DE19940394C2

DE19940394C2 - Fluorochrome und deren Verwendung

Info

Publication number: DE19940394C2
Application number: DE1999140394
Authority: DE
Inventors: Lutz Haalck; Erik Gedig; Andreas Katerkamp
Original assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Current assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2002-03-21
Anticipated expiration: 2019-08-26
Also published as: DE19940394A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Fluorochrome auf der Basis aktivierter 4,4' Cyanine und deren Verwendung als Makromolekül.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Fluorochrome auf der Basis aktivierter 4,4'Cyanine und deren Verwendung als Mar kermolekül.

Fluoreszenzfarbstoffe werden in zunehmenden Maße als Markermoleküle für anlaytische Anwendungen genutzt. Sie werden erfolgreich zur Markierung von Enzymen, Antikörpern und Nukleinsäuren zum Einsatz in Immunoassays, der Fluoreszenzmikroskopie und zur Sequenzierung eingesetzt. Traditionell werden Fluorochrome eingesetzt, die im UV oder im sichtbaren Bereich angeregt werden. Ihre Anregungs- und Emissionsspektren überlappen jedoch mit der natür lichen Serumfluoreszenz, weshalb sie für die Analytik natürlicher Proben (z. B. Blut- und Serumsproben) nicht immer geeignet sind. Seit einigen Jahren werden daher, zunehmend Fluorochrome mit Anregungswellenlängen im nahen infra roten Bereich des Lichtspektrums verwendet, die eine Messung biologischer Proben mit geringer Hintergrundfluores zenz bei gleichzeitig gesteigerter Sensitivität ermöglichen. Als NIR-Fluorochrome bezeichnet man Farbstoffe, die durch Licht mit einer Wellenlänge von 600-1000 nm angeregt werden. Typischerweise besitzen NIR-Farbstoffe hohe molare Extinktionskoeffizienten und überdurchschnittliche Quantenausbeuten. Der Stokes Shift beträgt in der Regel mindestens 15 nm. Eine breite Anwendung dieser Farbstoffe, vor allem in der Sensorentwicklung, wurde durch die Entwicklung ko stengünstiger langwellig emittierender Laserdioden im Wellenlängenbereich von 670 bis 830 nm möglich.

Die kommerziell verwendeten NIR-Farbstoffe gehören chemisch überwiegend der Gruppe der Oxazine, Squaraine, Rhodamine und Cyanomethine an, wobei letztgenannte Farbstoffe am weitesten verbreitet sind. Da die Farbstoffe in Membranen, Folien, Lacken usw. zur Anwendung kamen, sind sie in der Regel nicht oder kaum wasserlöslich.

Im US-Patent 5,268,486 wird erstmals der Einsatz reaktiver und wasserlöslicher NIR-Fluorochrome zur Kopplung an Biomoleküle beschrieben. Dazu werden chemische Gruppen, vorzugsweise als N-Substituent, eingeführt, die zur Kopp lung mit reaktiven Aminosäureseitengruppen, z. B. Amino-, Thio-, Carbonyl-, oder Hydroxyfunktionen geeignet sind. Dazu gehören u. a. Isothiocyanante, Thiocyanante, Hydrazine, Hydroxysuccinimidester, Disulfide usw. Dieses Prinzip wurde in jüngster Zeit erweitert und umfaßt neben symmetrischen Cyolnomethinfarbstoffen (2,2'Indocyaninen) auch die strukturell verwandten Merocyanine und Styrylfarbstoffe. Neben den reaktiven, zur kovalenten Kopplung an Biomole küle gedachten Fluorochrome, werden auch adsorbtive Fluoreszenzmarker eingesetzt, die durch gezielt eingestellte Per meabilität zur Färbung bestimmter Zellkompartimente, DNA, RNA usw. dienen. Parallel zu dem in den letzten Jahren sprunghaft gestiegenen Bedarf an DNA-Sequenatoren mit optischer Auswertung, wurden eine Fülle von Fluorochrome speziell für die DNA und Nukleinsäureanalytik entwickelt.

