DE69912139T2

DE69912139T2 - Energieübertragungsfarbstoffe

Info

Publication number: DE69912139T2
Application number: DE69912139T
Authority: DE
Inventors: Shiv Kumar; Satyam Nampalli; Mahesh Khot
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-30
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2019-08-31
Also published as: AU767840B2; JP2002523783A; ATE252239T1; ES2209492T3; JP4659213B2; DE69912139D1; AU5697099A; GB2341189A; GB9920022D0; EP1110088A1; GB2341189B; EP1110088B1; DE29915165U1; CA2341520A1; WO2000013026A9; CA2341520C; WO2000013026A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse an Energieübertragungsfarbstoffen, deren Herstellung und deren Verwendung als Markierungen in biologischen Systemen.
Hintergrund der Erfindung
Im Folgenden wird ein bestimmter verwandter Fachbereich beschrieben, von dem nichts als Stand der Technik für die anhängigen Ansprüche zugelassen ist.
Verschiedene Methodiken stehen für die Visualisierung von Zellen oder Molekülen in Zellen und für die Messung von Analyt-Konzentrationen in Fluiden zur Verfügung. Die Fluoreszenzmikroskopie verwendet fluoreszierende Farbstoffe, allgemein in Verbindung mit spezifischen Sonden, wie Antikörpern, für die Lokalisierung von Proteinen und Komplexen in Zellen.
Für die Messung von Analyt-Konzentrationen, den Nachweis eines Analyts von Interesse, die Bestimmung der speziellen Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls sind Immunoassays und verschiedene Hybridisierungsverfahren in den letzten 40 Jahren populär geworden. Radioimmunoassays wurden entwickelt, weil die hohe spezifische Aktivität des Radionukleotids die Messung sehr niedriger Konzentrationen an Analyt ermöglichte. Allerdings nimmt die Popularität der Verwendung von Radionukleotiden aufgrund der Besorgnisse um die Umwelt und die menschliche Gesundheit immer mehr ab. Der Einsatz von Enzymen in Immunoassays zur Verstärkung eines Signals war ein sehr bedeutender Fortschritt auf dem Gebiet der Immunoassays, weil ihre Verwendung keine Gefahren oder Risiken für die Umwelt oder die menschliche Gesundheit mit sich bringt. Enzym-gebundene Immunoassays können jedoch problematisch sein, weil die Aktivität des Enzyms temperaturabhängig ist und die Instabilität des Enzyms oder der Substrate zu einer ungenauen Quantifizierung des Zielliganden führen kann. Noch andere Immunoassays überwachen die Fluoreszenz als das Signal – mit oder ohne Enzyme – für die Messung von Analyt-Konzentrationen.
Doppelt fluoreszierende (bifluorophore) Energieübertragungsfarbstoffe wurden beschrieben, welche eine neue Methodik zur Überwachung von Prozessen in biologischen Systemen bereitstellen. Die fluoreszierende Natur solcher Farbstoffe ermöglicht es, Prozesse zu überwachen, an welchen die biologischen Systeme beteiligt sind. Das fluoreszierende Signal wird durch ein Fluorometer gemessen, welches so abgestimmt ist, dass es das fluoreszierende Molekül bei einer spezifischen Wellenlänge anregt und die Emission der Fluoreszenz bei einer anderen Wellenlänge misst. Der Unterschied bezüglich der Anregung und der Emissionswellenlängen wird als Stokes-Shift bzw. Verschiebung bezeichnet.
Bislang wurde eine Vielzahl an Kombinationen von doppelt fluoreszierenden bzw. biphluorophoren Farbstoffen beschrieben. Das US-Patent Nr. 5 688 648 unter dem Titel "Probes labelled with Energy Transfer Coupled Dyes" (Sonden, die mit durch Energieübertragung gekuppelten Farbstoffen markiert wurden), Mathies et al., eingereicht am 19. Dezember 1995, offenbart Sets von fluoreszierenden Markierungen, welche Paare von Donor- und Akzeptor-Farbstoffmolekülen tragen, bei welchen die Markierungen an Nukleinsäure-Grundgerüsten zur Sequenzierung geknüpft werden können. Eingeschlossen ist ein Verfahren zum Identifizieren und Detektieren von Nukleinsäuren in einer Mischung aus mehreren Nukleinsäuren durch Verwenden unterschiedlicher fluoreszierender Markierungen, wobei die fluoreszierenden Einheiten gewählt sind aus Familien, wie Cyaninfarbstoffen oder Xanthenen. Die fluoreszierenden Markierungen umfassen Paare von Fluorophoren, wobei ein Fluorophor-Donor ein Emissionsspektrum aufweist, welches die Absorption des fluorophoren Akzeptors überlappt, so dass es zu einer Energieübertragung von dem angeregten Glied zu dem anderen Glied des Paares kommt.
Das UK-Patent Nr. 2 301 833 B mit dem Titel "Fluorescent Labelling Complexes mit Large Stokes' Shifts Formed by Coupling Together Cyanine and Other Fluorochromes Capable of Resonance Energy Transfer" (Fluoreszierende Markierungskomplexe mit großen Stokes-Verschiebungen, gebildet durch Zusammenkuppeln von Cyanin und anderen Fluorochromen, die zur Resonanzenergieübertragung befähigt sind), Waggoner et al., eingereicht am 30. Mai 1996, offenbart Komplexe, welche ein erstes Fluorochrom mit ersten Absorptions- und Emissionsspektren und ein zweites Fluorochrom mit zweiten Absorptions- und Emissionsspektren umfasst. Die Linkergruppen zwischen den Fluorochromen sind Alkylketten. Die fluoreszierende Natur der Farbstoffe ermöglicht es, dass diese bei der Sequenzierung und beim Nukleinsäure-Nachweis von Nutzen sind.
Die EP 0 805 190 A2 betrifft Linker zum Verknüpfen eines Donor-Farbstoffs mit einem Akzeptor-Farbstoff in einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff und mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff mit verstärkter Fluoreszenz.
Die WO 97/11084 beschreibt fluoreszierende Markierungen, welche eine Kombination aus einer Energie-Absorber-/Donor-Komponente und einer Energie-Akzeptor-/Fluoreszierer-Komponente verwenden, gebunden an einen Spacer, der Zuckerphosphat-Bindungen, die frei von Purin- und Pyrimidinbasen sind, eine Kassette bildend, umfasst.
Beim Aufbau eines doppelt fluoreszierenden Farbstoffs sind Gesichtspunkte von spezieller Bedeutung der Abstand zwischen den Akezptor- und Donor-Molekülen und die Struktur der Linkergruppen. Es besteht weiterhin Bedarf an zusätzlichen Verbesserungen beim Farbstoffaufbau, um zum Beispiel der Auswahl biologischer Moleküle verschiedener Größen Rechnung zu tragen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun festgestellt, dass eine neue Klasse an Energieübertragungsfarbstoffen in Markierungsmaterialien, die bei Sequenzierungsreaktionen und anderen Anwendungen beteiligt sind, von Nutzen ist. Die Farbstoffe liegen vorzugsweise in der Form von "Kassetten" vor, die deren Verknüpfung mit einer Vielzahl an biologischen Materialien ermöglichen. Eine Kassette schließt eine kovalent verbundene Struktur oder einen Komplex mit mindestens zwei fluoreszierenden Farbstoffeinheiten, eine Linkergruppe und vorzugsweise eine reaktive Gruppe zum Verknüpfen des Komplexes mit einem biologischen Material oder einem anderen Zielmaterial ein. Die reaktive Gruppe wird so gewählt, dass sie zur Bildung einer kovalenten Verknüpfung mit eine funktionellen Gruppe auf einem bestimmten Zielmaterial geeignet ist.
Die Farbstoffe sind so gewählt, dass das Emissionsspektrum eines Farbstoffs das Absorptionsspektrum eines zweiten Farbstoffs überlappt, wodurch eine Energieübertragung zwischen den Farbstoffen ermöglicht wird. Farbstoffkassetten, die Aryl- und Heteroaryl-Linkergruppen enthalten, sehen stabile, starre Strukturen vor, an welche biologische Moleküle verschiedener Größen gebunden werden können und die Charakteristika aufweisen, welche eine Energieübertragung zwischen den Fluorophoren zulassen.
Die vorliegende Erfindung stellt Energieübertragungsfarbstoffe, Reagenzien und Verfahren bereit, wie durch die unabhängigen Ansprüche definiert ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt einen Energieübertragungsfarbstoft der Formel (I) bereit: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, welche als Akzeptor oder Donor in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ ein zweiter Farbstoff ist, welcher als ein Donor oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist, oder jegliche zusätzliche hinzugefügte Farbstoffe. A umfasst 5 – 20 verbundene Atome, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten und wobei die Atome unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Verknüpfung mit dem D₁ umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbunde nen Atomen zur Verknüpfung mit dem D₂ und eine funktionelle Gruppe von 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen, umfasst.
