DE69432751T2

DE69432751T2 - Präparation und stabilisation von zellen

Info

Publication number: DE69432751T2
Application number: DE69432751T
Authority: DE
Inventors: Vivian Woodseats GRANGER; David Stannington BARNETT; John Tennison Dore REILLY; Petra Susanne Maria Mayr; Shawn Patrick Fay
Original assignee: SHEFFIELD TEACHING HOSPITALS; Sheffield Teaching Hospitals NHS Trust
Current assignee: SHEFFIELD TEACHING HOSPITALS; Sheffield Teaching Hospitals NHS Trust
Priority date: 1993-07-05
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2014-07-06
Also published as: BR9407003A; US6197540B1; US6197539B1; AU4441096A; AU700699B2; WO1995001796A1; EP0708649B1; DE708649T1; GB2279653A; GB2279653B; CA2166729A1; NO960049D0; ES2197168T3; EP0708649A1; AU7490994A; NO960049L; FI960045A; FI960045A0; NZ271318A; DE69432751D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Herstellung und Stabilisierung von Zellen, und insbesondere ein neues Verfahren zur Herstellung und Stabilisierung von Zellen und Zell-Suspensionen, insbesondere von Vollblut und Bestandteilen desselben, sowie die Verwendung von neuen stabilisierten Zell-Zusammensetzungen zur Qualitätskontrolle von analytischen Verfahren, wie beispielsweise UV-Mikroskopie und durchflußzytometrische Leukozyten-Immunophänotypisierungs-Verfahren, von immobilisierten Antigen/Antikörper-Detektions-Systemen und Hämatologie-Analysatoren sowie von Blut-Bestimmungs-Verfahren, wie beispielsweise Messungen des Zinkprotoporphyrins (ZPP), des Erythrozyten-Folats und der Blutglucose.
UV-Mikroskopie und Durchfluss-Zytometrie sind Verfahren, die bei der Diagnose von hämatologisch bösartigen Erkrankungen verwendet werden. Sie werden ferner verwendet, um die Fortentwicklung von Patienten, die mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) infiziert sind (entweder asymptomatisch oder an ARC oder vollständig ausgebildetem AIDS leidend) zu überwachen. Eine Qualitätskontrolle (QC) dieser beiden Techniken ist extrem wichtig, um zu der korrekten Diagnose zu gelangen und um wirksame therapeutische Regime zu überwachen. Die derzeitigen QC-Verfahren verwenden frisch abgenommenes Blut oder Mikrokugeln, die mit einem Fluorochrom beschichtet sind.
Die tägliche Verwendung von frischem Blut versagt jedoch bei der Bereitstellung von Informationen über die Tag-zu-Tag-Variation des Verfahrens oder der Ausrüstung. Ferner können Fluorochrom-beschichtete Mikrokugeln nicht für UV-Mikroskopiearbeiten verwendet werden, obwohl sie eine Tag-zu-Tag-Überwachung der Leistung des Durchfluss-Zytometers erlauben. Des Weiteren können sie nicht verwendet werden, um eine Qualitätskontrolle für die Markierungsverfahren von Leukozyten bereit zu stellen.
Die Fixierung von normalen Leukozyten unter Verwendung von Verbindungen, wie beispielsweise Aldehyden, erhöht die zelluläre Autofluoreszenz, obwohl sie Stabilität für 5 bis 7 Tage verleiht. Dies macht die Zusammensetzung für eine Verwendung als Material für die Langzeitqualitätskontrolle ungeeignet. Ferner benötigt die Lyse von Erythrozyten nach dem Verfahren der Vollblut-Lyse eine Zusammensetzung, die dieses Vorgehen hinsichtlich der Qualität kontrolliert. Die derzeitigen Verfahren der Fixierung von Leukozyten inhibieren dieses Lyse-Verfahren, was zu einer signifikanten Erhöhung von Zelltrümmern führt, die mit den Tests interferieren.
In der Internationalen Anmelde-Nr. PCT/US91/03236, deren gesamte Offenbarung durch Literaturverweis eingeschlossen ist, wird ein Blut-Verdünnungsmittel und ein lysierendes Mittel für die differentielle Bestimmung von weißen Blutzellen (Leukozyten) beschrieben, wobei der Stabilisator Diazolidinyl-Harnstoff ist. Solche Leukozyten-Zusammensetzungen sind nicht als Zusammensetzungen für die Qualitätskontrolle vorgeschlagen worden, möglicherweise weil sie eine unzureichende Stabilität aufweisen und ihnen eine bestimmte spezifische Antigen-Aktivität für diejenigen Routine-Verfahren zur Qualitätskontrolle fehlt, die Ergebnisse einer großen Anzahl von Laboratorien bewerten müssen.
Internationale Anmelde-Nr. PCT/US92/03758, deren Offenbarung durch Literaturverweis eingeschlossen ist, offenbart die Verwendung von Diazolidinyl-Harnstoff, Imidazolidinyl-Harnstoff, Dimethylol-5,5-Dimethylhydantion, Dimethylol-Harnstoff, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-Diol sowie quatärem Adamantan als Gewebe-Fixiermittel, die frei von Aldehyden sind. Die Formulierungen können unter anderem Beizmittel, wie beispielsweise Zink-, Strontium-, Calcium-, Barium- und Chrom-Salze enthalten. Es wird jedoch nicht vorgeschlagen, dass eines dieser Salze stabilisierende Eigenschaften aufweist.
Andere QC-Ausrüstungen, die die Verwendung von Vollblut-Proben oder Blut-Produkten für die Kalibrierung benötigen, um fassen Hämatologie-Analysatoren, bei denen gegenwärtig fixiertes Rinderblut oder Blut von Eseln oder Truthähnen verwendet wird, da eine geeignete Quelle für stabilisiertes humanes Blut nicht verfügbar ist. Überwachungsverfahren für Zinkprotoporphyrin (ZPP) und Erythrozyten-Folat benötigen ferner eine frische Erythrozyten-Suspension für die Kalibrierung, wiederum weil eine geeignete stabilisierte Quelle nicht verfügbar ist. Schließlich beschränkt das Fehlen einer stabilisierten Quelle für humanes Vollblut für Kalibrierungszwecke die Möglichkeit von Diabetes-Patienten, eine Blutzucker-Überwachung zu Hause durchzuführen.
Aus dem oben Gesagten wird verständlich, dass ein Bedürfnis für verbesserte Verfahren zur Stabilisierung von Zellen, insbesondere von Vollblut und Blut-Produkten, für eine Vielzahl von Anwendungen bei der Qualitätskontrolle, der Überwachung und Kalibrierung besteht.
ZIELE DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der Erfindung, eine verbesserte stabilisierte Zell-Zusammensetzung und ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Zellen bereitzustellen.
Es ist ferner ein Ziel der Erfindung, eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung bereitzustellen.
Es ist ferner ein Ziel der Erfindung, ein verbessertes lysierendes Verfahren für die Trennung von Leukozyten von Erythrozyten in Vollblut bereitzustellen.
