DE60112585T2

DE60112585T2 - Farbstoffe und Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäure in unreifen roten Blutzellen

Info

Publication number: DE60112585T2
Application number: DE60112585T
Authority: DE
Inventors: Chiranjit Deka; Y. Song LEE; G.-Y. Gene SHEN; Stephen Szydlo; Tsong-Tseh Tsay; Ravinder Gupta
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-05-05
Also published as: JP4831914B2; EP1303751A4; JP2003532790A; EP1303751A1; US20020037589A1; EP1303751B1; DE60112585D1; US6551831B2; WO2001086264A1; US6368864B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet von neuen Farbstoffen, Farbstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in roten Blutzellen mittels Durchflusszytometrie durch Anwenden von fluoreszierenden, Nukleinsäure bindenden Farbstoffen. Insbesondere stellt diese Erfindung ein Reagenz und Verfahren zur Zählung von Reticulozyten und kernhaltigen roten Blutzellen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Die Analyse roter Blutzellen und das Zählen von unreifen Subpopulationen davon sind wertvolle Bestandteile der diagnostischen Hämatologie. Beispielsweise ist das Zählen von Reticulozyten, d.h. den unreifen Erythrozyten, in humanem peripherem Blut bei der Diagnose von Hämorrhagie, Anämie, Verfolgen von Knochenmarkstransplantation und zur Beobachtung von Patienten, die eine Chemotherapie erhalten haben, und bei anderen Störungen, die Blutzellenerzeugung einbeziehen, nützlich [US-Patent Nr. 5 360 739; H. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3. Ausgabe, 1995; Wiley-Liss, New York; Davis et al., (1990) Pathobiol., 58: 99–106; Hoy (1990) Bailliere's Clin. Haemat., 3: 977–988; H. J. Tanke, Reticulozyten and Mature Erythrocytes in Flow Cytometry in Haematology (1992) Academic Press Ltd., Seiten 75–93]. Weil Reticulozyten Ribonukleinsäure (RNA) enthalten, fluoreszieren diese Zellen, falls mit an RNA bindenden, anregbaren Farbstoffen angefärbt, wenn sie durch eine Lichtquelle geeigneter Wellenlänge bestrahlt werden. RNA-bindende Farbstoffe wur den zum Unterscheiden von Reticulozyten von reifen roten Blutzellen (RBCs), denen RNA fehlt, verwendet.
Die Verteilung von Fluoreszenzintensitäten einer relativ großen Reticulozytenpopulation kann durch Durchflusszytometrie in einer schnellen und verlässlichen Weise bestimmt werden, und verschiedene Reifungsstadien von Reticulozyten, wie reflektiert durch Unterschiede im RNA-Gehalt, können unterschieden werden.
Die Anwendung von rot-anregbaren Farbstoffen ist erwünscht, weil solche Farbstoffe durch Anregung mit relativ kostengünstigen Dioden- oder HeNe-Lasern nachgewiesen werden können. Jedoch anfängliche Bemühungen im Stand der Technik, Diodenlaser und rot-angeregte Farbstoffe in schnellen Durchflusszytometrieanalysen von Reticulozyten anzuwenden, waren nicht erfolgreich. Yamamoto, US-Patent Nr. 5 563 070, schlug vor, dass der Zusatz von großen Mengen TO-PRO-3, ein rotanregbarer Farbstoff, gefolgt von einer Inkubation von 30 Minuten, RNA innerhalb lebender Reticulozyten anfärbt. Ein solches Verfahren ist jedoch zur Routineanalyse von Reticulozyten in klinischen Laboratorien nicht praktikabel, welche einen hohen Probendurchsatz erfordern, weil die Probenherstellungszeit lang ist und die Kosten pro Test hoch sind, auf Grund der großen Menge an zur Anfärbung von jeder Probe erforderlichem Farbstoff.
Ein rot-anregbarer Farbstoff, genannt Thiazolblau (TB), wurde in US-Patent 4 957 870 beschrieben. Jedoch, wie in diesem Patent beschrieben (US-Patent 4 957 870), erfordert dieser Farbstoff auch lange Inkubationszeiträume von etwa 30 Minuten.
Akai et al., US-Patent Nr. 5 821 127 haben auch die Herstellung von fluoreszierenden Farbstoffen beschrieben, die Reticulozyten, unter Anwendung von kostengünstigen Detektoren über Fluoreszenz im roten Bereich nachweisen können. Jedoch erfordern die Proben Inkubation bei erhöhten Temperaturen von etwa 40°C.
Vor kurzem beschrieb US-Patent Nr. 5 994 138 das Anfärben von Reticulozyten über die Anwendung eines rot-anregbaren Farbstoffs in Kombination mit einem Detergenz und einem Ionophor bei erhöhten Temperaturen von etwa 35°C. Jedoch war das Anfärben von Reticulozyten nicht erfolgreich, wenn Umgebungstemperaturen angewendet wurden.
Fan et. al ( US 5 411 891 , US 5 360 739 ) beschreiben deutlich, dass die spezifische Bindungskonstante zwischen einem Farbstoff und Reticulozyten-RNA und der Penetrationsgeschwindigkeit des Farbstoffs für jeden Farbstoff verschieden ist, und dass es unmöglich ist, vorherzusagen, unter welchen Bedingungen ein teilchenförmiger Farbstoff schnell rote Zellmembran durchdringen und Reticulozyten anfärben kann. Dies wurde weiter gestützt von Akai et. al ( US 5 821 127 ).
Somit gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für Farbstoffe, Zusammensetzungen und Verfahren, die schnelles Anfärben von intrazellulärer RNA bei Raumtemperaturen über die Anwendung von Farbstoffen ermöglichen, die in dem roten Bereich anregbar sind und kostengünstige und leicht zugängliche Rot-Illuminierungsgeräte anwenden können. Zusätzlich gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für Farbstoffzusammensetzungen und Verfahren, die nicht nur für rot-anregbare Farbstoffe anwendbar sind, sondern auch für Farbstoffe, die bei anderen Wellenlängen anregbar sind, wie bei der blauen Wellenlänge. Hierdurch kann, einfache und genaue Bestimmung von Reticulozyten ohne besondere Einschränkung der Anregungswelle bewirkt werden.
Zusätzlich zu den Reticulozyten sind ein weiterer Typ von unreifen roten Blutzellen, die in klinischen Diagnostika wichtig sind, die kernhaltigen roten Blutzellen (NRBCs). Im Gegensatz zu Reticulozyten enthalten NRBCs DNA. NRBCs treten normalerweise in dem Knochenmark auf, jedoch nicht in peripherem Blut. Aber bei bestimmten Erkrankungen, wie Anämie und Leukämie, treten NRBCs auch in peripherem Blut auf. Deshalb ist es von klinischer Wichtigkeit, NRBC zu messen. Da NRBCs DNA enthalten, kann Fluoreszenznachweis und Zählung von NRBCs durch Anfärben dieser Zellen mit Farbstoffen, die DNA erkennen, möglich sein. Somit gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für Farbstoffe, und Zusammensetzungen, die das Anfärben von sowohl intrazellulärer DNA als auch RNA ermöglichen, sodass sowohl NRBCs als auch Reticulozyten über die Anwendung des gleichen Farbstoffs unter Anwenden von verschiedenen Verfahren gezählt werden können.
Kurzdarstellung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung drei Gruppen von neuen Farbstoffen bereit, die als Gruppe I, Gruppe II und Gruppe III angegeben werden, mit: Gruppe I mit der allgemeinen Formel von:
wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R₁ H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R₂ CH₂(CH₂)_mOH ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist, R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OH, eine Alkyl-, Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist; und B^– ein Gegenanion ist.
Gruppe II mit der allgemeinen Formel von:
wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOAc ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OAc, eine Alkyl-, eine Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist und B^– ein Gegenanion darstellt;
und
Gruppe III mit der nachstehenden allgemeinen Formel:
wobei n 0, 1 oder 2 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOH oder CH₃ ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; B^– ein Gegenanion ist, und R3, R4, R5, R6 verschiedene Substituenten, wie durch die Formeln für die speziellen Verbindungen Farbstoff-3 bis Farbstoff-6 wiedergegeben, sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Farbstoff der Erfindung und ein Lösungsmittel enthaltendes Reagenz bereit.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Erleichtern des schnellen Transports von Farbstoffmolekülen durch eine Zellmembran bereit. Solches schnelles Anfärben erfordert, dass eine Probe mit einer Farbstoffzusammensetzung der Erfindung in Gegenwart von mindestens einem grenzflächenaktiven Mittel und gegebenenfalls einer Sulfonsäure oder einem Salz davon in Kontakt gebracht wird.
Andere Aspekte und Vorteile dieser Erfindung werden aus der Beschreibung der Erfindung im Einzelnen besser deutlich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren der Farbstoffverbindung Nr. 6, beschrieben in Beispiel 1, anschließend ReticRed1 genannt, in PBS-Lösung, mit oder ohne in der Lösung vorliegende RNA.
1B ist der Vergleich der Fluoreszenzintensität der erfindungsgemäßen Farbstoffe und verschiedener anderer Farbstoffe, die während dieses Versuchs untersucht wurden, bezüglich der Fluoreszenzintensität eines kommerziellen Nukleinsäurefarbstoffs Syto 62 (Molecular Probes, Inc.), alle in Gegenwart der gleichen Menge RNA in der Lösung.
1C zeigt die Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe, ReticRed1 bis ReticRed6, dieser Erfindung, in Gegenwart von 8 mg/ml RNA, verglichen mit deren entsprechenden Fluoreszenzintensitäten, wenn es keine in der Lösung vorliegende RNA gibt.
2A und 2B zeigen die Fluoreszenz von Reticulozyten für eine anormale Blutprobe, die mit dem Farbstoff ReticRed1 in einer isotonischen Salzlösung ohne das Vorliegen der schnell anfärbenden Zusammensetzung behandelt wurden und für zwei verschiedene Zeiträume inkubiert wurden. 2A zeigt Fluoreszenz aus Zellen, die nur mit ReticRed1 behandelt und für etwa 10 Minuten inkubiert wurden: Gesamtzählung 42660, rote Zellen 32841, Reticulozyten 801, berechneter Retic-Prozentsatz 2,4%. 2B zeigt Fluoreszenz aus Zellen, die nur mit ReticRed1 behandelt und für etwa 40 Minuten inkubiert wurden: Gesamtzählung 46199, Rote Zellen 39713, Reticulozyten 2310, berechneter Retic-Prozentsatz 5,8%. Der Bezugswert für Reticulozyten in dieser Probe war ungefähr 7%.
3 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten in der Blutprobe von dem gleichen Donor, der in den in 2A und 2B beschriebenen Versuchen verwendet wurde, nach Behandeln mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die den Farbstoff ReticRed1 enthält und Inkubieren für etwa 1 Minute. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wird, war 7,3%.
4 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten in einer anormalen Blutprobe nach Behandeln mit einer Zusammensetzung der Erfindung, die den Farbstoff ReticRed1 enthält und Inkubieren für etwa 1 Minute. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wurde, war 7,5%. Der Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz, der für diesen Donor unter Anwendung eines unabhängigen Messverfahrens erhalten wurde, war 8%. Die Reagenzzusammensetzung in diesem Beispiel schloss Igepal, Dodecyl-β-D-maltosid und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat ein.
5 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten in der Blutprobe von einem normalen Donor, nach Behandeln mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die den Farbstoff ReticRed1 enthält, und Inkubieren für etwa 1 Minute. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wurde, war 0,82%. Die Reagenzzusammensetzung in diesem Beispiel schloss Igepal, Dodecyl-β-D-maltosid und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat ein. Der Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz, der für diesen Donor unter Verwendung einer unabhängigen Messung erhalten wurde, war 0,95%.
6 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten in einer anormalen Blutprobe nach Behandeln mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die den Farbstoff ReticRed1 enthielt, und Inkubieren für etwa 1 Minute. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wurde, war 13,7%. Der Bezugswert für Reticulozytenprozentsatz, der für diesen Donor unter Anwendung einer unabhängigen Messung erhalten wurde, war 13%. Die Reagenzzusammensetzung in dieser Ausführungsform schloss Igepal, Dodecyl-β-D-maltosid und Natrium-p-toluolsulfonat ein.
7 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten in einer anormalen Blutprobe nach Behandeln mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die den Farbstoff ReticRed3 enthielt, und ohne weitere Inkubation für etwa 1 Sekunde vermischt wurde. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wurde, war 13,8%. Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz, der für diese Probe durch ein herkömmliches Retic-Count^TM-Verfahren erhalten wurde, war ungefähr 13,3%. Die Reagenzzusammensetzung in dieser Ausführungsform schloss Igepal^®, Dodecyl-β-D-maltosid und Natrium-p-toluolsulfonat ein.