Die Kette kann wahlweise substituiert sein, sofern gewünscht, mit Gruppen, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, welche nicht die Energieübertragung verhindern, der Ring kann zum Beispiel ein aromatischer ode heteroaromatischer Ring sein, substituiert mit ein, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Alkinyl-, Alkenyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Amino-, Nitro- und Estereinheiten, oder substituiert durch lineares oder verzweigtes C_1,2,3- oder α-Alkyl, Phenyl oder Arylalkyl, gegebenenfalls substituiert mit 1, 2 ,3 oder 4 Substituenten, die unabhängig gewählt sind aus OH-, Halogen-, Methyl-, Wasserstoff- oder Ethylgruppen.
Weiterhin enthält L₂ unabhängig ein Atom oder eine Gruppe, die gezielt für das Binden an einen zusätzlichen Linker adaptiert sind, an welchen ein dritter Energieübertragungsfarbstoff in einer kaskadenförmigen Energieübertragungs-Anordnung gebunden ist, wobei der dritte Farbstoff mit dem zweiten Farbstoff (D₂) in Wechselwirkung tritt, welcher mit dem ersten Farbstoff (D₁) in Wechselwirkung tritt, und ein Atom oder eine Gruppe zur Verknüpfung an ein Zielmaterial, z. B. ein biologisches Material, wie untenstehend erwähnt.
Wenn D₁ oder D₂ ein Fluorescein/Rhodamin-Paar sind, liegen vorzugsweise zusammengenommen 6 bis 25 verbundene Linkeratome in A, L₁ und L₂ vor, und stärker bevorzugt 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder i 5 Linkeratome. Vorzugsweise ist A eine mit L₁ oder L₂ verbundene aromatische C₆-Kohlenwasserstoffeinheit. L₁ ist eine C₂-C₄-Kohlenwasserstoffkette, die zusätzliche Gruppen enthält, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, welche das Binden an ein Xanthin- oder Cyanin-Molekül ermöglichen, und L₂ ist eine C₄-Kohlenwasserstoffkette, welche zusätzliche Gruppen enthält, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, welche das Binden an ein Xanthin- oder Cyanin-Molekül und/oder ein biologisches Zielmaterial ermöglichen.
Die Spezifizierung eines Wertebereichs für die Anzahl der Atome in einer Kette oder Gruppe, ob eine ausdrückliche Auflistung jeder ganzen Zahl innerhalb des Bereichs wie obenstehend angegeben oder eine Beschreibung des Bereichs durch Spezifizieren der Endpunkte des Bereichs, schließt die spezifische Beschreibung jedes ganzzahligen Wertes innerhalb dieses Bereichs ein, einschließlich die Endpunkte. Sie schließt weiter die spezifische Beschreibung jedes Unterbereichs innerhalb des größeren Bereichs ein. Zum Beispiel schließt der Bereich 1– 6 die Unterbereiche 1–4 und 3–6 zusammen mit den anderen eingeschlossenen Unterbereichen ein.
Die reaktive oder funktionelle Gruppe, L₂, kann jedwede Gruppe sein, die für das Verknüpfen des Energieübertragungsfarbstoffs an ein Zielmaterial, vorzugsweise ein biologisches Zielmaterial, geeignet ist und als solche Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt ist. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe von L₂ zum Verknüpfen an ein Zielmaterial aus der Gruppe, bestehend aus Carboxyl, Succinimidylester, Sulphosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid und Phosphoramidit, und mit Carboxyl, Succinimidylester, Sulphosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid und Phosphoramidit kovalent reagierenden Gruppen gewählt.
Geeignete Farbstoffe für D₁ oder D₂ können Farbstoffe sein, die reaktive oder funktionelle Gruppen enthalten, die zur Verbindung mit L₁ oder L₂ imstande sind. Die Verknüpfungsgruppen von L₁ und L₂ können jegliche geeignete Adaption für die Verbindung mit D₁ oder D₂ sein. Vorzugsweise ist die funktionelle Verknüpfungsgruppe von L₁ und/oder L₂ PO₃, NH-CO oder NH-CS.
Die Farbstofteinheiten, z. B. D1 oder D2, der vorliegenden Energieübertragungsfarbstoffe sind Fluorophore, die, wie weiter hierin angegeben, so gewählt sind, dass sie an einer Energieübertragungs-Anordnung teilhaben können.
Vorzugsweise besitzen die Energieübertragungsfarbstofte dieser Erfindung ein Gesamtmolekulargewicht von weniger als 10.000 oder 5000 Dalton, stärker bevorzugt von weniger als 3000 oder 2000 Daltons, noch stärker bevorzugt von weniger als 1500 oder 1200 Dalton.
In Verbindung mit den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung ist mit "Energieübertragungs-Anordnung" gemeint, dass zwei fluoreszierende Farbstoffe mit Absorptions- und Emissionsspektren gewählt werden, die für die Energieübertragung zwischen den Farbstoffen geeignet sind, und die sich in ausreichend physischer Nähe und Verbindung befinden, so dass die Photoanregung eines ersten Farbstoffs (des Donors) zu einer Übertragung von Energie von dem ersten Farbstoff zu dem zweiten Farbstoff (dem Akzeptor) führt. Weitere Energieübertragungen, an welchen ein oder mehrere zusätzliche Farbstoffeinheiten beteiligt sind, können ebenfalls erzeugt werden.
Mithin bezieht sich ein "Energieübertragungsfarbstoff' auf einen fluoreszierenden Farbstoffkomplex mit mindestens zwei Farbstofteinheiten, die an der Energieübertragung zwischen diesen zwei Farbstoffeinheiten teilhaben können, eine kaskadenförmige Energieübertragungs-Anordnung würde daher mehr als zwei Farbstoffeinheiten und mindestens drei Farbstoffe beinhalten, die an der Energieübertragung zwischen den drei Farbstoffeinheiten teilhaben können.
Mit "Akzeptor" in einer Energieübertragungs-Anordnung ist eine Farbstoffeinheit gemeint, die Energie bei einer Wellenlänge absorbiert, die durch eine Donor-Farbstoffeinheit emittiert wird, d. h. das Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt das Emissionsspektrum des Donors.
Mit "Donor" in einer Energieübertragungs-Anordnung ist eine Farbstoffeinheit gemeint, welche Energie von Licht absorbiert und Licht bei Frequenzen emittiert, die zumindest teilweise innerhalb des Absorptionsspektrums einer Akzeptor-Farbstoffeinheit liegen.
In den generischen Beschreibungen von Verbindungen dieser Erfindung ist die Anzahl von Atomen eines speziellen Typs in einer Substituentengruppe allgemein als ein Bereich angegeben, zum Beispiel eine Alkylgruppe, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Ein solcher Bereichshinweis soll spezifische Hinweise auf Gruppen jeweils mit der Anzahl an Atomen innerhalb des spezifizierten Bereichs einschließlich der Endpunkte einschließen. Andere Atomzahlen und andere Typen von Atomen sind in der folgenden Weise angegeben, zum Beispiel schließt C_1-4 jedes aus C₁, C₂, C₃ und C₄ einzeln und jegliche Untergruppe des Bereichs ein.
Wenn nichts anderes angegeben ist, bezieht sich der Ausdruck "Alkyl" auf eine verzweigte oder unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und stärker bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoftatomen. Vorzugsweise ist die Kohlenwasserstoffgruppe gesättigt. Die Alkylgruppe kann wahlweise substituiert sein, und einige bevorzugte Substituenten schließen Alkoxy-, Alkylthio-, Halogen-, Amino-, einfach substituierte Amino-, zweifach substituierte Amino- und Carboxygruppen ein.
Der Ausdruck "Niederalkyl" bezieht sich auf einen aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 1 bis 6 Kohlenstoftatomen, und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoff atomen. Die Niederalkylgruppe kann wahlweise substituiert sein; bevorzugte Substituenten schließen Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Amino, einfach substituiertes Amino, zweifach substituiertes Amino und Carboxy ein.
Der Ausdruck "verzweigtes Alkyl" bezieht sich auf einen verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoff. Die verzweigte Alkylgruppe weist vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt 3 bis 6 Kohlenstoffe auf. Die verzweigte Alkylgruppe kann wahlweise substituiert sein und einige bevorzugte Substituenten schließen Alkoxy, Alkylthio, Halogen (wie Fluor, Brom, Chlor und Iod), Amino, einfach substituiertes Amino, zweifach substituiertes Amino und Carboxy ein.
Der Ausdruck "Halogenalkyl" bezieht sich auf eine Niederalkylgruppe, welche mit einem Halogen substituiert ist. Mithin bezieht sich der Ausdruck "Fluoralkyl" auf eine Niederalkylgruppe, welche mit einem Fluor substituiert wird. Der Ausdruck "Perfluoralkyl" bezieht sich auf eine Niederalkylgruppe, welche mit einem Fluoratom an jeder verfügbaren Position substituiert ist, mit Ausnahme von der Stelle, wo die Niederalkylgruppe mit der Hauptkette verknüpft ist.