Es ist weiterhin ein Ziel der Erfindung, stabile Materialien für die Qualitätskontrolle bereitzustellen, die in einem weiten Spektrum von Verfahren zur Qualitätskontrolle, Analyse und Überwachung verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nunmehr herausgefunden, dass ein weites Spektrum von Zellen durch Zusatz einer wirksamen Menge einer Verbindung, die ein Schwermetall umfasst, zu den Zellen stabilisiert werden kann, und dass solche stabilisierten Zellen für wesentlich längere Zeiträume aktiv bleiben, als die bislang bekannten.
Gemäß eines Aspektes stellt die Erfindung daher eine stabilisierte Zell-Zusammensetzung bereit, bei der der Stabilisator eine wirksame Menge einer Schwermetallverbindung umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von Zellen durch Zusatz einer wirksamen Menge eines Stabilisators bereit, der eine Schwermetallverbindung umfasst.
Die Erfindung ist insbesondere bei der Stabilisierung von Vollblut und Blut-Produkten anwendbar und wird im Folgenden mit Verweis auf diese näher beschrieben. Es sollte jedoch verständlich sein, dass die Erfindung nicht auf die Stabilisierung solcher Materialien beschränkt ist, und auf ein breites Spektrum von zellulären Materialien, und insbesondere auf Zell-Suspensionen anwendbar ist.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die Erfindung daher eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung, in der der Stabilisator eine wirksame Menge einer Schwermetallverbindung umfasst, sowie ein Verfahren zur Stabilisierung einer Vollblut-Zusammensetzung durch Zusatz einer wirksamen Menge der Verbindung bereit.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Stabilisierung der zellulären Bestandteile von Vollblut, insbesondere von Leukozyten-Zusammensetzungen, die beispielsweise aus lysiertem Vollblut gebildet wurden, durch Zusatz einer wirksamen Menge einer Schwermetallverbindung bereit.
Die Erfindung stellt daher gemäß eines weiteren Aspektes eine stabilisierte Leukozyten-Zusammensetzung, in der der Stabilisator eine wirksame Menge einer Schwermetallverbindung umfasst, sowie ein Verfahren zur Stabilisierung einer Leukozyten-Zusammensetzung durch Zusatz einer wirksamen Menge eines Stabilisators, der eine Schwermetallverbindung umfasst, bereit.
Die stabilisierte Leukozyten-Zusammensetzung dieses Aspektes der Erfindung kann Leukozyten-depletiertem Vollblut (Erythrozyten) zugesetzt werden, um eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung zu bilden, und die Erfindung umfasst entsprechend gemäß eines weiteren Aspektes eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung, die Leukozyten umfasst, die durch den Zusatz einer wirksamen Menge eines Stabilisators stabilisiert wurden, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung, das den Zusatz einer stabilisierten Leukozyten-Zusammensetzung zu Leukozyten-depletiertem Vollblut umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die Erfindung eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung bereit, die stabilisierte Leukozyten und unbehandelte Erythrozyten umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die Erfindung einen neuen Stabilisator für zelluläre Materialien, insbesondere für Blut und Blutprodukte bereit, der eine wässrige Lösung einer Schwermetallverbindung und einen Formaldehyd umfasst.
Gemäß eines weiteres Aspektes der Erfindung wird ein lysierendes Mittel für die Differenzierung von Leukozyten bereitgestellt, das eine Lösung eines Ammonium- oder quatären Ammoniumsalzes und einen Harnstoffs umfasst, wobei die Konzentration des Harnstoffs und der pH-Wert der Lösung ausreichen, um die Monozyten im ausreichenden Maße daran zu hindern, das CD14-Antigen herabzuregulieren, um so ihre Detektion durch immunologische Mittel zu erlauben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun insbesondere mit Verweis auf die Herstellung stabilisierter Vollblut-Zusammensetzungen zur Verwendung bei Verfahren zur Labor-Qualitätskontrolle beschrieben, obwohl verständlich sein wird, dass die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, und dass beispielsweise die stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen auch andere Verwendungen finden können, und die stabilisierten Leukozyten-Zusammensetzungen ebenfalls Anwendung als Materialien der Qualitätskontrolle finden können, und dass die beschriebenen Stabilisierungsverfahren Anwendung bei der Herstellung von stabilisierten Leukozyten aus anderen Quellen als Blut, beispielsweise aus intrathyroidalen Lymphozyten, finden können. Weiterhin können die beschriebenen Stabilisierungsverfahren Anwendung bei der Herstellung von stabilisierten Zellen aus anderen Quellen als Blut finden, beispielsweise aus mikrobiellen Zellen, Pflanzenzellen und ähnlichen Materialien, die von lebendem Gewebe abgeleitet sind.
Vollblut-Zusammensetzungen schließen in dieser Beschreibung Zusammensetzungen ein, die im Wesentlichen alle Komponenten von Frischblut enthalten, sowie Zusammensetzungen, die im Wesentlichen alle Komponenten von Frischblut außer Plasma enthalten.
Das Verfahren, durch das die Stabilisierung von Vollblut erreicht wird, verwendet eine Reihe von Stufen, die den Zusatz sowohl von organischen als auch von anorganischen Verbindungen einschließen. Der initiale Vorgang der Abnahme einer Einheit Blut ist hinreichend dokumentiert, und es kann sich um jeden derjenigen Vorgänge handeln, die von denen auf dem Gebiet der Blutentnahme tätigen Personen verwendet werden. Es wird vorzugsweise antikoaguliertes Blut verwendet, und einige geeignete Antikoagulanzien sind kommerziell erhältlich. Die Verwendung eines Kalium-EDTA-Salzes wird jedoch bevorzugt.
Im Einklang mit der ersten Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung kann eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung hergestellt werden, indem man zunächst die Leukozyten von den Erythrozyten abtrennt, die Leukozyten stabilisiert und anschlieflend die stabilisierten Leukozyten zu Leukozyten-depletiertem Vollblut gibt. In einer zweiten Vorgehensweise wird der Schritt der Leukozyten-Trennung ausgelassen und der Stabilisator wird zu Vollblut zugesetzt, von dem lediglich das Plasma entfernt worden ist. Diese zwei Vorgehensweisen werden getrennt beschrieben.