8 zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten für eine anormale Blutprobe nach Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die den Farbstoff ReticRed3 enthielt und ohne weitere Inkubation für etwa 1 Sekunde vermischt wurde. Der Prozentsatz an Reticulozyten, der durch dieses Verfahren gezählt wurde, war 1%. Ein unabhängiger Bezugswert für Reticulozytenprozentsatz, der für diese Probe durch ein herkömmliches Retic-Count^TM-Verfahren erhalten wurde, war ungefähr 1,3%. Die Reagenzzusammensetzung in dieser Ausführungsform schloss Igepal, Dodecyl-β-D-maltosid und Natrium-p-toluolsulfonat ein.
9A ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren des Farbstoffs Farbstoff-1, beschrieben in Beispiel 1B, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9B ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren des Farbstoffs Farbstoff-1, beschrieben in Beispiel 1B, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
9C ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren des Farbstoffs Farbstoff-2, beschrieben in Beispiel 1B, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9D ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren des Farbstoffs Farbstoff-2, beschrieben in Beispiel 1B, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
9E ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-3, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9F ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-3, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
9G ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-4, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9H ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-4, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
9I ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-5, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9J ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-5, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
9K ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-6, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne RNA, die in der Lösung vorliegt.
9L ist der Vergleich der Fluoreszenzspektren von Farbstoff-6, beschrieben in Beispiel 1C, in PBS-Lösung, mit oder ohne DNA, die in der Lösung vorliegt.
10A, 10B und 10C zeigen die Fluoreszenz von Reticulozyten für drei verschiedene Blutproben (eine normal, zwei anormal, stark retisch), welche mit dem Farbstoff Farbstoff-1 in einer isotonischen Salzlösung in Gegenwart einer schnell anfärbenden Zusammensetzung behandelt und anschließend sofort analysiert wurden. In diesen Beispielen schloss die zum Erleichtern des schnellen Anfärbens verwendete Reagenzzusammensetzung Igepal^® und Dodecyl-β-D-maltosid ein.
11A, 11B und 11C zeigen die Fluoreszenz von Reticulozyten für drei verschiedene Blutproben (eine normal, zwei anormal, stark retisch), welche mit dem Farbstoff Farbstoff-2 in einer isotonischen Salzlösung in Gegenwart einer schnell anfärbenden Zusammensetzung behandelt und anschließend sofort analysiert wurden. In diesen Beispielen schloss die zum Erleichtern des schnellen Anfärbens verwendete Reagenzzusammensetzung Igepal^® und Dodecyl-β-D-maltosid ein.
12A, 12B und 12C zeigen die Fluoreszenzhistogramme von roten Blutzellen, die verschiedene Reticulozytenzahlen enthalten. Für diese drei verschiedenen Blutproben (eine normal, zwei anormal, mit hohem Retic-Wert) wurde jede Probe mit dem Farbstoff-3 in einer isotonischen Salzlösung in Gegenwart einer schnell anfärbenden Zusammensetzung behandelt und an einem BECKMAN COULTER^TM XL^TM Durchflusszytometer anschließend sofort analysiert. In diesem Beispiel schloss die zum Erleichtern des schnellen Anfärbens verwendete Reagenzzusammensetzung das Detergenz Igepal und das grenzflächenaktive Mittel Dodecyl-β-D-maltosid ein.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Die vorliegende Erfindung stellt Farbstoffe zum Anfärben von Nukleinsäuren sowie Zusammensetzungen und Verfahren zum Erleichtern des schnellen Transports von Farbstoffen durch Zellmembranen zum Anfärben von Reticulozyten bereit. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Farbstoffe durch Aufzeigen von signifikant starker Fluoreszenz charakterisiert, wenn an Nukleinsäuren gebunden, als wenn ungebunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden geeignete Proben die Reticulozytenzellpopulationen zum Analysieren unter Verwendung der Farbstoffe, Zusammensetzungen und erfindungsgemäßen Verfahren enthalten, vorzugsweise aus Vollblut oder Blutproben, die durch bestimmte zusätzliche Verfahren vor dem Anfärben angereichert oder verarmt wurden, ausgewählt. Solche Anreicherungs- oder Verarmungsverfahren schließen unter anderem Zentrifugierung, Ficoll-unterstützte Schwerkrafttrennung oder magnetische Trennung ein.
Vorteilhafterweise erfordern die Farbstoffe, Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung keine Zellfixierung und sind deshalb besonders gut zur Verwendung in Analysen von metabolisch aktiven Zellen geeignet. Jedoch ist die Auswahl der Zellpopulation keine Begrenzung der vorliegenden Erfindung.
Wie vorstehend erörtert, sind nur einige Farbstoffe, die die Fähigkeit für Fluoreszenz in dem roten oder blauen Bereich aufweisen, für die Reticulozytenzählung geeignet. Diese Farbstoffe erfordern jedoch die Anwendung von erhöhten Temperaturen, was lange Inkubationszeiträume erfordert, große Mengen an nichtspezifischer Hintergrundfluoreszenz erzeugt und/oder wenig Verstärkung der Fluoreszenz in Gegenwart von RNA zeigt. Die vorliegende Erfindung stellt neue Farbstoffe, sowohl rot- als auch blau-anregbar, bereit, die Nukleinsäuren binden und Nachweis von Reticulozyten über Fluoreszenz bei Umgebungstemperaturen erlauben. Geeigneterweise werden die erfindungsgemäßen Farbstoffe durch Verfahren angepasst, die vorwiegend schnellen Nachweis von Reticulozyten in Abwesenheit von wesentlicher Hintergrundfluoreszenz erlauben. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Geschwindigkeit, mit der Anfärben ausgeführt wird, und die Tatsache, dass sie unter Verwendung von Vollblut bei Raumtemperatur erreicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt drei Gruppen von neuen Farbstoffen bereit, die angeführt werden als:
Gruppe I mit der allgemeinen Formel von:
wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R₁ H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R₂ CH₂(CH₂)_mOH ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OH, eine Alkyl-, Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist; und B^– ein Gegenanion ist.
Gruppe II mit der allgemeinen Formel von:
wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOAc ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OAc, eine Alkyl-, eine Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist und B^– ein Gegenanion darstellt.
Gruppe III mit der nachstehenden allgemeinen Formel:
wobei n 0, 1 oder 2 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOH oder CH₃ ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; B^– ein Gegenanion ist, und R3, R4, R5, R6 verschiedene Substituenten, wie durch die Formeln für die speziellen Verbindungen Farbstoff-3 bis Farbstoff-6 wiedergegeben, sind.
Gemäß der Erfindung schließt ein Gegenion ohne Begrenzung ein einzelnes Element oder eine negativ geladene Gruppe ein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Gegenanion ein Halogenid, ausgewählt aus Br^–, Cl^– oder I^–. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Gegenanion eine Tosylatgruppe (OTs^–), wobei OTs^– [CH₃(C₆H₄)SO₃]^– ist. In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Gegenanion BF₄ ^–. Jedoch ist die Erfindung nicht in diesem Sinne begrenzt. Es liegt innerhalb des Fachwissens, ein geeignetes Gegenanion unter bekannten Ionen und ionischen Gruppen, einschließlich ohne Begrenzung PF₆ ^– auszuwählen.
Diese Erfindung stellt Farbstoffverbindungen mit der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel bereit, die entweder rot-anregbar oder blau-anregbar sein können. Wie hierin verwendbar, ist ein rot-anregbarer Farbstoff ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn mit Licht einer Wellenlänge im roten Spektralbereich angeleuchtet. Wie hierin verwendet, ist dieser rote Spektralbereich etwa 600 nm bis etwa 725 nm und vorzugsweise 630 nm bis 670 nm. Ein blau-anregbarer Farbstoff ist ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn er mit Licht einer Wellenlänge im blauen Spektralbereich in Kontakt gebracht wird. Wenn hierin verwendet, kann ein blau-anregbarer Farbstoff typischerweise ein Absorptionsmaximum im Bereich von 420 nm bis 560 nm und vorzugsweise etwa 450 nm bis etwa 520 nm aufweisen.
Wie vorstehend ausgewiesen, zeigen die erfindungsgemäßen Farbstoffe starke Verstärkung der Fluoreszenz, wenn an Nukleinsäuren gebunden. Im Allgemeinen haben die Farbstoffe der allgemeinen Formel der Gruppe I ein Fluoreszenzverstärkungsverhältnis größer als etwa 200 (Verhältnis der Fluoreszenzintensität von RNA-gebundenem Farbstoff an Fluoreszenzintensität von freiem Farbstoff). In einigen Ausführungsformen haben die erfindungsgemäßen Farbstoffe ein Fluoreszenzverstärkungsverhältnis von mehr als etwa 300. Noch andere erfindungsgemäße Farbstoffe werden ein Fluoreszenzverstärkungsverhältnis von mehr als etwa 350 aufweisen; noch andere erfindungsgemäße Farbstoffe werden ein Fluoreszenzverstärkungsverhältnis von mehr als etwa 400 aufweisen und noch andere erfindungsgemäße Farbstoffe werden ein Fluoreszenzverstärkungsverhältnis von mehr als etwa 450 aufweisen. Für spezielle Beispiele siehe z.B. 1B und Tabelle 1. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin bereitgestellten Verhältnisse begrenzt.
In einer erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung hierin einen ReticRed1 genannten Farbstoff mit der nachstehenden Formel bereit:
ReticRed1 wird weiterhin in Beispiel 1A, Verbindung (6) beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel, in ReticRed1, ist n 1, R1 ist H, R2 = CH₂CH₂OH, R = CH₂CH₂OH, X ist S und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticRed2 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel, in ReticRed2, ist n 1, R₁ ist H, R ist CH(CH₃)₂, X ist S, R₂ ist CH₂CH₂OH und B^– ist Br^–.
In einer noch weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticRed3 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel in ReticRed3 ist n 1, R₁ ist H, R ist CH₃, R₂ ist CH₂CH₂OH, X ist S und B^– ist Br^–.
In einer noch weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticRed4 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel, in ReticRed4, ist n 1, R₁ ist CH₃, R ist CH₃, R₂ ist CH₂CH₂OH, X ist S und B^– ist Br^–.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticRed5 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel, in ReticRed5, ist n 1, R₁ ist CH₃, R ist CH(CH₃)₂, R₂ ist CH₂CH₂OH, X ist S und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticRed6 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel, in ReticRed6, ist n 1, R₁ ist CH₃, R ist CH₂CH₂OH, R₂ ist CH₂CH₂OH, X ist S und B^– ist Br^–.
In einer noch weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen ReticBlue1 genannten, blau-anregbaren Farbstoff bereit, wobei mit Bezug auf die allgemeine Formel n 0 ist. Ein besonders erwünschtes Beispiel eines bevorzugten blau-anregbaren Farbstoffes ist ReticBlue1, welcher durch die allgemeine Formel wiedergegeben wird, worin n = 0, R1 = H, m = 1, R2 = CH₂CH₂OH, R = CH₂CH₂OH, X = S, B^– = Br^–.
In einer erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen hierin Farbstoff-1 genannten Farbstoff mit der allgemeinen Formel bereit:
Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-II hat der Farbstoff-1 n = 1; R₁ = H; R = CH₃; R₂ = CH₂CH₂OAc; X = S; und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Farbstoff-2 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Farbstoff-2 wird in Beispiel 1B weiter beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-II hat der Farbstoff-2 n = 1; R1 = H; R2 = R = CH₂CH₂OAc; X = S und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen hierin Farbstoff-3 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Farbstoff-3 wird weiterhin in Beispiel 1C beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-III hat der Farbstoff-3 n = 1; X ist S, R1 = H; R2 = CH₂CH₂OH; R3 = R4 = OCH₃, R5 = R6 = H und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Farbstoff-4 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Farbstoff-4 wird weiterhin in Beispiel 1C beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-III hat der Farbstoff-4 n = 1; X ist S, R1 = H; R2 = CH₂CH₂OH; R3 = R5 = R6 = H; R4 = CO·CH₃ und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Farbstoff-5 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Farbstoff-5 wird weiterhin in Beispiel 1C beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-III hat der Farbstoff-5 n = 1; X ist S, R1 = H; R2 = CH₂CH₂OH; R3 = R4 = R5 = R6 = H; und B^– ist Br^–.
In einer weiteren erwünschten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Farbstoff-6 genannten Farbstoff mit der Formel bereit:
Farbstoff-6 wird weiter in Beispiel 1C beschrieben. Mit Bezug auf die allgemeine Formel von Gruppe-III hat Farbstoff-6 n = 1; X = S, R1 = H; R2 = CH₂CH₂OH; R3 = R4 = R5 = H; R6 = B(OH)₂; und B^– ist I^–.