Der Ausdruck "Aryl" bezieht sich auf eine aromatische Gruppe, welche mindestens einen Ring mit einem konjugierten π-Elektronensystem aufweist, und schließt sowohl carbocyclisches Aryl (z. B. Phenyl) und heterocyclische Arylgruppen (z. B. Pyridin) ein.
Spezifische Beispiele von heterocyclischen Gruppen, die in den Fachbereichen der Chemie bekannt sind, schließen die Folgenden ein:
Die Arylgruppe hat vorzugsweise 6 bis 14 Kohlenstoffe, stärker bevorzugt 6 bis 10 Kohlenstoffe. Aryleinheiten schließen monocyclische, bicyclische und tricyclische Ringe ein, wobei jeder Ring vorzugsweise fünf oder sechs Glieder aufweist. Die Aryleinheit kann wahlweise unabhängig voneinander mit Niederalkyl oder alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Halogenalkyl, Mercapto, Amino, einfach substituiertem Amino und zweifach substituiertem Amino einfach substituiert oder zweifach substituiert sein.
Der Ausdruck "carbocyclisch" bezieht sich auf eine Verbindung oder Gruppe, welche eine oder mehrere kovalent geschlossene Ringstrukturen enthält, und darauf, dass die das Grundgerüst des Rings bildenden Atome alles Kohlenstoff atome sind. Der Ausdruck unterscheidet somit carbocyclische von heterocyclischen Ringen, in welchen das Ringgrundgerüst mindestens ein Nicht-Kohlenstoft-Atom enthält. Ein "Cycloalkan" oder "cyclisches Alkan" oder "Cycloalkyl" ist eine carbocyclische Gruppe, in welcher der Ring ein wahlweise substituierter cyclischer aliphatischer Kohlenwasserstoff, d. h. eine cyclische Alkylgruppe vorzugsweise mit 3, 4, 5 oder 6 Ringkohlenstoffen, ist. Somit besitzt eine "Cyclopropyl"-Gruppe 3 Ring-Kohlenstoffatome.
Mit "lineares oder verzweigtes Alkyl" ist ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter aliphatischer Kohlenwasserstoff gemeint. Typische Alkylgruppen schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tertiäres Butyl, Pentyl, Hexyl und dergleichen ein. Mit Halogen ist Fluor, Chlor, Brom oder Iod gemeint.
Im Kontext dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Zielmaterial" auf eine Verbindung oder eine Struktur, an welche ein Energieübertragungsfarbstoff kovalent gebunden werden soll oder an welche ein solcher Farbstoff gebunden ist.
Mit "biologisches Material" ist eine Verbindung gemeint, die durch einen Organismus gebildet wird oder in diesem vorliegt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle, Kohlehydrate und Lipide. Solche Verbindungen können adaptiert oder derivatisiert sein, um eine Gruppe zu beinhalten, die für eine kovalente Verknüpfung eines Energieübertragungsfarbstoffs geeignet ist. Der Ausdruck bedeutet nicht, dass die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung mit intakten Organismen verwendet werden müssen, da die Farbstoffe häufig mit Extrakten verwendet werden, wie Nukleinsäureextrakten, oder Proben, einschließlich konservierten Proben, wie Gewebeschnitten, oder in Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen. Vorzugsweise liegt die Größe des biologischen Materials zwischen MG 400 und MG 1.000.000. Stärker bevorzugt liegt die Größe zwischen MG 400 und MG 100.000 und am meisten bevorzugt liegt die Größe zwischen 500 und MG 15.000.
Vorzugsweise ist der Donor-Farbstoff ein Xanthin- oder Cyanin-Farbstoff, und der Akzeptor ist ein Rhodamin- oder Cyanin-Farbstoff. Vorzugsweise enthalten L₁ und L₂ eine reaktive oder funktionelle Gruppe, die für die Verknüpfung des Farbstoffs an eine korrespondierende funktionelle oder reaktive Gruppenkomponente von A geeignet ist. Zum Beispiel sind zur Anbindung von D₁ an die L₁-Kette, Farbstoffe, die eine Carboxyl- oder aktivierte Carboxylgruppe enthalten, bevorzugt. Die Wahl der reaktive und funktionelle Gruppen enthaltenden Farbstoffe, die für die Bildung kovalenter Bindungen mit der L₁- und/oder L₂-Kette geeignet sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Weiterhin ist die Wahl der reaktiven und funktionellen Gruppe für L₁ und/oder L₂, die zur Bildung kovalenter Bindungen mit der Kette A geeignet sind, Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.
Geeignete Xanthin-Donor-Farbstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, 5-Carboxyfluorescein, 6-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7-dimethoxyfluorescein, CyA (3-(ε-Carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyl-oxacarbocyanin), Cy2 (3-(ε-Carboxypentyl)-3'-ethyl-oxa-carbocyanin) und Cy3 (3-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3, 3, 3', 3'-tetramethyl-5, 5'-disulphonato-carbocyani n.
Geeignete Cyanin-Farbstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Cy3.5 (3-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-4,5,4',5'-(1,3-disulphonato)-dibenzo-carbocyanin), Cy5 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-5,5'-disulphonato-dicarbocyanin, Cy5.5 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-4,5,4',5'-(1,3-disulphonato)-dibenzodicarbocyanin, Cy7 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-5,5'-disulphonato-tricarbocyanin. Cyanin-Farbstoffe, die für die Verwendung in den Energieübertragungsfarbstoften der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in dem US-Patent Nr. 5 268 486 (Waggoner et al.; hierin durch den Bezug in seiner Gesamtheit einschließlich jeglicher Zeichnungen eingeschlossen) offenbart.
Geeignete Rhodamin-Akzeptor-Farbstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: 5-Carboxyrhodamin (Rhodamin 110-5), 6-Carboxyrhodamin (Rhodamin 110-6), 5-Carboxyrhodamin 6G (R6G-5 oder REG-5), 6-Carboxyrhodamin-6G (R6G-6 oder REG-6), N,N,N',N'-Tetramethyl-5-carboxyrhodamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin (TAMRA oder TMR), 5-Carboxy-X-rhodamin, 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), Cy3 (3-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-5,5'-disulphonato-carbocyanin), Cy3.5 (3-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl- 3,3,3',3'-tetramethyl-4,5,4',5'-(1,3-disulphonato)-dibenzocarbocyanin), Cy5 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3,3'-tetrameihyl-5,5-disulphonato-dicarbocyanin, Cy5.5 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-4,5,4',5'-(1,3-disulphonato)-dibenzodicarbocyanin und Cy7 (1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethyl-5,5'-disulphonato-tricarbocyanin.
Die obenstehenden und zusätzliche Farbstoffe sind zum Beispiel beschrieben bei Southwick et al., 1990, Cytometry 11: 418–430; Mujumdar et al., 1993, Bioconjugate Chemistry 4: 105–111; Waggoner und Ernst, Fluorescent Reagents for Flow Cytometry, Part 1: Principles of Clinical Flow Cytometry (1993), und Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Inc. 6th edition (1996) Haugland, welche hierin durch den Bezug in ihrer Gesamtheit einschließlich jeglicher Figuren mit eingeschlossen sind.
Gegebenenfalls können die Komplexe einen dritten Farbstoff, z. B. einen Cyanin-Farbstoff, verknüpft mit L₂ über eine geeignete Linkergruppe und welcher in einer kaskadenförmigen Energieübertragungs-Anordnung mit D₁ und D₂ vorliegt, enthalten.
Mit "kaskadenförmige Energieübertragungs-Anordnung" ist ein Energieübertragungsfarbstoft gemeint, welcher mindestens drei Farbstoffeinheiten enthält. Bei diesem Typ einer Anordnung liegt der erste Farbstoff in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem zweiten Farbstoff vor, wobei der zweite Farbstoff der Empfänger von dem ersten Farbstoff übertragener Energie ist. Außerdem liegt bei diesem Anordnungstyp der zweite Farbstoff in einer Energieübertragungs-Anordnung vor, in welcher er eine Energieübertragung von dem ersten Farbstoff erhält und auch Energie zu dem dritten Farbstoff überträgt. Vorzugsweise wird ein zusätzlicher Linker verwendet, um den dritten Farbstoff an L₂ zu binden, welcher immer noch verfügbar ist, um sowohl an D₂ als auch an ein biologisches Material zu binden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein biologisches Material, das einen Energieübertragungsfarbstoft der Formel (1) enthält.