VORGEHENSWEISE 1
Das Verfahren zur Stabilisierung der Leukozyten wird üblicherweise innerhalb von 24 Stunden nach Blutentnahme, vorzugsweise jedoch innerhalb von 2 Stunden durchgeführt. Um die Leukozyten von den Erythrozyten zu trennen, wird ein neues Verfahren zur Erythrozyten-Lyse angewendet.
Das frische, ein Antikoagulans enthaltende Vollblut wird zunächst zentrifugiert, und die Lyse wird mit dem "Buffycoat" durchgeführt, der nach dem Zentrifugieren erhalten wird. Die lysierenden Mittel umfassen eine Lösung, vorzugsweise eine wässrige Lösung, eines Ammoniumsalzes, beispielsweise Ammoniumchlorid, oder eines quartären Ammoniumsalzes und Harnstoff, oder einen geeignet substituierten Harnstoff oder ein Harnstoff-Derivat. Die Konzentration des quartären Ammoniumsalzes liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 0,5 M, und die Konzentration des Harnstoffs beträgt weniger als 1,0 M, wobei ein Bereich von 0,05 bis 0,5 M am meisten bevorzugt wird. Der pH-Wert der Lösung beträgt vorzugsweise von 6,8 bis 7,8. Der Zeitraum der Lyse beträgt vorzugsweise von 5 bis 20 Minuten. Nach diesem Zeitraum werden die resultierenden Leukozyten in einer isotonischen Salzlösung gewaschen, um die lysierten Zelltrümmer zu entfernen.
Die Leukozyten werden anschließend mit einem ersten Stabilisator behandelt, der eine Schwermetallverbindung umfasst, und insbesondere ein Schwermetall-Salz. Geeignete Schwermetalle sind diejenigen, die komplexierende Eigenschaften und ein atomares Gewicht von größer als 20 aufweisen, beispielsweise Übergangsmetalle, insbesondere Übergangsmetalle der Gruppen IVa bis VIIa des Periodensystems, beispielsweise Mangan, Chrom, Molybdän, Vanadium und Titan, der Gruppe Ib, beispielsweise Kupfer, sowie der Gruppe IVb, beispielsweise Zinn. Übergangsmetalle der Gruppen VIa und VIIa, insbesondere Chrom und Mangan werden besonders bevorzugt. Geeignete Verbindungen umfassen wasserlösliche Salze dieser Metalle, insbesondere anorganische saure Salze, beispielsweise Sulfate und insbesondere Chloride. Besonders gute Resultate wurden unter Verwendung von Chrom-Verbindungen, beispielsweise Chrom-Salzen wie beispielsweise Chromchlorid CrCl₃, erzielt. Diese sind die bevorzugten ersten Stabilisatoren für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Schwermetallverbindung wird vorzugsweise in Form einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel verwendet. Dieses Lösungsmittel wird üblicherweise Wasser oder ein wässriges Medium sein, jedoch sind Zusätze von kleinen Mengen von weniger als 10% eines geeigneten organischen Lösungsmittels, das die Antigen-Aktivität der Leukozyten nicht wesentlich beeinflussen wird, und sich nicht auf ihre Integrität auswirken wird, nicht spezifisch ausgeschlossen.
Das Vorhandensein von großen Mengen organischer Lösungsmittel ist jedoch üblicherweise schädlich.
Das Lösungsmittel ist vorzugsweise eine isotonische wässrige Lösung, die auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 gepuffert ist. Geeignete gepufferte wässrige Lösungen umfassen beispielsweise Phosphat-gepufferte Salzlösungen.
Die Schwermetallverbindung wird vorzugsweise in dem Lösungsmittel gelöst, und die Lösung wird stehen gelassen, beispielsweise für mindestens 6 Stunden, vorzugsweise für 12 Stunden, besonders bevorzugt für 24 Stunden und am meisten bevorzugt für 48 Stunden, beispielsweise 1 Woche vor Benutzung. Der Grund, warum sich die Wirksamkeit der Lösung beim Stehenlassen verbessert wird nicht verstanden, könnte jedoch auf die Bildung von hydratisierten Metall-Hydroxy-Ionenarten in der Lösung zurückzuführen sein. Es wurde beispielsweise an einigen gepufferten Lösungen von Chrom-Verbindungen beobachtet, dass die frisch hergestellte Lösung in einem Zeitraum von 24 Stunden von grün zu violett wechselt, was auf das Vorhandensein von geladenen komplexen Ionen und die Bildung eines Präzipitates hinweist, wobei es sich um eine Chrom-Hydroxy-Polymerart handeln könnte. Dieses wird vorzugsweise vor Gebrauch aus der Lösung abfiltriert. Die Bildung eines Präzipitates wird selbstverständlich die Konzentration von Schwermetallionen in der Lösung verringern. wenn das passiert sollte selbstverständlich eine Analyse der Lösung durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Konzentration des ersten Stabilisators weiterhin im bevorzugten Bereich liegt.
Vorzugsweise wird die Lösung der Schwermetallverbindung als relativ konzentrierte Lösung gelagert, beispielsweise als eine 1%ige w/v-Lösung, und wird vor Gebrauch mit einem geeigneten Puffer verdünnt. Bei Verdünnung könnte sich aufgrund des ansteigenden pH-Wertes ein Präzipitat bilden, und es sollte ausreichend Zeit vor Benutzung der Lösung gewährt werden, damit dies geschehen kann.
Die gealterte Lösung der Schwermetallverbindung behält ihre Wirksamkeit über beträchtliche Zeiträume, wird jedoch vorzugsweise nach 12 Monaten verworfen, und besonders bevorzugt nach 6 Monaten.
Das Vorhandensein des ersten Stabilisators kann die Leukozyten daran hindern, überschüssige Autofluoreszenz zu zeigen, und gleichzeitig die Leukozyten für einen Zeitraum von länger als 25 Tage stabilisieren. Der erste Stabilisator wird vorzugsweise als isotonische Lösung zu der Leukozyten-Zusammensetzung gegeben, in der die optimale Endkonzentration des ersten Stabilisators vorzugsweise weniger als 1% w/v beträgt, besonders bevorzugt von 0,005% bis 0,75% w/v, und insbesondere bevorzugt von 0,01% bis 0,5% w/v, und am meisten bevorzugt von 0,05 bis 0,25% w/v, beispielsweise 0,1% w/v. Die Lösung ist vorzugsweise eine 0,85%ige Phosphat-gepufferte Salzlösung. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Wert zwischen 6,5 bis 7,0 eingestellt. Die Leukozyten werden dem ersten Stabilisator vorzugsweise für einen Inkubationszeitraum von 5 Minuten bis 18 Stunden ausgesetzt, jedoch am meisten bevorzugt für etwa 60 Minuten. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise von 0°C bis 8°C, beispielsweise etwa 4°C.
Nach dem ersten Inkubationszeitraum werden die Leukozyten vorzugsweise mit einem zweiten Stabilisator behandelt, bei dem es sich beispielsweise um einen Aldehyd, vorzugsweise um einen Formaldehyd, und am meisten bevorzugt um einen Para-Formaldehyd handeln kann, der beispielsweise in einer Lösung in einer bevorzugten Endkonzentration von 0,1 bis 0,5% w/v, beispielsweise 0,35% w/v, gelöst sein kann.