Die Farbstoffe der Erfindung sind für eine Vielzahl von Zwecken verwendbar, die sich dem Fachmann leicht erschließen. Solche Anwendungen schließen beispielsweise die Anwendung von Farbstoffen als Marker oder Anhängsel zum Nachweisen des Vorliegens eines Moleküls oder einer Verbindung, an die sie gebunden sind, ein. Solche Marker können zum Verfolgen der Wirksamkeit einer therapeutischen Verbindung in vivo oder für diagnostische Anwendungen oder dergleichen verwendet werden. Jedoch sind die erfindungsgemäßen Farbstoffe besonders gut geeignet zum Anfärben von Nukleinsäuren. Beispielsweise sind diese Farbstoffe besonders geeignet zum Anfärben von RNA in Reticulozyten. In einer weiteren beispielhaften Anwendung sind diese Farbstoffe zum Anfärben von DNA in kernhaltigen roten Blutzellen geeignet. Typischerweise werden die Farbstoffe beim Anwenden der Anfärbung von Nukleinsäuren in Reagenzlösungen formuliert.
1. Anfärben von Reagenzien
Die Erfindung stellt eine Vielzahl von hierin beschriebenen Zusammensetzungen bereit, die als Anfärbungsreagenzien in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich einer Vielzahl von Assayformaten, verwendbar sind. Beispiele für solche Anwendungen erschließen sich dem Fachmann leicht nach einer Übersicht der hierin beschriebenen Zusammensetzungen.
A. Farbstoffzusammensetzungen
Um die neuen erfindungsgemäßen Farbstoffe zum Anfärben von Nukleinsäuren zu nutzen, werden die Farbstoffe in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bildung von Lösungen gelöst. Wie hierin definiert, ist ein Lösungsmittel gemeint, um eine beliebige Flüssigkeit zu beschreiben, die einen Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Gas lösen kann. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet auf Wasser basierende oder mit Wasser mischbare Flüssigkeiten, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol, Ethanol und Gemische davon. Die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels ist jedoch keine Begrenzung für die vorliegende Erfindung. Zur Lagerung wird typischerweise der Farbstoff bei einer relativ hohen Konzentration in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, um eine Stammlösung zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird, um eine Stammlösung des Farbstoffs zu erhalten, der Farbstoff in DMSO bei einer Farbstoffkonzentration im Bereich von 0,5 mM bis 10 mM und besonders bevorzugt 1 bis 5 mM gelöst.
Zur weiteren Anwendung der Farbstoffzusammensetzung in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Stammlösung in anderen Reagenzien oder Puffern, einschließlich beispielsweise Wasser, Salzlösung, Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) oder isotonischer Salzlösung, verdünnt werden. Die Farbstoffendkonzentration in solchen Farbstoffzusammensetzungen kann in Abhängigkeit von der Anwendung variiert werden. In einer Ausführungsform liegt die Konzentration des Farbstoffs in der Farbstoffendzusammensetzung, die zu einer Probe von Vollblut gegeben wird, im Bereich von etwa 0,1 bis 50 μM, vorzugsweise etwa 0,5 bis 25 μM und bevorzugter 2 bis 10 μM. Jedoch ist die Auswahl einer geeigneten Konzentration oder Verdünnungslösungsmittel keine Begrenzung für die vorliegende Erfindung.
Die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung kann für eine Vielzahl von Zwecken angewendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Anwendung der Farbstoffzusammensetzung zum Anfärben, Nachweis und Analyse von Nukleinsäuren. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung der Farbstoffzusammensetzung zum Anfärben, Nachweis und zur Analyse von Reticulozyten in Vollblut. Eine noch weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Anwendung des Farbstoffs zum Anfärben, Nachweis und zur Analyse von kernhaltigen roten Blutzellen in Vollblut. Der Fachmann wird leicht verstehen, dass die Anwendung der Farbstoffe und Reagenzien der vorliegenden Erfindung nicht derart begrenzt wird. In einer besonders erwünschten Ausführungsform, beispielsweise wenn der Farbstoff intakte Zellen kontaktiert, kann es erwünscht sein, einen oder mehrere der Farbstoffe in ein Gemisch zu formulieren.
B. Zusammensetzungen zum schnellen Anfärben:
In einem weiteren Aspekt kann die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung angewendet werden, um schnellen Transport der Farbstoffe durch die Zellmembran zu erleichtern, wodurch der Farbstoff, Reticulozyten in etwa 1 Minute oder weniger anfärben kann. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren das Anfärben in etwa 0 bis etwa 60 Sekunden, vorzugsweise etwa 0 Sekunden bis etwa 45 Sekunden, bevorzugter etwa 0 Sekunden bis etwa 30 Sekunden, besonders bevorzugt etwa 0 Sekunden bis etwa 20 Sekunden, erlauben.
Im Allgemeinen erfordert solches schnelles Anfärben, dass eine Probe mit einer Farbstoffzusammensetzung der Erfindung, in Gegenwart von mindestens einem grenzflächenaktiven Mittel und gegebenenfalls einer Sulfonsäure oder einem Salz davon, in Kontakt gebracht wird.
Wenn zum schnellen Anfärben verwendet, können zusätzliche Komponenten zu der Zusammensetzung der Erfindung gegeben werden. Beispielsweise können Puffer in Situationen angewendet werden, in denen das Halten des pH-Werts der Farbstoff zusammensetzung notwendig ist. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Farbstoffreagenz im Bereich von etwa 6 bis etwa 9 gehalten. Bevorzugter wird ein pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis etwa 7,5 erhalten. Der Puffer kann aus einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Puffern zum Anwenden in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ausgewählt sein, und schließt ohne Begrenzung Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder isotonische Salzlösung, wie ISOTON^®II Verdünnungsmittel, US-Patent 3 962 125 [Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida] oder dergleichen ein. Zusätzlich können auch solche Puffer verwendet werden, um die Konzentration von einer oder mehreren der Komponenten in der Zusammensetzung dieser Erfindung einzuschließen. Konservierungsmittel können zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gegeben werden und können aus 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on [solche Konservierungsmittel können kommerziell bezogen werden, beispielsweise als ProClin 300 oder ProClin 150] ausgewählt sein, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Mindestens ein grenzflächenaktives Mittel wird bei der Zusammensetzung zum schnellen Anfärben verwendet. In einer beispielhaften Ausführungsform schließen die grenzflächenaktiven Mittel ein Detergenz und ein zweites grenzflächenaktives Mittel, das als ein Kugelmittel für eine Zelle wirkt, ein. In einer weiteren beispielhaften Ausführungsform können die grenzflächenaktiven Mittel derart aufgebaut sein, dass ein einziges grenzflächenaktives Mittel als sowohl ein Detergenz als auch ein Kugelmittel wirkt. In einer noch weiteren beispielhaften Ausführungsform können die grenzflächenaktiven Mittel derart aufgebaut sein, dass ein einziges grenzflächenaktives Mittel die notwendige grenzflächenaktive Funktion bereitstellt, jedoch wird keine Kugelreagenzfunktion erforderlich ist.
In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung anzuwendende grenzflächenaktive Mittel können ausgewählt sein unter anderem aus dem anionischen grenzflächenaktiven Mittel Ammoniumperfluoralkylcarboxylat [kommerziell erhältlich als Fluorad^® FC-143 (3M Company, Minneapolis, Minnesota)], Natriumlauroylmyristoyllactylat [kommerziell erhältlich als Pationic^® 138C (R. I. T. A. Corp, WoodStamm, Illinois)], oder von den nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln Dodecyl-β-D-maltosid, N,N-Bis[3-D-gluconamidopropyl]cholamid, Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Blockcopoly mer, N-Tetradecyl-β-D-maltosid, Daconyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-β-D-glucopyranosid, n-Decyl-β-D-glucopyranosid, Polyethylenglycolester von Stearinsäure, ethoxyliertes Cocomonoglycerid, Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, ethoxyliertem Octylphenol, und linearem Alkohol, oder aus den kationischen grenzflächenaktiven Mitteln, Cocohydroxyethylimidazolin, Lauryltrimethylammoniumchlorid, Decyltrimethylammoniumbromid, Octyltrimethylammoniumbromid, oder aus den zwitterionischen grenzflächenaktiven Mitteln Lauramidopropylbetain, N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, Cocoamidopropylbetain, Cocoamidosulfobetain, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat.
Wie vorstehend erörtert, kann das ausgewählte grenzflächenaktive Mittel als ein Kugelmittel für rote Zellen wirken, wenn die Konzentration und Osmolarität geeigneterweise eingestellt ist. Ein Kugelmittel kann leicht durch den Fachmann ausgewählt werden. Ein bevorzugtes Kugelmittel basiert auf dem nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel Dodecyl-β-D-maltosid, das geeigneterweise in Lösung mit einem Puffer, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung, vorliegt. Um wirksam die Reticulozyten und roten Blutzellen innerhalb einer Blutprobe isovolumetrisch kugelförmig zu machen, ist die Konzentration des Kugelmittels in der Zusammensetzung besonders bevorzugt etwa 3 μg/ml bis etwa 50 μg/ml mit einem mOsm-Bereich von etwa 200 bis etwa 400 mOsm und vorzugsweise etwa 250 mOsm bis etwa 350 mOsm. Jedoch wird der Fachmann leicht diese Konzentration und Osmolarität, wie benötigt oder erwünscht, um die Zellen isovolumetrisch kugelförmig zu machen, einstellen, unter Bezugnahme auf das ausgewählte grenzflächenaktive Mittel. Wie vorstehend erörtert, kann die Auswahl von Kugelmittel gegebenenfalls den Bedarf für Detergenz entfernen.
In einer Ausführungsform ist ein Detergenz in die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung eingeschlossen. Anzuwendende Detergenzien sind ausgewählt unter nichtionischen Detergenzien. Wünschenswerterweise werden diese Detergenzien bei einer Konzentration zwischen etwa 0 bis etwa 1% verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Detergenzien bei Konzentrationen zwischen etwa 0,001% bis etwa 0,5% verwendet, und in einer bevorzugteren Ausführungsform liegen sie im Bereich von etwa 0,005% bis 0,1%. Ein gegenwärtig bevorzugtes Detergenz ist Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol [kommerziell erhältlich als Igepal^® CA-630 (Sigma N-6507) oder Nonidet P-40 (Sigma)]. Beispiele für andere geeignete Detergenzien schließen ethoxyliertes Octylphenol [kommerziell erhältlich als Triton X-100 (Sigma T9284)] und lineare Alkoholalkoxylate [kommerziell erhältlich als Plurafac^® A-38 (BASF Corp.) oder Plurafac^® A-39 (BASF Corp.)] ein. Typischerweise werden diese Detergenzien mit einer Probe (oder umgekehrt), beispielsweise 1–2 μl Vollblut oder dergleichen, oder getrennt formuliert in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, vermischt.
In einer erwünschten Ausführungsform ist in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine Sulfonsäure oder ein Salz davon eingeschlossen. Die Sulfonsäure oder ein Salz davon wirkt als ein weiteres Erleichterungsmittel zum Transportieren der Farbstoffzusammensetzung durch die Zellmembran und wird in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 250 μM, besonders bevorzugt 0,01 bis etwa 50 μM, verwendet. Eine Ausführungsform der Erfindung wendet p-Toluolsulfonsäure an. In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann ein p-Toluolsulfonatsalz gegen p-Toluolsulfonsäure substituiert werden. Beispiele für solche Salze schließen Natrium-, Kalium-, Silber-, Zink- und Barium-p-toluolsulfonatsalze ein. Einige Beispiele für solche Salze sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Sigma Aldrich. Andere geeignete Sulfonate können zur Verwendung in der Erfindung leicht ausgewählt werden.
Die erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen können einen einzelnen Farbstoff, gegebenenfalls in Gegenwart von anderem Farbstoff, enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung kann eine Zusammensetzung der Erfindung eine oder mehrere andere erfindungsgemäße Farbstoffverbindungen oder eine beliebige Kombination davon enthalten.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung andere, dem Fachmann in Kombination mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen neuen Farbstoffe, bekannten anderen Farbstoffe enthalten. Solche Farbstoffe werden leicht ausgewählt unter Farbstoffen, die veröffent licht wurden und/oder die kommerziell erhältlich sind. Siehe beispielsweise Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, Kalifornien) Katalog. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen für die Farbstoffe und erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die dem Fachmann leicht deutlich werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung andere Farbstoffe und Reagenzien, die auf dem Fachgebiet als Blockierungsmittel für spezielle Nukleinsäuren oder Proteine in Zellen bekannt sind, in Kombination mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen neuen Farbstoffe enthalten. Solche Blockierungsmittel werden leicht ausgewählt aus Farbstoffen und Reagenzien, die veröffentlicht wurden und/oder die kommerziell erhältlich sind. Siehe beispielsweise Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, Kalifornien) Katalog oder Molecular Probes (Eugene, Oregon) Katalog. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen für die Farbstoffe und erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die sich dem Fachmann leicht erschließen werden.
