DE10025820C2 - Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen - Google Patents

Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen

Info

Publication number
DE10025820C2
DE10025820C2 DE2000125820 DE10025820A DE10025820C2 DE 10025820 C2 DE10025820 C2 DE 10025820C2 DE 2000125820 DE2000125820 DE 2000125820 DE 10025820 A DE10025820 A DE 10025820A DE 10025820 C2 DE10025820 C2 DE 10025820C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
laser
equal
compatible
substituents
dimethylethyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE2000125820
Other languages
English (en)
Other versions
DE10025820A1 (de
Inventor
Peter Czerney
Wilhelm Frank
Frank Lehmann
Bernd Schweder
Matthias Wenzel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dyomics GmbH
Original Assignee
Dyomics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE2000125820 priority Critical patent/DE10025820C2/de
Application filed by Dyomics GmbH filed Critical Dyomics GmbH
Priority to DE50107913T priority patent/DE50107913D1/de
Priority to AU65811/01A priority patent/AU6581101A/en
Priority to US10/031,741 priority patent/US6750346B2/en
Priority to JP2001587056A priority patent/JP2003534435A/ja
Priority to BR0106715-0A priority patent/BR0106715A/pt
Priority to PCT/DE2001/001946 priority patent/WO2001090253A1/de
Priority to AT01943135T priority patent/ATE308589T1/de
Priority to CA2380272A priority patent/CA2380272C/en
Priority to EP01943135A priority patent/EP1283855B1/de
Publication of DE10025820A1 publication Critical patent/DE10025820A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE10025820C2 publication Critical patent/DE10025820C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0066—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of a carbocyclic ring,(e.g. benzene, naphtalene, cyclohexene, cyclobutenene-quadratic acid)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.
Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben sowie anderes mehr.
Polymethine sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.-Rev. 1992, 92, 1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π-Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im roten und nahem infraroten (NIR)-Bereich. Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX- Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzähler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik, als Licht-Absorber in beschreibbaren CD's und nicht zuletzt als Biomarker ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S.; Resch-Genger, U.; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - Dordrecht/Boston/London - 1998).
Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin (DE 410 487) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (US-PS 5 627 027). Darüber hinaus werden das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin "Indocyaningreen" bzw. "Cardio Green" abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (US-PS 5 569 766). In der Polymethinkette aliphatisch verbrückte Heptamethine wurden von Patonay entwickelt (US-PS 5 800 995).
Charakteristisch für alle kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden (Fischer-Base) bzw. Heteroinden ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf aufeinander folgende sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine) zwischen den Heterocyclen anzuordnen um Absorptionsmaxima an der Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.
Ein wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethine besteht darin, daß mit Verlängerung der Polymethinkette im steigenden Maße nucleopile bzw. elektrophile Angriffsmöglichkeiten auf die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des π-Systems kommt. Weitere Nachteile dieser Marker-Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo- oder Lagerstabilität, in aufwendigen Synthese- und Reinigungs­ schritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw. einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nucleinsäureoligomeren bzw. nach Bindung an diese. Beispielsweise wurde eine Verminderung der Fluoreszenzquantenausbeute von Cy5 beim kovalenten Binden an verschieden Albumine beschrieben (Oswald, B.; Patsenker, L.; Duschl, J.; Szmacinski, H.; Wolfbeis, O. S.; Terpetschnig, E.; Bioconjugate Chem. 1999, 10, 925-931).
Die Verwendung von Pyrylium- und Benzopyrylium-Heterocyclen bzw. den entsprechenden mesomeren Chromenen als terminale Endgrppen in Markerfarbstoffen in biologisch relevanten Systemen ist bisher nicht bekannt. Dies ist auf die extreme Hydrolyseempfindlichkeit dieser π-Mangelaromaten, vor allem in wässrig-basischem Milieu, zurückzuführen (H. Lietz, G. Haucke, P. Czerney, B. John, J. Prakt. Chem., 1996, 338, 725-730).
