CN103382313B - 一种萘酰亚胺荧光染料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于精细化工技术领域,一种萘酰亚胺荧光染料及其制备和应用,它是利用PET机理设计合成用于检测环境粘度变化的荧光分子探针,并且可以对细胞内粘度变化进行双光子比率成像及寿命成像。本发明所述的萘酰亚胺荧光染料具有合成简便,反应条件温和,光稳定性好等优点,并且其对pH、极性和生物大分子都不敏感,所以可以在细胞内检测粘度分布,并且通过双光子比率成像反映出溶酶体内粘度在细胞内最大,荧光比率的检测可以克服由于单靠荧光强度变化所引起的误差,另一方面可以通过对细胞进行药物刺激,达到检测细胞内粘度变化,通过荧光寿命更直观的反应出粘度变化的数值,在生物及环境领域中有着广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种萘酰亚胺荧光染料及其制备和应用,属于精细化工技术领域。
背景技术
粘度是流体粘滞性的一种量度,是流体流动力对其内部摩擦现象的一种表示。在生物体内,粘度同样扮演着重要的角色在细胞内物质和信号的传输等。因为在细胞生物学细胞膜和细胞质具有粘弹性,所以粘度的变化会导致一系列生理过程的变化,特别是一些疾病的产生。但是传统的粘度仪器在微生物系统中很难测量生物组织和细胞内微粘度的变化。荧光分子探针具有敏感性高、高度的时间、空间分辨成像等优势,被大家广泛应用。近几年来,分子转轴被广泛的应用在溶液和生物体内的粘度探测和成像。这些探针的共同结构特点是供体和受体以共轭的形式相连接,根据周围环境的粘度的增大从而不易形成TICT复合体,从而产生荧光的增强。尽管分子转轴被广泛的应用到微粘度的研究,但是它也同样存在诸多的弊端,例如易受溶剂极性和染料浓度的影响等等,极易产生实验误差。比率检测荧光分子探针能够排除以上误差对于实验干扰,从而提高实验的准确性。
PET机理(光致电子转移)被大家广泛熟知,电子从供体部分转移到电子受体部分从而导致荧光淬灭,它被广泛用来识别金属离子。电子在传递的过程中会受到周围环境的影响,我们发现粘度会在很大程度上影响电子的传递速度和分子的构型变化,很少有文献关注周围环境粘度的变化对PET过程的影响。钱旭红课题组[1]等人发现在特定的条件下PET和TICT可以协同作用促进荧光增强,但是没有生物学方面的应用。基于此我们利用PET机理设计合成了一类新型的对环境粘度敏感的双光子比率型荧光分子探针,可以定量的检测粘度的变化,并将其应用于活细胞成像。
由于对细胞内粘度变化成像要求很大的精确性,Kuimova和Haidekker小组利用细胞内荧光寿命和比率成像的方法反应细胞内粘度的不同,并利用光照细胞的方式检测细胞凋亡过程中粘度的变化。但是很少有人同时利用双光子比率成像和寿命成像的方法检测细胞内粘度的分布和变化。
萘酰亚胺荧光团具很多优良的性质,例如结构易于改造,高的摩尔消光系数和荧光量子产率和高的耐光性,而且其具有典型的双光子性质。到目前为止没有文献报道利用PET机理设计的萘酰亚胺类探针应用于环境粘度的检测并将其应用细胞环境成像。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明目的是提供一种萘酰亚胺荧光染料及其制备和应用,它是利用光诱导电子转移机理和粘度的关系设计合成用于检测环境粘度变化的荧光分子探针,并且可以对细胞内粘度变化进行双光子比率成像及寿命成像。本发明所述的萘酰亚胺类荧光染料具有合成简便,反应条件温和,光稳定性好等优点。
为了实现上述发明目的,本发明采取的技术方案是:一种萘酰亚胺荧光染料,具有以下结构通式:
通式中:R1为C1-C12的直链烷基或丁基,R2为(CH2)2或(CH2)3,R3为C1-C12的直链烷基、亚甲基苯或亚甲基蒽,R4为苯基或萘基。
一种萘酰亚胺荧光染料的制备方法,包括以下步骤:
(a)、将4-溴-1,8-萘酐和NH2CH2R1在乙醇中反应制得化合物I,所述NH2CH2R1与4-溴-1,8-萘酐的摩尔比是1-2:1,反应时间控制在6-10小时,反应温度控制在60-80℃。
