DE69827636T2

DE69827636T2 - Blutverdünnungsreagenz

Info

Publication number: DE69827636T2
Application number: DE69827636T
Authority: DE
Inventors: I. Mirta RIESGO; Jo Carole YOUNG
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2018-07-16
Also published as: CN1265196A; WO1999006829A1; JP2001512238A; CN1163751C; DE69827636D1; US5935857A; EP1000356B1; JP4153162B2; EP1000356A1

Description

Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Hämatologie und der Immunologie und Verbesserungen von Reagenzien, die zur Analyse von Blutzellen verwendet werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verdünnungsmittel, das besonders zum Zählen und zur Größenbestimmung von Blutzellen, zur Bestimmung von Hämoglobinparametern und zur Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen in einer einzelnen Blutzellprobe mittels geeigneter elektronischer Geräte geeignet ist.
Es ist ein gebräuchliches medizinisch-diagnostisches Verfahren, eine Blutprobe eines Patienten zu analysieren, um bezüglich der Blutprobe bestimmte klassische Bestimmungen durchzuführen. Dieses Verfahren ist ein wichtiges Hilfsmittel für den Arzt. Wichtige Parameter werden als Anzahl der roten Blutzellen (RBC), Hämatokrit (HCT), Hämoglobin (HGB), mittleres Zellvolumen (MCV), mittlerer Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten (MCH), mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Anzahl der Blutplättchen (PLT) und mittleres Blutplättchenvolumen (MPV) bezeichnet. Diese Parameter werden in ein vollständiges Blutbild (CBC) einbezogen. Weitere wichtige Bestimmungen sind die Anzahl der weißen Blutzellen (WBC) und die Differenzierung der weißen Blutzellen in drei oder mehr Subpopulationen.
Im Allgemeinen umfasst die Blutzellanalyse das Verdünnen einer Blutprobe mit einem Fluid, das als Verdünnungsmittel wirkt, das Analysieren eines Teils der verdünnten Blutprobe bezüglich roter Blutzellen und der Blutplättchenparameter und das In-Kontakt-Bringen des anderen Teils der verdünnten Blutprobe mit einem lytischen Reagenz, um die Erythrozyten und Blutplättchen zu entfernen, so dass eine Zählung und Differenzierung von Leukozyten möglich wird. Eines der frühesten beschriebenen Verdünnungsmittel war physiologische Kochsalzlösung. Verbesserte Verdünnungsmittel für Vollblutproben enthielten typischerweise bestimmte physiologische Salze, spezifische Puffer und Konservierungsmittel. Darüber hinaus führte die Verwendung anderer Reagenzien bei der Blutzellanalyse, einschließlich gerinnungshemmender Mittel in der Blutprobe, Detergenzien, monoklonaler Antikörper, von Farbstoffen und Färbemitteln, zu nicht vorhersagbaren Wechselwirkungen zwischen der biologischen Probe und den chemischen Reagenzien, insbesondere bei variierenden Arbeitstemperaturen.
Aufgrund der Empfindlichkeit der Erythrozyten, der Leukozyten, der Blutplättchen und der Hämoglobinkonzentration gegenüber den chemischen Reagenzien war es sehr schwierig, eine Kombination von chemischen Reagenzien zu finden, welche die Eigenschaften der Zellen, die analysiert werden sollen, und die Hämoglobinparameter nicht verschlechtern oder in unerwünschter Weise verändern, insbesondere bei variierenden Arbeitstemperaturbedingungen. Häufig wird eine Komponente wie z. B. ein Konservierungsmittel zur Aufrechterhaltung der Stabilität eines Reagenzes zugesetzt, das jedoch die physikalischen Parameter der Zellen schwerwiegend und in schädlicher Weise beeinflusst, oder einem Verdünnungsmittel wird eine Komponente für eine bestimmte funktionelle Eigenschaft zugesetzt, wobei diese Komponente jedoch andere Blutzellbestimmungen nachteilig beeinflusst. In einem derartigen Beispiel wurde gefunden, dass der Zusatz einer Komponente zur Stabilisierung von Leukozyten die Hämoglobinkonzentrationsbestimmungen nachteilig beeinflusst.
Da die physikalischen Parameter der Zellen durch die Bestandteile eines beliebigen Verdünnungsmittels und das Analyseverfahren beeinflusst werden, und zwar ungeachtet davon, ob dieses automatisiert, halbautomatisiert oder manuell durchgeführt wird, wurden Verdünnungsmittel des Standes der Technik zur spezifischen Verwendung mit einem spezifischen Test oder einem spezifischen Gerät formuliert. Diese Verdünnungsmittel des Standes der Technik waren in dem Sinn, dass sie in verschiedenen Testgeräten oder mit verschiedenen Testverfahren verwendet werden könnten, keine universellen Verdünnungsmittel oder Mehrzweck-Verdünnungsmittel. Beispielsweise unterscheidet sich im Allgemeinen ein käufliches Verdünnungsmittel, das zur hämatologischen Analyse verwendet wird, von einem Verdünnungsmittel, das für eine Fluoreszenz-Durchflusszytometrieanalyse verwendet wird, und zwar aufgrund der Probleme einer Verdünnungsmittelfluoreszenz oder einer Kompatibilität des Verdünnungsmittels bezüglich Fluoreszenzsonden oder monoklonalen Antikörpern.
