故后续关于AIE性能测试及其溶致变色行为研究等所有测试光谱均用纯水为溶剂。
图1C为化合物B在Tris溶液(0.05mol/L)中的紫外可见吸收光谱和光致发光光谱的归一化谱图，通过图1C可以计算出化合物B的斯托克斯(Stokes)位移高达到138nm，这样大的Stokes位移可以有效地分开光激发和光接收的窗口，降低入射光干扰。而468nm的吸收峰的适用激发光源，对细胞或者生物组织的损伤较小。
测试例2
将实施例1制备得到的化合物B以水作为良溶剂，四氢呋喃(THF)为不良溶剂，配置化合物B物质的量浓度为1×10-5mol/L的THF/H2O混合溶液，其中THF体积含量分别0,10,20,30,40,50,60,70,80,90％；然后，分别测试上述溶液的荧光发射强度，具体操作如下：
将式I所示的化合物溶解于水溶液中，配制成浓度为1×10-4mol/L的母液。取母液转移至10mL容量瓶中，加入计算量的THF，在快速搅拌下滴加THF定容，最终配制成浓度为1×10-5mol/L且THF分别为0～90％的混合溶液，其含水量为体积百分数。迅速将上述各溶液转移到紫外光谱仪和荧光光谱仪的样品架上进行光谱测试，选择激发波长的依据为溶液的紫外可见吸收光谱的最高能量的吸收峰的波长。测试仪器为Shimadzu UV-1800紫外-可见吸收光谱仪和Shimadzu RF-5301PC光致发光光谱仪。
将测得的荧光发射强度与溶液中的THF含量作为变量，绘制曲线，如图2为化合物B的聚集诱导发光性质测试结果：图2A为化合物B(1×10-5mol/L)在不同THF体积分数(fT)的THF/H2O混合溶液中的光致发光光谱(λex＝475nm)；图2B为化合物B(1×10-5mol/L)在593nm处不同THF体积分数(fT)的THF/H2O混合溶液中的相对PL强度图(I/I0)。
由图2可知，随着THF含量的增加，化合物B的溶解度降低，当THF含量升高至80％以上时，化合物发生聚集，从溶剂体系中析出，从而荧光发射强度急剧增高，当THF体积含量达到90％时，化合物B的荧光强度为初始的30倍左右，证明该化合物B荧光分子为典型的AIE分子，具有聚集诱导发光性质。
测试例3
将实施例1制备得到的化合物B以水作为良溶剂，甘油为不良溶剂，配置化合物B物质的量浓度为1×10-5mol/L的甘油/H2O混合溶液，其中甘油体积含量分别0,10,20,30,40,50,60,70,80,90％；然后，分别测试上述溶液的荧光发射强度。具体操作步骤同测试例2。
将测得的荧光发射强度与溶液中的甘油含量作为变量，绘制曲线，如图3为化合物B的聚集诱导发光性质测试结果：图3A为化合物B(1×10-5mol/L)在不同甘油体积分数(fG)的甘油/H2O混合溶液中的光致发光光谱(λex＝471nm)；图3B为化合物B(1×10-5mol/L)在601nm处不同甘油体积分数(fG)的甘油/H2O混合溶液中的相对PL强度图(I/I0)。
由图3可知，随着甘油含量的增加，化合物B的溶解度降低，当甘油含量升高至70％以上时，化合物发生聚集，从溶剂体系中析出，从而荧光发射强度急剧增高，甘油体积含量90％的混合体系中，化合物B的荧光强度约为纯水中的80倍，表现出典型的聚集诱导发光(AIE)性质，具有聚集诱导发光性质。
测试例4
本测试例以介电常数为参考还测试了化合物B的溶致变色行为。因化合物B的极性较强，在非极性溶剂如甲苯、正己烷等中难以溶解，因此最终选用四氢呋喃、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、二甲基亚砜和水八种溶剂来进行溶致变色行为的研究。通过测试其在不同极性的溶剂中的紫外-可见吸收光谱和光致发射光谱，进行归一化处理后观察其吸收峰/发射峰波长的变化。
为了测定化合物B的溶剂化效应，选用四氢呋喃(TMF)、正丁醇(n-BuOH)、丙酮(Actone)、乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)八种溶剂配制溶液，其中化合物B的物质的量浓度均为1×10-5mol/L,并分别测定其紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。
表1化合物B在不同溶剂中的光学参数