Geeignete biologische Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Antikörper, Antigene, Peptide, Proteine, Kohlehydrate, Lipide, Peptidnukleinsäuren (PNA), Nukleotide, Oxy- oder Desoxyribopolynukleinsäuren, geschlossene (locked) Nukleinsäuren (LNA), wie bei Koshkin et al. beschrieben, Tetrahedron Letters 1998 39: 4381–4384, und Zellen, die derivatisiert sein können, sofern erforderlich, so dass sie eine oder mehrere Gruppen enthalten, die für die Verknüpfung eines Energieübertragungsfarbstoffs geeignet sind, z. B. Amino-, Hydroxy-, Thiophosphoryl-, Sulphhydryl- oder Carboxylgruppen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Energieübertragungsfarbstoff der Formel (II) bereit:
Vorzugsweise dient D₁ bei dieser Anordnungsart als Donor-Farbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die gewählt sind aus den Gruppen bestehend aus Xanthin oder Cyanin. Geeignete Farbstoffe entweder von Xantin oder Cyanin wurden obenstehend erläutert. Weiterhin dient bei dieser Anordnungsart D₂ als Empfängerfarbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die aus den Gruppen Rhodamin oder Cyanin wie obenstehend beschrieben gewählt sind. Ebenfalls bevorzugt ist, dass der Arylring mit gesättigten oder ungesättigten Nebenketten substituiert sein kann, wie eine ethylenische Gruppe enthaltenden Ketten (C=C) oder eine acetylenische Gruppe enthaltenden Ketten (C=C).
n1, n2 und n3 sind eine Kette von verknüpften Atomen, wobei die Atome gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel. Vorzugsweise ist die Kette aufgebaut aus Kohlenwasserstoffen und Carbonylen. Vorzugsweise sind n1, n2 und n3 NH.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Energieübertragungsfarbstoft der Formel (III) bereit:
Vorzugsweise dient D₁ bei dieser Anordnungsart als Donor-Farbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die gewählt sind aus den Gruppen bestehend aus Xanthin oder Cyanin. Geeignete Farbstoffe entweder von Xanthin oder Cyanin wurden obenstehend erläutert. Weiterhin dient bei dieser Anordnungsart D₂ als Empfängerfarbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die aus den Gruppen Rhodamin oder Cyanin wie obenstehend beschrieben gewählt sind. Weitere Ausführungsformen sind eingeschlossen, wie für die Anordnung II beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Energieübertragungsfarbstoff der Formel (IV) bereit:
Vorzugsweise dient D₁ bei dieser Anordnungsart als Donor-Farbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die gewählt sind aus den Gruppen bestehend aus Xanthin oder Cyanin. Geeignete Farbstoffe entweder von Xanthin oder Cyanin wurden obenstehend erläutert. Weiterhin dient bei dieser Anordnungsart D₂ als Empfängerfarbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die aus den Gruppen Rhodamin oder Cyanin wie obenstehend beschrieben gewählt sind. Weitere Ausführungsformen sind eingeschlossen, wie für die Anordnung II beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Energieübertragungsfarbstoft der Formel (V) bereit:
Vorzugsweise dient D₁ bei dieser Anordnungsart als Donor-Farbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die gewählt sind aus den Gruppen bestehend aus Xanthin oder Cyanin. Geeignete Farbstoffe entweder von Xanthin oder Cyanin wurden obenstehend erläutert. Weiterhin dient bei dieser Anordnungsart D₂ als Empfängerfarbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die aus den Gruppen Rhodamin oder Cyanin wie obenstehend beschrieben gewählt sind. Weitere Ausführungsformen sind eingeschlossen, wie für die Anordnung II beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Energieübertragungsfarbstoff der Formel (VI) bereit:
Vorzugsweise dient D₁ bei dieser Anordnungsart als Donor-Farbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die gewählt sind aus den Gruppen bestehend aus Xanthin oder Cyanin. Geeignete Farbstoffe entweder von Xanthin oder Cyanin wurden obenstehend erläutert. Weiterhin dient bei dieser Anordnungsart D₂ als Empfängerfarbstoff und schließt jene Farbstoffe ein, die aus den Gruppen Rhodamin oder Cyanin wie obenstehend beschrieben gewählt sind. Die Gruppe 'n₁' besitzt vorzugsweise 1 bis 10 gebundene Kohlenwasserstoffe, und eine weitere Ausführungsform 'n_1' ist gleich eins. Weitere Ausführungsformen sind eingeschlossen wie für die Anordnung II beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Energieübertragungsfarbstoffs nach Anspruch 1 bereit, welches vorzugsweise mindestens fünf Kupplungsreaktionen anwendet:

(i) Kuppeln von A an eine Komponente von L₂;
(ii) Kuppeln des Reaktionsprodukts (i) mit L₁, das durch eine reaktive Gruppe substituiert wird, die zur Bildung der Verknüpfung mit D₁ geeignet ist;
(iii) Kuppeln des Reaktionsprodukts (ii) mit D₁;
(iv) Umsetzen des Reaktionsprodukts (iii), so dass L₂ durch eine reaktive Gruppe substituiert wird, die zur Bildung einer Verknüpfung mit D₂ und einem biologischen Molekül geeignet ist;
(v) Kuppeln des Produkts von (iv) mit D₂.

Es wäre für einen Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres ersichtlich, dass alternative Kupplungsschritte zu demselben Zweck angewandt werden könnten. Eine Alternative beispielsweise wäre der Austausch von D₁ durch D₂ in den Schritten i und iv.
In Verbindung mit den vorliegenden Energieübertragungsfarbstoften und der Verknüpfung der verschiedenen Einheiten dieser Farbstoffe bezieht sich der Ausdruck "Kuppeln" auf die Bildung von (einer) kovalenten Bindung(en), welche zwei Komponenten verbinden, zum Beispiel das Verbinden einer Farbstoffeinheit mit dem L₁-A-L₂-Teil des Energieübertragungsfarbstoffs. Der Ausdruck "Umsetzen" bezieht sich auf die Hinzufügung oder Entfernung von Gruppen oder Komponenten, was zu der Bildung einer reaktiven Gruppe führt, welche leicht mit einem kovalenten Partnermolekül verknüpft werden kann.
Da mehrere reaktive Gruppen in jeder Komponente vorliegen können, die an einer der Kupplungsreaktionen beteiligt ist, kann es erforderlich sein, dass die nicht an der Umsetzung beteiligten geblockt oder geschützt werden und danach entschützt werden, je nachdem, wie es später in der Reaktionsfolge angebracht ist.
Der Farbstoff enthält normalerweise einen Substituenten, der für die Kupplungsreaktion mit der L₁-A-L₂-Gruppe geeignet ist, oder er wird modifiziert, um eine solche Gruppe zu beinhalten. Zum Beispiel ist Iodacetamid ein geeigneter Substituent für Xanthin-Farbstoffe, Maleimido ist ein geeigneter Substituent für Cyanin-Farbstoffe.
Die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe können verwendet werden zur Bildung von Reagenzien durch kovalentes Binden der Farbstoffe an Trägermaterialien, wie Polymerteilchen, Zellen, Glaskügelchen, Antikörper, Proteine, Peptide, Enzyme, Kohlehydrate, Lipide und Nukleotide oder Nukleinsäuren (DNA, PNA, LNA (geschlossene Nukleinsäuren, "Novel convenient Syntheses of LNA [2.2.1] Bicyclo-Nucleosides", Koshkin et al., Tetrahedron Letters 39: 4381– 4384 (1998)) und RNA) und Analoga, die mindestens eine erste reaktive Gruppe enthalten oder derivatisiert wurden, um diese zu beinhalten, welche zur Bildung einer kovalenten Bindung mit der funktionellen Gruppe auf dem Markierungskomplex fähig ist (oder der funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer kovalenten Bindung mit einer reaktiven Gruppe auf dem Komplex fähig ist, wie obenstehend beschrieben) und mindestens einer zweiten reaktiven Gruppe (oder, je nach Bedarf, eine funktionelle Gruppe) mit Spezifität für die Bildung einer kovalenten Bindung mit einer biologischen Zielverbindung, wie Antikörpern, Zellen, Arzneistoffen, Antigenen, Bakterien, Viren und anderen Mikroorganismen.
Wenn der Träger funktionelle Gruppen aufweist, können die funktionellen Gruppen Antikörper oder DNA sein, die für die Verknüpfung an Antigen bzw. eine komplementäre DNA-Sequenz geeignet sind. Wenn das Trägermaterial reaktive Gruppen aufweist, kann der Träger ein Polymerteilchen oder ein Antigen sein, das für die Verknüpfung an beispielsweise DNA oder einen Antikörper geeignet ist. Techniken für das kovalente Binden von Fluorochromen an Trägermaterialien wie die Genannten sind im Fachbereich allgemein bekannt und ohne Weiteres in der Literatur verfügbar.
Das Trägermaterial kann weiterhin Nukleotide, die derivatisiert sind, um eines aus Amino-, Sulphydryl-, Carboxyl-, Carbonyl- oder Hydroxylgruppen zu enthalten, und Oxy- oder Desoxyribopolynuklein- oder Nukleinsäuren, die derivati siert sind, um eines aus Amino-, Thiophosphoryl, Sulphydryl-, Carboxyl-, Carbonyl- oder Hydroxylgruppen zu enthalten, einschließen.