II. Verfahren zum Anfärben von Nukleinsäuren unter Anwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe
Die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung ist beim Färben einer Vielzahl von Nukleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, verwendbar.
In Proben, die freie Nukleinsäuren, beispielsweise Nukleinsäuren, die nicht von einer intakten Zellmembran von zellulärer oder nichtzellulärer Quelle umgeben sind, enthalten, kann die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung die Nukleinsäuren anfärben. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Inkontaktbringen einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe mit den erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen bereitgestellt. Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren Inkontaktbringen einer Nukleinsäuren-enthaltenden Probe mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzung, gegebenenfalls in Gegenwart von anderen Farbstoffen und Reagenzien, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Verfahren Inkontaktbringen einer Nukleinsäuren-enthaltenden Probe mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffzusammen setzung, die etwa 2 bis etwa 10 μM rot-anregbarem ReticRed1-Farbstoff und einen wässrigen isotonischen Puffer enthält. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Verfahren Inkontaktbringen einer Nukleinsäurenenthaltenden Probe mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzung, die etwa 1 bis etwa 10 μM rot-anregbaren Farbstoff-1, Farbstoff-2, Farbstoff-3 oder Kombinationen davon und einen wässrigen isotonischen Puffer enthält.
Die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung ist besonders gut zur Verwendung für den Nachweis und die Zählung von Reticulozyten, die RNA enthalten, geeignet. Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet deshalb Inkontaktbringen eines Reticulozyten, der Nukleinsäure enthält, mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen.
Die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung, vorzugsweise Gruppen II und III, ist auch gut zur Verwendung beim Nachweis und bei der Zählung von kernhaltigen roten Blutzellen, die DNA enthalten, geeignet.
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren Inkontaktbringen der Blutzellen mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzung in Gegenwart von mindestens einem Tensid, gegebenenfalls zusammen mit einem Konservierungs- und Sulfonmittel. Wie vorstehend beschrieben, kann/können das/die grenzflächenaktive(n) Mittel ein Detergenz oder ein Kugelmittel (sphering agent) einschließen. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Zellen mit einer diese Komponenten enthaltenden Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden. Alternativ können eine oder mehrere von diesen Komponenten getrennt, beispielsweise durch Zusetzen der Komponente(n) direkt zu der Probe, abgegeben werden. Das Gemisch wird dann für einen geeigneten Zeitraum inkubiert. Wie vorstehend erörtert, wird die Inkubationszeit weniger als 1 Minute sein. Jedoch kann, zweckmäßigerweise erwünscht, der Inkubationszeitraum entweder ausgedehnt oder verkürzt werden. Beispielsweise kann durch Einstellen der Konzentration des Farbstoffs, grenzflächenaktiven Mittels oder Detergenz, die Inkubationszeit auf mehr als 1 Minute erhöht werden. Wünschenswerterweise kann dieses Vermischen und die Inkubation bei Temperaturen zwischen ungefähr 20°C bis 40°C ausgeführt werden. Jedoch in einer be vorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform können Temperaturen im Bereich von 22°C bis 28°C angewendet werden.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform erfordert das erfindungsgemäße Verfahren Inkubation des Farbstoffs im Bereich von etwa 0 Sekunden bis etwa 1 Minute zum Anfärben von Reticulozyten und das Anfärben kann bei Raumtemperaturen ausgeführt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Inkubationszeit entfernt, weil die Blutprobe mit der Farbstoffzusammensetzung vermischt ist und anschließend sofort durch das Instrument analysiert wird. Siehe Beispiel 5, 7 und 8, und Beispiel 7, 10A–2B, 11A–11C, 12A–12C. Die Anfärbungstechniken des Standes der Technik erfordert unter Anwendung von rotanregbaren Farbstoffen für Reticulozyten in diesem Zeitrahmen Inkubation bei erhöhten Temperaturen und/oder zusätzliche Verwendung von toxischen Ionophorenverbindungen.
Die mit den Farbstoffzusammensetzungen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren angefärbten Reticulozyten werden vorzugsweise in einem automatischen Durchflusszytometer gezählt. Jedoch können diese Zellen auch durch ein manuelles Verfahren oder automatisierte Mikroskopie gezählt werden.
Somit erleichtert das erfindungsgemäße Verfahren den Transport von Nukleinsäurespezifischen Farbstoffen dieser Erfindung über die Zellmembran in dem für die automatisierte Durchflusszytometrie erwünschten Zeitrahmen. Automatische Durchflusszytometer sind auf dem Fachgebiet bekannt, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Anwendung von beliebigem besonderem Durchflusszytometer begrenzt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zieht den Nachweis und die Zählung von Reticulozyten unter Anwendung des XL^TM Durchflusszytometers nach sich [Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida]. Verschiedene analytische Techniken können bei der Zählung von Reticulozyten durch Durchflusszytometriemessungen, einschließlich, jedoch nicht darauf begrenzt Lichtstreuung, Fluoreszenz, optische Absorption, axialen Lichtverlust, Gleichstrom-elektrische Impedanz und Radiofrequenz (RF)-Leitfähigkeit, angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beim Anwenden von solchen Durchflusszytometern werden Lichtstreuung store zum Isolieren von roten Zellen verwendet, und Fluoreszenztore werden dann verwendet, um die Reticulozyten von reifen roten Zellen darzustellen und die Reticulozyten zu zählen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden unter Anwendung von Durchflusszytometern DC-Lichtstreuungstore angewendet, um rote Zellen zu isolieren, und Fluoreszenztore werden dann angewendet, um die Reticulozyten von den reifen roten Zellen darzustellen und die Reticulozyten zu zählen. In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung werden unter Anwendung von Durchflusszytometern DC- und Fluoreszenzmessung einzeln angewendet, um Reticulozyten von reifen roten Zellen darzustellen und die Reticulozyten zu zählen.
Ein weiterer, besonderer Vorteil der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht darin, dass, wenn die Zusammensetzung einen rot-anregbaren Farbstoff der Erfindung, wie ReticRed1, ReticRed3, Farbstoff-1, Farbstoff-2 oder Farbstoff-3, einschließt, dies die Anwendung einer weniger kostspieligen Anregungsquelle als die Argonlaser erlaubt, die für andere gegenwärtig verfügbare Reticulozytenfarbstoffe, wie CPO, AO [Seligman, Am. J. Hematology, 14: 57 (1983)], TO [Lee et al., Cytometry, 7: 508 (1986)], Auramin-O und Pyronin-Y, verwendet werden. Wenn beispielsweise die erfindungsgemäße rot-anregbare Farbstoffzusammensetzung verwendet wird, erlaubt die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise die Verwendung eines roten Lasers als Anregungsquelle. Insbesondere kann ein roter Diodenlaser, eine Licht-emittierende Hochleistungs-Diode (LED) oder ein roter Helium-Neon-Laser zum Durchführen von Reticulozytenzählen unter Anwenden eines erfindungsgemäßen rot-anregbaren Farbstoffs verwendet werden.
Eine Vielzahl von Lasern ist dem Fachmann bekannt, die als Anregungsquellen für die Durchflusszytometer verwendet werden können. Die Laser können aus Argon-, Helium-Neon-, Dioden- und Dioden-gepumptem Festkörper-Laser in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge des für den Nachweis von Reticulozyten ausgewählten erfindungsgemäßen Farbstoffs ausgewählt werden, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Die Auswahl von geeigneten Lichtquellen und geeigneten Anregungswellenlängen ist keine Begrenzung für die vorliegende Erfindung.
Geeignete Anregungswellenlängen können leicht durch den Fachmann bestimmt werden. Beispiele für geeignete Anregungswellenlängen in dem roten Spektralbereich schließen jene im Bereich von 600 nm bis 725 nm und vorzugsweise 630 nm bis 670 nm ein. Andere geeignete Anregungsquellen und -wellenlängen können leicht durch den Fachmann ausgewählt werden, unter In-Betrachtziehen des zur Verwendung in dem Verfahren und in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ausgewählten Farbstoffs.
Ein weiterer Vorteil stammt von der Tatsache, dass die erfindungsgemäßen rotanregbaren Farbstoffverbindungen, wie ReticRed1, ReticRed2, ReticRed3, ReticRed4, ReticRed5, ReticRed6, Farbstoff-1, Farbstoff-2 oder Farbstoff-3, usw., im Wesentlichen nichtfluoreszierend, oder sehr schwach fluoreszierend in wässrigen Lösungen in Abwesenheit von Nukleinsäuren (ungebundener Zustand) sind. Im Ergebnis sind mit Hintergrundfluoreszenz verbundene Probleme minimal, und Reticulozyten können mit einer hohen Empfindlichkeit unter Anwendung dieses Farbstoffs nachgewiesen werden.
Somit erlaubt die vorliegende Erfindung, Reticulozyten schnell mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen zur anschließenden Durchflussanalyse anzufärben. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von sowohl dem Stand der Technik, Pyronin-Y-[Tanke et al., vorstehend angeführt]-Anfärbungsverfahren, das Fixierung der Zellen erfordert und als auch den Fluoreszenzanfärbungsverfahren des Standes der Technik, die Membran-permeable Farbstoffe, wie CPO (ReticONE^TM) oder Thiazolorange (Retic-Count^TM) einbeziehen, das keine Zellfixierung erfordert, jedoch lange Inkubation mit dem Blut zum Ausführen des Anfärbens erfordert.
III. Beispiele
Die nachstehenden Beispiele werden zur Erläuterung der Erfindung bereitgestellt und begrenzen deren Umfang nicht. Der Fachmann wird einschätzen, dass, obwohl spezielle Reagenzien und Bedingungen in den nachstehenden Beispielen ausgewiesen sind, Modifizierungen erfolgen können, die vorgesehen sind, vom Umfang der Erfindung umfasst zu werden.
Beispiel 1A – Materialien und Methoden für die Synthese von Verbindungen der Gruppe I A. Allgemeine Farbstoffsynthese für Gruppe I
B. Spezielle Farbstoffherstellung
Herstellung von 1-(2-Hydroxy)ethyllepidiniumbromid (2). Eine Lösung von Lepidin (11,5 g) und Bromethanol (100 g) wurde gerührt und in einem Ölbad für 48 Stunden auf 110°C erhitzt. Das Kühlen des Gemisches auf Raumtemperatur, Zusetzen von Essigsäureethylester (100 ml) und Rühren für 5 Minuten ergab einen Feststoff, der gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml) gewaschen und getrocknet wurde. Der Feststoff wurde dann in Methanol (80 ml) gelöst und mit Essigsäureethylester (600 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 100 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, unter Gewinnung von 11,47 g (53% Ausbeute) des Produkts (2c).
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-methylbenzothiazoliumbromid (4a). Eine Lösung von 2-Methylbenzothiazol (5,87 g) und 2-Bromethanol (49,2 g) wurde gerührt und in einem Ölbad für 18 Stunden auf 110°C erhitzt. Nach Kühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur, Zugeben von Essigsäureethylester (100 ml) und Dekantieren wurde der erhaltene Feststoff dann in Methanol (50 ml) gelöst und mit Essigsäureethylester (300 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde erneut aus einem Gemisch von Methanol und Essigsäureethylester umkristallisiert, mit Essigsäureethylester (2 × 25 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, unter Gewinnung von 4,21 g (39%) 4a.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2,6-dimethylbenzothiazoliumbromid (4b). Eine Lösung von 2,6-Dimethylbenzothiazol (13,0 g) und 2-Bromethanol (100 g) wurde gerührt und in einem Ölbad für 96 Stunden auf 120°C erhitzt. Nach Kühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur, Zusetzen von Essigsäureethylester (150 ml) und Rühren für 1 Stunde wurde der erhaltene Feststoff filtriert und gesammelt. Der Feststoff wurde dann in Methanol (150 ml) gelöst und Aktivkohle (2 g) wurde zugegeben. Die Aktivkohle wurde mittels Durchleiten durch eine Lage Celite^® entfernt. Die Lösung wurde dann zu einem kleinen Volumen aufkonzentriert und mit Aceton (200 ml) verrieben. Der Feststoff wurde gesammelt, mit Aceton (2 × 30 ml), Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, unter Gewinnung von 13,95 g (61%) 4b.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-6-methoxy-2-methylbenzothiazoliumbromid (4c). Eine Lösung von 6-Methoxy-2-methylbenzothiazol (1,82 g) und 2-Bromethanol (8,8 g) wurde gerührt und in einem Ölbad für 74 Stunden auf 120°C erhitzt. Nach Kühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur, Zusetzen von Essigsäu reethylester (25 ml) und Rühren für 1 Stunde wurde der Feststoff filtriert und gesammelt. Der Feststoff wurde dann in Methanol (50 ml) gelöst und Aktivkohle (0,5 g) wurde zugegeben. Die Aktivkohle wurde mittels Durchleiten durch eine Lage Celite^® entfernt. Die Lösung wurde dann zu einem kleinen Volumen aufkonzentriert und mit Essigsäureethylester (100 ml) verrieben. Der Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, unter Gewinnung von 0,9 g (30%) 4c.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5a). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-methylbenzothiazoliumbromid (4a, 1,19 g) in einem gemischten Lösungsmittel von Methanol/Ethanol (3:1, 80 ml) wurde ein Überschuss an N-Phenylformiminosäureethylester (3,0 g) gegeben und die Lösung wurde 36 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, unter Gewinnung eines trockenen Feststoffs. Der Feststoff wurde Säulenchromatographie-(Kieselgel, Methylenchlorid/Methanol)-Reinigung unterzogen. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit Ethylether (200 ml) ausgefällt. Nach Trocknen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht wurden 1,04 g (63%) 5a als ein gelber Feststoff erhalten.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-6-methyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5b). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2,6-dimethylbenzothiazoliumbromid (4b, 2,76 g) in Methanol (80 ml) wurde ein Überschuss an N-Phenylformiminosäureethylester (3,6 g) gegeben und die Lösung 36 h bei Raumtemperatur gerührt. Essigsäureethylester (160 ml) wurde dann zugegeben und über Nacht gerührt. Der Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Trocknen des Feststoffs weiterhin in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 2,32 g (62%) 5b als einen gelben Feststoff.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-6-methoxy-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5c). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-6-methoxy-2- methylbenzothiazoliumbromid (4c, 0,79 g) in Methanol (30 ml) wurde ein Überschuss an N-Phenylformiminosäureethylester (1,5 g) gegeben und die Lösung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, unter Gewinnung eines trockenen Feststoffs. Der Feststoff wurde Säulenchromatographie (Kieselgel) unterzogen und mit einem Methanol/Methylenchloridgradienten (von 0 bis 15% Methanol) eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol (5 ml) gelöst und mit Ethylether (150 ml) ausgefällt. Nach Trocknen in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht wurden 0,35 g (33%) 5c als ein gelber Feststoff erhalten.