(b)、将制得的化合物I与CH3NHR2OH在溶剂中反应生成化合物Ⅱ,所述化合物I与CH3NHR2OH的摩尔比是1:1-5,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,反应温度控制在80-125℃,反应溶剂选自乙二醇甲醚、乙醇、丙醇、丁醇或乙腈中的一种,反应时间控制在6-12小时,所述化合物I与碱的摩尔比是1:1-5。
(c)、将制得的化合物Ⅱ和三溴化磷反应生成化合物Ⅲ,所述化合物Ⅱ 和三溴化磷的摩尔比是1:1-2,反应温度控制在零下10℃-0℃,反应溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯或甲苯中的一种,反应时间控制在6-12小时。
(d)、将制得的化合物Ⅲ和R3NH2反应生成化合物Ⅳ,所述化合物Ⅲ和R3NH2的摩尔比是1:1-5,反应溶剂选自乙醇、丙醇或正丁醇中的一种,反应温度控制在80-120℃,反应时间控制在6-12小时,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,所述化合物Ⅲ与碱的摩尔比是1:1-5。
(e)、将制得的化合物Ⅳ和R4CH2Z反应生成目标化合物Ⅴ,所述化合物Ⅳ和R4CH2Z的摩尔比是1:1-5,反应溶剂选自乙醇、丙醇、正丁醇或乙腈中的一种,反应时间控制在6-12小时,反应温度控制在80-120℃,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,所述R4CH2Z中的Z可选自氯或溴中的一种,并加入适量的碘化钾作为催化剂,惰性气体保护,所述化合物Ⅳ与碱的摩尔比是1:1-5,所述化合物Ⅳ与催化剂的摩尔比是1:1-5。
一种萘酰亚胺荧光染料,其特点是利用PET机理设计合成,并具体应用在生物及环境领域中。
本发明有益效果是:一种萘酰亚胺荧光染料,它是利用光诱导电子转移机理和粘度的关系设计合成用于检测环境粘度变化的荧光分子探针,并且可以对细胞内粘度变化进行双光子比率成像及寿命成像。与已有技术相比,本发明所述的萘酰亚胺类荧光染料具有合成简便,反应条件温和,光稳定性好等优点,并且其对pH、极性和生物大分子都不敏感,所以可以在细胞内检测粘度分布,并且通过双光子比率成像反映出溶酶体内粘度在细胞内最大,荧光比率的检测可以克服由于单靠荧光强度变化所引起的误差,例如激发光强度,染料浓度,环境因素等等,另一方面可以通过对细胞进行药物刺激,达到检测细胞内粘度变化,通过荧光寿命更直观的反应出粘度变化的数值,所以该探针在生物及环境领域具有很强的实际应用价值。
附图说明
图1是目标化合物Ⅴ(10μmol)在乙二醇和甘油的混合体系中的荧光光谱,其中图A激发波长是370nm,图B激发波长是430nm。萘酰亚胺荧光团在 图A和图B的出峰位置一致。
图2是目标化合物Ⅴ(10μmol)在乙二醇和甘油的混合体系中荧光强度对数与溶剂粘度对数之间的线性关系。其中图A是目标化合物Ⅴ两荧光强度对数的比值与溶剂粘度对数之间的线性关系。图B是目标化合物Ⅴ两个发射峰各自强度与各自起始强度的比值的对数与溶剂粘度对数之间的线性关系。
图3是目标化合物Ⅴ(10μmol)在甲醇和甘油以及乙醇和甘油体系的荧光光谱。其中图A是目标化合物Ⅴ(10μmol)在甲醇和甘油体系的荧光光谱。图B是在乙醇和甘油体系中荧光光谱。(λex=370nm)
图4是目标化合物Ⅴ(10μmol)在比的乙二醇和甘油体系中(乙二醇和甘油体积比是4:6)随温度变化的荧光光谱。(λex=370nm)
图5是目标化合物Ⅴ(10μmol)在乙二醇和甘油混合体系中(乙二醇和甘油体积比是4:6)荧光强度对数的比值与温度对数之间的线性关系。其中图A是两荧光强度对数的比值与温度对数之间的线性关系。图B是两个发射峰各自强度与各自起始强度的比值的对数与温度对数之间的线性关系。
图6是目标化合物Ⅴ(10μmol)在PBS水溶液中随着pH的变化荧光强度的变化。
图7是目标化合物Ⅴ(10μmol)在不同比例乙二醇和甘油混合溶液中荧光寿命曲线。其中图A是荧光寿命变化曲线,图B是荧光寿命对数与粘度对数之间的线性关系。