Ein wichtiger Parameter zur Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen ist die Quantenausbeute, die als ein Maß für das Verhältnis von emittierten zu absorbierten Licht angesehen werden kann. Eine Quantenausbeute von Φ = 1, ent spricht einer 100%igen Umwandlung von absorbierten in emittiertes Licht. Das Maß für die Lichtabsorption ist der mo lare Extinktionskoeffizient ε. Nur wenn beide Parameter eine ausreichende Größe besitzen, d. h. Φ, < 0,2 und ε < 50000 (L/M × cm), sind NIR-Fluorochrome als Fluoreszenzmarker geeignet.

Viele Farbstoffe neigen zu strahlungslosen Deaktivierungen die dadurch entstehen können, daß nach der Lichtanre gung Molekülteile, z. B. Donor und Akzeptor in eine um 90° verdrehte Form gebracht werden. Diese strukturelle Anord nung wird als "Twisted Intramolecular Charge Transfer", kurz TICT bezeichnet und ermöglicht so nichtradiative Pro zesse, die die Empfindlichkeit des Fluorophors erheblich reduzieren können.

Darüber hinaus kommt es zu durch Dimerisierung oder Aggregation der Fluorochrome zu einem hypsochromen Ef fekt, d. h. zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximas in den kurzwelligen Bereich des Spektrums. Dieses Phäno men tritt sowohl in Lösung, z. B. in Gegenwart von geringen Salzgehalten, aber auch bei ein Protein gebundenen Fluorophoren auf. Besonders empfindlich sind Farbstoffe ohne zusätzliche hydro phile Gruppen, aber auch aminosubstituierte Cyanin farbstoffe.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Fluorochrome vorzuschlagen, die eine hohe Quantenausbeute aufweisen und die gleichzeitig wasserlöslich und reaktiv sind, um somit ein großes Einsatzspektrum zu ermöglichen.

Die Erfindung wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruches 1 gelöst. Die Verwendung der Fluorochrome ist im Anspruch 18 angegeben. Die Unter ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß werden somit Fluorochrome vorgeschla gen, die auf einer Grundstruktur von 4,4'Cyaninfarb stoffen beruhen. Das erfindungsgemäße Fluorochrom weist dabei folgendes Grundgerüst auf:

Durch die Verwendung von 4,4'Cyaninfarbstoffen werden 4 der 6 oder 7 Elektronenpaare des mesomeren Systems in der Ringstruktur stabilisiert. Dies sind 60-67% der freien Elektronen, im Gegensatz zu 33-40% bei den bisher beschriebenen 2,2'Cyaninen. Dadurch wird eine wichtige Stabilisierung für den Einsatz dieser Farbstoffe in der fluoreszenzoptischen Analytik wäßriger Systeme erreicht, die durch Komple xierung oder Einführung von Ringsystemen (Formeln IV und V) noch gesteigert werden kann.

In der allgemeinen Formel I ist -Z- gleich

mit n = 0, 1, 2 oder 3, oder

mit m gleich 1, 2, 3 oder 4 oder

In der allgemeinen Formel I ist jeder Rest R1, -R4 unabhängig voneinander Wasserstoff (H), eine Alkylgruppe mit 1-10 Kohlenstoffatomen,
eine Alkoxy-Gruppe mit 1-10 Kohlenstoffatomen,
eine Trifluormethylgruppe, ein Halogenatom,
eine Sulfonsäuregruppe und/oder eine Sulfonatgruppe;
mit dem Maßgabe, daß einer der Reste R₂ und/oder R₄ eine reaktive R_x-Gruppe ist.

Der Rest R_x ist ausgewählt aus der Gruppe der Carbon säuren, aktivierten Ester, Acylazide, Acylhalogenide, Acylnitrile, Aldehyde, Anhydride, Arylamide, Alkylha logenide, Aniline, Alkylsulfonate, Arylhalogenide, Thiole, Azide, Aziridine, Borate, Carbodiimide, Dia zoalkane, Epoxide, Glycerole, Haloacetamine, Halo triazine, Hydrazine, Hydroxylamine, Imidoester, Isocyanate, Isothiocyanate, Maleimide, Phosphoramidi te, Silylhalogene, Sulfonsäureester und Sulfonsäu rechloride.