Herstellung von Farbstoffverbindung 6 (ReticRed1). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5a, 85,8 mg) und 1-(2-Hydroxy)ethyllepidiniumbromid (2, 58,4 mg) in Methylenchlorid (20 ml) wurde Triethylamin (91 μl) und Acetanhydrid (62 μl) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde teilweise in Methanol (15 ml) gelöst und Essigsäureethylester (300 ml) wurde zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 67,8 mg (66%) 8 als einen blauen Feststoff. Absorptionsspektrum-Maximum: 630 nm (in Methanol), 640 nm (in DMSO).
Herstellung von Farbstoffverbindung 7 (ReticRed6). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-6-methyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5b, 85,6 mg), 1-(2-Hydroxy)ethyllepidiniumbromid (2, 58,7 mg) in Methylenchlorid (10 ml) und Methanol (1,0 ml) wurde Triethylamin (91 μl) und Acetanhydrid (61 μl) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde teilweise in Methanol (10 ml) erneut gelöst und Essigsäureethylester (200 ml) wurde zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 63,7 mg (60%) 11 eines blauen Feststoffs. Absorptionsspektrum-Maximum: 630 nm (in Methanol), 645 nm (in DMSO). Beispiel 1B: Materialien und Methoden für die Synthese von Verbindungen der Gruppe II Syntheseschema

(i) Herstellung von 1-Methyllepidiniumjodid (2a). Eine Lösung von Lepidin (10,56 g) und Methyljodid (105 g) wurde gerührt und in einem Ölbad für 19 Stunden auf 50°C unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, Aceton (200 ml) wurde zugegeben und 2 Stunden gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml) gewaschen und dann mit Essigsäureethylester (200 ml) verrieben. Der Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 25 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet. Es wurden 20,74 g (98,6% Ausbeute) Produkt erhalten.
(ii) Herstellung von 1-(2-Hydroxyethyl)lepidiniumbromid (2b). Eine Lösung von Lepidin (11,5 g) und Bromethanol (100 g) wurde in einem Ölbad für 48 Stunden auf 110°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, Essigsäureethylester (100 ml) zugegeben und 5 Minuten gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml) gewaschen und getrocknet. Der Feststoff wurde dann in Methanol (80 ml) gelöst und mit Essigsäureethylester (600 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 100 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet. Es wurden 11,47 g (53% Ausbeute) Produkt erhalten.
(iii) Herstellung von 3-(2-Hydroxyethyl)-2-methylbenzothiazoliumbromid (4). Eine Lösung von 5,87 g 2-Methylbenzothiazol (3) und Bromethanol (49,2 g) wurde in einem Ölbad für 18 Stunden bei 110°C gerührt. Essigsäureethylester (100 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und dekantiert. Der erhaltene Feststoff wurde dann in Methanol (50 ml) gelöst und mit Essigsäureethylester (300 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde erneut aus Methanol/Essigsäureethylester (15 ml/150 ml) umkristallisiert, mit Essigsäureethylester (2 × 25 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet. Die Ausbeute war 4,21 g (39%). DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,34.
(iv) Herstellung von 3-(2-Hydroxyethyl)-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxyethyl)-2-methylbenzothiazoliumbromid (4, 1,19 g) in einem gemischten Lösungsmittel von Methanol/Ethanol (3:1, 80 ml) wurde überschüssiger N-Phenylformiminosäureethylester (3,0 g) gegeben und 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der Feststoff wurde Säulenchromatographie-(Kieselgel, Methylenchlorid/Methanol)-Reinigung unterzogen. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit Ethylether (200 ml) ausgefällt. Nach Trocknen in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht wurden 1,04 g (63%) eines gelben Feststoffs erhalten. DC (Kieselgel, 9:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,27.
(v) Herstellung von Farbstoffverbindung, entsprechend der als 6 in den vorstehenden Figuren beschriebenen Konfiguration, mit R = CH₃, R1 = H. Eine Lösung von 3-(2-Hydroxyethyl)-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5, 203,8 mg) und 1-Methyllepidiniumjodid (2a, 154,0 mg) in Pyridin (10 ml) wurde in einem Ölbad 2 Stunden unter wasserfreier Bedingung auf 90°C erhitzt. Eine Lösung von Natriumtetrafluoroborat (59,3 mg) in DMF (0,5 ml) wurde zugegeben und das Erhitzen für weitere 20 Minuten bei 90°C fortgesetzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung in Essigsäureethylester (100 ml) gegossen und der erhaltene Feststoff über Filtration gesammelt. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (100 ml) gelöst und Essigsäureethylester (300 ml) zugegeben und über Nacht gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 165,4 mg (68%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,65. Absorptionsmaximum: 629 nm (in Methanol).
(vi) Herstellung der Farbstoffverbindung, die der als 7 beschriebenen Konfiguration entspricht, mit R = CH₂CH₂(OH), R₁ = H. Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxyethyl)-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (5, 85,8 mg) und 1-(2-Hydroxyethyl)lepidiniumbromid (2b, 58,4 mg) in Methylenchlorid (20 ml) wurde Triethylamin (91 μl) und Acetanhydrid (62 μl) gegeben. Nach Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Teilweise wurde der Feststoff in Methanol (15 ml) erneut gelöst und Essigsäureethylester (300 ml) zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 67,8 mg (66%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,18. Absorptionsmaximum: 631 nm (in Methanol).
(vii) Herstellung der acetylierten Farbstoffverbindung, die der als 8 beschriebenen Molekularkonfiguration entspricht. Eine Suspension der vorstehend in (v) beschriebenen Farbstoffverbindung (50 mg) in Acetanhydrid (4 ml) und Pyridin (1 ml) wurde unter Rühren in einem Ölbad unter wasserfreier Bedingung für 10 Stunden auf 50°C erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung in Essigsäureethylester (100 ml) gegossen und 3 Minuten gerührt. Die erhaltenen feinen Kristalle wurden über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 56,5 mg (quantitative Ausbeute) eines blauen, kristallinen, festen Produkts erhalten. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,79. Absorptionsmaximum: 625 nm (in Methanol). Diese Verbindung wird nachstehend als Farbstoff-1 bezeichnet.
(viii) Herstellung der acetylierten Farbstoffverbindung, die der als 9 beschriebenen Molekularkonfiguration entspricht. Eine Suspension der vorstehend in (vi) beschriebenen Farbstoffverbindung (377,5 mg) in Acetanhydrid (8 ml) und Pyridin (2 ml) wurde unter Rühren in einem Ölbad unter wasserfreier Bedingung für 10 Stunden auf 50°C erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung in Essigsäureethylester (100 ml) gegossen und 3 Minuten gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 20 ml), Ethylether (2 × 20 ml) gewaschen und in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht getrocknet. Es wurden 411,9 mg (92,6% Ausbeute) eines blauen, festen Produkts erhalten. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,96. Absorptionsmaximum: 631 nm (in Methanol). Diese Verbindung wird nachstehend als Farbstoff-2 bezeichnet.

Beispiel 1C – Materialien und Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Gruppe III Syntheseschema I.
Syntheseschema II.
Herstellung von 2-Brommethylphenylboronsäure (5). Eine Suspension von 2-Methylphenylboronsäure (10,65 g), N-Bromsuccinimid (NBS, 16,86 g) und 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN, 1,708 g) in Tetrachlorkohlenstoff (1000 ml) wurde in einem Ölbad 2 Stunden unter wasserfreier Bedingung auf 82°C unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Feststoff abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Wasser (2 × 200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (100 ml) gelöst und Essigsäureethylester (1000 ml) wurde dazugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 50 ml) gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Filtrat wurde zu einem kleinen Volumen aufkonzentriert und eine zweite Charge Feststoff wurde auch gesammelt. Der vereinigte Feststoff wurde in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 6,48 g (39%) Produkt erhalten.
Herstellung von 1-Benzyllepidiniumbromid (6). Eine Lösung von Lepidin (37,82 g) und Benzylbromid (6,471 g) in Acetonitril (100 ml) wurde gerührt und in einem Ölbad 20 Stunden auf 93°C unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, Essigsäureethylester (50 ml) zugegeben und 30 min gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (4 × 20 ml) gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Filtrat wurde zu einem kleinen Volumen aufkonzentriert und eine zweite Charge Feststoff wurde auch gesammelt. Der vereinigte Feststoff wurde in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 11,52 g (96,9%) Produkt erhalten.
Herstellung von 1-(3',5'-Dimethoxybenzyl)lepidiniumbromid (7). Eine Lösung von Lepidin (3,36 g) und 3,5-Dimethoxybenzylbromid (5,41 g) in Acetonitril (100 ml) wurde in einem Ölbad 30 Stunden gerührt und auf 90°C unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, Essigsäureethylester (50 ml) zugegeben und 30 Minuten gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (4 × 20 ml) gewaschen und an der Luft getrocknet. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (200 ml) gelöst und mit Aktivkohle (5 g) behandelt und 15 Minuten unter Rückfluss erhitzt, um die dunkelfarbigen Verunreinigungen zu entfernen. Nach Filtrieren durch eine Lage Celite^® wurde das Filtrat zu einem kleinen Volumen (≈ 20 ml) aufkonzentriert und Essigsäureethylester (300 ml) wurde zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 50 ml), Ethylether (2 × 20 ml) gewaschen und an der Luft getrocknet. Weiteres Trocknen in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht lieferte 6,65 g (76%) Produkt.
Herstellung von 1-(4'-Carboxymethylbenzyl)lepidiniumbromid (8). Eine Lösung von Lepidin (3,32 g) und 4-(Brommethyl)benzoesäuremethylester (5,31 g) in Acetonitril (100 ml) wurde gerührt und in einem Ölbad 16 Stunden auf 90°C unter Rückfluss erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde mit Essigsäureethylester (3 × 100 ml) gewaschen. Der Feststoff in Methanol (100 ml) erneut gelöst und mit Aktivkohle (5 g) behandelt und 15 min unter Rückfluss erhitzt, um die dunkelfarbigen Verunreinigungen zu entfernen. Nach Filtrieren durch eine Lage Celite^® wurde das Filtrat zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde dann mit Aceton (100 ml) verrieben. Der erhaltene Feststoff wurde gesammelt, mit Essigsäureethylester (2 × 50 ml) gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Filtrat wurde zu einem kleinen Volumen aufkonzentriert und eine zweite Charge Feststoff wurde auch gesammelt. Der vereinigte Feststoff wurde in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 7,26 g (84%) Produkt erhalten.
Herstellung von 1-(2'-Boronsäure)benzyllepidiniumbromid (9). Eine Lösung von Lepidin (306 mg) und 2-Brommethylphenylboronsäure (417 mg) in Acetonitril (12 ml) wurde gerührt und in einem Ölbad 17 Stunden auf 90°C unter Rückfluss erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der Feststoff wurde mit Essigsäureethylester (3 × 20 ml) gewaschen und das Lösungsmittel wurde dekantiert. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (3 ml) gelöst und wiederum zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde mit Essigsäureethylester (3 × 20 ml) gewaschen. Der Feststoff wurde dann in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 650 mg (93,5%) Produkt erhalten.
