CN111116539B

CN111116539B - 一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针、制备方法和应用

Info

Publication number: CN111116539B
Application number: CN202010021955.0A
Authority: CN
Inventors: 孙远强; 宋琰; 李朝辉; 王霞
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2040-01-09
Also published as: CN111116539A

Abstract

本发明提供了一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针、制备方法和应用，该探针分子的结构式如下：

，其中R为H、CH₂COOMe或CH₂COOH。该探针的合成只需要几步就可以完成，且后处理相对简单；本发明涉及的探针具有高灵敏性，溶酶体靶向性好的特点。该探针对pH和粘度双重响应，在高粘度条件下荧光增强55倍，可以精准的靶向溶酶体，在溶酶体的酸性环境（pH=4‑6）中对粘度有响应，基于这个特性，可以将该探针应用于区分正常细胞和癌细胞，对于癌症检测具有重要意义。

Description

一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针、制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针、制备方法和应用。

背景技术

癌症是一种公认的顽疾，是细胞突变后无序分裂生长而形成的恶性肿瘤。正常细胞向癌细胞的转化是一个复杂的过程，不仅表现为细胞的无序增殖和分裂，还表现为细胞微环境的差异。细胞微环境是细胞的重要参数，与电子传递和生物分子相互作用密切相关。

在众多参数中，细胞黏度是细胞微环境中不可缺少的重要环节。细胞内黏度的异常变化与包括癌症在内的诸多疾病有关。细胞内因为存在多种细胞器导致黏度分布不均匀，细胞内不同区域的粘度在生物系统中起着非常重要的作用，而不同区域的粘度变化就会引起相应的生理功能的改变或疾病的发生。为了准确检测细胞黏度的变化，需要选择特定的细胞器进行检测。

溶酶体是一种真核细胞中的酸性亚细胞器，溶酶体在细胞迁移、信号转导、胆固醇稳态、细胞凋亡和组织重塑等方面发挥重要作用。溶酶体中具有多种生理性水解酶，作用为分解或代谢细胞中的蛋白质或大分子，其特征是具有酸性环境，特异性的粘度，溶酶体粘度的异常变化是溶酶体存在疾病、炎症甚至癌症的标志。在癌细胞中，溶酶体粘度相对于正常细胞要高，且癌细胞中溶酶体pH（3.8-4.7）低于正常细胞的pH（4.5-6.0）。通过癌细胞与正常细胞中粘度和pH的明显差异，实现正常细胞与癌细胞的区分。但是利用荧光分子探针对粘度检测的方法中，大多数探针只能实现粘度或者pH的单一检测，受细胞环境影响较大，区分度不高，因此需要开发灵敏度更高的探针。

识别传感机理如下：

在中性条件下探针以亚胺形式存在，可见区没有吸收，在高粘度和低粘度条件下长波都没有荧光。在酸性条件下，胺基被质子化，以胺基吡罗红形式存在，在低粘度环境下，探针由于苯胺基的旋转，导致荧光很弱或没有荧光，在高粘度下，苯胺基旋转被抑制，探针显示很强的荧光，具有高度的灵敏性，并且可以对正常细胞和癌细胞进行荧光成像。

发明内容

本发明通过分子设计，合成了溶酶体靶向的探针，是一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针，该探针分子的结构式如下：

，其中R为H、CH₂COOMe或CH₂COOH。

R为H时，探针的pKa为4.5，R为CH₂COOMe时，探针的pKa为5.5，R为CH₂COOH时，探针的pKa为9.5。

探针的制备方法为：将吡罗红酮溶于二氯甲烷中，然后向反应液中逐滴加入三氟甲磺酸酐，搅拌反应，然后向反应液中逐滴加入氨类化合物的二氯甲烷溶液，反应液继续在室温下反应，反应完成后，减压除去溶剂，柱层析分离得到荧光探针。

所述氨类化合物为苯胺、4-氨基苯乙酸或4-氨基苯乙酸甲酯。

以吡罗红酮为基准，三氟甲磺酸酐用量为1.5-3当量，氨类化合物用量为1.5-3当量；所述反应温度为20-40℃，反应时间为0.5-1h。

所述吡罗红酮的结构式如下：

。

由于本发明探针不仅对酸性环境有响应，还对溶液的高粘度有相应，在高粘度条件下荧光增强55倍，可以精准的靶向溶酶体，因此可以靶向检测细胞内溶酶体的pH（pH=4-6）以及粘度情况。