图8是目标化合物Ⅴ(10μmol)在水和甘油体系中荧光随粘度变化荧光曲线。
图9是目标化合物Ⅴ(10μmol)在体外关于极性和生物分子方面以及化合物双光子截面积的测试。其中图A是在1,4-二氧六环和水的体系中荧光强度的变化。图B是在BSA(牛血清白蛋白)混合体系中荧光强度变化。图C是在正己烷中不同波长下双光子吸收截面积。
图10是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Lyso-Tracker Red,5μmol)在MCF细胞中荧光强度成像。确定最亮的区域是溶酶体,与其对应的粘度也是最大。
图11是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化线粒体定位染料(TMRM,5 μmol)在MCF-7细胞中荧光强度成像。
图12是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在Hela细胞中荧光强度成像。
图13是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在BV2细胞中荧光强度成像。
图14是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在PC12细胞中荧光强度成像。
图15是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在7721细胞中荧光强度成像。
图16是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在心肌细胞中荧光强度成像。
图17是目标化合物Ⅴ(5μmol)与商品化溶酶体定位染料(Neutral red,5μmol)在神经干细胞中荧光强度成像。
图18是目标化合物Ⅴ(5μmol)不同时间段细胞毒性实验。
图19是目标化合物Ⅴ(5μmol)在MCF-7细胞中双光子荧光比率成像,其中a)是蓝色通道荧光图片,b)是绿色通道荧光图片,c)是蓝色和绿色通道叠加图片,d)是图c)图b)荧光比例成像图片。Leica激光共聚焦荧光显微镜×60 objective lens,激发波长810nm。
图20是目标化合物Ⅴ(5μmol)在MCF-7细胞中荧光寿命成像。其中图a)是细胞亮场成像图片,图b)是细胞寿命成像图片,图c)是细胞荧光寿命柱状图片。
图21是目标化合物Ⅴ(5μmol)在MCF-7细胞中用地塞美松(10μmol)诱导细胞凋亡过程(30分钟内)荧光寿命成像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:化合物Ⅰ的制备方法
将4-溴-1,8-萘酐5g(0.018mol)与300ml乙醇加热至78℃,溶解后冷却至50℃滴加完正丁胺2.63mL(0.018mol),回流反应8小时,冷却析出固体,过滤得化合物Ⅰ,5g(产率83.3%)。
实施例2:化合物Ⅱ的制备方法
将化合物Ⅰ 3.31g(0.01mol)与N-甲基乙醇胺1.61g(0.02mol)混在20ml乙二醇甲醚中,磁力搅拌下加入2.78ml(0.02mol)三乙胺,124℃反应12小时。冷却至室温,将反应液加入冰水中,析出大量产品,过柱得纯产物2.45g,产率75.15%。产物结构鉴定的核磁和质谱数据:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(d,J=7.3Hz,1H),8.51(d,J=8.2Hz,2H),7.71(d,J=8.5Hz,1H),7.32–7.18(m,4H),4.21–4.11(m,2H),3.74(t,J=6.9Hz,2H),3.59(t,J=7.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.77–1.65(m,2H),1.45(m,J=7.5Hz,2H),0.97(t,J=7.4Hz,3H).