Viele der Verdünnungsmittel des Standes der Technik weisen abhängig von dem Gerät, der Arbeitstemperatur, dem Alter der Probe und der spezifischen Parameter der Probe, die bestimmt werden sollen, einen oder mehrere Mängel auf. Blutverdünnungsmittel zur Verwendung in automatischen Hämatologiegeräten wurden in den US-Patenten 3,962,125 (Armstrong), 4,185,964 (Lancaster), 4,213,876 (Crews et al.), 4,529,705 (Larsen), 4,617,275 (Matsuda et al.), 4,745,071 (Lapicola et al.), 4,485,175 (Ledis et al.), 4,346,018, 4,521,518 und 4,962,038 (Carter et al.), 4,968,629 (Lapicola) und 5,250,438 (Ryan) beschrieben. Darüber hinaus stellen die folgenden Patente zusätzliche Informationen bezüglich Blutverdünnungsmitteln und deren Anwendung bereit.
Die US 4,255,385 (Stroupe et al.) beschreibt ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Hämoglobin in Blutproben. Die Veröffentlichung beschreibt ein Reagenz zum Lysieren und Verdünnen einer Vollblutprobe zur Zellanalyse. Das Reagenz enthält Kaliumhexacyanoferrat(III) zur Hämoglobinbestimmung.
Die US 4,506,018 (North) beschreibt ein Blutverdünnungsmittel zur Vermeidung von Blutzellvolumenänderungen durch einen ausgewogenen Einsatz der Effekte eines Konservierungsmittels und eines grenzflächenaktiven Mittels, die in dem Verdünnungsmittel eingesetzt werden.
Die US 4,656,139 (Matsuda et al.) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Blutanalyse, das den Schritt des Verdünnens einer Blutprobe mit einem Verdünnungsmittel umfasst, das eine Borsäurepufferlösung, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und (2-Pyridylthio-1-oxid)natrium umfasst. Das (2-Pyridylthio-1-oxid)natrium wird eingesetzt, um eine Hämoglobinbestimmung zu ermöglichen.
Die US 5,008,202 (Edmondson et al.) beschreibt ein Blutverdünnungsmittel und ein Verfahren zum Verdünnen von Blut zur Verwendung bei der Blutzellanalyse. Das Blutverdünnungsmittel umfasst im Allgemeinen einen organischen Puffer, ein Zellstabilisierungsmittel, ein anorganisches Salz, ein Lösungsmittel und EDTA, wobei das EDTA als antimikrobielles Mittel dient, oder ein Gemisch aus EDTA und Natriumfluorid, wobei diese zusammen als antimikrobielles Mittel dienen.
Die US 5,227,304 (Wong) beschreibt ein kompliziertes Reagenzsystem zur Zählung und Größenbestimmung von Blutzellen in einem Blutanalysegerät der Marke Cell Dyn^®. Das Reagenzsystem umfasst ein isotonisches Verdünnungsmittel und ein Detergenz, wobei das Verdünnungsmittel einen organischen Imidazolpuffer, ein antimikrobielles Mittel, anorganische Salze und ein pH-Einstellmittel umfasst. In der Beschreibung lehrt Wong, dass EDTA als Chelatisierungsmittel wirkt und den antimikrobiellen Charakter des Verdünnungsmittels verstärkt, wobei das antimikrobielle Mittel Natriumomadin [2-Pyridinthiol-1-oxid] und Triaden 3 [Hexahydro-1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin] oder Triaden 10 [ein Gemisch aus 60% Triaden 3 und 6% Natriumomadin] ist. (Natriumomadin ist eine eingetragene Marke der Olin Corporation.)
Die US 5,242,832 (Sakata) beschreibt ein lytisches Reagenz, das Imidazol und Imidazolderivate als Hämoglobinstabilisator enthält.
Die PCT-Patentanmeldung WO 95/24651 (Kim et al.) beschreibt ein lytisches Reagenz zur Verwendung bei Gesamthämoglobinmessungen, das Lauryldimethylaminoxid als lytisches Mittel und Imidazol und dessen Derivate als Hämoglobinstabilisator enthält. Das lytische Reagenz wird zum Lysieren von Erythrozyten für Hämoglobinbestimmungen ohne die Verwendung von Cyanid eingesetzt. Dieses Reagenzsystem wird jedoch nicht für eine andere Blutzellanalyse wie z. B. WBC oder eine Leukozytendifferenzierung verwendet.