Herstellung von 2,3-Dimethylbenzothiazoliumjodid (11a). Eine Lösung von 2-Methylbenzothiazol (5,00 g) und Jodmethan (50 g) wurde in einem Ölbad 44 Stunden bei 45°C gerührt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und der Feststoff wurde mit Essigsäureethylester (2 × 100 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum über Nacht bei 50°C getrocknet. Es wurden 8,02 g (82,3% Ausbeute) Produkt erhalten.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-methylbenzothiazoliumbromid (11b). Eine Lösung von 2-Methylbenzothiazol (5,87 g) und Bromethanol (49,2 g) wurde in einem Ölbad 18 Stunden bei 110°C gerührt. Essigsäureethylester (100 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und dekantiert. Der zurückbleibende Feststoff wurde dann in Methanol (50 ml) gelöst und mit Essigsäureethylester (300 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde erneut aus Methanol/Essigsäureethylester (15 ml/150 ml) umkristallisiert, mit Essigsäureethylester (2 × 25 ml) gewaschen und in einem Ofen unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht getrocknet. Die Ausbeute war 4,21 g (39%). DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,34.
Herstellung von 3-Methyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumjodid (12a). Zu einer Lösung von 2,3-Dimethylbenzothiazoliumbromid (11a, 1,01 g) in Ethanol (30 ml) wurde überschüssiger N-Phenylformiminosäureethylester (1,5 g) gegeben und 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der Feststoff wurde Säulenchromatographie(Kieselgel, Methylenchlorid/Methanol)-Reinigung unterzogen. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit Ethylether (200 ml) ausgefällt. Nach Trocknen in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht wurden 0,88 g (60%) eines gelben Feststoffs erhalten. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,60.
Herstellung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (12b). Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-methylbenzothiazoliumbromid (11b, 1,19 g) in einem gemischten Lösungsmittel von Methanol/Ethanol (3:1, 80 ml) wurde überschüssiger N-Phenylformiminosäureethylester (3,0 g) gegeben und 36 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der Feststoff wurde Säulenchromatographie(Kieselgel, Methylenchlorid/Methanol)-Reinigung unterzogen. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit Ethylether (200 ml) ausgefällt. Nach Trocknen in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht wurden 1,04 g (63%) eines gelben Feststoffs erhalten. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,58.
Herstellung von Farbstoffverbindung, die unter Syntheseschema II in Beispiel 1C als 13 bezeichnet wurde:
Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (12b, 41,9 mg) und 1-Benzyllepidiniumbromid (6, 33,4 mg) in Methylenchlorid (5 ml) wurden Triethylamin (44,3 μl) und Acetanhydrid (30,1 μl) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (10 ml) gelöst und Essigsäureethylester (200 ml) zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (3 × 10 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 49,1 mg (89%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 9:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,43. Absorptionsspektrum: 636 nm (Methanol).
Herstellung der Farbstoffverbindung, die unter Syntheseschema II in Beispiel 1C als 14 bezeichnet wurde:
Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (12b, 120,5 mg) und 1-(3',5'-Dimethoxybenzyl)lepidiniumbromid (7, 119,5 mg) in Methylenchlorid (15 ml) und Methanol (1 ml) wurden Triethylamin (133 μl) und Acetanhydrid (90 μl) gegeben. Nach Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (10 ml) gelöst und Aceton (100 ml) und Essigsäureethylester (100 ml) wurden zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (3 × 20 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 147,3 mg (80%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,91. Absorptionsspektrum: 637 nm (Methanol).
Herstellung von Farbstoffverbindung, die unter Syntheseschema II in Beispiel 1C als 15 bezeichnet wurde:
Zu einer Lösung von 3-(2-Hydroxy)ethyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumbromid (12b, 171,1 mg) und 1-(4'-Carboxymethyl-benzyl)lepidiniumbromid (8, 168,8 mg) in Methylenchlorid (15 ml) und Methanol (1 ml) wurden Triethylamin (189 μl) und Acetanhydrid (128 μl) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (10 ml) gelöst und Aceton (50 ml) und Essigsäureethylester (50 ml) zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (3 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 208,9 mg (80%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,80. Absorptionsspektrum: 639 nm (Methanol).
Herstellung von Farbstoffverbindung, die unter Syntheseschema II in Beispiel 1C als 16 bezeichnet wurde:
Zu einer Lösung von 3-Methyl-2-(2-N-phenyl)ethenylbenzothiazoliumjodid (12a, 144,6 mg) und 1-(2'-Boronsäure)benzyllepidiniumbromid (9, 131,3 mg) in Methylenchlorid (5 ml) und Methanol (1 ml) wurden Triethylamin (153 μl) und Acetanhydrid (104 μl) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 15 min wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, unter Gewinnung eines blauen Feststoffs. Der Feststoff wurde erneut in Methanol (5 ml) gelöst und Essigsäureethylester (200 ml) zugegeben. Der erhaltene Feststoff wurde über Filtration gesammelt, mit Essigsäureethylester (3 × 30 ml) gewaschen und getrocknet. Weiteres Trocknen des Feststoffs in einem Ofen bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht lieferte 107 mg (50%) eines blauen Feststoffs. DC (Kieselgel, 4:1 Methylenchlorid:Methanol) R_f = 0,58. Absorptionsspektrum: 634 nm (Methanol).
D. Farbstoff-Stammlösung
Die Stammlösungen der Farbstoffe bei 5 mM Konzentration in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden durch Auflösen einer definierten Menge von jeder Farbstoffverbindung in geeigneten Volumen an DMSO hergestellt.
E. Farbstoff-Spektroskopie
Für spektroskopische Messungen wurde eine individuelle Probenlösung von jedem Farbstoff in PBS durch Verdünnen von Portionen seiner Stammlösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Insbesondere wurden in einer Ausführungsform die Farbstofflösungen durch Mischen von 2 μl der 5 mM Stammfarbstofflösung mit 5 ml PBS unter Gewinnung einer 2 μM Endfarbstoffkonzentration hergestellt. Die Fluoreszenzspektren der vorstehenden Lösungen wurden mit einem Spektrofluorometer unter Anwendung einer Anregungswellenlänge von 633 nm gemessen.
Lösungen der Farbstoffe dieser Erfindung, die an RNA binden, wurden durch Vereinigen von 2 μl der 5 mM Stammlösung des Farbstoffs und einer 5 ml Lösung RNA, gelöst in PBS, bei einer RNA-Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Das Fluoreszenzspektrum von jeder Farbstoff/RNA-Lösung wurde mit einem Spektrofluorometer unter Anwendung einer Anregungswellenlänge von 633 nm gemessen.
Lösungen der Farbstoffe dieser Erfindung, die an DNA binden, wurden durch Vereinigen von 2 μl der 5 mM Stammlösung des Farbstoffs und einer 5 ml Lösung von DNA, gelöst in PBS, bei einer DNA-Konzentration von 0,5 mg/ml hergestellt. Das Fluoreszenzspektrum von jeder Farbstoff/DNA-Lösung wurde mit einem Spektrofluorometer unter Anwendung einer Anregungswellenlänge von 633 nm gemessen.
F. Durchfluss-Zytometrie für rot-anregbare Farbstoffe
Ein XL^TM Durchflusszytometer [Beckman Coulter Inc., Miami, Florida] wurde zum Durchführen der hierin beschriebenen Versuche verwendet unter Verwendung der rot-anregbaren Farbstoffe der Erfindung. Das Durchflusszytometer wurde aus einem Standard XL^TM Durchflusszytometer durch Aufnehmen eines HeNe-Lasers (632,8 nm) und zwei rot-empfindlichen Photonenvervielfacherröhren (PMT). modifiziert. Ungefähr 11,5 mW 632,8 nm Laserlicht von dem vorstehenden Laser wurden an einer strahlformenden Optik des Durchflusszytometers einfallen lassen. Vorwärtslichtstreuung (FS), Seitenstreuung (SS) und ein Fluoreszenz-(FL)-Parameter in der orthogonalen Richtung wurden zum Analysieren der roten Zellen gemessen. Die roten Zellen wurden auf einer SS- gegen FS-Punktkurve eingefangen. Ein befestigtes Tor wurde dann verwendet, um die Reticen auf einer FL- gegen FS-Punktkurve zu zählen.
G. Bezugsanalysen
Getrennte Analysen für Reticulozyten wurden unter Verwendung von entweder, (1) den Beckman Coulter Reticulozytenreagenzien ReticONE^TM, welches auf einer blauanregbaren metachromatischen Fluoreszenzfarbstoffverbindung basiert, unter Anwendung eines Standard XL^TM Durchflusszytometers [Beckman Coulter Inc., Miami, Florida], mit einem 488 nm Argonlaser als der Beleuchtungsquelle, oder (2) dem herkömmlichen Retic-Count^TM Reticulozytenzählungsverfahren (Becton Dickinson Kat. Nr. 349204), unter Anwendung von Thiazolorange, angeregt bei 488 nm, in einem FACSCAN^TM Durchflusszytometer ausgeführt. Das ReticONE^TM Verfahren, FS-, SS- und zwei FL-Parameter, wurden zum Analysieren der roten Zellen, die mit dem blau-anregbaren Fluoreszenzfarbstoff, der in dem ReticONE^TM Reagenz enthalten war, analysiert. Außerhalb der zwei gemessenen FL-Parameter wird einer bei 525 nm gemessen, was der Fluoreszenz aufgrund von an DNA gebundenem Farbstoff entspricht, und der andere wird bei 675 nm gemessen, was dem an RNA gebundenen Farbstoff entspricht. Ein automatisierter Toralgorithmus, erhältlich von kommerziellen XL^TM Durchflusszytometern, berechnete den Reticulozytenprozentsatz von einer DNA- gegen RNA-Fluoreszenzpunktkurve. Dieses Verfahren wird in US-Patent Nr. 5 639 666 beschrieben.
Für das Retic-Count^TM Verfahren wurden FS-, SS- und ein FL-Parameter gemessen, um die mit dem blau-anregbaren Fluoreszenzfarbstoff Thiazolorange, das in dem Retic-Count^TM Reagenz enthalten ist, angefärbte rote Zellen zu analysieren.
Beispiel 2 – Fluoreszenzvergleich der erfindungsgemäßen Farbstoffe im gebundenen und ungebundenen Zustand
Um einen Fluoreszenzfarbstoff als einen geeigneten Kandidaten für die Reticulozytenzählung herauszufinden, wurden die Fluoreszenzeigenschaften von einigen verschiedenen Verbindungen bestimmt. Für die Reticulozytenzählung ist es besonders erwünscht, dass Farbstoffe vorliegen, die schwach fluoreszierend sind, wenn sie an RNA gebunden sind, jedoch wesentliche Verstärkung der Fluoreszenzinten sität zeigen, wenn sie an RNA gebunden sind. Jedoch ist es nicht möglich, vorherzusagen, welche Farbstoffverbindung diese idealen Kombinationswirkungen auf ihre Fluoreszenzwirkung, sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von RNA, aufweisen wird. Insbesondere haben die Erfinder gefunden, dass die erfindungsgemäßen Farbstoffe günstige Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, die für den empfindlichen Nachweis von RNA erforderlich sind.
Für Fluoreszenzmessungen wurde eine Stammlösung von jeder Verbindung in DMSO (wie in Beispiel 1D beschrieben) hergestellt. Ein Teil von dieser Stammlösung wurde in PBS verdünnt, um eine Farbstoffkonzentration von 2 μM zu erhalten. 1 ml von dieser verdünnten Lösung wurde in eine Glasküvette gegeben und die erhaltenen Fluoreszenzspektren regten den Farbstoff bei seinem Anregungswellenlängenmaximum an. Nun wurde 1 ml einer Lösung von freien Kalbsleber RNA (Sigma), gelöst in PBS, bei einer Konzentration von 8 mg/ml und einem gemessenen Volumen der Stammlösung gemischt, um eine Farbstoffkonzentration von 2 μM in der RNA-Lösung zu erhalten. Diese Farbstofflösung, die in der RNA-Lösung verdünnt wurde, wurde in eine Glasküvette gegeben und die Fluoreszenzspektren, unter Verwendung der gleichen Anregung wie in der vorstehenden Messung, gemessen. Beispielsweise zeigt 1A den Vergleich der Fluoreszenzspektren der Farbstoffverbindung ReticRed1 in PBS-Lösung mit (siehe die obere Kurve) und ohne RNA (siehe die untere Kurve), die in der Lösung vorliegen.
