DE10159078A1

DE10159078A1 - Neue Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen

Info

Publication number: DE10159078A1
Application number: DE2001159078
Authority: DE
Inventors: Mathis Hoffmann; Yaroslav Prostota; Nikolai N Romanov
Original assignee: Dyomics GmbH
Current assignee: Dyomics GmbH
Priority date: 2001-11-27
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2003-06-05

Abstract

Die Erfindung betrifft sogenannte Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren, beispielsweise in der Medizin, in der Pharmazie sowie in der Bio-, Material- und Umweltwissenschaft. DOLLAR A Aufgabe war es, Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder NIR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers, zur Fluoreszenz angeregt werden können.

Description

Die Erfindung betrifft Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies. Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben sowie anderes mehr.
Polymethine sind als Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.- Rev. 1992, 92, 1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π- Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im roten und nahem infraroten (NIR)-Bereich. Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX- Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzähler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik, als Licht-Absorber in beschreibbaren CD's und nicht zuletzt als Biomarker ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, 5.; Resch-Genger, U.; Wollbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - DordrechtBoston/London - 1998).
Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin (DE 415 534) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (US-PS 5 627 027). Darüber hinaus wird das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin "Indocyaningreen" bzw. "Cardio Green" abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (US-PS 5 569 766).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder im nahen IR- Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers zur Fluoreszenz angeregt werden können.
Erfindungsgemäß werden Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen eingesetzt, die substituierte Heterocyclen der allgemeinen Formeln I oder II oder III

sind, wobei

- X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl, C(alkyl)₂ oder CH=CH steht,
- Y für ein Element aus der Gruppe O⁺, S⁺, Se⁺ oder das Strukturelement N⁺R¹ bzw. N⁺R⁹ steht,
- n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
- R¹-R⁹ gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei Reste, z. B. R¹ und R³ in II bzw. III oder R³ und R⁴ bzw. R⁶ und R⁷ zusammen einen weiteren aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring bilden können,
- mindestens einer der Substituenten R¹-R⁹ einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO₃ ^-, PO₃ ^2-, COO^- oder NR₃ ⁺, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
- mindestens einer der Substituenten R¹-R⁹ für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit Trägermolekülen ermöglicht.

Diese substituierten Heterocyclen der allgemeinen Formel I oder II oder III können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, Nukleotiden, Vitaminen, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymerer Trägermaterialien verwendet werden.
Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formeln I oder II oder III und dem zu markierenden Materialien erfolgen.
Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH₂- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, Nukleotiden, Vitaminen, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren. Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formeln I oder II oder III und davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Biochips).
Durch "molecular engineering" ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptions- und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen.
Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Verfügung gestellt werden kann.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in den Formel dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Ausführungsbeispiel 1

Ausführungsbeispiel 2

Ausführungsbeispiel 3

Ausführungsbeispiel 4

Ausführungsbeispiel 5

Ausführungsbeispiel 6

Ausführungsbeispiel 7

Ausführungsbeispiel 8

Ausführungsbeispiel 9

Ausführungsbeispiel 10

Claims

1. Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen der allgemeinen Formeln I oder II oder III

wobei

- X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)₂ steht,

- Y für ein Element aus der Gruppe O⁺, S⁺, Se⁺ oder das Strukturelement N⁺R¹ bzw. N⁺R⁹ steht,

- n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,

- R¹-R⁹ gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei Reste, z. B. R¹ und R³ in II bzw. III oder R³ und R⁴ bzw. R⁶ und R⁷ zusammen einen weiteren aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring bilden können,

- mindestens einer der Substituenten R¹-R⁹ einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO₃ ^-, PO₃ ^2-, COO^-, oder NR₃ ⁺, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt, und

- mindestens einer der Substituenten R¹-R⁹ für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit Trägermolekülen ermöglicht, wobei diese Substituenten auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann.

2. Fluorophore gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere der Substituenten R¹-R¹⁴ solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO₃ ^-, PO₃ ^2-, COO^-, O^-, NR₃ ⁺, Cyclodextrin oder Zucker darstellen können, die die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, möglicherweise zyklische Spacergruppe am eigentlichen Chromophor angebunden sein können.

3. Fluorophore gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Substituenten R¹-R⁹ für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit steht, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, möglicherweise zyklische Spacergruppe am eigentlichen Grundchromophor angebunden sein kann.

4. Fluorophore gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatische oder heteroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH₂)_a-Y'-(CH₂)_b]_c-, worin Y' gleich oder verschieden eine CR₂-, O-, S-, SO₂, SO₂NH-, NR-, COO- oder CONR- Funktion sein kann, wobei R die Funktionen von R¹-R⁹ einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen, besteht.

5. Fluorophore gemäß den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß n für die Zahlenwerte 0, 1, 2 oder 3 steht, wobei die für n = 2 oder 3 jeweilig doppelt oder dreifach vorkommenden Substituenten R⁵ und R⁶ gleich oder unterschiedlich sein können.

6. Verwendung der substituierten Polymethin-Derivate der allgemeinen Formel I, II und III als Farbstoffe zur optischen Markierung von Proteinen, Nukleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Mono-, Oligo- und Polysacchariden, Liganden, Rezeptoren, Vitaminen, Nukleotiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln.

7. Systeme zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nukleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 6 kovalent an eine HO-, H₂N- oder HS-Funktion der zu bestimmenden Substanzen gekoppelt werden.

8. System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsreaktion in organischen oder wässrigen Lösungen durchgeführt werden.

9. System nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalent gekoppelte Verbindung fluoreszierende Eigenschaften aufweist.

10. Verwendung der Verbindungen und Systeme nach Anspruch 1 bis 9 in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahren und im Hoch-Durchsatz-Screening.

11. Verwendung der in den Ansprüchen 1 bis 9 aufgeführten Verbindungen und Systeme zur Analyse von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen auf einem Mikroarray.