Ferner wird bezüglich des Standes der Technik die EP 0 467 337 genannt, die eine Kombination für die Konservierung diagnostischer Tests beschreibt, die durch einen Gehalt an mindestens zwei Komponenten gekennzeichnet ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on-hydrochlorid, 2-Hydroxypyridin-N-oxid, Chloracetamid, (N,N-Methylen-bis-(N-(1-hydroxymethyl-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl))-harnstoff und 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan umfasst. Die EP 0 467 337 beschreibt auch einen konservierten diagnostischen Testkit, der Testreagenzien und mindestens zwei Konservierungsmittel umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on-hydrochlorid, 2-Hydroxypyridin-N-oxid, Chloracetamid, (N,N-Methylen-bis-(N-(1-hydroxymethyl-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl))-harnstoff und 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan umfasst.
Ferner wird bezüglich des Standes der Technik die WO 88/07187 genannt, die ein Verfahren und ein Reagenzsystem zur schnellen Isolierung, Identifizierung und/oder Analyse von Leukozyten einer Vollblutprobe beschreibt. Das lytische Reagenzsystem zur selektiven chemischen Behandlung des Vollbluts umfasst eine saure wässrige Lösung, die im Wesentlichen aus einem Verdünnungsmittel, einem lytischen Reagenz, das aus der Gruppe bestehend aus Ameisensäure, Essigsäure und deren jeweiligen Gemischen ausgewählt ist, wobei die relative Konzentration des lytischen Reagenzes in der sauren wässrigen Lösung ausreichend ist, um die Trennung einer Vollblutprobe in eine Fraktion mit lysierten roten Zellen und eine im Wesentlichen intakte Leukozytenfraktion in einem Zustand zu bewirken, der eine differenzierende Analyse von mindestens fünf Subpopulationen dieser Leukozyten ermöglicht, und einer für eine Klärung effektiven Menge an Saponin im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,20% (w/w) besteht.
Trotz der Verdünnungsmittel des Standes der Technik besteht nach wie vor ein Bedarf für ein Mehrzweck-Verdünnungsmittel, das den Bedarf für mehrere Verdünnungsmittel minimiert und in einer Umgebung mit variierender Temperatur eingesetzt werden kann. Ein Mehrzweck-Verdünnungsmittel vermeidet die Kosten, die Unannehmlichkeiten und die potenzielle Verwechslung, die durch das Bevorraten einer Anzahl verschiedener Verdünnungsmittel in nerhalb eines gegebenen klinischen Labors verursacht werden, um die verschiedenen Anforderungen eines spezifischen Hämatologieanalysegeräts oder Durchflusszytometrieanalysegeräts und einer spezifischen Analyse zu erfüllen, die auf jedem dieser Analysegeräte durchgeführt wird.
Im Hinblick auf die vorstehende Beschreibung ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verdünnungsmittel und ein Verfahren zur Verwendung eines verbesserten Verdünnungsmittels zur Bestimmung von Parametern roter Blutzellen, einschließlich der Hämoglobinkonzentration und der Blutplättchen in einer Blutprobe, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verdünnungsmittels und eines Verfahrens zur Verwendung des verbesserten Verdünnungsmittels zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutzellen und der Leukozyten-Subpopulationen in einer Blutprobe.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Mehrzweck-Blutverdünnungsmittel bereit, das nicht Hexahydro-1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin enthält, und das in der Analyse von roten Blutzellen, weißen Blutzellen, Blutplättchen und der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe verwendbar ist. Das Verdünnungsmittel umfasst eine erste Verbindung, die aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäurederivaten und Kombinationen davon ausgewählt ist, eine zweite Verbindung, die aus Imidazol, Imidazolderivaten und Kombinationen davon ausgewählt ist, ein Alkalimetallchlorid, eine dritte Verbindung, die aus Alkalimetallsulfat und Alkalimetallsalzen organischer Säuren ausgewählt ist, die aus Tartrat, Formiat, Lactat, Acetat, Citrat und Pyruvat und Kombinationen davon ausgewählt sind, wobei die erste Verbindung und die zweite Verbindung in einer Menge vorliegen, die für das Bereitstellen von reproduzierbaren Hämoglobin- und Zellvolumen-Messungen in einem Temperaturbereich von 12,8°C bis 40,5°C wirksam ist, und wobei das Verdünnungsmittel ein zum Leiten von elektrischem Strom befähigter Elektrolyt ist und isotonisch ist, so dass es das Blutzellvolumen stabilisiert und einen neutralen pH-Wert aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Analysieren einer Blutzellen enthaltenden Blutprobe bereit, welches a) das Mischen einer Blutzellen enthaltenden Blutprobe mit einem Mehrzweck-Blutverdünnungsmittel zum Bilden einer verdünnten Blutprobe, wobei das Verdünnungsmittel i) eine erste Verbindung, ausgewählt aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäurederivaten und Kombinationen davon, ii) eine zweite Verbindung, ausgewählt aus Imidazol, Imidazolderivaten und Kombinationen davon, iii) ein Alkalimetallchlorid, iv) eine dritte Verbindung, ausgewählt aus Alkalimetallsulfat und Alkalimetallsalzen von organischen Säuren, ausgewählt aus Tartrat, Formiat, Lactat, Acetat, Citrat und Pyruvat und Kombinationen davon umfasst, wobei das Verdünnungsmittel nicht Hexahydro- 1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin enthält, und wobei die erste Verbindung und die zweite Verbindung in einer Menge vorliegen, die für das Bereitstellen von reproduzierbaren Hämoglobin- und Zellvolumen-Messungen in einem Temperaturbereich von 12,8°C bis 40,5°C wirksam ist, und wobei das Verdünnungsmittel ein zum Leiten von elektrischem Strom befähigter Elektrolyt ist und isotonisch ist, so daß es das Blutzellvolumen stabilisiert und einen neutralen pH-Wert aufweist, und b) das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen umfasst.