Die funktionellen Gruppen auf dem Trägermaterial, die komplementär sind, d. h. die zur Bildung kovalenter Bindungen mit den reaktiven Gruppen der Markierungskomplexe der Erfindung fähig sind, schließen Amino-, Carboxyl-, Carbonyl- und Hydroxylgruppen ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Markierungsverfahren, in welchen in einem ersten Schritt ein Energieübertragungsfarbstoff der vorliegenden Erfindung kovalent mit einer ersten Komponente reagiert und dadurch diese markiert und danach die markierte erste Komponente verwendet, um mit einer zweiten Komponente zu binden unter Bildung einer markierten zweiten Komponente. Geeigneter Weise kann die erste Komponente ein Glied eines spezifischen Bindungspaars (ein spezifischer Bindungspartner) sein. In dem zweiten Schritt der Verfahrensweise wird der fluoreszierend markierte spezifische Bindungspartner danach als Sonde für das Binden an ein zweites Glied des spezifischen Bindungspaars (der zweiten Komponente) verwendet, zu welchem er eine spezifische Affinität besitzt.
Die spezifischen Bindungspaare können eine breite Vielzahl an Molekülen einschließen, die willkürlich bezeichnete Liganden und Rezeptoren sind. Ein Beispiel für solche Ligand-Rezeptor-Paare schließt einen Antikörper und das korrespondierende Antigen, für welches der Antikörper spezifisch ist, ein. Wenn das Ziel des so markierten Antikörpers eine Zelle ist, kann der zweite Schritt der Verfahrensweise angewandt werden, um die Menge an markierten Antikörpern zu bestimmen, die an den Zellentyp verknüpft sind, durch Bestimmen der Fluoreszenzintensität der Zellen. Mit dieser Verfahrensweise könnten monoklonale Antikörper und andere Komponenten, die kovalent in einem ersten Schritt mit den fluoreszierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung markiert wurden, als Antigensonden verwendet werden.
Zahlreiche andere Beispiele sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Mithin schließen zusätzliche Ligand-Rezeptor-Paare zum Beispiel Biotin-(strept)-avidin, Hormon-Rezeptor-Hormon, DNA-komplementäre DNA, DNA-RNA, DNA- bindendes Protein, Enzym-Substrat und dergleichen ein. Es versteht sich, dass beliebige zwei Moleküle, welche eine spezifische Bindungsaffinität besitzen, verwendet werden können, so dass die Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung für die Markierung eines Glieds eines spezifischen Bindungspaars verwendet werden können, welches seinerseits bei der Detektion des komplementären Glieds verwendet werden kann.
In einer zusätzlichen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls heraus, bestehend aus den Schritten des Inkubierens eines DNA-Moleküls, das mit einem zur Hybridisierung an das DNA-Molekül geeigneten Primermolekül annealed wurde, und zwar in einem Behälter, welcher eine thermostabile DNA-Polymerase, einen Energieübertragungsfarbstoft, der an einen DNA-Sequenzierungsterminator verknüpft ist, enthält, wobei die Verknüpfung mit einem Linker von mindestens 5, und stärker bevorzugt mindestens 10 Atomen zwischen dem Farbstoff und dem Nukleotid erfolgt, und Trennen von DNA-Produkten der Inkubierungsreaktion nach der Größe, wodurch mindestens ein Teil der Nukleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden kann. Ein solches Verfahren ist im Beispiel III beschrieben und die 7 und 8 liefern Sequenzdaten und eine beispielhafte Reihe von Energieübertragungsfarbstoff-Terminatoren.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Energieübertragungsfarbstoff-Terminator eine Verbindung, gewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddUTP; 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddCTP; 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddATP; 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-TAMRA-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddGTP oder 5-FAM-Phe-5-R110-11-dd CTP.
Die US-Patentanmeldung unter dem Titel "Dideoxy Dye Terminators" (Didesoxyfarbstoft-Terminatoren), Seriennummer 09/018 695, eingerereicht am 4. Februar 1998, und die hierin durch den Bezug in ihrer Gesamtheit einschließlich jeglicher Zeichnungen eingeschlossen ist, beschreibt die Bedeutung der Länge des Linkers zwischen Farbstoff und dem ddNTP. Der Aufbau und die Verknüpfung verschiedener Linker ist im Fachbereich allgemein bekannt. Geeignete Reagenzien für den Linkeraufbau schließen eine oder mehrere Verbindungen ein, bestehend aus aktivierten Formen von Amino-geschützten Alkyl- oder Arylaminosäuren, wie Verbindungen der Formel R-NH-(CH₂)_n-CO₂R' oder R-NH-(CH₂)_n-X(CH₂)_m-CO₂R', worin R eine Säure- oder Basen-stabile Schutzgruppe ist, R' eine reaktive Ester- oder Anhydridgruppe ist, X Aryl, 0, S oder NH ist, und worin n und m 0 – 12 sind. Andere Linker, durch die N- oder O- oder S-Alkylierung aufgebaut werden, sind ebenfalls geeignet. Die genaue Linkerlänge für einen spezifischen Farbstoff und Didesoxynukleotid-Kombination können empirisch durch Überwachen der Bandenuneinheitlichkeit bei der DNA-Sequenzierung bestimmt werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und anhand der Ansprüche offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 ist eine Schematik der Umsetzung zur Herstellung einer Energieübertragungs-(ET-)Farbstoff-Terminator-Kassette, N-5ROX-p-Propargylamido-5FAM-L-phenylalanin-11-ddCTP (SFAM-ROX-Phe-11-ddCTP) und andere Terminatoren der Erfindung.
Die 2 ist eine Tabelle von blauen ET-Farbstoff-Terminatoren.
Die 3a, b und c sind die chemische Struktur (3a) und Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungsdaten (3b, c) des ET-Farbstoff-Terminators 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddCTP.
Die 4a, b und c sind die chemische Struktur (4a) und die Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungsdaten (4b, c) des ET-Farbstoff-Terminators 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddUTP.
Die 5a, b und c sind die chemische Struktur (5a) und die Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungsdaten (5b, c) des ET-Farbstoff-Terminators 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddGTP.
Die 6a, b und c sind die chemische Struktur (6a) und die Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungsdaten (6b, c) des ET-Farbstoff-Terminators 5-FAM-Phe-5-R1-10-ddATP.
Die 7 sind die resultierenden Sequenzierungsdaten eines DNA-Moleküls unter Verwendung der hierin beschriebenen Energieübertragungsfarbstoffe.
Die 8 ist ein Set von vier Blau-Farb-Energieübertragungsfarbstoff-Terminatoren mit.
Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu, und bestimmte Merkmale der Erfindung können im Maßstab übertrieben sein und schematisch dargestellt sein im Interesse der Klarheit und Knappheit.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Diese Erfindung betrifft neue Energieübertragungsfarbstoffe, welche eine Fluoreszenz-Energieübertragung (Donor-Akzeptor-Energieübertragung) zeigen. Diese neuen Energieübertragungsfarbstoffe können auf spezifische Anregungs- und Emissionswellenlängen abgestimmt sein, um einer breiten Vielzahl an Assay- oder Visualisierungssystemen Rechnung zu tragen. Assays, wie die molekulare Hybridisierung zwischen Einheiten, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, oder für Verfahrensweisen, wie die Sequenzierung oder Elektrophorese von kleinen zellulären Komponenten.
Die Energieübertragungsfarbstofte der vorliegenden Erfindung sehen ein wertvolles Set an fluoreszierenden Markierungen vor, die für die Multiparameter-Analyse besonders nützlich sind und, was wichtig ist, die ein ausreichend geringes Molekulargewicht aufweisen, um mit den fluoreszierenden Komplexen markierte Materialien in Zellstrukturen eindringen zu lassen. Als solche sind die Farbstoffe gut für die Verwendung mit DNA- PNA- LNA- und/oder RNA-Sonden geeignet. Die Multiparameter-Analyse kann auf mehrfachen Proben erfolgen, um das Vorhandensein von biologischen Zielverbindungen nachzuweisen. Jede Probe wird durch allgemein bekannte Markierungsmethoden mit einem Energieübertragungsfarbstoff markiert.
Zum Beispiel wird eine Probe (Probe 1), von der vermutet wird, dass sie eine biologische Zielverbindung enthält, mit einem einzelnen Fluorochrom, wie Fluorescein, Kaskadenblau, einem BODIPY-Farbstoff, oder einem der mit Monomethin starr gemachten Farbstoffe, oder CY3(SO₃)₂, die alle im Wellenlängenbereich von 500–575 nm (Grün bis Orange) emittieren, inkubiert. Eine zweite Probe, von der vermutet wird, dass sie die biologische Zielverbindung (die gleiche Verbindung oder eine unterschiedliche Verbindung wie diejenige in Probe 1) enthält, wird mit einem Energieübertragungsfarbstoff der Erfindung inkubiert, zum Beispiel N-5-Tetramethyl-Rhodamin-p-propargylamido-5FAM-L-phenylalain, der Licht bei 490 nm absorbiert und Fluoreszenz im Bereich von 525 nm–602 nm emittiert, je nach dem gewählten Rhodamin-Farbstoff. Weitere Proben, von den vermutet wird, dass sie eine andere Zielverbindung enthalten, werden mit anderen Farbstoffen der Erfindung inkubiert, die unterschiedliche Absorptions- und Emissionsspektren aufweisen als Farbstoffe, die bereits in dem Assay verwendet werden. Nach einem geeigneten Zeitraum, um die fluoreszierenden Markierungen mit den Zielmarkierungen binden zu lassen, wird ungebundene Markierung durch Waschen entfernt und die markierten Proben werden vermischt.
