CN108752275B - 一种pH荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH荧光探针及其制备方法和应用。所述pH荧光探针的结构如式(I)所示，其制备方法为：化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；最后，化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)。本发明提供了所述的pH荧光探针在检测细胞内溶酶体的pH值中的应用，pH值范围在4.5‑5.5之间。本发明的有益效果在于提供了一种能检测细胞内溶酶体的pH值的荧光探针，为研究细胞中pH的生理作用提供一种有效的研究工具。

Description

一种pH荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种pH荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
1、体内pH的平衡对于人体执行多种关键功能如酶催化，细胞内吞作用和肌肉收缩至关重要。对于各种细胞，亚细胞器和细胞间基质以及体液内的pH，分布范围从碱性到高酸性不等。体内pH平衡的破坏与许多健康问题有关，包括癌症、消化性溃疡、阿尔茨海默氏病、溶酶体贮积症和代谢性疾病。因此，精确测量体内的pH值，尤其是细胞内pH值，对于理解各种pH依赖性生理和病理过程都具有重要意义。
2、溶酶体在细胞各种生命活动，如物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡中发挥着重要作用。将溶酶体可视化，并对其活性物种、特定微环境及关键生理过程进行检测，不仅有助于理解溶酶体参与生命活动的分子机制，而且对疾病的治疗具有重要的指导意义。有研究表明，溶酶体是参与pH代谢的重要细胞器，pH可以导致老年斑、Tau蛋白异常磷酸化以及认知异常。
3、荧光探针由于其高灵敏度、实时检测等优点而受到关注。本发明目的在于开发一个新型pH荧光探针，用于检测细胞内pH的变化。
发明内容
本发明目的是提供一种pH荧光探针。
本发明第二个目是提供一种所述pH荧光探针的制备方法。
本发明第三个目是提供所述pH荧光探针在检测细胞内pH值中的应用。
本发明为实现上述目的采用以下技术方案：
一种pH荧光探针，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0001688656690000021
一种所述pH荧光探针的制备方法，所述制备方法为：
化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；最后，化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)；反应路线如下：
Figure BDA0001688656690000022
进一步，所述制备方法具体按照如下步骤进行：
(1)将化合物(III)、Cs2CO3按物质的量比1:1～1.5(优选为1:1)，混合在无水DMF中，滴加化合物(II)，并将所得混合物在N2保护下于40℃～50℃搅拌过夜，然后减压除去溶剂，所得残余物经二氧化硅柱层析法(优选使用体积比1:10的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，得到化合物(IV)；
(2)将二氯化锡、三乙胺、苯硫酚按物质的量比1:2～3.5:2～3.5(优选为1:3:3)加入到乙腈溶剂中，在30℃～40℃下搅拌15min～30min，然后加入化合物(IV)，其中化合物(IV)与二氯化锡二水合物的物质的量比为0.5～1：1(优选0.7：1)，并在30℃～40℃下继续搅拌12h～14h；将反应物减压浓缩，通过二氧化硅柱层析(优选以体积比1：3的乙酸乙酯/石油醚作为洗脱试剂)进行纯化，得到化合物(I)。
本发明化合物(II)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(K.J.Bruemmer,R.R.Walvoord,T.F.Brewer,G.Burgos-Barragan,N.Wit,L.B.Pontel,K.J.Patel andC.J.Chang,Development of a General Aza-Cope Reaction Trigger Applied toFluorescence Imaging of Formaldehyde in Living Cells J.Am.Chem.Soc.,2017,139,5338.)。
本发明化合物(III)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(H.Park,S.-K.Chang,Signaling of water content in organic solvents by solvatochromism ofa hydroxynaphthalimide-based merocyanine dye.Dyes and Pigments,2015,122,324.)。
本发明提供了所述的pH荧光探针在检测细胞内溶酶体的pH值中的应用，pH值范围在4.5-5.5之间。
进一步，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
本发明所述化合物(I)作为一种溶酶体靶向的pH荧光探针，可应用于pH的荧光定量检测。所述的定量pH值的荧光检测原理为：化合物(I)本来是无荧光的，也就是探针中的荧光团1,8-萘酰亚胺是被淬灭的，在与pH进行反应后，氨基作为pH敏感基团，得到一个质子，形成NH3 +反应基团，1,8-萘酰亚胺荧光恢复，从而实现了荧光turn-on的效果，测定在激发为365nm时，发射波长455nm处探针的荧光强度变化，从而获得pH值。