Jeder geeignete Aldehyd kann verwendet werden, wo zelluläre Autofluoreszenz kein Problem darstellt, beispielsweise bei bestimmten histologischen Verfahren. Im Allgemeinen jedoch muss die Autofluoreszenz auf ein Minimum gehalten werden, insbesondere, wenn Proben für die Durchfluss-Zytometrie hergestellt werden. Unter diesen Umständen wird Para-Formaldehyd bevorzugt, da er in den meisten Fällen zur geringsten Autofluoreszenz führt. Bei der Herstellung der Para-Formaldehydlösung wird es bevorzugt, die Temperatur unter 60°C zu halten, um die Reversion von Para-Formaldehyd zu Formaldehyd zu verhindern.
Es wurde herausgefunden, dass bei Verwendung einer wässrigen Lösung einer Schwermetallverbindung und eines Aldehyds als zweiter Stabilisator sehr gute Ergebnisse erhalten werden. Dieser kombinierte zweite Stabilisator ist unabhängig davon bei der Stabilisierung von zellulären Materialien nützlich und stellt dementsprechend einen getrennten Aspekt der Erfindung dar.
Die Schwermetallverbindung kann jede der zuvor beschriebenen sein, und kann in der Lösung in einer Menge von 0,01% bis 0,5% w/v vorhanden sein. Der Aldehyd kann in einer Menge von 0,1% bis 0,5% w/v vorhanden sein, und vorzugsweise ist das Verhältnis von Schwermetallverbindung zu Aldehyd in der Lösung im Bereich von 5 : 1 bis 1 : 50. Die Lösung hat vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 und kann einen geeigneten isotonischen Puffer umfassen. Eine bevorzugte Lösung kann beispielsweise eine 0,85%ige Phosphat-gepufferte Salzlösung sein. Vorzugsweise umfasst die Lösung ferner ein Antikoagulans, und bevorzugten Antikoagulanzien sind EDTA und Heparin. Das Einwirken der zweiten stabilisierenden Lösung erfolgt vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden in dem oben angegebenen Temperaturbereich.
Obwohl herausgefunden wurde, dass die Schwermetallverbindungen in einigen Fällen eine signifikante stabilisierende Wirkung über 20 Tage aufweisen, wenn sie alleine verwendet werden, konnte im allgemeinen nicht herausgefunden werden, dass sie Stabilität über 60 Tage verleihen, was als kommerziell erstrebenswerte Lagerzeit angesehen wird.
Eine weitere Verbesserung wird bei gleichzeitiger Verwendung einer kombinierten Lösung einer Schwermetallverbindung und eines Aldehyds erhalten (im Endeffekt der zuvor beschriebene zweite Stabilisator allein verwendet). Es wurde jedoch herausgefunden, dass auch diese Behandlung nicht in allen Fällen die benötigte 60tägige Stabilität verleiht.
Auf der anderen Seite kann die Verwendung eines ersten und eines zweiten Stabilisators nacheinander, wie nachfolgend beschrieben, eine Leukozyten-Stabilität von mehr als 220 Tagen verleihen. Das Intervall zwischen den Behandlung mit dem ersten und zweiten Stabilisators beträgt vorzugsweise mindestens 30 Minuten, besonders bevorzugt mindestens 1 Stunde und am meisten bevorzugt mindestens 12 Stunden, beispielsweise 24 Stunden.
Nach dem Waschen in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung werden die stabilisierten Leukozyten zurück zu dem Leukozyten-depletierten Vollblut gegeben. Dieses Leukozyten-depletierte Vollblut kann (muss jedoch nicht notwendigerweise) von der Originalspende durch Filtern des Blutes durch einen kommerziell erhältlichen Leukozytenfilter erhalten werden. Vorzugsweise werden ferner bakterielle Wachstumsinhibitoren zu der finalen Zusammensetzung gegeben. Die Zusammensetzung wird dann vor der Verwendung bei zwischen 0°C und 8°C für 1 bis 5 Tage aufbewahrt.
Alle obigen Schritte werden vorzugsweise unter sterilen Bedingungen ausgeführt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann das Leukozyten-depletierte Blut, das vorwiegend Erythrozyten umfasst, als "unbehandelt" angesehen werden, da herausgefunden wurde, dass es nicht notwendig ist, einen Stabilisator zu dem Leukozyten-depletierten Blut zu geben, um eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung zu erhalten. Es ist äußerst überraschend, dass es möglich ist, eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung zu erhalten, indem man lediglich den Leukozyten-Anteil derselben stabilisiert.
Bei der kommerziellen Herstellung einer stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung nach Vorgehensweise I ist es möglich, eine Mehrzahl von gespendeten Blut-Einheiten von verschiedenen Quellen zu vereinigen und die Leukozyten abzutrennen und zu stabilisieren. Weitere Blut-Einheiten von verschiedenen Spenden können anschließend vereinigt und an Leukozyten depletiert werden. Schließlich wird die vereinigte, stabilisierte Leukozyten-Zusammensetzung zu dem Leukozyten-depletierten Blut gegeben, um eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung zu bilden.
VORGEHENSWEISE II
Diese Vorgehensweise ist zu der in Vorgehensweise I beschriebenen ähnlich, mit der Ausnahme, dass (wie zuvor erwähnt) der Leukozyten-Trennungsschritt ausgelassen wird. Aus diesem Grund wird die Vorgehensweise II oftmals bei der Herstellung von stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen im großen Maßstab bevorzugt werden.
Das Verfahren zur Stabilisierung der Vollblutprobe wird üblicherweise innerhalb von 24 Stunden nach Blutentnahme durchgeführt, vorzugsweise jedoch innerhalb von 2 Stunden.
Das frische Vollblut, das ein Antikoagulans wie beispielsweise EDTA umfasst, wird zunächst zentrifugiert, und das Plasma wird entfernt und aufbewahrt.
Die verbleibenden Zellen werden gewaschen und anschließend mit einem ersten Stabilisator behandelt, der eine Schwermetallverbindung umfasst, und der derselbe sein kann wie der in Vorgehensweise I beschriebende.
Der erste Stabilisator wird vorzugsweise zu der Vollblut-Zusammensetzung als Lösung zugegeben, in der die optimale Endkonzentration des ersten Stabilisator vorzugsweise von 0,01 bis 0,5% w/v beträgt. Die Lösung ist vorzugsweise eine 0,85%ige Phosphat-gepufferte Salzlösung. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Wert von 6,5 bis 7,0 eingestellt. Das Vollblut wird vorzugsweise für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 18 Stunden einem ersten Stabilisator ausgesetzt, wobei jedoch etwa 60 Minuten am meisten bevorzugt sind. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise von 0°C bis 8°C, beispielsweise etwa 4°C.