HRMS-ESI:m/z calcd for[M+H]+C19H21N2O2Br,389.0786;found,389.085。
实施例3:化合物Ⅲ的制备方法
将化合物Ⅱ 1.63g(0.005mol)溶解在20ml二氯甲烷中,冰浴下滴加0.57ml(0.006mol)三溴化磷,0℃反应8小时。将反应液倒入冰水中继续搅拌0.5小 时,水洗3次收集有机相,无水硫酸镁干燥,过滤旋干溶剂得粗产品。过柱(淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=4:1)得纯产物1.38g(产率为71.1%)。产物结构鉴定的核磁和质谱数据:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(d,J=7.3Hz,1H),8.51(d,J=8.2Hz,2H),7.71(d,J=8.5Hz,1H),7.32–7.18(m,4H),4.21–4.11(m,2H),3.74(t,J=6.9Hz,2H),3.59(t,J=7.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.77–1.65(m,2H),1.45(m,J=7.5Hz,2H),0.97(t,J=7.4Hz,3H).HRMS-ESI:m/z calcd for[M+H]+C19H22N2O2Br,389.0865;found,389.0862。
实施例4:化合物Ⅳ的制备方法
将化合物Ⅲ 1.94g(0.005mol)与0.55ml(0.006mol)苯胺加入10ml正丁醇中,搅拌下加入0.84ml(0.006mol)三乙胺,回流反应8小时。冷却至室温,将反应液到入冰水中,二氯甲烷萃取多次,合并有机相干燥旋干过柱(淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=2:1)得纯产品1.2g(产率为59.82%)。产物结构鉴定的核磁和质谱数据:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,J=7.3Hz,1H),8.53–8.43(m,2H),7.61(d,J=7.3Hz,1H),7.26(t,J=4.1Hz,2H),7.22–7.08(m,2H),6.72(t,J=7.3Hz,1H),6.60(d,J=8.5Hz,2H),4.23–4.11(m,2H),3.58(d,J=4.4Hz,2H),3.48(t,J=6.1Hz,2H),3.07(s,3H),1.77–1.64(m,2H),1.45(m,J=7.4Hz,2H),0.97(t,J=7.4Hz,3H).
HRMS-ESI:m/z calcd for[M+H]+C25H28N3O2,402.2182;found,402.2156。
实施例5:目标化合物Ⅴ的制备方法
将化合物Ⅳ 0.401g(1mmol)与0.45g(2mmol)9-氯甲基蒽以及0.332g(2mmol)碘化钾加入至20ml正丁醇。搅拌下加入0.276g(2mmol)碳酸钾。氩气保护下110℃反应8小时。反应结束后将反应液加入冰水中,二氯甲烷萃取多次,合并有机相,无水硫酸镁干燥,旋干过柱(淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=2:1)得目标产物纯品0.361g(产率为61.06%),既一种萘酰亚胺荧光染料。产物结构鉴定的核磁和质谱数据:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47(d,J=7.2Hz,1H),8.31(s,1H),8.10(d,J=8.5Hz,2H),8.03(d,J=8.1Hz,1H),7.98–7.89(m,2H),7.84(d,J=7.6Hz,1H),7.49–7.31(m,6H),7.31–7.26(m,1H),7.04(d,J=8.2Hz,2H),6.88(t,J=7.3Hz,1H),6.38(d,J=8.2Hz,1H),5.23(s,2H),4.26–4.15(m,2H),3.34–3.21(m,2H),3.09–2.92(m,2H),2.45(s,3H),1.84–1.67(m,2H),1.48(m,J=7.1Hz,2H),1.00(t,J=7.4Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.62,163.93,155.10,149.31,131.78,131.32,131.13,130.78,130.07,129.64,129.20,128.39,127.42,126.56,125.41,125.06,124.87,123.97,122.95,117.87,115.51,114.62,113.14,77.35,77.23,77.03,76.71,54.50,45.94,44.79,41.13,40.05,30.35,20.48,13.89。