Telfer et al. (US-Patent 5 262 549) beschreiben symmetrische Trimethine auf der Basis von 2-alkyl-substituierten Benzopyryliumsalzen für die Verwendung als NIR-Absorber in polymeren Medien, wobei die Aggregationsneigung in diesen Medien reduziert ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im langwelligen sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht des Helium/Neon- oder Diodenlasers, zur Fluoreszenz angeregt werden können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Marker-Farbstoffe auf der Basis von unsymmetrischen Polymethinen, die eine substituierte ω-(Benz[b]pyran-4-yliden)alk-1-enyl)-Einheit der allgemeinen Struktur I
enthalten mit Z als substituierten Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9- Methylacridinderivaten der allgemeinen Formeln IIa oder IIb oder IIc
wobei
  • - X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht,
  • - n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
  • - R1-R14 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R10 und R11, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
  • - mindestens einer der Substituenten R1-R14 einen solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Cyclodextrin, Zucker, SO3 -, PO3 -, COO-, oder NR3 + darstellt, die die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt, wobei dieser Substituent auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann,
  • - mindestens einer der Substituenten R1-R14 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht, wobei dieser Substituent auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann, und
  • - R1 einen Substituenten darstellt, der in α-Position zum Pyran-Ring ein quartäres C-Atom aufweist. Beispiele für einen solchen Substituenten sind t-Butyl (-C(CH3)3) und Adamantyl (-C10H15/Tricyclo[3.3.1.13,7]decyl).
In den Unteransprüchen 2-18 sind spezielle Ausführungsformen und Anwendungen zu den Marker-Farbstoffen aufgeführt.
Diese substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin- oder Acridinderivate der allgemeinen Formel I können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologischen Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymeren Trägermaterialien verwendet werden.
Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formel I und dem zu markierenden Materialien erfolgen.
Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.
Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel I und davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care- Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Genchips).
Durch die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol- bzw. Acridinderivate sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere nachfolgende Vorteile erreicht:
Bereits Trimethine absorbieren im Spektralbereich < 650 nm und zeigen eine gegenüber den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima < 650 nm (Penta- und Hepta­ methine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische Stabilität.
Durch "molecular engineering" ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptions- und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen.
Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Verfügung gestellt werden kann.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und Zeichnungen näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele 1.: Vorschrift zur Darstellung von 11-(2,2-Dimethylethyl)-9-methyl-1H,2H,3H,5H,6H,7H- pyrano[2,3-f]pyrido[3,2,1-ij]chinolin-12-ium tetrafluoroborat 2b (BS 28), vgl. Fig. 1
Zu einer gekühlten Lösung von 7.3 g (0.0245 mol) 11-(2,2-Dimethylethyl)- 1H,2H,3H,5H,6H,7H-pyrano[2,3-f] pyrido[3,2,1-ij]chinolin-9-on in 50 ml Ethylenglycoldimethylether wird tropfenweise 50 ml eine 1.0 molare Lösung von Methylmagnesiumbromid in Dibutylether gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten auf 40°C erwärmt. Nach Kühlung auf 0°C wird 70 ml gesättigte NH4Cl-Lösung und verdünnte Salzsäure zur Hydrolyse zugegeben. Die organische Phase wird abgetrennt und mit 4 × 10 ml Diethylether extrahiert. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und der ölige Rückstand in 20 ml Eisessig gelöst. Zugabe von 3 ml HBF4 (48-50%) und Verdünnen mit Diethylether führte zu einem Niederschlag, der abfiltriert und aus Eisessig umkristallisiert wird.
3.35 g (35%) Ausbeute, 175-80°C Schmelzpunkt. - 1H NMR (400 MHz, CDCl3 + CF3CO2D): 1.43 (s, 9H), 1.90 (m, 2H), 2.06 (m, 2H), 2.67 (m, 2H), 2.92 (m, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 6.90 (s, 1H), 7.58 (s, 1H): - C20H26BF4NO (383.24): ber. C 62.68, H 6.84, N 3.65, gef. C 63.06, H 6.72, N 3.48.
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung der unsymmetrischen Trimethine OB11, OB14, OB15 und OB20
0.01 mol vom entsprechenden 4-Methyl-benzopyrylium-tetrafluoroborat der Formel 2a (BS4) oder 2b (BS28) (vgl. Fig. 1a und 1b) und 0.01 mol methylenaktiver N-Heterocyclus werden in 20 ml Acetanhydrid gelöst, mit 2,0 g Triethoxymethan und 5 ml Pyridin versetzt und ca. 10 min erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung auf RT wird das Farbstoffrohprodukt mit ca. 30 ml Diethylether ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und säulenchromatographisch gereinigt.