Nach dem ersten Inkubationszeitraum wird das Vollblut vorzugsweise mit einem zweiten Stabilisator behandelt, der beispielsweise ein Aldehyd, vorzugsweise Para-Formaldehyd sein kann, wobei die gleichen Bedingungen wie in Vorgehensweise I be schrieben verwendet werden. Die Zugabe dieser zweiten Stabilisator-Lösung kann die Stabilität des Vollblutes auf mehr als 130 Tagen erhöhen. Das Einwirken der zweiten stabilisierenden Lösung erfolgt vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden, beispielsweise für etwa 18 Stunden in dem Temperaturbereich, der in Vorgehensweise I genannt wurde.
Nach Waschen in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung wird das Plasma zurück zu dem stabilisierten Vollblut gegeben. Dieses Plasma kann (muss jedoch nicht notwendigerweise) das sein, welches durch die Originalspende erhalten wurde. Bakterielle Wachstumsinhibitoren und Antibiotika, beispielsweise Gentamycin, werden vorzugsweise ebenfalls zu der finalen Zusammensetzung zugegeben. Die Zusammensetzung wird anschließend vor der Verwendung bei zwischen 0°C und 8°C für 1 bis 5 Tage aufbewahrt.
Alle obigen Schritte werden vorzugsweise unter sterilen Bedingungen ausgeführt, und vorzugsweise wird das gesamte Verfahren in dem Blutentnahme-Behältnis durchgeführt, in dem das gespendete Blut gesammelt wurde.
Bei der kommerziellen Herstellung von stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen gemäß Vorgehensweise II ist es möglich und kann es bevorzugt sein, mehrer gespendete Blut-Einheiten von verschiedenen Quellen zu vereinigen und den resultierenden Pool zu stabilisieren.
Die hier beschriebenen Stabilisierungsverfahren können sowohl auf normale als auch auf leukämische Zellen angewendet werden, wobei eine bekannte normale Kontrolle und eine abnormale (leukämische Kontrolle) vorausgesetzt werden.
Die stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung können exzellentes, stabiles Material zur Qualitätskontrolle und als Referenz bereitstellen, welches bei der Leukozyten-Immunophänotypisierung sowohl durch UV-Mikroskopie als auch durch Durchfluss-Zytometrie verwendet werden kann. Die Zusammensetzungen sind wertvoll zur Qualitätskontrolle von Vollblut-Lyse-Verfahren ohne irgendeinen Überschuss an Kontaminationen aus Zelltrümmern. Die stabilisierten Proben können alle normalen peripheren Blutleukozyten (Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten) oder Untergruppen derselben umfassen. Die Vorgehensweise kann unter optimalen Bedingungen die Antigen-Profile der Leukozyten erhalten, wodurch Phänotypisierung und Qualitätskontrolle der Vorgehensweise ermöglicht wird. Die Werte für die üblichen Antigen-Determinanten können bestimmt werden und können für mehr als 130 Tage stabil bleiben. Der Untersuchende kann ferner erfolgreich Werte für Antigene erhalten, die von speziellem Interesse sein könnten. Des Weiteren können Zusammensetzungen verwendet werden, um die vom Durchfluss-Zytometer erhaltene Differenzierung hinsichtlich ihrer Qualität zu kontrollieren. Dies ist ein Parameter, der für die Überwachung einer anti-viralen Therapie bei HIV-infizierten Individuen verwendet wird.
Es sind neue Verfahren für die Phänotypisierung von Blutproben entwickelt worden, die es nicht erfordern, dass die Probe nach der Färbung mit einem lysierenden Mittel behandelt wird. Diese Techniken werden als "no-wash, no-lyse" bezeichnet. Die Vollblut-Zusammensetzungen dieser Erfindung können dazu verwendet werden, um eine Qualitätskontrolle für diese Methoden bereitzustellen, und sie können ferner bei Durchfluss-Zytometein verwendet werden, die "no-wash, no-lyse"-Verfahren analysieren.
Im Allgemeinen können die stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung bei der Qualitätskontrolle von Immunphänotypisierungs-Methoden mittels UV-Mikroskopie und Durchfluss-Zytometrie verwendet werden, sowohl bei Vollblut-Lyse-Methoden als auch bei Methoden, bei denen Vollblut nicht lysiert wird.
Untersuchungen mit stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung zeigen, dass sie auch für die Verwendung in immunzytochemischen Analysen unter Verwendung von Methoden, wie beispielsweise der immunzytochemischen Alkalische Phosphatase/Anti-Alkalische Phosphatase Methode (APAAP), geeignet sind, und beispielsweise verwendet werden können, um das Antigen-Profil von Leukozyten auf peripheren Blutausstrichen zu bestimmen. Sie können als Tag-zu-Tag-Referenzmaterial oder bei einer externen Qualitätskontrolle zwischen Laboren verwendet werden. Zahlreiche Ausstriche können im voraus gemacht werden und anschließend bis zur Verwendung bei –20°C gelagert werden. Die Ausstriche können täglich gefärbt werden oder als Kontrollen bei der Färbung anderer Ausstriche verwendet werden.
Die stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung können ferner als Standard-Referenzmaterialien für die Verwendung in Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Verfahren und in immunradiometrischen Assay-Verfahren Anwendung finden.
Weitere Verwendungen der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung im Labor können die Verwendung als Qualitätskontrolle und Kalibrierungsmittel für hämatologische Analysatoren, als Material zur Qualitätskontrolle bei der Überwachung des Eisenmangels durch die Zinkprotoporphyrin-Methode (ZPP) und als Material zur Qualitätskontrolle bei der Erythrozyten-Folat-Methode sein. Schließlich können die stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen der Erfindung auf einer breiten Basis Anwendung bei der Qualitätskontrolle von Tests des Blut-Glucosegehalt finden, wodurch diabetischen Patienten ermöglicht wird, dieses Verfahren zu Hause auszuführen.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele illustriert.
BEISPIEL 1
Eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung wird wie nachfolgend beschrieben hergestellt, und ihre Eigenschaften im Hinblick auf die Alterung werden mit einer ähnlichen, unbehandelten Vollblutprobe verglichen.
Herstellung