所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中粘度试剂中的应用。

所述的荧光探针在靶向检测细胞内溶酶体pH试剂中的应用。

当粘度系数大于于45.86 cP时，有明显荧光。

当pH≤4时，有明显荧光。

所述的细胞为HL-7702细胞，HepG-2细胞，Hela细胞，4T1细胞和SMMC-7721细胞。

本发明的优点在于：（1）在酸性溶液（pH≤4）中有荧光响应；（2）在高粘度溶液中有荧光响应；（3）在同一位点实现对pH和粘度的双重相应；（4）靶向检测高粘度，低pH的细胞器溶酶体；（5）由于癌细胞的溶酶体酸性较强，可以根据荧光强度不同可以区分正常细胞和癌细胞；（6）本探针通过pH作用，靶向溶酶体检测细胞内粘度变化，不需要溶酶体定位基团；（7）本发明实现了粘度探针的高灵敏性，靶向性好的特点。

附图说明

图1是实施例1探针的¹H NMR图谱。

图2是实施例1探针的¹³C NMR图谱。

图3是使用4 µM探针在不同比例的PBS缓冲液 ,（10 mM， pH= 7.4），和甘油的混合溶液（0-100%）中的荧光发射光谱，激发波长为460 nm，收集波长为（460 nm-750 nm），以及紫外灯（365 nm）照射下探针分别在水和甘油两种溶剂中的颜色变化。

图4是4 µM探针在不同pH的B-R缓冲溶液（0.04 mol/L ，pH= 2-12）中的紫外吸收图谱。

图5是4 µM探针和溶酶体商业染料（Lyso-Track Deep Red，50 nM）的共定位荧光成像图。

图6是探针在460 nm激发波长应用于细胞中正常细胞(HL-7702), 癌细胞（HepG-2, Hela, 4T1, SMMC-7721）的荧光成像图。

图7是4 µM探针用于组织成像和50 µM用于活体器官15分钟后荧光成像。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

胺基吡罗红化合物的合成路线如下：将吡罗红酮(1g, 3mmol)溶于15ml二氯甲烷中，然后向反应液中逐滴加入三氟甲磺酸酐(4.5mmol)，室温25 ℃下搅拌反应30min，然后向反应液中逐滴加入苯胺(0.42g，4.5mmol)的二氯甲烷溶液，反应液继续在室温下反应30min，反应完成后，减压除去溶剂，然后使用柱层析分离(MeOH/DCM = 1:20)，得到产物1.26g，产率75%。

结构式如下：

。

如图1所示，¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J = 6.4Hz, 2H), 7.40 (m,4H), 7.31 (m, 1H), 6.62 (dd, J = 6.4, 1.6 Hz, 2H), 6.51 (d, J = 1.6 Hz, 2H),3.47 (q, J = 4.8 Hz, 8H), 1.25 (t, J = 4.8 Hz, 12H)。

如图2所示，¹³C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 160.40, 156.27, 155.76, 143.32,132.64, 131.70, 130.19, 127.96, 113.72, 106.14, 98.98, 47.97, 15.39。

实施例2

胺基吡罗红化合物的合成路线如下：将吡罗红酮(1 g, 3 mmol)溶于15ml二氯甲烷中，然后向反应液中逐滴加入三氟乙酸酐(6 mmol)，室温25℃下搅拌反应45 min，然后向反应液中逐滴4氨基苯乙酸(0.96 g, 6 mmol)的二氯甲烷溶液，反应液继续在室温25 ℃下反应45 min，反应完成后，减压除去溶剂，然后使用柱层析分离(MeOH/DCM=1：20)，得到产物1.13 g，产率80 %。

实施例3

胺基吡罗红化合物的合成路线如下：将吡罗红酮(1 g, 3 mmol)溶于15 ml二氯甲烷中，然后向反应液中逐滴加入三氟乙酸酐(9 mmol)，30 ℃下搅拌反应1 h，然后向反应液中逐滴加入4氨基苯乙酸甲酯(1.48 g, 9 mmol)的二氯甲烷溶液，反应液继续在30 ℃下反应1 h，反应完成后，减压除去溶剂，然后使用柱层析分离(MeOH/DCM = 1 : 20)，得到产物1.18 g，产率70 %。

化合物粘度荧光探针随粘度的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的粘度荧光探针溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成2mM储备液。从储备液中取出100µL加入到10mL的离心管中，用去离子水和丙三醇配成不同比例（0:100；10:90；20:80；30:70；40:60；50:50；60:40；70:30；80:20；90:10；100:0）的粘度测试液。取2mL系列粘度测试液，各加入4µL探针母液，测试体系中探针的终浓度为4µM。以460nm为激发光，测量其荧光性质。荧光光谱如图3所示。由图3可见，随着粘度的增加荧光逐渐增强，且在550nm处的荧光强度的对数与溶液粘度的对数有良好的线性关系。