2.: 1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-2-[3-(7-N,N-diethylamino-2-(1,1-dimethylethyl)-4H- benzopyran-4-yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat OB11
0.01 mol 2a und 0.01 mol 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonat werden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt, vgl. Fig. 2.
Säulenchromatographie: SiO2, Eluent Ethanol. 3.2 g (50%) Ausbeute, 280-82°C Schmelzpunkt. - 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.10-1.86 (m, 27H), 2.16 (m, 2H), 3.54 (m, 4H), 4.13 (m, 2H), 6.58 (d, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.06 (d, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.78 (s, 1H)., 8.08 (d, 1H), 8.32 (t, 1H) - 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 12.30, 21.51, 24,32, 25.66, 26.56, 27.55, 34.07, 36.37, 43.72, 44.22, 48.87, 96.36, 99.40, 104.11, 109.85, 110.28, 112.48, 113.27, 119.66, 126.09, 140.23, 141.81, 145.59, 147.09, 162.14, 172.33, 174.64 - MS (FAB in dmba): 657 (M + Na+), 635 (M + H+), 391, 359, 258, 257 - C36H46N2O6S (634.83): ber. C 68.11, H 7.30, N 4.41, gef. C 68.25, H 7.33, N 4.39.
3.: 1-(3-Hydroxypropyl)-4-[3-(7-N,N-diethylamino-2-(1,1-dimethylethyl)-4H-benzopyran- 4-yliden)-1-propenyl]-chinolinium-tetrafluoroborat OB14
0.01 mol 2a und 0.01 mol 1-(3-Hydroxypropyl)-4-methylchinolinium-iodid werden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.
Säulenchromatographie: SiO2, Eluent Toluol/Ethanol 1/1. 2.4 g (42%) Ausbeute, 162-­ 64°C Schmelzpunkt. - 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.17 (t, 6H), 1.32 (s, 9H), 2.14 (m, 2H), 2.25 (s, 1H), 3.39 (q, 4H), 3.71 (m, 2H), 4.89 (m, 2H), 6.31 (d, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.62 (m, 2H), 7.01 (d, 1H), 7.60 (t, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 7.84 (t, 1H), 7.93 (d, 1H), 8.12 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 9.27 (d, 1H). - 13C NMR (100 MHz, CDCl3): 12.52, 28.08, 32.01, 36.20, 44.61, 52.53, 57.52, 97.05, 97.94, 109.58, 109.94, 110.91, 111.77, 113.61, 117.72, 124.79, 125.38, 125.50, 12713, 133.64, 137.96, 140.92, 142.20, 144.96, 150.87, 151.74, 155.40, 167.12 - MS (FAB in dmba): 483 (M+) - C32H39BF4N2O2 (570.48): ber. C 67.37, H 6.89, N 4.91, gef. C 67.30, H 6.92, N 4.89.
4.: 1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-2-[3-(11-(2,2-dimethylethyl)-1H,2H,3H,5H,6H,7H- pyrano[2,3-f]pyrido[3,2,1-ij]chinolin-9-yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat OB­ 15
0.01 mol 2b und 0.01 mol 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonat werden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.
Säulenchromatographie: SiO2, Eluent Ethanol. 2.9 g (44%) Ausbeute, < 300°C Schmelzpunkt. - 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6): 1.10-1.56 (m, 19H), 1.91 (m, 4H), 2.08 (m, 4H), 2.83 (m, 4H), 3.38 (m, 4H), 4.03 (m, 2H), 6.45 (d, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.26 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 8.23 (t, 1H) - 13C NMR (62 MHz, DMSO-d6): 19.40, 20.43, 24.86, 25.98, 26.61, 27.16, 27.76, 27.85, 28.94, 35.17, 36.71, 43.40, 48.45, 49.04, 49.63, 99.24, 102.90, 105.09, 109.69, 110.03, 112.96, 119.71, 121.85, 123.50, 139.89, 142.18, 144.84, 145.76, 148.56, 148.86, 151.59, 170.08, 171.37 - MS (ESI): 681 (M + Na+), 659 (M + H+), 352 - C38H46N2O6S (658.12): ber. C 69.27, H 7.34, N 4.25, gef. C 69.20, H 7.37, N 4.29.
5.: 1-(5-Carboxypenlyl)-4-[3-(7-N,N-diethylamino-2-(1,1-dimethylethyl)-4H-benzo-pyran- 4-yliden)-1-propenyl]-chinolinium-6-sulfonat OB20
0.01 mol 2a und 0.01 mol 1-(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinolinium-6-sulfonat werden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.
Säulenchromatographie: SiO2, Eluent Ethanol. 2.1 g (35%) Ausbeute, < 300°C Schmelzpunkt. - C35H42N2O6S (618.76): ber. C 67.93, H 6.84, N 4.53, gef. C 67.73, H 6.93, N 4.29.
6.: Anregungs- und Emissionsspektren von 1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-2-[3-(11- (2,2-dimethylethyl)-1H,2H,3H,5H,6H,7H-pyrano[2,3-f]pyrido[3,2,1-ij]chinolin-9-yliden)- 1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat
Figure 3a und 3b zeigen die Emissions- (Figure 3a) und Anregungsspektren von 1-(5- Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-2-[3-(11-(2,2-dimethylethyl)-1H,2H,3H,5H,6H,7H-pyrano [2,3-f]pyrido[3,2,1-ij]chinolin-9-yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat in Wasser und nichtkovalent gebunden an Rinder-Serum-Albumin (BSA), wobei jeweils das intensivere Spektrum das BSA konjugat kennzeichnet. Beide Farbstofflösungen waren bei diesen Messungen gleich konzentriert.