Das erfindungsgemäße Mehrzweck-Verdünnungsmittel ist zur Analyse einer Blutprobe verwendbar. In einer ersten Ausführungsform ist das Verdünnungsmittel zur Bestimmung roter Blutzellen, von Hämoglobin und zur Messung von Blutplättchen verwendbar. Die Messungen umfassen die Zellgröße, die Zellform, den Zellgehalt und das Zellvolumen. Die Messungen können mittels Lichtstreuung, Niederfrequenzstrom, Hochfrequenzstrom, Fluoreszenz und Kombinationen davon durchgeführt werden. In einer zweiten Ausführungsform ist das Verdünnungsmittel zur Bestimmung der WBC und zur Differenzierung von Leukozyten in drei Subpopulationen verwendbar. In einer dritten Ausführungsform ist das Verdünnungsmittel als Hüllfluid in einer fokussierten Durchflusszytometrie zur Bestimmung von fünf Subpopulationen von Leukozyten verwendbar. In einer vierten Ausführungsform ist das Verdünnungsmittel zur Fluoreszenzdurchflusszytometrieanalyse bei der Verwendung von Fluoreszenzsonden oder Antikörpern geeignet.
Das Verdünnungsmittel ist lagerstabil und kann in einem breiten Bereich von Arbeitstemperaturen eingesetzt werden. Darüber hinaus kann es mit frischen oder gealterten Blutproben verwendet werden. Messungen, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verdünnungsmittel durchgeführt werden, sind mit Messungen vergleichbar, die unter Verwendung eines käuflichen Verdünnungsmittels durchgeführt werden.
Das Verdünnungsmittel enthält eine erste Verbindung, die aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), EDTA-Derivaten und Kombinationen davon ausgewählt ist. Die EDTA-Derivate umfassen Salze von EDTA, wie z. B. Dinatrium-EDTA und Ethylenglykol-bis-(3-aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure (EGTA). Die bevorzugte erste Verbindung ist Dinatrium-EDTA. Der Bereich der ersten Verbindung beträgt 2,5 g/Liter bis 11 g/Liter. Die bevorzugte Menge der ersten Verbindung beträgt 3 bis 8 g/Liter.
Das Verdünnungsmittel enthält auch eine zweite Verbindung, die aus Imidazol, Imidazolderivaten und Kombinationen davon ausgewählt ist. Die Imidazolderivate umfassen Phenylimidazol, Methylimidazol, Ethylimidazol und Butylimidazol. Der Bereich der zweiten Verbindung liegt bei 0,5 g/Liter bis 9 g/Liter. Die bevorzugte Menge der zweiten Verbindung beträgt 2 bis 4 g/Liter. Es wurde gefunden, dass die zweite Verbindung in dem Mehrzweck-Verdünnungsmittel ein kompatibler pH-Puffer ist.
Während eine Bindung an eine Theorie der Erfindung nicht erwünscht ist, wird gegenwärtig angenommen, dass die Kombination der ersten Verbindung und der zweiten Verbindung die einzelnen Blutzellen so beeinflusst, dass dann, wenn eine Blutprobe mit einer oder mehreren Messungen analysiert wird, die Blutprobe in konsistenter Weise in einem Temperaturbereich von 12,8°C bis 40,5°C, vorzugsweise von 15,5°C bis 32,2°C die gleiche Messung bereitstellt. Diese Leistungsstabilität über einen breiten Temperaturbereich ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, da Temperaturvariationen ausgehend von einer Standardarbeitstemperatur eines Geräts Variationen der Messungen verursachen können.
Das Verdünnungsmittel umfasst ferner ein Alkalimetallchlorid. Geeignete Alkalimetallchloride umfassen die Metalle, die aus der Gruppe bestehend aus Natrium und Kalium ausgewählt sind. Der Bereich des Alkalimetallchlorids liegt bei 0,1 bis 5,0 g/Liter. Die bevorzugte Menge des Alkalimetallchlorids beträgt 0,5 bis 3,5 g/Liter.