In 1B wird der Vergleich der Fluoreszenzintensität von verschiedenen Verbindungen, in Gegenwart von RNA in Lösung, wiedergegeben. In dieser 1B werden die Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe bezüglich der Fluoreszenzintensität eines kommerziellen Farbstoffs Syto 62 (Molecular Probes Inc.), hierin als ein Bezugsstandard verwendet, gezeigt. Die Strukturen der zusätzlichen Verbindungen, die in diese Studie eingeschlossen sind und in 1B gezeigt werden, jedoch vorstehend nicht bereits beschrieben wurden, werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 1 vergleicht die Fluoreszenzintensitäten der erfindungsgemäßen Farbstoffe, ReticRed1 bis ReticRed6 (Konzentration 2 μM), wenn sie nicht an RNA gebunden sind (nicht an RNA gebunden) und wenn sie in Gegenwart von RNA vorliegen (an RNA gebunden). Diese Intensitäten wurden bei den Peak-Emissionswellenlängen für jedes Fluoreszenzspektrum, das wie vorstehend angegeben gemessen wurde, erhalten. 1C vergleicht die Fluoreszenzintensitäten der an RNA gebundenen und nicht gebundenen Farbstoffe in graphischer Form.
Tabelle 1
Tabelle 2
Beispiel 3 – Anfärben von Reticulozyten mit ReticRed1 in isotonischer Salzlösung ISOFLOW^TM
Eine Blutprobe, die aus einem örtlichen Krankenhaus bezogen wurde, wurde angewendet, um die Anfärbungskinetik von ReticRed1 (hergestellt wie in Beispielen 1A und D beschrieben) einzeln zu bestimmen. Die Blutprobe wurde zuerst durch zwei unabhängige, automatisierte Bezugsverfahren analysiert: das ReticONE^TM Verfahren [beschrieben in Beispiel 1G] und das Neue Methylen-Blau-Verfahren, ein kommerzielles Verfahren, das zur Verwendung in Gen*S^TM Instruments (Beckman Coulter) verfügbar ist. Das ReticONE^TM Bezugsverfahren ergab einen Retic-Prozentsatz von 7% und das Gen*S^TM Verfahren ergab einen Retic-Prozentsatz von 6,7%.
Für Messungen unter Verwendung von ReticRed1 wurde 1 μl Vollblut zu 1 ml einer isotonischen Salzlösung, die 5 μM ReticRed1-(verdünnt aus der 5 mM Stammlösung, die in Beispiel 1C beschrieben wurde)-Lösung enthält, gegeben und für 10 und 40 Minuten inkubiert. Die Probe wurde dann in einem XL^TM Durchflusszytometer gemessen, das modifiziert war, um einen roten HeNe-Laser (632,8 nm), wie in Beispiel 1E beschrieben, aufzunehmen. Wenn Vollblut mit ReticRed1 behandelt und im Fluss analysiert wurde, ergab rote Fluoreszenz in der 660 nm Bande eine Population von roten Zellen, und wies das Vorliegen von Nukleinsäure, die an ReticRed1 in solchen Zellen gebunden ist, aus. Diese Fluoreszenz erfolgt aufgrund der mit ReticRed1 angefärbten Reticulozyten. Die Durchflusszytometriedaten können gemäß der Dauer der Inkubation wie nachstehend zusammengefasst werden: (a) 10 Minuten: Gesamtzählung 42660, Rote Zellen 32841, Reticulozyten 801, berechneter Retic-Prozentsatz 2,4%; (b) 40 Minuten: Gesamtzählung 46199, Rote Zellen 39713, Reticulozyten 2310, berechneter Retic-Prozentsatz 5,8%; siehe 2A und 2B.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass der ReticRed1 Farbstoff einzeln einen relativ langen Zeitraum zum Bewirken von Anfärbung der intrazellulären RNA erfordert.
Beispiel 4 – Schnelles Anfärben von Reticulozyten mit ReticRed1, unter Verwendung von Vollblutproben
Obwohl vorstehendes Beispiel 3 zeigte, dass der Farbstoff ReticRed1 in einer isotonischen Salzlösung einen relativ langen Zeitraum zum Anfärben von Reticulozyten benötigt, haben wir gefunden, dass beim Anwenden dieses Farbstoffs zum Anfärben von Reticulozyten, in Gegenwart von zusätzlichen erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen, die Inkubationszeit für das Anfärben signifikant vermindert werden kann. Versuche, unter Verwendung von vier getrennten Blutproben, werden angeführt, um das schnelle Anfärben von Reticulozyten durch den Farbstoff ReticRed1 zu zeigen.
A. Versuch 1
1 μl Vollblut (aus dem gleichen Donor, dessen Blut zum Durchführen der in vorstehendem Beispiel 3 beschriebenen Analysen wurde) wurde in 1 ml einer ein Kugelmittel, dass die roten Zellen kugelförmig werden, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff ReticRed1, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat, bei einer Endkonzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und für etwa 1 Minute inkubiert. Die Probe wurde dann in einem XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert, um einen roten HeNe-Laser (632,8 nm) aufzunehmen, analysiert. Das Kugelmittel ist eine Lösung, die etwa 20 μg/ml Dodecyl-β-D-maltosid und 0,05% Proclin 300 in PBS, bei etwa pH 7,4 und etwa 290 mOsm, umfasst.
Die mit ReticRed1 so angefärbte Probe wurde dann in einen Durchflusszytometer, unter Verwendung von 632,8 nm Anregung von einem HeNe-Laser, analysiert. Hellrote Fluoreszenz in der 660 nm Bande ergab sich aus den Reticulozyten. Die Ergebnisse von diesem Versuch werden in 3 gezeigt. Die Verteilung der Zellen in dieser Punktkurve, die Vorwärtsstreuung gegen Fluoreszenz zeigt, ist konsistent mit der Verteilung von reifen roten Zellen und Reticulozyten, die bereits von Tanke et. al. [vorstehend zitiert], in Bezug auf ihre Arbeit über Fluoreszenz basierende Reticulozytenmessungen, gezeigt wurde. Der Prozentsatz an Reticulozyten, die durch das vorliegende Verfahren gezählt wurden, war 7,3%.
B. Versuch 2
1 μl Vollblut von einem weiteren, anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 4A, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, dem Farbstoff ReticRed1, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat, bei einer Endkonzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und für etwa 1 Minute inkubiert. Die Probe wurde dann in einem XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), analysiert.
Die so mit dem ReticRed1 angefärbte Probe wurde dann in einem Durchflusszytometer, unter Verwendung von 632,8 nm Anregung von einem HeNe-Laser, analysiert. Das Ergebnis dieses Versuchs wird in 4 gezeigt. Die Verteilung der Zellen in dieser Vorwärtsstreuung-gegen-Fluoreszenz-Punktkurve zeigt deutlich die Reticulozyten mit höherer Fluoreszenzintensität. Der Prozentsatz an Reticulozyten, die in diesem Versuch gezählt wurden, war 7,5%. Ein unabhängiger Bezugswert für Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 8%.
C. Versuch 3
1 μl Vollblut aus einem normalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 4A, Versuch 1, vorstehend), das rote Zellen zu Kugeln macht, Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff ReticRed1, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat, bei einer Endkonzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und für etwa 1 Minute inkubiert. Die Probe wurde dann in einem XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), analysiert. Die mit dem Farbstoff ReticRed1 so angefärbte Blutprobe wurde zum Fluss, unter Verwendung von 632,8 nm Anregung von einem HeNe-Laser, analysiert. Das Ergebnis dieses Versuchs wird in 5 gezeigt. Der durch diesen Versuch gezählte Reticulozytenprozentsatz war 0,82%. Eine unabhängige Bezugsmessung für das Blut aus dem gleichen Donor, unter Verwendung von neuem Methylenblau, in einem kommerziell erhältlichen klinischen Hämatologieanalysator, ergab einen Retic-Prozentsatz von 0,95%.
D. Versuch 4
1 μl von anormalem Vollblut aus einem Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 4A, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff ReticRed1, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonat, bei einer Endkonzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und für etwa 1 Minute inkubiert. Die Probe wurde dann in einem XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), analysiert.
Das so mit ReticRed1 angefärbte Probenblut wurde dann im Durchflusszytometer, unter Verwendung von 632,8 nm Anregung von einem HeNe-Laser, analysiert. Das Ergebnis dieses Versuchs wird in 6 gezeigt. Der in diesem Versuch gezählte Reticulozytenprozentsatz war 13,7%. Ein unabhängiges Bezugsverfahren für diese gleiche Probe ergab einen Retic-Prozentsatzwert von 13%.
Beispiel 5 – Schnelles Anfärben von Reticulozyten mit ReticRed3 unter Verwendung von Vollblutproben
A. Versuch 1
2 μl Vollblut aus einem anormalen Donor mit einer hohen Reticulozytenzahl wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 4A, Versuch 1, vorstehend), das rote Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal^® (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, dem Farbstoff ReticRed3, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonat, bei einer Endkonzentration von 50 μM, umfassenden Lösung gegeben und wurde für etwa eine Sekunde mild gemischt/inkubiert. Das Gemisch wurde dann in das XL^TM Durchflusszytometer, das den roten HeNe-Laser zur Analyse enthält, gesaugt.
Das Ergebnis dieses Versuchs wird in 7 gezeigt, wo die Reticulozyten von den reifen roten Blutzellen durch höhere Fluoreszenzintensitäten, die mit ihnen verbunden sind, unterschieden werden. Der Prozentsatz an durch diesen Versuch gezählten Reticulozyten war 13,8%. Ein unabhängiger Bezugswert für den für diese Probe, unter Verwendung des herkömmlichen Retic-Count^TM Reticulozytenzählverfahrens (unter Verwendung von Thiazolorange, angeregt bei 488 nm) in einem FACSCAN Durchflusszytometer, gemessenen Reticulozytenprozentsatz war 13,3%.
B. Versuch 2
2 μl Vollblut von einem anormalen Donor mit niedrigen Reticulozytenzählungen wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 4A, Versuch 1, vorstehend), das rote Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff ReticRed3, bei einer Konzentration von 5 μM, und eine Lösung von p-Toluolsulfonat, mit einer Endkonzentration von 50 μM, umfassenden Lösung gegeben und für etwa eine Sekunde mild vermischt/inkubiert. Das Gemisch wurde dann in das XL^TM Durchflusszytometer, das den roten HeNe-Laser zur Analyse enthält, gesaugt.
Das Ergebnis dieses Versuchs wird in 8 gezeigt. Der Prozentsatz an durch diesen Versuch gezählten Reticulozyten war 1%. Ein unabhängiger Bezugswert für den für diese Probe, unter Verwendung des herkömmlichen Retic-Count^TM Reticulozytenzählverfahrens (Thiazolorange, angeregt bei 488 nm) in einem FACSCAN Durchflusszytometer, gemessenen Reticulozytenprozentsatz war 1,3%.
Beispiel 6 – Vergleich von Fluoreszenzintensität der erfindungsgemäßen Farbstoffe im gebundenen und ungebundenen Zustand
Um die relativen Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe im gebundenen und ungebunden Zustand zu vergleichen, wurden Fluoreszenzmessungen in einem Spektrofluoromefer durch Anregen von jeder Farbstofflösung bei 633 nm unter geeigneten Bedingungen, Aufzeichnen des Fluoreszenzspektrums jeder Probe und Messen der Intensitäten bei dem Peak der Fluoreszenzspektren durchgeführt.
Um die Fluoreszenzintensitäten in Abwesenheit von DNA oder RNA (d.h. ungebundener Zustand) zu messen, wurde eine erste Stammlösung von jeder Verbindung in DMSO hergestellt (wie in Beispiel 1D beschrieben). Ein Teil der Stammlösung für den Farbstoff-1 wurde in PBS verdünnt, um eine Farbstoffkonzentration von 2 μl zu erhalten. Nun wurde 1 ml dieser verdünnten Lösung in einer Glasküvette angeordnet und das Fluoreszenzspektrum dieser Lösung wurde durch ein Spektrofluorometer, unter Anwendung einer Anregungswellenlänge von 633 nm, gemessen.
Nun wurde 1 ml einer Lösung von freier Torulahefe-RNA (Sigma) in PBS bei einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und das gemessene Volumen der Farbstoffstammlösung von Farbstoff-1 wurde gemischt, um eine Farbstoffkonzentration von 2 μM der RNA-Lösung zu erhalten. Das Fluoreszenzspektrum dieser Farbstofflösung, in Gegenwart von RNA, wurde durch Bestrahlen der Probe bei 633 nm gemessen. 9A zeigt den Vergleich der Fluoreszenzspektren vom Farbstoff Farbstoff-1 in PBS-Lösung mit (siehe die obere Kurve) und ohne RNA (siehe die untere Kurve), die in der Lösung vorliegen.