R_x ist eine reaktive Gruppe, die an den Farbstoff über eine kovalente Bindung ankoppelbar ist. Die reaktive Gruppe R_x, und die funktionelle Gruppe eines biologischen oder nicht biologischen Zielmoleküls M reagieren unter Ausbildung einer oder mehrerer kova lenten Bindung zu einem Komplex(Konjugat) -M, wobei M vorzugsweise aus der Gruppe Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstrate, Hormone, Lymphokine, Metabo lite, Rezeptoren, Antigene, Haptene, Lectine, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, derivati sierte Nukleinsäuren, derivatisierte Desoxyribonu kleinsäuren, DANN-Fragmente, RNA-Fragmente, Arznei mittel, Viruspartikel, Viruskomponenten, Hefen, Hefekomponenten, Bakterien, Bakterienkomponenten, Blutzellen, Blutzellenkomponenten, biologische Zellen, nichtzelluläre Blutkomponenten, Gifte, Polymere, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasober flächen, Kunststoffoberflächen, Kunststoffteilchen, Polymermembran, Metalle, Leiter oder Halbleiter ausgewählt ist.

Mindestens einer der Reste R₁-R₅, vorzugsweise R₂ oder R₄ enthalten eine hydrophile Gruppierung zur Erhö hung der Wasserlöslichkeit, vorzugsweise Carbon säuren, Kohlenhydrate, Sulfonsäuren, Sulfonate, Amine, Halogene, Polyole oder Polyäther.

Bevorzugt können die Reste R₁ und/oder R₃ zusammen genommen mit anderen Resten R₁ bzw. R₃, aliphatische und/oder aromatische Ringe 5 und 6-gliedrige Ringe bilden.

Die erfindungsgemäßen Fluorochrome zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie wasserlöslich und reaktiv sind und eine hohe Quantenausbeute aufweisen und so ausgezeichnet als Fluoreszenzfarbstoff, insbe sondere als NIR-Fluoreszenzfarbstoff zur Kopplung von Biomolekülen in Bioassays geeignet sind. Die analy tischen Verfahren umfassen alle Methoden, bei denen Biomoleküle mit Hilfe fluoreszenzoptischer Methoden detektiert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform sind Fluoreszenzimmunotests, wobei verschiedenste be kannte biochemische Assays von allgemeinen Rezeptor- Ligand Systemen, wie z. B. Antikörper-Antigen, Lectin- Kohlenhydrat, DNA oder RNA-komplementäre Nukleinsäu ren, DNA oder RNA-Protein, Hormonrezeptor, Enzym- Enzymcofaktoren, Protein G oder Protein A- Immunglobulin oder Avidin-Biotin zugrunde gelegt werden.

In Tabelle 1 ist eine Übersicht enthalten über mögli che Herstellungen von Farbstoffkonjungaten mit kova lenten Bindungen.

Beispiele für den Rest R_x, sind:
aktivierte Carbonsäuren

mit n, m, p = 1-8
Carbodiimide

Anhydride

Carbonsäureazide

mit n = 1-8
Kopplung von Nukleophilen über Epoxide

Isothiocyanate

mit n = 1-8
Isocyanate

mit n = 1-8
Aziridine

Maleimide

Pyridyl-disulfid aktivierte Gruppen

Halodi- und triazine

mit W = Chlor oder Brom
Vinylsulfone

Acylimidazole

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Herstellungsbeispieles für ein erfindungsgemäßes Fluorochrom und durch konkrete Strukturbeispiele die in den Fig. 1 bis 13 angegeben sind, näher erläutert.

Beispiel

Herstellung von 4-{3'-[1"-(ε-Carboxypentynyl-N-hydroxy-succinimidyl}-6"-sulfochinolin-4"-yliden)-1'-3'-propio dien-1'yl)-1-(ε-Carboxypentynyl-N-hydroxy-succinimidyl)-chinolin-6-sulfonat.

Die Herstellung erfolgt in vier Schritten. In einem ersten Schritt wird Sulfanilsäure mit 2-Keto-3-propen umgesetzt. Analog der Skraup'schen Chinolinsynthese erhält man dann 4-Methyl-6-Sulfonylchinolin. Dieses 4-Methyl-6-Sulfonyl chinolin dient dann als Schlüsselbaustein für die weitere Synthese.