Das Verdünnungsmittel enthält auch eine dritte Verbindung, die i) aus Alkalimetallsulfat und ii) Alkalimetallsalzen von organischen Säuren, ausgewählt aus Tartrat, Formiat, Lactat, Acetat, Citrat und Pyruvat und Kombinationen davon, ausgewählt ist. Geeignete Alkalimetallsulfate umfassen die Metalle, die aus der Gruppe bestehend aus Natrium und Kalium ausgewählt sind. Der Bereich der dritten Verbindung liegt bei 8 bis 35 g/Liter. Die bevorzugte Menge der dritten Verbindung beträgt 10 bis 25 g/Liter. Die bevorzugte dritte Verbindung ist ein Alkalimetallsulfat. Die am meisten bevorzugte dritte Verbindung ist Natriumsulfat.
Das Alkalimetallchlorid und das Alkalimetallsulfat werden verwendet, um eine geeignete Osmolalität bereitzustellen, so dass das Zellvolumen nicht nachteilig beeinflusst wird. Im Allgemeinen wird das Mehrzweck-Verdünnungsmittel isoosmotisch sein. Insbesondere beträgt die Osmolalität etwa 200 bis 400 Milliosmol (mOsm), vorzugsweise 250 bis 380 mOsm und inbesondere 290 bis 350 mOsm. Die Osmolalität des Mehrzweck-Verdünnungsmittels kann jedoch variieren, wenn es mit einer lytischen Reagenzzusammensetzung verwendet wird. Das Volumen des Mehrzweck-Verdünnungsmittels kann relativ zu dem Volumen eines lytischen Reagenzes derart eingestellt werden, dass die Endosmolalität des Blutprobengemischs zwischen etwa 290 bis 350 mOsm, vorzugsweise bei 310 bis 330 mOsm liegt. Wenn das Mehrzweck-Verdünnungsmittel darüber hinaus als Hüllfluid in einem Durchflussgerät verwendet wird, sollte die Beziehung zwischen der Osmolalität und der Leitfähigkeit des Hüllfluids und der Osmolalität und der Leitfähigkeit des Kernfluids aufrechterhalten werden. Beispielsweise weist das Verdünnungsmittel typischerweise eine Leitfähigkeit von etwa 15 bis 23 mS/cm auf.
Der pH-Wert des Mehrzweck-Verdünnungsmittels wird gemäß dem einzusetzenden Gerät und Test ausgewählt. Im Allgemeinen wird das Verdünnungsmittel einen pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7,8 aufweisen. Für automatisierte und halbautomatisierte Geräte, die eine Volumenverteilungszählung durchführen, liegt der pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 7,6, vorzugsweise bei pH 6,6 bis 7,4. Wenn das Mehrzweck-Verdünnungsmittel als Hüllfluid für Durchflusszytometriegeräte verwendet wird, liegt der pH-Wert im Bereich von etwa pH 7,0 bis etwa 7,2.
Um für das Verdünnungsmittel einen pH-Wert im vorstehend genannten pH-Bereich zu erhalten, kann ein pH-Einstellmittel verwendet werden. Beispiele für pH-Einstellmittel, die geeignet sind, um den erforderlichen pH-Wert bereitzustellen, umfassen Säuren, typischerweise Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, und Basen, wie z. B. Alkalimetallhydroxide. Andere Säuren können verwendet werden, mit der Maßgabe, dass sie die Analyse der Blutprobe nicht stören. Beispiele für akzeptable Alkalimetallhydroxide umfassen Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid.
Die Reagenzzusammensetzung sollte weitere Eigenschaften aufweisen, die sie mit dem beabsichtigten Gebrauch kompatibel machen. Als erstes sollten sich die Verbindungen, die in dem Mehrzweck-Verdünnungsmittel verwendet werden, während der Gebrauchsfähigkeitsdauer des Produkts nicht zersetzen. Die Gebrauchsfähigkeitsdauer des Produkts umfasst die Zeit von der Herstellung des Produkts bis zu dem Zeitpunkt des Gebrauchs des Produkts durch den Kunden. Während dieser Zeit muss die chemische Funktionsfähigkeit des Produkts aufrechterhalten werden. Vorzugsweise weist das Verdünnungsmittel eine Gebrauchsfähigkeitsdauer von mehr als 12 Monaten auf. Es wurde gefunden, dass die Kombination von Verbindungen in der vorliegenden Formulierung diese Anforderungen erfüllt.
Zweitens enthält das Mehrzweck-Verdünnungsmittel auch eine konservierende Zusammensetzung zur Vermeidung eines Pilz- oder Bakterienwachstums, das die physikalischen Eigenschaften oder die Funktionsfähigkeit des Verdünnungsmittels nachteilig beeinflussen kann. Vorzugsweise enthält das Mehrzweck-Verdünnungsmittel nicht Natrium-2-pyridinthiol-1-oxid (Natriumomadin), Hexahydro-1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin (Triadin 3), 1- Hydroxypyridin-2-thion, das Natriumsalz von 2-Pyridylthiol-1-oxid, 1,3-Dimethylharnstoff, 1,3-Dimethylolharnstoff oder Natriumfluorid. Es wurde gefunden, dass das Natriumomadin gegenüber Licht und Oxidationsmitteln instabil ist, was die Funktionsfähigkeit des Produkts nachteilig beeinflussen kann. Entsprechend stellen 1,3-Dimethylharnstoff und 1,3-Dimethylolharnstoff keine reproduzierbare Bestimmung der Hämoglobinkonzentration bereit, da diese in nachteiliger Weise mit dem Hämoglobin reagieren und dessen spektrophotometrischen Eigenschaften ändern. Die Verwendung von Natriumfluorid stellt kein geeignetes Konservierungsmittel bereit, da gefunden wurde, dass es mit Glasküvetten reagiert.