Claims (18)

1. Marker-Farbstoffe auf der Basis von unsymmetrischen Polymethinen, die eine substituierte ω-(Benz[b]pyran-4-yliden)alk-1-enyl)-Einheit der allgemeinen Struktur I
enthalten mit Z als substituierten Benzooxazolium-, Benzothiazolium-, 3,3- Dimethylindolium-, 3,3-Dimethyl-4,5-benzo-3H-indolium-, 2- und 4-Pyridinium-, 2- und 4- Chinolinium- sowie 9-Acridiniumderivaten der allgemeinen Formeln IIa oder IIb oder IIc
wobei
X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht,
n für die Zahlenwerte 0, 1, 2 oder 3 steht,
R1-R14 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R10 und R11, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
mindestens einer der Substituenten R1-R14 eine solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Cyclodextrin, Zucker, SO3 -, PO3 -, COO-, oder NR3 +, darstellt, die die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt, wobei diese funktionelle Gruppe auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann,
mindestens einer der Substituenten R1-R14 für eine reaktive Gruppe steht, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit einem anderen Molekül ermöglicht, wobei dieser Substituent auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann, und
R1 einen Substituenten darstellt, der in α-Position zum Pyran-Ring ein quartäres C-Atom aufweist, wobei die Substituenten R1 und R2 auch ein aliphatisches bzw. substituiertes aliphatisches Ringsystem bilden können.
2. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt ist: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, Carbonsäurechloride, N Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder Iodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruchstücke.
3. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)m- am eigentlichen Chromophor gebunden ist, wobei m Werte von 1 bis 18 annehmen kann.
4. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR8- auch eine Verbrückung über vier-, fünf und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich an dieser auch reaktive Gruppen befinden und die Substituenten A-G die gleiche Funktionalität wie die Substituenten R1-R14 besitzen können.
5. Laser-kompatible MR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR8- (n = 2) für
6. Laser-kompatible MR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR8- (n = 2) für
7. Laser-kompatible MR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR8- (n = 3) für
8. Laser-kompatible MR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR8- (n = 3) für
9. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten A-G die gleiche Gestalt wie die Substituenten R1 bis R14 annehmen können oder für O, S, C(CN)2 bzw. N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatischen Rest, wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2, stehen kann.
10. Laser-kompatible MR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent D für Cl, einen Alkyl-, Alkoxy-, Cycloalkoxy-, Phenolat, Alkylmercapto oder Phenylmercapto-Rest steht, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten entsprechend den Substituenten R1 bis R14 angebracht sind.
11. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R1 für 1,1-Dimethylethyl, 6,6-Dimethylbicyclo-[3,1,1]hept-2-en-2-yl, Bicyclo[2,2,1]-hept-2-en-5-yl, 3,3-Dimethylbut-1-en-1-yl oder Adamant-1-yl (-C10H15/­ Tricyclo[3.3.1.13,7]decyl) steht.
12. Laser- kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R5 für einfach oder doppelt alkyliertes Amin steht, wobei über den Aminostickstoff Alkylverbrückungen mit den Substituenten R4 und R6 möglich sind.
13. Laserkompatible NIR-Farbstoffe gemäß den Ansprüchen 1, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß der ω-(Benz[b]pyran-4-yliden)alk-1-enyl)-Teil der Farbstoffe folgende Struktur Ia, Ib, Ic oder Id besitzt
wobei der Substituent R15 die gleichen Funktionalitäten wie die Substituenten R1 bis R14 besitzen kann.
14. Einen Laser-kompatiblen Markerfarbstoff gemäß den Ansprüchen 1, 11, 12 und 13, dergestalt daß