使用本发明的新型溶酶体靶向的pH荧光探针检测pH浓度的原理如下所示：
Figure BDA0001688656690000041
共聚焦荧光显微镜成像实验很好地证明了本发明所述pH荧光探针能够渗透细胞膜进入细胞的溶酶体中，且能够在细胞中检测pH的变化，为研究pH在细胞的代谢机制提供了新的工具，在生物领域具有很好的前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种能检测细胞内溶酶体的pH值的荧光探针，为研究细胞中pH的生理作用提供一种有效的研究工具。
附图说明
图1为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁氢谱。
图2为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁碳谱。
图3为本发明中实施例1制备的化合物(I)，加入到不同pH的DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)中的荧光发射光谱图，以及荧光强度与pH的线性关系。激发波长365nm，发射波长455nm。
图4为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH分别4、7.4的条件下，探针的荧光强度随时间的变化。激发波长365nm，发射波长455nm。
图5为本发明中实施例1制备的化合物(IV)(0.5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。激发波长365nm，发射波长455nm。
图6为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，选择性结果的荧光图。1-15分别为PBS、乙醛、苯甲醛、对硝基苯甲醛、对羟基苯甲醛、丙酮、甲酸、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、pH。图7激发波长365nm，发射波长455nm。
图7为本发明中实施例1制备的化合物(I)与商品化的Lyso-Tracker Red的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)化合物(IV)的制备
将化合物(VII)(0.65g,2.4mmol)和Cs2CO3(0.78g，2.4mmol)混合在10ml无水DMF中，滴加化合物(V)(0.67g,2mmol)，并将该混合物在N2保护下于40℃～50℃下搅拌过夜。减压除去溶剂，所得残余物使用乙酸乙酯/石油醚(v/v，1:10)的二氧化硅柱色谱法纯化，即得0.57g化合物(VII)(收率30％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.50–8.34(m,3H),7.59(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.3Hz,1H),6.00(dd,J＝17.5,10.9Hz,1H),5.20–5.03(m,2H),4.34(t,J＝6.7Hz,2H),4.17–4.02(m,2H),2.22(dd,J＝13.8,6.9Hz,1H),2.10(dt,J＝14.2,7.0Hz,1H),1.67(tt,J＝7.7,6.6Hz,2H),1.45(s,3H),1.41(dt,J＝14.2,7.2Hz,2H),1.13(s,6H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.18,163.58,159.52,143.42,133.07,131.20,129.08,128.22,125.69,123.19,122.23,114.94,114.06,105.61,67.10,65.70,45.53,39.89,34.57,30.13,22.31,22.13,20.29,18.01,13.75.C25H30N4O3(M+H)435.2,found 435.2.
(2)化合物(I)的制备
将二氯化锡的二水合物(1g，0.33mmol)加入到圆底烧瓶中，然后加入苯硫酚(0.11g，1mmol)和三乙胺(0.10g，1mmol)的混合乙腈溶液，并将混合物在30-40℃搅拌15min，然后将化合物(IV)(0.1g，0.23mmol)溶于乙腈溶液中，并在30-40℃下再搅拌12h。将反应物减压浓缩，残余物通过使用洗脱剂乙酸乙酯/石油醚(v/v，1：3)的二氧化硅柱层析进行纯化，得到120mg最终化合物(I)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.47(s,3H),7.58(s,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),6.07(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),5.29–5.06(m,2H),4.56(s,1H),4.45(dd,J＝15.8,8.2Hz,1H),4.30–4.00(m,2H),2.21(s,1H),1.71(ddd,J＝12.7,8.6,6.7Hz,2H),1.47(dt,J＝15.1,7.4Hz,2H),1.35–1.16(m,9H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.38,163.89,133.31,131.35,128.30,125.69,122.35,115.06,106.09,58.47,53.43,40.09,30.28,20.43,18.45,13.88.C25H30N4O3(M+H)409.2413,found409.2492.