Die Menge des Konservierungsmittels sollte die Analyse der Vollblutprobe nicht nachteilig beeinflussen. Die Menge der konservierenden Zusammensetzung kann vom Fachmann durch Routineexperimente bestimmt werden und beträgt typischerweise weniger als 0,5 Gew.-% des Verdünnungsmittels.
Geeignete Konservierungsmittel umfassen 1) organische und anorganische Säuren, wie z. B. Sorbinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dehydroessigsäure; 2) Ester und Salze, wie z. B. Ester von p-Hydroxybenzoesäure (Parabene); 3) substituierte aliphatische Diolderivate von 1,3-Dioxan, wie z. B. 6-Acetoxy-2,4-dimethyl-1,3-dioxan, 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan; 4) Imidazolderivate, wie z. B. 1,3-Di(hydroxymethyl)-5,5-dimethyl-2,4-dioxoimidazol, N,N''-Methylen-bis[5'-[1-hydroxymethyl]-2,5-dioxo-4-imidazolidinylharnstoff], Mono- und Dimethyloldimethylhydantoin; 5) Isothiazolone, wie z. B. 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on, 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on, 1,2-Benzisothiazolin-3-on; und Natriumhydroxymethylglycinat und cis-1-(3-Chlorallyl)-3,5,7-triaza-1-azoniaadamantanchlorid. Die bevorzugten Konservierungsmittel sind n-(Hydroxymethyl)-N-(1,3-dihydroxymethyl-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-N'-(hydroxymethyl)harnstoff und 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on mit 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on.
Gegebenenfalls kann das Verdünnungsmittel ein Anästhetikum umfassen, das als Zell-stabilisierendes Mittel wirkt. Das Zell-stabilisierende Mittel wird zur Stabilisierung der Zellgröße, -form und -integrität von zellulären Blutkomponenten verwendet, wie z. B. zur Verhinderung einer Blutplättchenaggregation. Die genauen Mengen des verwendeten Zell-stabilisierenden Mittels können gemäß ihrer chemischen Formulierung variieren. Typischerweise liegt das Zell-stabilisierende Mittel in einer Menge von weniger als 0,5 Gew.-% des Verdünnungsmittels vor. Geeignete Zell-stabilisierende Mittel umfassen 4-Aminobenzoesäureester und Derivate davon mit der Struktur RHN-C₆H₄-COOR' oder RHN-C₆H₄-COOCH₂CH₂R', wobei R Wasserstoff und Niederalkyl und R' Niederalkyl, Dialkylaminoalkyl und Dialkylamino ist. Beispiele für solche Verbindungen umfassen Benzocain, Procain, Butacain, Tetracain und Butethamin. Diese Verbindungen sind als Base oder Salz da von geeignet, z. B. als Hydrochlorid, Butyrat, Nitrat oder Borat. Einige spezifische Beispiele Zell-stabilisierender Mittel, die mit den anderen Verdünnungsmittelkomponenten verträglich sind, umfassen Dimethylolharnstoff, 4-Aminobenzoesäure-2-(diethylamino)ethylesterhydrochlorid und 2-(Diethylamino)-N-(2,6-dimethylphenyl)acetamid. Das bevorzugte Zell-stabilisierende Mittel ist 4-(Butylamino)benzoesäure-2-(dimethylamino)ethylesterhydrochlorid.
Eine erfindungsgemäße Mehrzweck-Verdünnungsmittelzusammensetzung ist in der nachstehenden Tabelle 1 veranschaulicht:
Tabelle 1 Verdünnungsmittelzusammensetzung
Beispiel 1
Es wurden drei Mehrzweck-Verdünnungsmittel unter Verwendung der in der Tabelle 1 angegebenen Komponenten und bevorzugten Bereiche hergestellt, wobei die EDTA-Konzentration variiert wurde und 0,3 bzw. 7,5 g/Liter betrug. Eine käufliche Hämatologiekontrolle, ein käuflicher Hämatologiekalibrator und drei Frischblutproben wurden mit einem COUNTER COUNTER^® S Plus IV diff-Hämatologieanalysegerät getestet. Das Gerät wurde in eine Kammer mit einer bei 15,5°C kontrollierten Temperatur eingebracht. Die Tabelle 2 gibt die Beziehung zwischen dem Zellvolumen und der EDTA-Konzentration an und zeigt, dass die EDTA-Konzentration das Zellvolumen bei 15,5°C beeinflusst.