HRMS-ESI:m/z calcd for[M+H]+C25H28N3O2,591.2886;found,591.2889。
实施例6:目标化合物Ⅴ在粘度体系中荧光光谱特征检测及分析
1)首先配置二甲基亚砜的染料母液,将其精确稀释成10mL浓度为10μmol的测试溶液。超声10分钟除去气泡后静置半小时,然后在紫外分光光度仪和荧光光度仪上测量其吸收和发射光谱。所选用激发波长是370nm。
2)不同比例粘度溶剂包括乙二醇和甘油、乙醇和甘油、甲醇和甘油体系。(图1、3,其中前者与甘油的体积比是100、8:2、6:4、4:6、2:8、0)。如图1所示,目标化合物Ⅴ在乙二醇和甘油的增加显著增强,乙二醇和甘油极性相差不大(介电常数分别为37和47),化合物5对溶剂粘度变化比较敏感同时540nm 处荧光明显倍数比420nm处的荧光峰增强的幅度要大,增加倍数分别是各自起始的45倍和4倍。从图1A和1B显示所知萘酰亚胺的出峰位置一致。
3)从图2中的图A看出两发射峰荧光增强倍数的对数值与粘度的对数值成线性关系,这也正好符合方程。从图2中的图B看出两个荧光峰增强的倍数有很大差异,可以用两个荧光峰与粘度做比发现两个荧光峰的比值同样与粘度的对数呈线性关系,同样符合方程,而且染料在其他粘性体系中同样表现出荧光随粘度增加而增强,由公式(1)logI=C+xlogη所示,公式(1)中:C是浓度或者温度常数,x是染料常数,η是测试溶液粘度。
4)图4是荧光强度随着温度变化的曲线,随着溶液中温度的降低,分子中键的自由转动的频率降低能量损失降低,非辐射跃迁造成的能量损失减小,同时PET能力减弱,荧光增强。
5)图5反应了出随着温度的降低,荧光强度逐渐增加,两个荧光峰的增加同样表现出比率的变化。
6)在溶液中pH的变化同样会影响荧光的变化,从图6可以看出目标化合物Ⅴ在pH2到pH11的较宽的pH变化范围内,荧光强度的变化很小。在生物体内pH的变化有很多的不确定性,像溶酶体内显弱酸性,线粒体显弱碱性,目标化合物Ⅴ对pH的不敏感性也为其在生物体内的应用提供潜在的可能性。
7)如果染料在配置过程中造成浓度的不均匀会造成荧光测试的偏差,但是比率的方法会排除这方面的干扰。另一方面荧光寿命不受染料浓度的影响,所以可以提供另外一种方法排除浓度的误差。图7中的图A是随着粘度的增加荧光寿命也随之增加。而且荧光寿命的对数与粘度的对数成线性关系,由公式(2)logτf=C+xlogη,公式(3)τf=zk0η所示,其中τf是染料荧光寿命,C是浓度或者温度常数,x是染料常数,η是测试溶液粘度。在细胞中70%的环境是水环境,而且细胞内粘度的变化是很大的从1cP到260cP,而且还有很多未知的大的粘度区域。所以从染料在水和甘油的体系情况得出当染料在水中是粘度很小,荧光很弱;溶液中随着甘油的加入,粘度增加,荧光显著的增强,如图8所示。
8)细胞内粘度的检测是比较复杂的过程,粘度测试易受到细胞内极性和生物大分子的荧光,所以排除极性和生物大分子干扰事在必行。水和1,4二氧六 环的极性相差较大,所以化合物在水和1,4-二氧六环体系中荧光强度的变化可以衡量其受极性影响程度。从图9中的图A可以看出,在水和1,4-二氧六环体系中随着极性变化,荧光强度的变化相比于在甘油中的变化是很微小的,所以在生物体系测试粘度时可以排除极性对化合物的影响。
9)在生物体内,一些生物大分子的存在会影响荧光的性能,造成干扰,例如蛋白质。在体外模拟生物大分子对化合物荧光测试的干扰,选取水和BSV(牛血清白蛋白)的混合液,结果发现随着BSA的加入荧光有所增强,但是增强的幅度相比于甘油的荧光变化非常的小。目标化合物Ⅴ有很好的生物体内检测粘度的潜力。
10)萘酰亚胺荧光团有显著的双光子性质,而且双光子测试有很多优点,比如对细胞损伤小,穿透力强,光漂白差。测试双光子截面积可以反应分子的双光子能力,从图9可知目标化合物Ⅴ在正己烷中的双光子吸收截面。在810nm处双光子的吸收截面积最大。
实施例7:一种萘酰亚胺荧光染料,体现在生物及环境领域中的应用。
1)激光共聚焦荧光显微成像染料对活细胞染色成像。