1. Entnimm 500 ml Blut in ein steriles Blutentnahmegefäß, das 600 mg Etyhlendiamintetraessigsäure (Dinatrium- oder Trikalium-Salz) gelöst in 50 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) enthält.
2. Teile das antikoagulierte Blut in zwei Teile (jeweils 250 ml).
3. Filtriere ein 250 ml-Volumen durch einen Leukozytenfilter, um Leukozyten zu depletieren. Lagere bei 4°C.
4. Zentrifugiere die verbleibenden 250 ml bei 800 g für 1 Stunde.
5. Entferne den Buffycoat (Leukozytenschicht).
6. Fülle den Buffycoat auf ein Volumen von 250 ml mit Lyse-Lösung auf.

Lyse-Lösung 10 × Stammlösung, pH 7,4

89,9 g Ammoniumchlorid

10,0 g Natriumhydrogencarbonat

370 mg Dinatrium-EDTA
Löse das obige in 1000 ml destilliertem H₂O (1,68 M NH₄Cl). Verdünne auf 2 × Stärke mit destillliertem H₂O und gibt anschließend das gleiche Volumina (1 : 1) 0,2 M Harnstoff (Harnstoff ist in destilliertem Wasser gelöst), um eine finale Lyselösung von 1 × pH 7,5 zu erhalten.

7. Lysiere für 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
8. Zentrifugiere für 3 Minuten bei 800 g und gieße den Überstand ab.
9. Wasche durch Zentrifugation bei 800 g 3 × mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Gieße den finalen Überstand ab.
10. Resuspendiere das Zellpellet in 20 ml PBS.
11. Gib 60 ml filtriertes, 0,1%iges, gealtertes (> 1 Monat) Chromchloridhexahydrat (pH 6,7) in PBS hinzu und inkubiere für 1 Stunde im Dunkeln bei 4°C bei gelegentlichem Mischen.
12. Zentrifugiere für 3 Minuten bei 800 g und gieße den Überstand ab.
13. Resuspendiere in 20 ml PBS und gib 60 ml gealtertes (> 1 Monat) und filtriertes 0,1%iges Chromchloridhexahydrat pH 6,7 in 0,35% Para-Formaldehyd in PBS hinzu. Inkubiere bei 4°C im Dunkeln für 16 bis 22 Stunden.
14. Zentrifugiere bei 800 g für 3 Minuten und gieße den Überstand ab.
15. Wasche zweimal wie in 9.
16. Resuspendiere die Leukozyten in dem Leukozyten-depletierten Vollblut, wie in 3 ausgeführt. Gib Breitbandantibiotika wie beispielsweise Gentamycin, Ciprofloxacin hinzu.
17. Bewahre bis zur Verwendung bei 4°C für 2 bis 3 Tage auf.

Phosphat-gepufferte Salzlösung pH 7,2

7,83 g/l Natriumchlorid

0,36 g/l Dinatrium-EDTA

0,28 g/l Kaliumchlorid

0,26 g/l Kaliumdihydrogenphosphat (monobasisch)

2,35 g/l Dinatriumhydrogenphosphat (dibasisch)
Die Vergleichsergebnisse sind in den anliegenden Zeichnungen illustriert, in denen:
1 die durchflusszytometrischen Eigenschaften von "frischem" Blut nach Färbung auf die Antigene CD3, CD4, CD8 und CD20 zeigt. Die Färbung wurde unter Verwendung der Vollblut-Lyse-Methode ausgeführt und die positiven Gehalte beziehen sich auf die negativen Kontrollen (a) Vorwärtsstreulicht & Seitwärtsstreulicht (FSC & SSC)-Eigenschaften, (b) CD3 PE & CD20 FITC, (c) CD3 FITC & CD4 PE, (d) FITC & CD8 PE.
2 die Wirkung der Alterung auf den durchflusszytometrischen FSC und SSC von "frischem" unstabilisierten Blut über einen Zeitraum von 8 Tagen zeigt; (a) Tag 1, (b) Tag 2, (c) Tag 3, (d) Tag 8.
3a und 3b die Wirkung der Alterung auf die Expression der in 1b beschriebenen Antigene c & d über einen 10tägigen Zeitraum zeigen; 3a(i) (ii) (iii) Tag 1 und 3b(i) (ii) (iii) Tag 10.
4a und 4b die mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmte Stabilität von FSC, SSC und die Eigenschaften der Negativ-Kontrolle bei der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung über einen Zeitraum von 57 Tagen zeigen; 4a Tag 2, 4b Tag 57.
5a und 5b die mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmte Stabilität der in 1b, c & d beschriebenen Antigene über einen 57tägigen Zeitraum zeigen; 5a Tag 2, 5b Tag 57.
6 die Wirkung der Lagerung auf die durchflusszytometrische Leukozyten-Differenzierung von "frischem" Blut über einen Zeitraum von 8 Tagen zeigt. Weitere Analysen nach Tag 8 waren aufgrund der deutlichen Verschlechterung der Probe nicht möglich. Die Analyse verwendete ein FACScan-Durchfluss-Zytometer.
7 die Stabilität der durchflusszytometrischen Differenzierung der stabilisierten Blut-Zusammensetzung über einen Zeitraum von 22 Tagen zeigt. Die Analyse verwendete ein FACScan-Durchfluss-Zytometer.
Das durchflusszytometrische Profil in 1 zeigt die normale Position der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten nach der Lyse der Erythrozyten. Die Antigen-Färbe-Eigenschaften werden ebenfalls in 1b, c, d und e gezeigt. Mit zunehmendem Alter der Probe (2) verändern sich die durchflusszytometrischen Eigenschaften und Antigen-Expressions-Eigenschaften.
Am Tag 8 macht die Menge an Zelltrümmern die Analyse unbefriedigend. Die Fluoreszenz-Markierungs-Eigenschaften haben sich ebenfalls verschlechtert, wie in 3 gezeigt wird.
4 zeigt die Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht-Eigenschaften der stabilisierten Probe zusammen mit der Negativ-Kontrolle am Tag 2 und am Tag 57. Die individuellen Populationen werden unmittelbar nach der Stabilisierung in ihren jeweiligen Positionen gehalten. Nach 57tägiger Aufbewahrung bleiben die durchflusszytometrischen Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht-Eigenschaften intakt (4b). Des Weiteren bleiben die Anti-Expressions-Eigenschaften über diesen Zeitraum unverändert (5).
Die stabilisierte Blut-Zusammensetzung kann verwendet werden, um die Leukozyten-Differenzierung zu überwachen. Unter Verwendung einer spezifischen Kombination von Antikörpern, die gegen die CD14- und CD45-Antigene gerichtet sind, kann eine Differenzierung in drei Populationen erreicht werden. 7 zeigt die Stabilität dieses Parameters, wohingegen 6 die Instabilität von "frischem" Vollblut über einen 8tägigen Zeitraum zeigt. Die Analyse des letzteren wurde nach dieser Zeit aufgrund von Kontamination mit überschüssigen Zelltrümmern abgebrochen.
BEISPIEL 2
Eine stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung wird wie nachfolgend beschrieben hergestellt und seine Alterungs-Eigenschaften werden mit einer ähnlichen, unbehandelte Vollblutprobe verglichen.
Herstellung