Tabelle 2 Effekt von EDTA auf das MCV für den Kalibrator, die Blutzellkontrolle und das Frischblut bei 15,5°C
Beispiel 2
Bestimmte Parameter roter Blutzellen, wie z. B. das MCV, ändern sich bei Temperaturen unterhalb von 23,9°C. Eine käufliche Verdünnungsmittelkontrolle in der Tabelle 3A wurde in der Tabelle 3B mit dem erfindungsgemäßen Verdünnungsmittel verglichen. Die Testproben wurden mit einem COULTER COUNTER^® S Plus IV diff-Hämatologieanalysegerät getestet. Das erfindungsgemäße Verdünnungsmittel macht das Blutzellvolumen der Kontrolle, des Kalibrators und des Frischbluts bei 15,5°C gegen Änderungen weniger empfindlich.
Tabelle 3A Verdünnungsmittelkontrolle – MCV
Tabelle 3B Erfindungsgemäßes Verdünnungsmittel – MCV
Beispiel 3
Das Verdünnungsmittel der Tabelle 1 ist besonders gut zur Verwendung mit einer Blutprobe geeignet, die durch ein Hämatologieanalysegerät des Typs geleitet wird, der von der Coulter Corporation, Miami, Florida hergestellt wird. Die Blutprobe wird analysiert, um bestimmte physikalische Parameter roter Blutzellen und eine Volumendifferenzierung der Leukozyten in mindestens drei Subpopulationen von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten zu erhalten. Bei der Verwendung des Mehrzweck-Verdünnungsmittels von Tabelle 1 wurde ein cyanidfreies lytisches Reagenz verwendet, das ein Gemisch aus

Menge (g/Liter)

Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid 32

Antioxidationsmittel 2

Dinatrium-EDTA 2,5

Pluronic 25R8-Granalien 1

umfasste.
Die WBC-, RBC- und Blutplättchenparameter, einschließlich die Differenzierung der weißen Blutzellen in drei Subpopulationen unter Verwendung dieses Reagenzsystems sind über einen Temperaturbereich von 15,5 bis 29,4°C konsistent.
Beispiel 4
Ein Mehrzweck-Verdünnungsmittel wurde unter Verwendung der Komponenten und bevorzugten Bereiche hergestellt, die in der Tabelle 1 angegeben sind. Frischblut von normalen Spendern und klinisch anomale Proben wurden auf einem COULTER^® STKS-Hämatologieanalysegerät getestet. Das Gerät wurde in eine Kammer mit einer bei 15,5°C kontrollierten Temperatur eingebracht und ein Teil der Frischblutproben wurde getestet. Danach wurde die Temperatur auf 29,4°C erhöht und ein weiterer Teil der Frischblutproben wurde getestet. Darüber hinaus wurde für jeden Test, der bei extremen Temperaturen durchgeführt wurde, ein Vergleichsgerät unter Verwendung eines weiteren Teils der Frischblutproben bei 23,9°C betrieben. Die folgende Tabelle 4 zeigt die Mittelwerte für die erhaltenen Hämoglobinwerte sowie die bei sich ändernder Temperatur festgestellten Unterschiede. Die Ergebnisse zeigten, dass das Hämoglobin über einen weiten Temperaturbereich stabil ist.
Tabelle 4
Beispiel 5
Ein Mehrzweck-Verdünnungsmittel wurde unter Verwendung der Komponenten und bevorzugten Bereiche hergestellt, die in der Tabelle 1 angegeben sind. Eine käufliche Hämatologiekontrolle, ein käuflicher Hämatologiekalibrator und drei Frischblutproben von normalen Spendern wurden auf einem COULTER STKS getestet. Das Gerät wurde in eine Kammer mit einer bei 15,5°C kontrollierten Temperatur eingebracht und ein Teil der Proben wurde getestet. Danach wurde die Temperatur auf 32,2°C erhöht und ein weiterer Teil der Proben wurde getestet. Darüber hinaus wurde für jeden Test, der bei extremen Temperaturen durchgeführt wurde, ein Vergleichsgerät unter Verwendung eines weiteren Teils der Proben bei 23,9°C betrieben. Die Tabelle 5 zeigt die Mittelwerte für die erhaltenen Hämoglobinwerte sowie die bei sich ändernder Temperatur festgestellten Unterschiede. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hämoglobinmesswerte über einen weiten Temperaturbereich stabil sind.