图4中A为化合物B(1×10-5mol/L)在不同极性溶剂中的紫外可见吸收光谱，由图4A可知：随着溶剂极性的增加，化合物B的紫外-可见吸收光谱吸收峰先从464nm处红移至499nm，而后再蓝移至470nm处。图4B为化合物B(1×10-5mol/L)在不同极性溶剂中的光致发光光谱(λex＝480nm)，由图4B所示的化合物B的光致发光光谱中，则表现出较强的极性依赖性。在极性较弱的四氢呋喃中，化合物B的最大发射波长为584nm，而在极性强的二甲基亚砜中则为609nm，有着25nm的红移，表明化合物B有较强的正溶致变色效应，即随着溶剂极性的增强，化合物B的荧光发射波长发生红移。数据中，乙醇和甲醇的光致发光光谱的发射峰偏离了总体趋势，猜测可能是由于羟基与化合物B分子的吡啶阳离子之间的氢键作用所导致的。氢键作用使得发射峰蓝移，在一定程度上抵消了溶剂极性增大而导致的红移。
测试例5
将式I所示的化合物溶解于水溶液中，配制成浓度为1×10-4mol/L的母液。取1mL母液转移至10mL容量瓶中，加入去离子水定容得到浓度为1×10-5mol/L的溶液，通过Hamamatsu Quantaurus-QY C11347光谱仪测试获得荧光量子效率。
本发明所述的4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(以下简称化合物B)的固体的荧光量子效率为6.03％，化合物B(物质的量浓度为1×10- 5mol/L)的水溶液中的荧光量子效率为4.04％。
综上可知，化合物B具有良好的水溶性，分子具有AIE特性，在水溶液中发光有大的Stokes位移，宏观发射有利于生物检测与荧光成像，这些研究结果表明，化合物B具有成为良好的细胞成像的潜力。
测试例6
上述研究表明化合物B具有明显的AIE特性，化学结构带有两个正电荷，同时，具有很高极性和很好的水溶性，因此可能是细胞成像的良好荧光剂。本测试例尝试通过将HeLa细胞与测试例5的化合物B(1×10-5mol/L)共同培育来染色HeLa细胞，然后使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞的荧光图像来进一步研究。具体操作步骤如下：
HeLa细胞在37℃、含1％青霉素-链霉素和10％牛血清的MEM培养基中培养，湿度为5％。每隔一天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液处理，待细胞融合后收集细胞。
细胞培养72h后，加入秋水仙素使其终浓度为0.07mg/mL的秋水仙素，再培养1.5h，然后将样品放入15mL离心管中，以2000r/min的速度离心5min。去掉上清液后，加入8mL预热的0.075mol/L氯化钾低渗溶液，充分混合，在37℃下孵育30min。低渗处理后，加入1mL新鲜配置的固定剂(甲醇：冰醋酸＝3：1)，固定1min，在2000r/min下离心5min。再次去掉上清液，加入8mL固定剂，继续孵育10min，然后在2000r/min下离心5min。重复这一过程，以完全固定细胞。最终在细胞颗粒中加入1mL新鲜制备的固定剂，轻轻搅拌。取细胞悬液(3滴)滴在预冷玻璃片上，75℃下烘干3h。用测试例5的化合物B(1×10-5mol/L)共同培育来染色HeLa细胞20min，然后使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察细胞的荧光图像(激发波长：473nm，发射波段：550-650nm，标尺：20μm)，结果如图5(图5A-C分别为化合物B(1×10-5mol/L)染色HeLa细胞荧光成像明场、暗场和重叠图像)所示。
图5显示在550-650nm的光谱窗口中，可以在细胞膜和细胞核核仁周围记录亮红色的发射光，表明化合物B已成功内化到活的HeLa细胞中。对荧光图像细节的仔细检查表明，红色发射来自细胞中核仁的区域，其荧光强度比周围的核质强。这使得每个细胞内的核仁的位置、数量和形态都可以清晰地显示出来。通常正常的细胞的细胞核中核仁只有一个，而图5中显示的一簇细胞的核仁明显不止一个，因为使用的是典型的癌细胞——Hela细胞。此外，在实验过程中，化合物B的透膜速率很快，在20分钟的染色时间内已经实现充分的细胞内化，且可以染色到核仁内部。