Die Detektion ist mit einer Anregungsquelle mit einer einzigen Wellenlänge, d. h. in der Laserlinie von 488 nm, möglich. Jede unterschiedlich markierte Probe fluoresziert eine unterschiedliche Farbe bei der Emissionswellenlänge ihrer speziellen Markierung, wodurch eine Unterscheidung der individuellen Markierungen voneinander ermöglicht wird.
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstofte der vorliegenden Erfindung für eine Vielzahl an Immunofluoreszenztechniken, einschließlich direkter und indirekter Immunoas says, und andere bekannte Fluoreszenz-Detektionsverfahren verwendet werden können. Die Bedingungen jeder Markierungsreaktion, z. B. der pH-Wert, die Temperatur und die Zeit, sind im Fachbereich bekannt, doch ist im Allgemeinen Raumtemperatur bevorzugt. Der pH-Wert wird in Abhängigkeit von den optimalen Reaktionsbedingungen für die speziellen reaktiven Gruppen gemäß den bekannten Techniken eingestellt.
Die Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung und die Reagenzien, die daraus hergestellt werden können, bieten eine breite Vielfalt an fluoreszierenden Markierungen mit großen Stokes-Verschiebungen. Die Stokes-Verschiebung des Farbstoffs sollte so groß wie möglich sein, um die Messung des Rauschens von der Anregungsquelle zu minimieren, so dass das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis an der Empfindlichkeitsgrenze maximiert wird. Die Verfügbarkeit von Farbstoffen mit Stokes-Verschiebungen größer als 100 nm ist stark eingeschränkt. Was die Nützlichkeit verfügbarer Farbstoffe weiter beschränkt, kann die Löslichkeit der Farbstoffe in wässrigen Proben ein Problem sein, weil die meisten Farbstoffe mit großen Stokes-Verschiebungen wasserunlöslich sind. Das Problem eines Farbstoffs, welcher eine geringe Stokes-Verschiebung aufweist, wird in der Regel bei der Konstruktion eines Fluorometers mit Hilfe von Monochromatoren oder teurer Optik behoben, welche das Licht von der Anregungsquelle herausfiltern. Um allerdings den Verlust an Lichtintensität infolge der Filter zu beheben, ist zum Beispiel der Einsatz von Hochleistungs-Lichtquellen erforderlich. Diese Lichtquellen erzeugen Wärme, die in einem Gerät mit Hilfe von Wärmesenken oder Ventilatoren abgeführt werden muß.
In oder auf Teilchen eingebrachte fluoreszierende Farbstoffmoleküle zeigen ein Fluoreszenz-Quenchen aufgrund der großen Nähe der Farbstoffe zueinander und zu der Matrix des Teilchens. Die Farbstoffe sind in der ET-Kassette in einer Energie austauschenden Entfernung voneinander positioniert, welche die Donor-Akzeptor-Energieübertragung ermöglicht. Darüber hinaus sieht der Aryl-Linker ein starres Grundgerüst vor, welches so adaptiert ist, um einen spezifischen Abstand zwischen den Fluorophoren vorzusehen. Weiterhin ermöglicht dieser Linker die Verknüpfung der ET-Kassette mit einer breiteren Vielzahl an biologischen Molekülen, Varianten, wie jenen, die obenstehend beschrieben sind.
Fachleute auf dem Gebiet werden anerkennen, dass die Farbstoffe der Erfindung in einer Vielzahl an Fluoreszenzanwendungen über einen weiten Bereich des sichtbaren Spektrums zur Anwendung kommen können. Zudem würden Fachleute erkennen, dass mehr als ein Farbstoffpaar, welches eine Fluoreszenz-Energieübertragung zeigt, in oder auf Moleküle eingebracht werden kann, was zu einer Klasse von Verbindungen führt, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren. Ferner kann mit den hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Lehren die Einbringung in oder auf Moleküle von 3 oder mehr Farbstoffen, die zusammen eine Kaskade der Energieübertragung von dem Absorber zu dem intermediären Donor zu dem Akzeptor (welcher fluoresziert) vorsehen, zur Herstellung von Verbindungen mit sehr langen Stokes-Verschiebungen führen und gibt einem die Möglichkeit, Verbindungen mit einer nahezu unbegrenzten Vielzahl an Anregungs- und Emissionscharakteristika zu erzeugen.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung der Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen.
Beispiel 1: Herstellung einer FAM Phenylalanin-Linker-Rhodamin-Energieübertragungskassette
1.1) Herstellung von N-Boc-p-N-propargyltrifluoracetamido-L-phenylalanin
Einer umgerührten Suspension von N-Boc-p-iod-L-phenylalanin (1,0 g, 2,55 mMol) und Cul (97 mg, 0,51 mMol, 0,2 Äqu.) in wasserfreiem DMF (20 ml) unter Ar wurden N-Propargyltrifluoracetamid (1,16 g, 7,67 mMol, 3 Äqu.), Triethylamin (0,71 ml, 5,1 mMol, 2 Äqu.) und Tetrakis-(triphenylphosphin) Pd(0) (295 mMol, 0,1 Äqu.) hinzugegeben. Die Umsetzung wurde 6 Stunden ablaufen gelassen. Die Mischung wurde danach mit 1 : 1-MeOH-CH₂Cl₂ verdünnt und mit AGI X 8-Harz (Bio-Rad) 15 Minuten lang behandelt, danach filtriert, und das Harz wurde mit 1 : 1-MeOH-CH₂Cl₂ gewaschen. Die zusammengebrachten Filtrate wurden un ter vermindertem Druck konzentriert und der erhaltene Rückstand wurde auf einem Silicagel für die Säulenchromatographie adsorbiert. Die Elution mit 5–15% MeOH in CHCl₃ ergab N-Boc-p-N-propargylrifluoracetamido-L-phenylalanin, 'H-NMR (CD₃OD) δ 7,31 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar), 7,19 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar), 6,49 (breites s, 1H, NH-Boc), 4,28 (breites s, 2H, CH₂-Propargyl₂), 4,21 (m, 1H, CH-chiral), 2,84–3,25 (m, 2H, CH₂-phe), 1,38 (s, 9H, t-Butyl).
1.2) Herstellung von N-Boc-p-propargylamino-L-phenylalanin
Einer umgerührten Lösung von N-Boc-p-N-propargyltrifluoracetamido-L-phenylalanin (500 mg, 1,2 mMol) in MeOH (5 ml) wurden 30%iges NH₄OH hinzugegeben und 4 Stunden lang inkubieren gelassen. Die Lösung wurde danach unter vermindertem Druck verdampft unter Erhalt von N-Boc-p-propargylamino-L-phenylalanin, 'H-NMR (DMSO-d₆) δ 7,35 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar), 7,21 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar), 6,49 (breites s, 1H, NH-Boc), 4,00 (breites s, 2H, NH₂), 3,75 (breites s, 2H, CH₂-Propargyl), 3,48 (m, 1H, CH-chiral), 2,81–3,55 (m, 2H, CH₂Phe), 1,32 (S, 9H, t-Butyl).