实施例2：化合物(I)(5μM)在不同pH下的荧光发射光谱图。激发波长为365nm，发射波长为455nm。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(最终pH值为3.5到10)中，37℃下反应3h后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
实验结果表明，在以365nm波长激发时，在pH值较低时，化合物(I)在455nm处的荧光强度较强；当pH呈中性和碱性时，化合物(I)在455nm处的荧光强度较弱。说明探针对pH敏感，荧光图谱见图3。
实施例3：化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH分别4、7.4的条件下，探针的荧光强度随时间的变化。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(最终pH值分别为4、7.4)，37℃下反应0.5h后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光光谱。
数据表明，化合物(I)在25min左右完全反应，且在pH＝4和pH＝7.4时，具有较大的荧光强度的差异。荧光图谱见图4。
实施例4：本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(IV)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(乙醛、丙酮、甲酸、4-羟基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、苯甲醛、双氧水、叔丁基过氧化氢、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、葡萄糖，最终浓度均为1mM)，37℃下反应0.5h，测定其荧光值。荧光激发波长为365nm，发射波长为455nm。
实验结果表明，除了pH，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其抗干扰能力十分好，即对pH的专一性比较好。荧光图谱见图6。
实施例5：本发明中化合物(I)与商品化的Lyso-Tracker Red的细胞成像图。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mL DMEM培养基中。取1mL含有化合物(I)的培养液加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，然后用商品化的Lyso-Tracker Red(0.5μmol)将细胞在37℃孵化20min，用1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图7为细胞共聚焦荧光成像效果图：(a)化合物(I)激发波长为405nm，接收波长范围为430–480nm，(b)Lyso-Tracker Red，激发波长为543nm，接收波长范围为590–640nm；(c)混合通道；基准尺，20μm。
实验结果表明，化合物(I)可以检测细胞内溶酶体的pH，使用Fiji软件对两组细胞内的荧光强度进行对比分析，得出皮尔逊相关系数为0.88，说明化合物(I)可以较为准确的检测溶酶体pH。荧光图谱见图7。
对比例1：本发明中实施例1制备的化合物(IV)(5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(IV)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从3.5到9.5)，加入到96孔板中，在37℃下反应3h，统计数据，并做线性关系的相关曲线。荧光激发波长为365nm，发射波长为455nm。
数据表明，化合物(IV)没有对pH的敏感性，可以进一步说明是化合物(I)的氨基基团对pH的敏感，才产生的“turn on”现象。荧光图谱见图5。
对比例2
为考察本发明探针的独特性，本发明还考察了与探针结构相似化合物(1)、(2)能否用于pH检测：
Figure BDA0001688656690000101
用化合物(1)或(2)替换对比例1中的化合物(IV)，结果表明，化合物(1)在同等检测条件下对pH不敏感；而化合物(2)在细胞内也无法实现对pH的检测，其只能实现单胺氧化酶检测。

Claims (5)

1.一种pH荧光探针，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0002507389620000011
2.一种如权利要求1所述pH荧光探针的制备方法，所述制备方法为：
化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；最后，化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)；反应路线如下：
Figure FDA0002507389620000012
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体按照如下步骤进行：
(1)将化合物(III)、Cs2 CO3按物质的量比1:1～1.5混合在无水DMF中，滴加化合物(II)，并将所得混合物在N2保护下于40℃～50℃搅拌过夜，然后减压除去溶剂，所得残余物经二氧化硅柱层析法纯化，得到化合物(IV)；
(2)将二氯化锡二水合物、三乙胺、苯硫酚按物质的量比1:2～3.5:2～3.5加入到乙腈溶剂中，在30℃～40℃下搅拌15min～30min，然后加入化合物(IV)，其中化合物(IV)与二氯化锡二水合物的物质的量比为0.5～1：1，并在30℃～40℃下继续搅拌12h～14h；将反应物减压浓缩，通过二氧化硅柱层析进行纯化，得到化合物(I)。
4.如权利要求1所述的pH荧光探针在制备检测细胞内溶酶体的pH值试剂中的应用，pH值范围在4.5-5.5之间。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
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