通过以上细胞染色实验结果可知：本发明提供的新型阳离子型AIE荧光分子4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐(化合物B)是活体细胞荧光成像的良好荧光剂，具有快速高效进入细胞并对细胞核、细胞质基质等进行差别染色的能力。
以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐，所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐具有式Ⅰ所示结构：
2.一种如权利要求1所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的制备方法，包括以下步骤：
S1：以4-甲基吡啶和3-溴丙基三甲基溴化铵为原料，将其溶于有机溶剂中，在80～120℃下，进行烷基化反应；
S2：待步骤S1反应结束后，将产物混合物冷却至室温，通过后处理得到中间产物A，所述中间产物A为4-甲基-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐；
S3：在惰性气体保护下，将中间产物A与对二甲氨基苯甲醛作为原料，溶于有机溶剂中，加入催化剂，在80～120℃下，进行亲核加成反应；
S4：待步骤S3反应结束后，将产物混合物冷却至室温，通过后处理得到目标产物B，所述目标产物B为4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐。
3.根据权利要求2所述的阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的制备方法，其特征在于，S3中所述亲核加成反应中，所述催化剂为哌啶，所述哌啶的化学式为C5H11N，所述哌啶的用量为中间产物A质量的1％～3％。
4.根据权利要求2所述的阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的制备方法，其特征在于，S1中所述烷基化反应中，所述原料3-溴丙基三甲基溴化铵和4-甲基吡啶的物质的量比为1:1.0～1:2.0，所述反应时间为2～15小时；S3中所述亲核加成反应中，所述中间产物A与对二甲氨基苯甲醛的物质的量比为1:1.0～1:1.5，所述反应时间为4～15小时。
5.根据权利要求2所述的阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐的制备方法，其特征在于，
所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或乙醇中的一种；
S2中所述后处理包括旋蒸、洗涤、沉析三个操作步骤；
S3中所述惰性气体为高纯氮气、普通氮气或氩气；
S4中所述后处理包括旋蒸、提纯操作，所述提纯操作是指硅胶色谱柱分离操作，淋洗剂为二氯甲烷与石油醚(60～90℃)按照7:3的体积比配制的混合溶剂。
6.权利要求1所述的阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐在细胞荧光成像领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的一种阳离子型荧光染料的应用，其特征在于，所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐作为唯一荧光探针分子单独应用于细胞荧光成像中。
8.根据权利要求6所述的一种阳离子型荧光染料的应用，其特征在于，所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐作为荧光探针组合中的荧光分子之一，被应用于细胞荧光成像领域。
9.根据权利要求6所述的一种阳离子型荧光染料的应用，其特征在于，所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐作为荧光试剂或荧光染料应用于肿瘤细胞荧光成像中。
10.根据权利要求9所述的一种阳离子型荧光染料的应用，其特征在于，所述阳离子型荧光染料4-(N,N-二甲基苯乙烯基)-N-(3-三甲胺基丙基)吡啶溴化二铵盐作为荧光染料用于制造肿瘤病理组织快速诊断用荧光试剂盒。
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