1. Schritt

2. Schritt

3. Schritt

4. Schritt

Tabelle 1

Beispiele zur Herstellung von Farbstoffkonjugaten mit kovalenten Bindungen

Claims

1. Fluorochrom der allgemeinen Formel I, worin

a) die Reste R₁ bis R₄ ausgewählt sind aus der Gruppe
H, Alkyl (C₁-C₁₀), Alkoxy (C₁-C₁₀), Trifluorme thyl, Halogen, Sulfonsäure und/oder Sulfonat, wobei zwei Reste R₁ und/oder zwei Reste R₃ aliphatische und/oder aromatische Ringe bil den können und
b) mindestens einer der Reste R₂ und R₄ eine re aktive Gruppe R_x ist ausgewählt aus der Grup pe der
Carbonsäuren, aktivierten Ester, Acylazide, Acylhalogenide, Acylnitrile, Aldehyde, Anhy dride, Arylamide, Alkylhalogenide, Aniline, Alkylsulfonate, Arylhalogenide, Thiole, Azi de, Aziridine, Borate, Carbodiimide, Diazoal kane, Epoxide, Glycerole, Haloacetamine, Ha lotriazine, Hydrazine, Hydroxylamine, Imi doester, Isocyanate, Isothiocyanate, Maleimide, Phosphoramidite, Silylhalogene, Sulfon säureester und Sulfonsäurechloride und
c) wobei an R_x ein Molekül M ausgewählt aus der Gruppe
Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstra te, Hormone, Lymphokine, Metabolite, Rezepto ren, Antigene, Haptene, Lecitine, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysacchari de, Nukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, derivatisierte Desoxyribonukleinsäuren, deri vatisierte Nukleinsäuren, DNA-Fragmente, RNA- Fragmente, Arzneimittel, Viruspartikel, Vi ruskomponenten, Hefen, Hefekomponenten, Bak terien, Bakterienkomponenten, Blutzellen, Blutzellenkomponenten, biologische Zellen, nichtzelluläre Blutkomponenten, Gifte, Poly mere, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glas oberflächen, Kunststoffoberflächen, Kunst stoffteilchen, Polymermembranen, Metalle, Leiter und/oder Halbleiter
ankoppelbar ist und
d) worin -Z- eine Verbindung der
allgemeinen Formel II
mit n = 0, 1, 2 oder 3 oder der
allgemeinen Formel III
oder der allgemeinen Formel IV
mit m = 1, 2, 3 oder 4 oder der
allgemeinen Formel V
ist, wobei der Rest R₅ wie bei den Resten R₁ bis R₄ angegeben definiert ist und
e) mindestens einer der Reste R₁ bis R₅ hydrophil ist.

2. Fluorochrom nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Reste R₁ und/oder zwei Reste R₃ fünf- oder sechsgliedrige aliphatische oder aromatische Ringe bilden.

3. Fluorochrom nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die hydrophile Gruppierung ausgewählt ist aus Carbonsäuren, Kohlenhydraten, Sufonsäuren, Sulfonaten, Aminen, Halogenen, Po lyolen und/oder Polyethern.

4. Fluorochrom nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Carbonsäuren ausgewählt sind aus mono-, bi- und multifunktionellen aliphati schen Carbonsäuren mit einer Kohlenstoffkette bis zu 10 Atomen, und die Kohlenhydrate ausge wählt aus der Gruppe der Monosaccharide wie Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen oder Hepto sen, Disaccharide wie Saccharose, Lactose, Tre halose oder Maltose, Oligosaccharide wie Cyclo dextrine oder Raffinose und Polysaccharide wie Dextrane oder Chitosane, einschließlich aller 0- und N-glykosidischen Modifikationen und Kombina tionen hiervon.

5. Fluorochrom nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ge kennzeichnet durch eine Verbindung der nachfol genden Formel VI
worin NHS = N-Hydroxysuccinimid ist.

6. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel VII

7. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel VIII

8. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel IX

9. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel X

10. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XI

11. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XII

12. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XIII

13. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XIV

14. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XV

15. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XVI

16. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XVII

17. Fluorochrom nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet, durch eine Verbindung der allgemeinen Formel XVIII

18. Verwendung der Fluorochrome nach mindestens ei nem der Ansprüche 1 bis 17 als Fluoreszenzfarb stoff zur Kopplung an biologisch oder nicht bio logische Zielmoleküle die in analytischen Ver fahren eingesetzt werden.