细胞种在DEME中用10%的FCS培养,待细胞状态良好时,将其接种在细胞共聚焦培养皿中,然后经过一天的培养后将5μmol的目标化合物Ⅴ加入到培养皿中,保持温度37℃和5%CO2条件下孵育30min,然后用生理盐水洗3遍后进行共聚焦成像。细胞成像所用的仪器是Olympus FV1000-IX81倒置显微镜以及60倍油镜。图10-17,激发波长是405nm,收集波段是520nm到560nm。图19,激发波长是810nm,收集波段是420nm-460nm和500nm-560nm。
2)细胞在不同的细胞中进行染色和成像,并和商品化溶酶体染料(Lyso-Tracker Red,Neutral red)和线粒体染料(TMRM)共染。从图10-17中可以看出,通过荧光强度的不同反应出细胞内粘度的分布情况,根据与商品化染料复染的结果看出,溶酶体的亮度要比其细胞其他位置亮,线粒体的亮度次之,说明粘度的对应关系,溶酶体的粘度大于线粒体,线粒体大于细胞内的其他部位。
3)图18是细胞毒性实验,从实验结果孵育12小时的时候细胞存活率在90%左右,在细胞孵育的24小时时,细胞存活率是68%,说明目标化合物Ⅴ有应用在细胞内检测粘度的潜力。
4)图19是将目标化合物Ⅴ染色到MCF-7进行双光子成像,激发波长是810nm,收集是蓝色通道(420nm-460nm)和绿色通道(500nm-560nm)。比率成像可以排除浓度环境等因素的干扰,从比率尺可以看出细胞内粘度的分布,粘度较大的区域主要是在溶酶体。
5)图20是细胞内荧光寿命成像,寿命成像可以排除浓度、测试、仪器的干扰。通过图20可以看出,不同区域的颜色反映出该区域的荧光寿命的不同,颜色从黄色过度到蓝色,荧光寿命变化范围是1.84ns变到4.4ns。荧光寿命也是从小到大对应的粘度也是逐渐增加。其中粘度较大的区域主要集中于细胞内的溶酶体。
6)地塞美松是典型的诱导细胞凋亡的药物,细胞凋亡的过程中细胞内粘度会有所增加。细胞内粘度的增加可以通过荧光寿命值的变化来反应。从图21可知,在药物刺激的30分钟内荧光寿命值有所增加,从1.609ns增加到2.531ns。
Claims (3)
1.一种萘酰亚胺荧光染料,其特征在于:所述萘酰亚胺荧光染料具有以下结构通式:
通式中:R1为C1-C12的直链烷基,R2为(CH2)2或(CH2)3,R3为C1-C12的直链烷基、亚甲基苯或亚甲基蒽,R4为苯基或萘基。
2.根据权利要求1所述的一种萘酰亚胺荧光染料的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(a)、将4-溴-1,8-萘酐和NH2CH2R1在乙醇中反应制得化合物I,所述NH2CH2R1与4-溴-1,8-萘酐的摩尔比是1-2:1,反应时间控制在6-10小时,反应温度控制在60-80℃;
(b)、将制得的化合物I与CH3NHR2OH在溶剂中反应生成化合物Ⅱ,所述化合物I与CH3NHR2OH的摩尔比是1:1-5,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,反应温度控制在80-125℃,反应溶剂选自乙二醇甲醚、乙醇、丙醇、丁醇或乙腈中的一种,反应时间控制在6-12小时,所述化合物I与碱的摩尔比是1:1-5;
(c)、将制得的化合物Ⅱ和三溴化磷反应生成化合物Ⅲ,所述化合物Ⅱ和三溴化磷的摩尔比是1:1-2,反应温度控制在零下10℃-0℃, 反应溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯或甲苯中的一种,反应时间控制在6-12小时;
(d)、将制得的化合物Ⅲ和R3NH2反应生成化合物Ⅳ,所述化合物Ⅲ和R3NH2的摩尔比是1:1-5,反应溶剂选自乙醇、丙醇或正丁醇中的一种,反应温度控制在80-120℃,反应时间控制在6-12小时,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,所述化合物Ⅲ与碱的摩尔比是1:1-5;
(e)、将制得的化合物Ⅳ和R4CH2Z反应生成目标化合物Ⅴ,所述化合物Ⅳ和R4CH2Z的摩尔比是1:1-5,反应溶剂选自乙醇、丙醇、正丁醇或乙腈中的一种,反应时间控制在6-12小时,反应温度控制在80-120℃,反应所用到的碱选自三乙胺、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种,所述R4CH2Z中的 Z选自氯或溴中的一种,并加入适量的碘化钾作为催化剂,惰性气体保护,所述化合物Ⅳ与碱的摩尔比是1:1-5,所述化合物Ⅳ与催化剂的摩尔比是1:1-5;
其中,R1 、R2 、R3 、R4与权利要求1中的定义是一致的。
3.根据权利要求1所述的一种萘酰亚胺荧光染料,其特征在于,所述荧光染料应用在生物及环境领域中。
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