  • a) R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 gleich H, R1 gleich 1,1-Dimethylethyl, R5 gleich N,N- Diethylamino, n = 1, Z gleich IIa mit R10, R11, R13 gleich H, R12 gleich SO3 - und R14 gleich 5-Carboxypent-1-yl, namentlich 1-(5-Carboxypent-1-yl)-3,3-dimethyl-2-[3- (7-N,N-diethylamino-2-(1,1-dimethylethyl)-4H-benzopyran-4-yliden)-1-propen-1- yl]-3H-indolium-5-sulfonat (OB11)
  • b) R2, R3, R7, R8, R9 gleich H, R4, R5, R6 zusammen einen Julolidin-Ring bilden, R1 gleich 1,1-Dimethylethyl, n = 1, Z gleich gleich IIa mit R10, R11, R13 gleich H, R12 gleich SO3 - und R14 gleich 5-Carboxypent-1-yl, namentlich 1-(5-Carboxypentyl)-3,3- dimethyl-2-[3-(11-(2,2-dimethylethyl)-1H,2H,3H,5H,6H,7H-pyrano[2,3-f]pyrido [3,2,1-ij]chinolin-9-yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat (OB15)
  • c) R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 gleich H, R1 gleich 1,1-Dimethylethyl, R5 gleich N,N- Diethylamino, n = 1, Z gleich IIc mit R10, R11 gleich H, R12 und R13 zusammen einen ankondensierten Ring der Struktur CH=C(SO3 -)-CH=CH bilden und R14 gleich 5- Carboxypent-1-yl, namentlich 1-(5-Carboxypent-1-yl)-4-[3-(7-N,N-diethylamino-2- (1,1-dimethylethyl)-4H-benzopyran-4-yliden)-1-propen-1-yl]-chinolinium-6-sulfonat (OB20)
  • d) R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 gleich H, R1 gleich 1,1-Dimethylethyl, R5 gleich N,N- Diethylamino, n = 1, Z gleich IIc mit R10, R11 gleich H, R12 und R13 zusammen einen ankondensierten Ring der Struktur CH=CH-CH=CH bilden und R14 gleich 3- Hydroxyprop-1-yl, namentlich 1-(3-Hydroxyprop-1-yl)-4-[3-(7-N,N-diethylamino- 2-(1,1-dimethylethyl)-4H-benzopyran-4-yliden)-1-propen-1-yl]-chinolinium- Perchlorat (OB14).
15. Verwendung der substituierten Pyran-Derivate der allgemeinen Formel I als Farbstoffe zur optischen Markierung von Proteinen, Nucleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch-Durchsatz-Screenings.
16. System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nucleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 14 kovalent an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion der zu bestimmenden Substanzen gekoppelt werden.
17. System nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsreaktion in wäßriger Lösung durchgeführt wird.
18. System nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalent gekoppelte Verbindung fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
DE2000125820 2000-05-23 2000-05-23 Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen Expired - Fee Related DE10025820C2 (de)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2000125820 DE10025820C2 (de) 2000-05-23 2000-05-23 Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen
CA2380272A CA2380272C (en) 2000-05-23 2001-05-22 Stable near-infrared (nir) marker dyes based on benzopyrylium-polymethines
US10/031,741 US6750346B2 (en) 2000-05-23 2001-05-22 Stable near-infrared (NIR) marker dyes based on benzopyrylium-polymethines
JP2001587056A JP2003534435A (ja) 2000-05-23 2001-05-22 ベンゾピリリウム・ポリメチンに基づく安定したｎｉｒマーカー色素
BR0106715-0A BR0106715A (pt) 2000-05-23 2001-05-22 Corantes marcadores nir estáveis na base de polimetinas de benzopirilio
PCT/DE2001/001946 WO2001090253A1 (de) 2000-05-23 2001-05-22 Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen
DE50107913T DE50107913D1 (de) 2000-05-23 2001-05-22 Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen
AU65811/01A AU6581101A (en) 2000-05-23 2001-05-22 Stable near-infrared (nir) marker dyes based on benzopyrylium-polymethines
EP01943135A EP1283855B1 (de) 2000-05-23 2001-05-22 Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen
AT01943135T ATE308589T1 (de) 2000-05-23 2001-05-22 Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2000125820 DE10025820C2 (de) 2000-05-23 2000-05-23 Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE10025820A1 DE10025820A1 (de) 2001-12-06
DE10025820C2 true DE10025820C2 (de) 2003-06-26