1. Entnimm eine Einheit von 500 ml Blut in ein steriles Blutentnahmegefäß, das 600 mg Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatrium- oder Trikalium-Salz) gelöst in 50 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2 enthält, wie in Beispiel 1 beschrieben.
2. Zentrifugiere diese Einheit bei 800 g für 1 Stunde. Entferne das Plasma und bewahre das Plasma auf.
3. Wasche die verbleibenden Zellen zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
4. Entferne den PBS-Überstand.
5. Gib 300 ml filtriertes, 0,1%iges gealtertes (> 1 Monat) Chromchloridhexahydrat (ph 6,7) in PBS hinzu und inkubiere für 1 Stunde im Dunkeln bei 4°C und gelegentlichem Mischen.
6. Zentrifugiere für 45 Minuten bei 800 g und gieße den Überstand ab.
7. Resuspendiere in 300 ml gealtertem (> 1 Monat) und filtriertem 0,1%igen Chromchloridhexahydrat pH 6,7 in 0,35 Para-Formaldehyd in PBS. Inkubiere bei 4°C im Dunkeln für 16 bis 22 Stunden.
9. Zentrifugiere bei 800 g für 45 Minuten und gieße den Überstand ab.
9. Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 800 g, mit PBS. Gieße den finalen Überstand ab.
10. Resuspendiere das stabilisierte Vollblut in dem in Schritt 2 genannten Plasma. Setze Breitbandantibiotika wie beispielsweise Gentamycin, Ciprofloxacin hinzu.
12. Bewahre vor der Verwendung bei 4°C für 2 bis 3 Tage auf.

Die Ergebnisse werden in den beiliegenden Zeichnungen illustriert, in denen:
8a und 8b die mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmte Stabilität von FSC, SSC und die Eigenschaften der Negativ-Kontrolle bei den stabilisierten Vollblut-Zusammensetzungen über einen Zeitraum von 60 Tagen zeigen; 4a Tag 3, 4b Tag 60.
9a und 9b die mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmte Stabilität der Antigene CD3, CD4, CD8, CD19 und CD16 + CD56 über einen Zeitraum von 57 Tagen zeigen; 5a Tag 3, 5b Tag 60.
10 die Stabilität der durchflusszytometrischen Differenzierung der stabilisierten Blut-Zusammensetzung über einen 25tägigen Zeitraum zeigt. Die Analyse verwendete ein FACScan Durchfluß-Zytometer.
11 die Stabilität im Zink-Protoporphyrin (ZPP)-Gehalt in einer Probe der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung über einen Zeitraum von 36 Tagen, gemessen in μmol ZPP/mol Hämoglobin, zeigt.
12 die Stabilität der Gesamtzahl an weißen Zellen und der Gesamtzahl an Lymphozyten über einen 117tägigen Zeitraum für eine Probe der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung zeigt, die unter Verwendung eines Toa (Sysmex) NE8000 Hämatologie-Analysators gemessen wurde.
13 schließlich die Messung des Erythrozyten-Folats in Proben der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung und des frisch gelagerten Vollbluts über einen 50tägigen Zeitraum zeigt.
Das durchflusszytometrische Profil in 1 zeigt die normale Position der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten nach Lyse der Erythrozyten. Die Antigen-Färbungs-Eigenschaften werden ferner in 1b, c, d & e gezeigt. Bei zunehmendem Alter der Probe (2) verändern sich die durchflusszytometrischen und Antigen-Expressions-Eigenschaften. Am Tag 8 macht die Menge an Zelltrümmern die Analyse unbefriedigend. Wie in 3 gezeigt wird, haben sich die Fluoreszenzmarkierungs-Eigenschaften ebenfalls verschlechtert.
Die 8a und 8b zeigen die Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht-Eigenschaften der stabilisierten Probe am Tag 3 und am Tag 60 zusammen mit der Negativkontrolle. Die individuellen Populationen werden unmittelbar nach der Stabilisierung in ihren jeweiligen Positionen gehalten. Nach 60tägiger Aufbewahrung bleiben die durchflusszytometrischen Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht-Eigenschaften intakt (4b). Ferner bleiben die Antigen-Expressions-Eigenschaften in diesem Zeitraum unverändert (9a und 9b). Es wurden durchweg dieselben Geräteeinstellungen beibehalten. Die Ergebnisse zeigen die deutliche Überlegenheit der stabilisierten Blut-Zusammensetzungen der Erfindung gegenüber den unstabilisierten "Kontrollen", wie in den 1 bis 3 gezeigt wird.
Die stabilisierte Blut-Zusammensetzung kann verwendet werden, um die Leukozyten-Differenzierung zu überwachen. Unter Verwendung einer spezifischen Kombination von Antikörpern, die gegen CD14- und CD45-Antigene gerichtet sind, kann eine Differenzierung in drei Populationen erreicht werden. 10 zeigt die Stabilität dieses Parameters über 25 Tage, wohingegen 6 die Instabilität des "frischen" Vollblut über einen 8tägigen Zeitraum zeigt. Die Analyse des letzteren wurde aufgrund von Kontaminationen mit überschüssigen Zelltrümmern nach diesem Zeitraum abgebrochen.
Wie in 11 gezeigt, bleiben die ZPP-Gehalte in der stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung im Wesentlichen konstant, mit einer lediglich sehr geringen Zunahme nach 36 Tagen. Wie in 12 gezeigt, wird die Gesamtzahl an weißen Zellen und die Gesamtzahl an Lymphozyten über einen 170tägigen Zeitraum ebenfalls kaum beeinflusst.
13 zeigt die deutliche Verbesserung, die bei der Stabilität des Erythrozyten-Folats unter Verwendung einer stabilisierten Vollblut-Zusammensetzung gemäß der Erfindung erhalten wurde.
Beispiel 3
Die Vorgehensweise von Beispiel 2 wird unter Verwendung von 0,1%igen (w/v) Lösungen verschiedener Metallsalze in 0,85%iger w/v Phosphat-gepufferter Salzlösung in Schritt 5 wiederholt. Die Stabilität der resultierenden Blut-Zusammensetzungen nach 8 und 12 Tagen wird unter Verwendung eines Durchfluss-Zytometers durch Bestimmung der Eigenschaften von FSC, SSC sowie der Eigenschaften der Negativkontolle gemessen. Die Ergebnisse werden durch visuelle Begutachtung der resultierenden Plots und durch Verwendung der Becton-Dickinson-Simulset-Software Version 2.3 als gut, bestanden oder versagt eingeschätzt.
Diese Ergebnisse zeigen die deutliche Überlegenheit von Verbindungen von Gruppe VIa- und Gruppe VIIa-Metallen gegenüber anderen Schwermetallverbindungen, obwohl einige der letzteren für akzeptabel erachtet wurden, da eine verbesserte Stabilität gegenüber einer unmstabilisierten Kontrolle, die nach nur 4 Tagen eine wesentliche Verschlechterung zeigte, erhalten wurde.
Es wurde herausgefunden, dass gealterte Chrom-Chloridlösung (16 Monate) weniger wirksam ist als die kürzlich hergestellte Lösung (> 1 Tag alt), vermutlich entweder aufgrund der Bildung von komplexen hydratisierten Chrom-Ionenarten in Lösung oder wegen der Präzipitation von unlöslichen Chromhydroxid-Polymerarten, was die Lösung an Chromionen entreichert. Die Aufmerksamkeit des Lesers wird auf alle Schriftstücke und Dokumente gelenkt, die gleichzeitig mit dieser Beschreibung eingereicht werden, und die einer öffentlichen Einsicht mit dieser Beschreibung offensteht. Der Inhalt all dieser Schriftstücke und Dokumente ist hiermit durch Literaturverweis eingeschlossen.
Alle in dieser Beschreibung offenbarten Merkmale (einschließlich aller begleitender Ansprüche, der Zusammenfassung und der Zeichnungen) und/oder alle Schritte oder alle Methoden oder so offenbarte Verfahren können in jeglicher Kombination kombiniert werden, mit Ausnahme von Kombinationen, bei denen sich mindestens einige dieser Merkmale und/oder Schritte wechselseitig ausschließen.
Jedes in dieser Beschreibung offenbarte Merkmal (einschließlich aller begleitender Ansprüche, der Zusammenfassung und der Zeichnungen) kann durch alternative Merkmale, die dem selben, einem äquivalenten oder einem ähnlichen Zweck dienen, ersetzt werden, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes behauptet wird. Daher ist jedes offenbarte Merkmal, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes behauptet wird, nur ein Beispiel für eine generische Serie von äquivalenten oder ähnlichen Merkmalen.