1.3) Herstellung von p-Propargylamido-5FAM-L-phenylalanin
Einer umgerührten Lösung von N-Boc-p-N-propargylamino-L-phenylalanin (33 mg, 0,12 mMol) in wasserfreiem DMSO (3 ml) bei Raumtemperatur unter einer Ar-Atmosphäre wurden Diisopropylethylamin (276 ml, 1,58 mMol, 15 Äqu.) und 1 ml einer Lösung von DMSO und 5FAM-NHS-Ester (60 mg, 0,13 mMol, 1,2 Äqu.) hinzugegeben. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung einer HPLC mit einer Umkehrphasensäule unterworfen und mit einem Gradienten von 0,05%iger wässriger TFA auf 0,05% TFA in CH₃CN 30 Minuten lang eluiert. Fraktionen, die mit 5FAM markiertes L-Phenylalanin enthielten, wurden getrocknet unter Bereitstellung von N-Boc-p-propargylamido-5FAM-L-phenylalanin. Diese Verbindung wurde zu einer eiskalten Lösung von wässriger 1 : 1-TFA hinzugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur umgerührt, um ein p-Propargylamido-SFAM-L-phenylalanin zu erzeugen. 'N-NMR (CD₃OD) δ 8,46 (s, 1H, Ar), 8,24 (d, J = 6,7 Hz, 1H, Ar), 6,52–7,46 (m, 11H, CH, Ar) 4,44 (s, 2H, CH₂-Progargyl), 4,25 (m, 1H, CH-chiral), 3,06–3,19 (m, 2H, CH₂Phe)
1.4) Verfahrensweise zur Umwandlung von p-Propargylamido-SFAM-L-phenylalanin zu N-5Rhodamin-p-propargylamido-5FAM-L-phenylalanin (1)
p-Propargylamido-5FAM-L-phenylalanin (15 mg, 0,03 mMol) wurden in wasserfreiem DMSO (2 ml) unter Ar gelöst und bei Raumtemperatur umgerührt. N,N'-Di-isopropylethylamin (68 ml, 0,39 mMol, 15 Äqu.) und 5-Rhodamin-Farbstoff NHS-Ester (0,39 mMol, 1,2 Äqu.) in wasserfreiem DMSO wurden der Lösung hinzugegeben. Nach 1–2 Stunden wurde die Lösung einer HPLC mit einer Umkehrphasen-Delta-Pak C18-Säule (1,9 × 30 cm) unterworfen und mit einem Gradienten von 0,1M TEAA zu CH₃CN mit 20 ml/min während 30 Minuten eluiert. Fraktionen, welche die ET-Kassette enthielten, wurden unter vermindertem Druck konzentriert.
Beispiel 2: Herstellung von Energieübertragungsfarbstoff, verknüpft mit einem Didesoxynukleotid (5FAM-ROX-Phe-11-ddCTP) (1 und 3)
Einer umgerührten Lösung von N-5ROX-p-N-propargylamido-5FAM-L-phenylalanin wurden N,N'-Disuccinimidylcarbonat und wasserfreie THF-Lösung von DMAP hinzugegeben. Der korrespondierende NHS-Ester wurde nach 20 Minuten gebildet und der Ester wurde mit 5-(N-Propargyl-6-aminocaproyl)ddCTP, gelöst in Puffer (pH-Wert 8,5) konjugiert. Nach dem Umrühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurden Lösungsmittel und Puffer unter vermindertem Druck entfernt und der erhaltene Rückstand wurde durch SiO₂-Gel-Wasser-Aspirator-Vakuum-Säulen-Chromatographie unter Elution mit 2 : 8- bis 1 : 1-MeOH in CHCl₃ zu MeOH gereinigt, wodurch freier Farbstoff und N-Hydroxysuccinimid-Verunreinigungen entfernt wurden. Fraktionen wurden weiter durch Umkehrphasen-HPLC-Verfahren gereinigt. Die Fluoreszenzverstärkung des Energieübertragungsfarbstoffkonjugats war, wie sich zeigte, das 8,25-fache von derjenigen von einzelner ROX-markierter ddCTP.
Es wäre bei Anwendung obenstehender Beispiele klar, dass andere ähnliche biologische Moleküle, wie Desoxynukleotide und Oligonukleotide, an korrespondierende NHS-Ester der Erfindung gemäß der obenstehenden Methodik ver knüpft werden können, um Verbindungen herzustellen, wie sie in den hierin bereitgestellten Zeichnungen durch Beispiele angegeben sind.
Beispiel 3: Sequenzierung von DNA unter Verwendung von Energieübertragungsfarbstoff-markierten Didesoxynukleosidtriphosphaten (7)
Eine Sequenz von M13mp18-Matrizen-DNA wurde unter Verwendung eines standardmäßigen "40"-Primers erzeugt. Die Reaktionsmischung (20 μl) enthielt 200 μM von jeweils dATP, dCTP und dTTP, 1000 μM dITP, 310nM5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddGTP, 140nM 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddATP, 275 nM 5-FAM-Phe-5-R6G-11-ddTTP, 410 nM 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddCTP, 2-pMol-40-Primer, 200ng M13mp18 DNA, 20 Einheiten Thermo-Sequenase II (Amersham Pharmacia Biotech), 0,0008 Einheiten anorganische Thermoplasma acidophilum-Pyrophosphatase, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, 35 mM KCl und 5 mM MgCl₂.
Die Reaktionsmischung wurde in einer Temperatur-Wechselvorrichtung während 25 Zyklen von 95°C, 30 s; 60°C, 60 s, inkubiert. Nach dem Zyklenbetrieb wurden die Reaktionsprodukte mit Ethanol unter Anwendung von Standard-Verfahrensweisen ausgefällt, gewaschen und in Formamid-Beladungspuffer erneut suspendiert. Die Probe wurde auf ein Applied-Biosystems-Gerät, Modell 377, geladen und die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Standard-Software-Methoden analysiert.
Es wäre unter Anwendung der obenstehenden Beispiele klar, dass andere ähnliche Energieübertragungsfarbstoffe der Erfindung an korrespondierende DNA-Terminatoren geknüpft werden können und für Sequenzierungsreaktionen verwendet werden können.
Alle in der Patentbeschreibung genannten Patente und Veröffentlichungen weisen auf die Erfahrungsgrade der Fachleute des Gebiets hin, auf welches sich die Erfindung bezieht. Alle in dieser Offenbarung angeführten Referenzen sind durch den Bezug in demselben Maße eingeschlossen, so als wenn jede Referenz durch den Bezug in ihrer Gesamtheit einzeln eingeschlossen worden wäre.
Ein Fachmann auf dem Gebiet würde ohne Weiteres anerkennen, dass die vorliegende Erfindung so gut angepasst ist, um die Ziele zu bewerkstelligen und die genannten Zwecke und Vorteile sowie die mit diesen verbundenen zu erreichen. Die hierin beschriebenen Farbstoffe, Substituenten und Zielmaterialien, wie sie in der vorliegenden Erfindung kennzeichnend für bevorzugte Ausführungsformen sind, dienen als Beispiele und sollen keine Einschränkungen des Umfangs der Erfindung bedeuten. Veränderungen darin und anderen Anwendungen werden für Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich, welche innerhalb des Wesens der Erfindung umfasst sind, und sind durch den Umfang der Ansprüche definiert.
Für einen Fachmann auf dem Gebiet wird leicht offensichtlich, dass unterschiedliche Substitutionen und Modifizierungen bei der hierin offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Umfang und Wesen der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel werden Fachleute auf dem Gebiet ohne Weiteres anerkennen, dass die vorliegenden Energieübertragungsfarbstofte eine Vielzahl an unterschiedlichen Farbstofteinheiten, Linkern, Verknüpfungsgruppen und reaktiven Gruppen beinhalten können und an eine Vielzahl unterschiedlicher Zielmaterialien geknüpft werden können. Somit liegen solche zusätzlichen Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und der nachstenden Ansprüche.
Die veranschaulichend hierin beschriebene Erfindung kann in geeigneter Weise bei Fehlen irgendeines Elements oder von Elementen, einer Einschränkung oder von Einschränkungen in die Praxis umgesetzt werden, welche hierin nicht speziell beschrieben sind. Daher kann zum Beispiel in jedem Einzelfall hierin jede der Bezeichnungen "umfassend", "bestehend im Wesentlichen aus" und "bestehend aus" durch eine beliebige der zwei anderen Bezeichnungen ersetzt werden. Die Bezeichnungen und Ausdrücke, die verwendet wurden, werden zum Zwecke der Beschreibung, und nicht der Einschränkung, verwendet und es ist nicht beabsichtigt, dass durch die Verwendung solcher Bezeichnungen und Ausdrücke irgendwelche äquivalenten Entsprechungen der dargelegten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen hiervon ausgenommen werden sollen, doch es wird anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Mithin sollte es sich verstehen, dass obwohl die vorliegende Erfindung zwar spezifisch anhand von bevorzugten Ausführungsformen und optionalen Merkmalen beschrieben wurde, Fachleute auf dem Gebiet aber auf eine Modifizierung und Abwandlung der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen können und dass solche Modifizierungen und Abwandlungen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, wie durch die anhängigen Ansprüche definiert, liegen sollen.
Außerdem werden Fachleute dort, wo Merkmale oder Aspekte der Erfindung als Markush-Gruppen oder andere gruppenmäßige Einstufungen von Alternativen beschrieben sind, erkennen, dass die Erfindung ebenfalls dadurch in Hinblick auf jedes einzelne Glied oder jede Untergruppe von Gliedern der Markush-Gruppe oder einer anderen Gruppe beschrieben wird.
Mithin liegen weitere Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der Erfindung und innerhalb der nachstehenden Ansprüche.