Tabelle 5 Hämoglobinunterschiede bei einer Temperaturvariation von 15,5°C bis 32,2°C Erfindungsgemäßes Verdünnungsmittel

Claims

Mehrzweck-Blutverdünnungsmittel, welches nicht Hexahydro-1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin enthält, verwendbar in der Analyse von roten Blutzellen, weißen Blutzellen, Blutplättchen und der Hämoglobin-Konzentration einer Blutprobe, wobei das Verdünnungsmittel a) eine erste Verbindung, ausgewählt aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäurederivate und Kombinationen davon, wobei die erste Verbindung in einer Konzentration von 2,5 bis 11 Gramm pro Liter vorliegt, b) eine zweite Verbindung, ausgewählt aus Imidazol, Imidazolderivaten und Kombinationen davon, wobei die zweite Verbindung in einer Konzentration von 0,5 bis 9 Gramm pro Liter vorliegt, c) ein Alkalimetallchlorid, d) eine dritte Verbindung, ausgewählt aus alkalischem Metallsulfat und Alkalimetallsalzen von organischen Säuren, ausgewählt aus Tartrat, Formiat, Lactat, Acetat, Citrat und Pyruvat und Kombinationen davon, wobei die erste Verbindung und die zweite Verbindung in einer Menge vorliegen, die für das Bereitstellen von reproduzierbaren Hämoglobin- und Zellvolumen-Messungen in einem Temperaturbereich von 12,8°C bis 40,5°C wirksam ist, und wobei das Verdünnungsmittel ein zum Leiten von elektrischem Strom befähigter Elektrolyt ist und isotonisch ist, so daß es das Blutzellvolumen stabilisiert und einen neutralen pH-Wert aufweist, umfaßt.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, wobei die Imidazolderivate aus Phenylimidazol, Methylimidazol, Ethylimidazol und Butylimidazol ausgewählt sind.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, welches weiter ein Zell-stabilisierendes Mittel umfaßt.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Verdünnungsmittel weiter eine konservierende Zusammensetzung in einer Konzentration von weniger als 0,5 Gew.-% umfaßt.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, wobei das Verdünnungsmittel weiter ein Zell-stabilisierendes Mittel in einer Menge, die für das Verhindern einer Blutplättchenaggregation wirksam ist, umfaßt.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 5, wobei das Zell-stabilisierende Mittel 4-Aminobenzoesäureester und Derivate davon sind.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, wobei das konservierende Mittel aus n-(Hydroxymethyl)-N-(1,3-dihydroxymethyl-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-N'-(hydroxymethyl)harnstoff, 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on mit 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Verdünnungsmittel eine Osmolalität von 250 bis 380 mOsm aufweist.
Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Verdünnungsmittel einen pH-Wert von 6,5 bis 7,6 aufweist.
Verfahren zum Analysieren einer Blutzellen enthaltenden Blutprobe, welches a) das Mischen einer Blutzellen enthaltenden Blutprobe mit einem Mehrzweck-Blutverdünnungsmittel zum Bilden einer verdünnten Blutprobe, wobei das Verdünnungsmittel i) eine erste Verbindung, ausgewählt aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäurederivaten und Kombinationen davon, wobei die erste Verbindung in einer Konzentration von 2,5 bis 11 Gramm pro Liter vorliegt, ii) eine zweite Verbindung, ausgewählt aus Imidazol, Imidazolderivaten und Kombinationen davon, wobei die zweite Verbindung in einer Konzentration von 0,5 bis 9 Gramm pro Liter vorliegt, iii) ein Alkalimetallchlorid, iv) eine dritte Verbindung, ausgewählt aus alkalischem Metallsulfat und Alkalimetallsalzen von organischen Säuren, ausgewählt aus Tartrat, Formiat, Lactat, Acetat, Citrat und Pyruvat und Kombinationen davon, wobei das Verdünnungsmittel nicht Hexahydro-1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-s-triazin enthält, und wobei die erste Verbindung und die zweite Verbindung in einer Menge vorliegen, die für das Bereitstellen von reproduzierbaren Hämoglobin- und Zellvolumen-Messungen in einem Temperaturbereich von 12,8°C bis 40,5°C wirksam ist, und wobei das Verdünnungsmittel ein zum Leiten von elektrischem Strom befähigter Elektrolyt ist und isotonisch ist, so daß es das Blutzellvolumen stabilisiert und einen neutralen pH-Wert aufweist, und b) das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Blutzellen rote Blutzellen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, welches weiter das Mischen eines lytischen Reagenz mit der verdünnten Blutprobe zum Lysieren der roten Blutzellen vor dem Analysieren der verdünnten Blutprobe umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Blutzellen weiße Blutzellen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen eine automatisierte Differentialanalyse der weißen Blutzellen zum Bestimmen von mindestens drei Subpopulationen von weißen Blutzellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen eine automatisierte Differentialanalyse der weißen Blutzellen zum Bestimmen von mindestens fünf Subpopulationen von weißen Blutzellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das lytische Reagenz eine wässrige Lösung von mindestens einem quartären Ammoniumsalz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter ein Analysieren zum Bestimmen des mittleren Zellvolumens der roten Blutzellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen ein Analysieren zum Bestimmen der Anzahl der Blutplättchen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Analysieren der verdünnten Blutprobe zum Bestimmen von mindestens einem physikalischen Parameter der Blutzellen ein Analysieren zum Bestimmen des Hämoglobingehalts umfaßt.