荧光探针对不同粘度溶液的可视化检测

准备两个相同的比色皿，分别加入2 mL去离子水与2 mL丙三醇溶液，各加入4 µL实施案例2配制的探针母液，紫外灯下有肉眼可视的发现，水溶液为无色，而甘油(高粘度)溶液发出黄绿色荧光，如图3所示，说明本发明是可用于荧光传感溶液粘度。

荧光探针在不同B-R缓冲溶液（pH=2-12）条件下的紫外吸收图谱

取实施案例1配备的探针母液，分别加入2 mL不同pH值的B-R缓冲溶液中，配成最终探针浓度为4 μM，测出pH从2到12的不同紫外吸收。如图4所示，探针1在pH为5的时候，紫外吸收开始下降，探针2在pH为6的时候，紫外吸收开始下降，探针3在pH为9的时候，紫外吸收开始下降。正常细胞溶酶体（pH=4.5-6.0）粘度低于癌细胞（pH=3.8-4.7），所以探针1在癌细胞的荧光强度大于正常细胞。

荧光探针与溶酶体商业染料的共定位

将本发明探针应用于HepG-2细胞中对粘度进行荧光成像应用，具体操作步骤如下：将含有4 µM探针的DMSO溶液加入到含有HepG-2细胞的激光共聚焦专用皿中，加入DMEM培养基避光孵育20 min，用PBS缓冲溶液洗3次，然后加入5 µM溶酶体商业染料（Lyso-TrackDeep Red），再加入DMEM培养基避光孵育20 min，用PBS缓冲溶液洗3次。如图5所示，用460nm激发进行共定位成像。其中a.黄色通道(本发明探针)，b.红色通道(Lyso-Track DeepRed)，c.黄色通道与红色通道复合场，d.共定位皮尔森系数图。结果表明，荧光探针的黄色通道与红色通道可以非常好的重合，皮尔森系数为90.41%，实验结果表明本发明探针能够靶向细胞溶酶体。

荧光探针在活细胞中的成像应用

我们将本发明探针用于检测正常细胞（HL-7702），癌细胞（HepG-2，Hela，4T1，SMMC-7721），然后再使用本发明探针应用于检测HL-7702细胞，探究本发明探针对于正常细胞和癌细胞的响应区分度。结果如图6所示。具体操作步骤如下：将含有4 µM探针的DMSO溶液加入分别育有HL-7702和HepG-2细胞，Hela细胞，4T1细胞和SMMC-7721细胞的培养液中，避光孵育20 min后用共聚焦显微镜进行成像。通过对HL-7702细胞进行明场、黄色通道荧光成像（图6 a1-a3），和对HepG-2细胞，Hela细胞，4T1细胞和SMMC-7721细胞明场、黄色通道荧光成像（图6 b1-e3），通过两组数据对比发现，癌细胞(HepG-2细胞，Hela细胞，4T1细胞和SMMC-7721细胞)均显示了非常强的荧光，正常细胞(HL-7702）显示了非常弱的荧光，说明本发明探针可以通过荧光强度变化区分正常细胞和癌细胞。实验结果的原因是癌细胞与正常细胞相比，其溶酶体酸性更强，而本发明探针在高粘度溶液中对酸性的相应效果比较强，由此实现了通过荧光强度区分正常细胞和癌细胞。

在此基础上，我们将该探针的应用进一步的深化研究，使用该探针通过使用4 µM荧光染色组织切片成像图(图7A)，以及在动物活体使用50 µM探针15分钟后器官成像图(图7B)，证实了本发明探针可以用于活体组织的检测(图7)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针，其特征在于，该探针分子的结构式如下：

，其中R为H、CH₂COOMe或CH₂COOH；

2.权利要求1所述的双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针的制备方法，其特征在于：将吡罗红酮溶于二氯甲烷中，然后向反应液中逐滴加入三氟甲磺酸酐，搅拌反应，然后向反应液中逐滴加入氨类化合物的二氯甲烷溶液，反应液继续在室温下反应，反应完成后，减压除去溶剂，柱层析分离得到荧光探针。

3.根据权利要求2所述的双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述氨类化合物为苯胺、4氨基苯乙酸或4氨基苯乙酸甲酯。

4.根据权利要求2所述的双重响应癌细胞内溶酶体粘度和pH的荧光探针的制备方法，其特征在于：以吡罗红酮为基准，三氟甲磺酸酐用量为1.5-3当量，氨类化合物用量为1.5-3当量；所述反应温度为20-40℃，反应时间为0.5-1h。

5.权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中粘度试剂中的应用。

6.权利要求1所述的荧光探针在靶向检测细胞内溶酶体pH试剂中的应用。