Family

ID=7643472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2000125820 Expired - Fee Related DE10025820C2 (de) 2000-05-23 2000-05-23 Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE10025820C2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10258150A1 (de) * 2002-12-10 2004-07-08 Dyomics Gmbh Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen
DE102005004745A1 (de) * 2005-01-31 2006-08-10 Dyomics Gmbh Verfahren zu Nachweis und Quantifizierung von Proteinen

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE410487C (de) * 1922-06-04 1925-03-10 Farbenfab Vorm Bayer F & Co Verfahren zur Darstellung von Polymethinfarbstoffen
US5262549A (en) * 1991-05-30 1993-11-16 Polaroid Corporation Benzpyrylium dyes, and processes for their preparation and use
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
DE69307585T2 (de) * 1992-04-27 1997-06-26 Minnesota Mining & Mfg Thermische Übertragungsmaterialien
US5800995A (en) * 1984-03-29 1998-09-01 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE410487C (de) * 1922-06-04 1925-03-10 Farbenfab Vorm Bayer F & Co Verfahren zur Darstellung von Polymethinfarbstoffen
US5800995A (en) * 1984-03-29 1998-09-01 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5569766A (en) * 1986-04-18 1996-10-29 Carnegie Mellon University Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5262549A (en) * 1991-05-30 1993-11-16 Polaroid Corporation Benzpyrylium dyes, and processes for their preparation and use
DE69307585T2 (de) * 1992-04-27 1997-06-26 Minnesota Mining & Mfg Thermische Übertragungsmaterialien

Also Published As

Publication number Publication date
DE10025820A1 (de) 2001-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1283855B1 (de) Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen
US7598385B2 (en) Asymmetric cyanine fluorescent dyes
DE10080558B4 (de) Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe
EP1318177B1 (de) Verbindung, insbesondere Marker-Farbstoff, auf der Basis von Polymethinen
DE10258150A1 (de) Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen
DE19937024A1 (de) Verwendung von Acylsulfonamido substituierten Polymethin-Farbstoffen als Fluoreszenz-Farbstoffe und/oder Marker
EP1173519B1 (de) Neue carbopyronin-fluoreszenz-farbstoffe
EP1535969B1 (de) Neue Polymethinfarbstoffe auf Cumarin-Basis mit einstellbarem Stoke&#39;s-Shift
EP1273584B1 (de) Verbindungen auf der Basis von 2-bzw. 4-Chromenyliden-Merocyaninen und ihre Verwendung
DE10025820C2 (de) Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen
WO2002020670A1 (de) Oxazinderivate
EP1272566B1 (de) Cyaninfarbstoffe als fluoreszenzmarker
DE102013114848A1 (de) Markerfarbstoffe für UV- und kurzwellige Anregung mit hohem Stokes Shift auf der Basis von Benzoxazolen
WO2000034394A2 (de) Pyridin- und chinolin-farbstoffe als marker für biomoleküle, polymere, arzneistoffe und partikel
DE10159078A1 (de) Neue Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen
DE102012205807A1 (de) Cyanin-Farbstoffe
DE19856152A1 (de) Pyridin- und Chinolinfarbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere und Arzneistoffe
DE102020109362A1 (de) Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem Stokes Shift auf der Basis von verbrückten Benzopyryliumsalzen
CN104610773A (zh) 一种荧光染料化合物及其制备方法和应用
DE19954934A1 (de) Verfahren zur Solubilisierung von optischen Markern
JPH06313118A (ja) 標識色素及び標識色素の中間物
DE19812020A1 (de) Reaktive, diodenlaser-kompatible Tandem-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle und Arzneistoffe
JPH06313116A (ja) 標識色素及び標識色素の中間物
JPH06313117A (ja) 標識色素及び標識色素の中間物

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8304 Grant after examination procedure
8364 No opposition during term of opposition
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20121201