Claims

Energieübertragungsfarbstoff der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₁ umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D2 umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, wobei L₁ einen oder mehrere aromatische Ringe enthält.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 2, wobei der aromatische Ring ein Phenylring ist.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 2, wobei L₁ einen oder mehrere heterocyclische Ringe enthält.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, wobei L₂ einen oder mehrere aromatische Ringe enthält.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, wobei A eine erste lineare Kohlenwasserstoffkette umfasst, die an eine oder mehrere Heteroarylgruppen ge bunden ist, und wobei die Heteroarylgruppen weiterhin an eine zweite lineare Kohlenwasserstoffkette gebunden sind.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, wobei D₁ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem Xanthinfarbstoff und einem Cyaninfarbstoff, und D₂ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem Rhodaminfarbstoff und einem Cyaninfarbstoff.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, umfassend weiterhin einen dritten Farbstoff, gebunden an L₂ über eine Linkergruppe, wobei diese Bindung in einer Energieübertragungs-Anordnung des dritten Farbstoffs mit D2 resultiert.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 8, wobei der dritte Farbstoff ein Cyaninfarbstoff ist.
Verbindung, gewählt aus der Gruppe, umfassend die Formeln:

worin D₁ und D₂ wie in Anspruch 1 definiert sind; n₁, n₂ und n₃ eine Kette aus verbundenen Atomen sind, wobei die Atome aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel; und n₁ 1 bis 10 ist.
Energieübertragungsfarbstoff-Terminator, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11- ddCTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddGTP, oder 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddCTP.
Verfahren zur Herstellung eines Energieübertragungsfarbstoffs der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D ₁ umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₂ umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kuppeln von A an eine Komponente von L₂; (b) Kuppeln des Produkts aus Teil (a) mit L₁, worin L₁ mit einer reaktiven Gruppe substituiert ist, welche zur Bildung einer Verknüpfung mit D₁ geeignet ist; (c) Kuppeln des Produkts aus der Umsetzung (b) mit D₁; (d) Umsetzen des Produkts aus (c) in der Weise, dass L₂ durch eine reaktive Gruppe substituiert wird, die zur Bildung einer Verknüpfung mit D₂ geeignet ist, und wobei ein zweiter Teil von L₂ durch eine reaktive Gruppe substituiert wird, welche zur Bildung einer Verknüpfung mit einem biologischen Ziel geeignet ist, und (e) Kuppeln des Produkts aus (d) mit D₂, wodurch die Verknüpfung gebildet wird.
Verfahren zur fluoreszierenden Markierung eines biologischen Matierals, umfassend: (a) Zugeben zu einer Flüssigkeit, welche das biologische Material enthält, eines Energieübertragungsfarbstoffs der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₂ umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen; und (b) Umsetzen des Farbstoffs, so dass der Farbstoff kovalent mit dem biologischen Material reagiert und dieses markiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das biologische Material aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Peptiden, Proteinen, Kohlehydraten, Lipiden, Nukleotiden, Oxy-, Desoxy- oder Desoxyribonuklein- oder Polynukleinsäuren und Zellen, welche wahlweise derivatisiert sind, so dass diese eine oder mehrere Amino-, Hydroxy-, Thiophosphoryl-, Sulphydryl- oder Carboxygruppen enthalten.
Verfahren zum fluoreszierenden Markieren einer ersten Komponente und danach Verwenden der markierten ersten Komponente zum Nachweisen des Vorliegens einer zweiten Komponente in einer Probe, umfassend: (a) Zugeben zu einer Flüssigkeit, welche die erste Komponente enthält, eines Energieübertragungsfarbstoffs der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₂ umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen; und (b) Umsetzen des Farbstoffs mit der ersten Komponente, so dass der Farbstoff mit der ersten Komponente kovalent reagiert und dadurch diese markiert; (c) zur Verfügung stellen der markierten ersten Komponente der Probe, um eine Bindung der markierten ersten Komponente mit der zweiten Komponente, falls vorhanden, zu ermöglichen; und (d) Nachweisen der zweiten Komponente, falls vorhanden, durch Detektieren der Fluoreszenzmarkierung mittels einer optischen Methode.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Zielmaterial ein biologisches Material umfasst.
Reagens, umfassend: (a) einen Energieübertragungsfarbstoff der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₂ umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen; (b) ein Trägermaterial, das enthält oder das derivatisiert worden ist, um zu beinhalten mindestens eine erste reaktive Gruppe, welche fähig ist eine kovalente Bindung mit einer funktionellen Gruppe zu bilden, oder funktionelle Gruppe, die fähig ist eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe auf dem Energieübertragungsfarbstoff zu bilden und daran kovalent gebunden ist.
Reagens nach Anspruch 17, wobei D₁ aus der Gruppe gewählt ist, umfassend einen Fluoresceinfarbstoff und einen Cyaninfarbstoff, und D₂ aus der Gruppe gewählt ist, umfassend einen Rhodaminfarbstoff und einen Cyaninfarbstoff.
Reagens nach Anspruch 17, wobei R₂ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Amino, Carboxyl, Succinimidylester, Sulphosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid und Phosphoramidit, und Gruppen, welche kovalent mit Carboxyl, Succinimidylester, Sulphosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid und Phosphoramidit reaktiv sind.
Biologisches Material mit einem daran geknüpften Energieübertragungsfarbstoff, umfassend (a) einen Energieübertragungsfarbstoff der Formel: D₁-L₁-A-L₂-D₂ worin D₁ eine erste Farbstoffeinheit ist, die als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; D₂ eine zweite Farbstoffeinheit ist, die als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; A 5-20 verbundene Atome umfasst, wobei die verbundenen Atome mindestens eine Aryl- oder Heteroarylgruppe enthalten, und worin die Atome unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor; L₁ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen umfasst; L₂ eine Gruppe von 2 bis 30 verbundenen Atomen zur Bindung an D₂ umfasst, und eine funktionelle Gruppe aus 4 bis 30 verbundenen Atomen, in der Weise adaptiert, um A an ein biologisches Ziel zu verknüpfen; und (b) ein biologisches Material, das beinhaltet oder derivatisiert worden ist, um zu beinhalten mindestens eine erste reaktive Gruppe,' die fähig ist, eine kovalente Bindung mit einer funktionellen Gruppe zu bilden, oder eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe auf dem Energieübertragungsfarbstoff zu bilden und kovalent daran gebunden ist.
Energieübertragungskassette der Formel:
worin F¹ ein erster Farbstoff ist, der als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; F² ein zweiter Farbstoff ist, der als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; B eine lineare oder verzweigte Alkylkette mit 1 bis 30 verbundenen Atomen ist, wobei die Kette eine oder mehrere -NH-, -O-, -CH=CH-, -C=C- und Phenylenylgruppen umfasst; M³ Wasserstoff oder eine reaktive oder funktionelle Gruppe umfasst, welche angepasst ist, um den Energieübertragungsfarbstoff an ein Zielmaterial zu verknüpfen; und D ein Atom oder eine Gruppe umfasst zur Verknüpfung von F² mit der Linkergruppe B.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 21, wobei F¹ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem Xanthinfarbstoff und einem Cyaninfarbstoff, und F2 aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem Rhodaminfarbstoff und einem Cyaninfarbstoff.
Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 21, umfassend weiterhin einen dritten Farbstoff, verknüpft an F² über eine Linkergruppe, wobei die Verknüpfung in einer Energieübertragungs-Anordnung des dritten Farbstoffs mit F² resultiert.
Energieübertragungsfarbstoff der Formel:
worin P¹ ein erster Farbstoff ist, der als Akzeptor oder Donator in einer Energieübertragungs-Anordnung geeignet ist; P² ein zweiter Farbstoff ist, der als Donator oder Akzeptor in einer Energieübertragungs-Anordnung mit dem ersten Farbstoff geeignet ist; R⁴ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl ist; R⁵ Hydroxyl, Halogen, Methyl oder Ethyl umfasst; N¹ eine Verbindungsgruppe mit 1 bis 10 Atomen oder Gruppen ist, unabhängig gewählt aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, -CH=CH- und C=C-; S³ Wasserstoff oder eine reaktive oder funktionelle Gruppe ist, adaptiert zur Verknüpfung des Energieübertragungsfarbstoffs an ein Ziel.
Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines DNA-Moleküls, das mit einem zur Hybridisierung an das DNA-Molekül geeigneten Primermolekül annealed wurde, in einem Behälter, enthaltend eine thermostabile DNA-Polymerasae, eine Verbindung der Formel, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-REG-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-ROX-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddGTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddCTP, 5-FAM-Phe-5-TAMRA-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddATP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddUTP, 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddGTP, oder 5-FAM-Phe-5-R110-11-ddCTP, und (ii) Trennen der DNA-Produkte der Inkubierungsreaktion nach ihrer Größe, wodurch mindestens ein Teil der Nukleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines oder mehrerer Moleküle in einer Probe, umfassend die Schritte: Auswählen von Bindungspartnern, welche für mindestens eines der Moleküle in der Probe spezifisch sind, unabhängig voneinander Verknüpfen jedes der Bindungspartner an einen individuellen Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin D₁ für jede individuelle Verbindung gleich ist und D2 verschieden ist, Mischen der Bindungspartner, welche unabhängig an individuelle Verbindungen der Formel 1 verknüpft sind, mit der Probe, Nachweisen des Vorhandenseins der Moleküle, basierend auf unterschiedlichen Emissionsspektren.