Für Fluoreszenzmessungen in DNA wurden 1 ml einer Lösung von freier Kalbsthymus-DNA (Sigma), gelöst in PBS, bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml, und ein abgemessenes Volumen der Farbstoffstammlösung angemischt, um eine Farbstoffkonzentration von 2 μM in der RNA-Lösung zu erhalten. Das Fluoreszenzspektrum der Farbstofflösung wurde nun durch Bestrahlen der Probe bei 633 nm gemessen. 9B zeigt den Vergleich der Fluoreszenzspektren des Farbstoffs Farbstoff-1 in PBS-Lösung mit (siehe die obere Kurve) und ohne DNA (siehe die untere Kurve), die in der Lösung vorliegen.
In der gleichen Weise wurden die vorstehend beschriebenen Versuche für den Farbstoff Farbstoff-2 bis Farbstoff-6 (siehe 9C und 9L) wiederholt.
Tabelle 3 vergleicht die relativen Fluoreszenzintensitäten der erfindungsgemäßen Farbstoffe, Farbstoff-1 und Farbstoff-2 (Konzentration 2 μM), wenn sie nicht an RNA gebunden sind (ungebunden an RNA) und wenn sie in Gegenwart von RNA vorliegen (gebunden an RNA), und wenn sie in Gegenwart von DNA vorliegen (gebunden an DNA). Diese Intensitäten werden an dem Peak der entsprechenden Fluoreszenzspektren, wie vorstehend beschrieben, erhalten.
Tabelle 3
Tabelle 4 vergleicht die Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe der Gruppe III (Farbstoff-3 bis Farbstoff-6) der vorliegenden Erfindung, wenn sie nicht an RNA gebunden sind (nicht an RNA gebunden) und wenn sie in Gegenwart von RNA vorliegen (an RNA gebunden). Die Intensitäten wurden an dem Peak der Emissionsspektren gemessen.
Tabelle 5 vergleicht die Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe der Gruppe III (Farbstoff-3 bis Farbstoff-6) der vorliegenden Erfindung, wenn sie nicht an DNA gebunden sind (nicht an DNA gebunden) und wenn sie in Gegenwart von DNA vorliegen (an DNA gebunden). Die Intensitäten wurden an dem Peak der Emissionsspektren gemessen.
Tabelle 4
Tabelle 5
Beispiel 7 – Schnelles Anfärben von Reticulozyten mit Farbstoff-1 unter Anwendung von Vollblutproben
Wir haben gefunden, dass der Farbstoff Farbstoff-1 in Gegenwart der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen schnell durch die Zellmembran der Reticulozyten gelangt, wodurch die Inkubationszeit für das Anfärben deutlich vermindert wird. Versuche werden unter Verwendung von drei getrennten Blutproben ausgeführt, um das schnelle Anfärben von Reticulozyten durch den Farbstoff Farbstoff-1 zu zeigen. Wir beziehen uns auf diese drei Versuche als Versuch 1, Versuch 2 bzw. Versuch 3.
A. Versuch 1
1 μl Vollblut von einem normalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelreagenz, das die roten Zellen zu Kugeln machen kann, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff Farbstoff-1, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und unmittelbar danach zur Analyse in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen von einem roten HeNe-Laser (632,8 nm), gesaugt. Das Kugelmittel ist eine etwa 20 μg/ml Dodecyl-β-D-maltosid und 0,05% Proclin 300 in PBS, bei etwa pH 7,4 und etwa 290 mOsm, umfassende Lösung.
10A zeigt die Fluoreszenz der Reticulozyten bezüglich der reifen roten Zellen für diese Probe. Der Prozentsatz an in dem vorliegenden Verfahren gezählten Reticulozyten war 1,9%, was innerhalb des erwarteten normalen Bereichs lag.
B. Versuch 2
1 μl Vollblut von einem anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff Farbstoff-1, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt.
10B zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten bezüglich der reifen roten Blutzellen für diese Probe. Die Verteilung der Zellen in dieser Vorwärtsstreuung-gegen-Fluoreszenz-Punktkurve zeigt deutlich die Reticulozyten mit relativ hoher Fluoreszenzintensität. Der Prozentsatz an durch diesen Versuch gezählten Reticulozyten war 10,6%. Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 12%.
C. Versuch 3
1 μl Vollblut von einem weiteren anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, und den Farbstoff Farbstoff-1, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt.
10C zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten bezüglich der reifen roten Blutzellen für diese Probe. Die Verteilung der Zellen in dieser Vorwärtsstreuung-gegen-Fluoreszenz-Punktkurve zeigt deutlich die Reticulozyten mit hoher Fluoreszenzintensität. Der Prozentsatz an in diesem Versuch gezählten Reticulozyten war 26,3%. Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 27%.
Beispiel 8 – Schnelles Anfärben von Reticulozyten mit Farbstoff-2 unter Anwendung von Vollblutproben
Wir haben gefunden, dass auch Farbstoff-2 in Gegenwart der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen schnell durch die Zellmembran von Reticulozyten gelangen kann, wodurch die Inkubationszeit zum Anfärben deutlich vermindert wird. Versuche wurden unter Verwendung von drei verschiedenen Blutproben ausgeführt, um schnelles Anfärben von Reticulozyten durch den Farbstoff Farbstoff-2 zu zeigen. Wir beziehen uns auf diese drei Versuche als Versuch 4, Versuch 5 bzw. Versuch 6.
A. Versuch 4
1 μl Vollblut von einem normalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelreagenz, das rote Zellen zu Kugeln machen kann, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff Farbstoff-2, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben und unmittelbar danach in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen von einem roten HeNe-Laser (632,8 nm), zur Analyse gesaugt. Das Kugelmittel ist eine etwa 20 μg/ml Dodecyl-β-D-maltosid und 0,05% Proclin 300 in PBS, bei etwa pH 7,4 und etwa 290 mOsm, umfassende Lösung.
11A zeigt die Fluoreszenz der Reticulozyten bezüglich der reifen roten Blutzellen für diese Probe. Der Prozentsatz an durch das vorliegende Verfahren gezählten Reticulozyten war 1,8%.
B. Versuch 5
1 μl Vollblut von einem anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, und den Farbstoff Farbstoff-2, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt.
11B zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten bezüglich der reifen roten Blutzellen für diese Probe. Die Verteilung der Zellen in dieser Vorwärtsstreuung-gegen-Fluoreszenz-Punktkurve zeigt deutlich die Reticulozyten mit hoher Fluoreszenzinten sität. Der Prozentsatz an durch diesen Versuch gezählten Reticulozyten war 12,5%. Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 12%.
C. Versuch 6
1 μl Vollblut von einem stark retischen, anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, und den Farbstoff Farbstoff-2, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt.
11C zeigt die Fluoreszenz von Reticulozyten bezüglich der reifen roten Blutzellen für diese Probe. Die Verteilung der Zellen in dieser Vorwärtsstreuung-gegen-Fluoreszenz-Punktkurve zeigt deutlich die Reticulozyten mit hoher Fluoreszenzintensität. Der Prozentsatz an in diesem Versuch gezählten Reticulozyten war 24%. Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 27%.
Beispiel 9 – Schnelles Anfärben von Reticulozyten mit Farbstoff-3 unter Anwendung von Vollblutproben
A. Versuch 7
1 μl Vollblut von einem normalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelreagenz, das rote Zellen zu Kugeln machen kann, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, den Farbstoff Farbstoff-3, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben, und unmittelbar danach in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Laser (632,8 nm), zur Analyse gesaugt. Das Kugelmittel ist eine etwa 20 μg/ml Dodecyl-β-D-maltosid und 0,05% Proclin 300 in PBS, bei etwa pH 7,4 und etwa 290 mOsm, umfassende Lö sung. Der Prozentsatz an durch das vorliegende Verfahren gezählten Reticulozyten war 2,3% (siehe 4A).
B. Versuch 8
1 μl Vollblut von einem anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, und den Farbstoff Farbstoff-3, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt. Der Prozentsatz an durch diesen Versuch gezählten Reticulozyten war ungefähr 14,6% (siehe 4A). Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 12%.
C. Versuch 9
1 μl Vollblut von einem weiteren anormalen Donor wurde zu 1 ml einer ein Kugelmittel (beschrieben in Beispiel 7, Versuch 1, vorstehend), das die roten Zellen zu Kugeln macht, das Detergenz Igepal (Sigma CA-630), bei einer Konzentration von 0,01%, und den Farbstoff Farbstoff-3, bei einer Konzentration von 5 μM, umfassenden Lösung gegeben. Unmittelbar danach wurde das Gemisch in ein XL^TM Durchflusszytometer, modifiziert zum Aufnehmen eines roten HeNe-Lasers (632,8 nm), zur Analyse gesaugt. Der Prozentsatz an in diesem Versuch gezählten Reticulozyten war ungefähr 24% (siehe 12A). Ein unabhängiger Bezugswert für den Reticulozytenprozentsatz in dieser Probe war 27%.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf eine besonders bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, wird eingeschätzt, dass Modifizierungen erfolgen können. Es ist vorgesehen, dass solche Modifizierungen in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

Farbstoffzusammensetzung, umfassend (a) einen Farbstoff mit der Formel
, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOH ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OH, eine Alkyl-, eine Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist und B^– ein Gegenanion ist; und (b) eine oder mehrere Komponente(n), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem grenzflächenaktiven Mittel, einem Konservierungsmittel und einer Sulfonsäure oder einem Salz davon.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 H ist, R CH₂CH₂OH ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 H ist, R CH(CH₃)₂ ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 H ist, R CH₃ ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 CH₃ ist, R CH₃ ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 CH₃ ist, R CH(CH₃)₂ ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, R1 CH₃ ist, R CH₂CH₂OH ist, R2 CH₂CH₂OH ist, und X S ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Komponente ein grenzflächenaktives Mittel ist.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Komponente eine Sulfonsäure oder ein Salz davon ist.
Verfahren zum Anfärben einer Nukleinsäure, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens einer Probe von Blutzellen, die Nukleinsäure enthalten, mit einem Farbstoff mit der Formel
, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOH ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OH, eine Alkyl-, eine Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkyl gruppe ist, und B^– ein Gegenanion ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Blutzellen kernhaltige rote Blutzellen oder Reticulozyten umfassen.
Farbstoff mit der Formel
, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_m OAc ist, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; R CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂OAc, eine Alkyl-, eine Alkylsulfonat- oder eine Hydroxyalkylgruppe ist, und B^– ein Gegenanion ist.
Farbstoff gemäß der Formel
, wobei n 0, 1 oder 2 ist; R1 H, eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe ist; R2 CH₂(CH₂)_mOH oder CH₃ ist; X O, S oder C(CH₃)₂ ist; B^– ein Gegenanion ist, und R3, R4, R5, R6 verschiedene Substituenten, wie durch die Formeln für die spezifischen Verbindungen Farbstoff-3 bis Farbstoff-6 dargestellt, sind.
Farbstoff nach Anspruch 12, wobei n = 1; R₁ = H; R = CH₃, R2 = CH₂CH₂OAc; X = S, und B^– Br^– ist.
Farbstoff nach Anspruch 12, wobei n = 1, R1 = H, R2 = R = CH₂CH₂OAc, X = S, und B^– Br^– ist.
Farbstoff nach Anspruch 13, wobei n = 1; X = S; R₁ = CH₂CH₂OH; R₂ = R₄ = R5 = H; R3 = CO·CH₃; und B^– Br^– ist.
Farbstoff nach Anspruch 13, wobei n = 1; X = S; R₁ = CH₂CH₂OH; R₂ = R₄ = R5 = H; R3 = CO·CH₃; und B^– Br^– ist.
Farbstoff nach Anspruch 13, wobei n = 1; X = S; R₁ = CH₂CH₂OH; R₂ = R₃ = R₄ = R₅ = H; und B^– Br^– ist.
Farbstoff nach Anspruch 13, wobei n = 1; X = S; R₁ = CH₂CH₂OH; R₂ = R₃ = R₄ = H; R₅ = B(OH)₂; und B^– I^– ist.
Farbstoffzusammensetzung zum Anfärben von Reticulozyten nach Anspruch 12 oder 13, weiter umfassend ein grenzflächenaktives Mittel.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, weiter umfassend eine Sulfonsäure oder ein Salz davon.
Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, weiter umfassend ein Konservierungsmittel.
Verfahren zur Analyse einer Blutzellenprobe, umfassend die Schritte (a) des Inkontaktbringens einer Blutzellprobe, welche kernhaltige rote Blutzellen oder Reticulozyten enthält, mit einer Verbindung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13 derart, daß die kernhaltigen roten Blutzellen oder Reticulozyten durch die Verbindung angefärbt werden, und (b) des Analysierens der angefärbten Blut zellprobe mittels Durchflußzytometrie zum Nachweisen der Anwesenheit von Reticulozyten.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Analyse mittels Durchflußzytometrie das Messen eines Fluoreszenzparameters und mindestens eines Parameters, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lichtstreuung, axialem Lichtverlust, Gleichstrom-Elektrische Impedanz und Radiofrequenz (RF)-Leitfähigkeit und Kombinationen davon, einschließt.