Claims

Zell-Zusammensetzung, die stabilisierte Leukozyten umfaßt, wobei der Stabilisator eine wirksame Menge einer Schwermetall-Verbindung umfasst.
Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zell-Zusammensetzung eine Zell-Suspension ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zell-Zusammensetzung eine Zusammensetzung aus Vollblut ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, in der das Schwermetall ein Übergangsmetall ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, in der das Übergangsmetall ein Metall der Gruppe VIa oder VIIa ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, in der das Übergangsmetall Chrom ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der die Verbindung ein Salz ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, in der das Salz ein Salz einer anorganischen Säure, insbesondere ein Chlorid ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, in der der Stabilisator Chromchlorid ist.
Zell-Zusammensetzung gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, in der der Stabilisator eine gealterte Lösung eines Schwermetallsalzes ist.
Stabilisierte Zell-Zusammensetzung gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, in der der Stabilisator ferner eine wirksame Menge eines Aldehyds umfasst.
Stabilisierte Zell-Zusammensetzung Zell-Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, in der das Aldehyd ein Para-Formaldehyd ist.
Verfahren zur Stabilisierung einer Zell-Zusammensetzung, Schritte umfassend, bei denen man eine ausreichend stabilisierende Menge eines ersten Stabilisators, der eine Schwermetall-Verbindung umfasst, zugibt.
Verfahren zur Stabilisierung einer Zell-Zusammensetzung, Schritte umfassend, bei denen man eine ausreichend stabilisierende Menge eines ersten Stabilisators, der eine wässrige Lösung einer Schwermetall-Verbindung umfasst, zugibt.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, bei dem die Zell-Zusammensetzung eine Zell-Suspension ist.
Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem die Zell-Zusammensetzung Leukozyten umfaßt.
Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem die Zell-Zusammensetzung eine Zusammensetzung aus Vollblut ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 16, bei dem das Schwermetall ein Übergangsmetall ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem das Übergangsmetall ein Metall der Gruppe VIa oder der Gruppe VIIa ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem das Übergangsmetall Chrom ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 19, bei dem die Verbindung ein Salz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, bei dem das Salz ein Salz einer anorganischen Säure, insbesondere eines Chlorids ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 23, indem der Stabilisator Chromchlorid ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 23, bei dem der erste Stabilisator zu der Zell-Zusammensetzung in einer ausreichenden Menge zugegeben wird, um eine Endkonzentration zwischen 0,01% und 0,5% W/V wässriger Lösung zu erhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 24, bei dem der pH-Wert der Lösung von 6,5 bis 7,0 beträgt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 25, bei dem die Zellen dem ersten Stabilisator für eine Zeit von 5 Minuten bis 18 Stunden bei einer Temperatur von 0°C bis 8°C ausgesetzt werden.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 26, bei dem der erste Stabilisator eine wässrige Lösung einer Schwermetallverbindung umfaßt, die für mindestens 24 Stunden gealtert wurde.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 27, bei dem ein zweiter Stabilisator zu der Zell-Zusammensetzung gegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 28, bei dem der zweite Stabilisator ein Aldehyd ist.
Verfahren gemäß Anspruch 29, bei dem das Aldehyd Para-Formaldehyd ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 30, bei dem der zweite Stabilisator als wässrige Lösung in einer Menge von 0,1% bis 0,5% W/V zugegeben wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 28 bis 31, bei dem der zweite Stabilisator eine wässrige Lösung eines Aldehyds und einer Schwermetall-Verbindung umfasst, die einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,0 aufweist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 28 bis 32, bei dem die Zell-Zusammensetzung dem zweiten Stabilisator für einen Zeitraum von 6 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 0°C bis 8°C ausgesetzt wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 28 bis 33, bei dem der erste und zweite Stabilisator nacheinander zu der Zell-Zusammensetzung gegeben werden.
Stabilisierte Zell-Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, die durch ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 34 hergestellt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem die Zusammensetzung aus Vollblut erhalten wurde, indem Proben verschiedener Blutspenden vereinigt wurden.
Material zur Qualitätskontrolle zur Verwendung bei der Leukozyten-Immunophänotypisierung, umfassend eine stabilisierte Zusammensetzung aus Vollblut gemäß Anspruch 3.
Verfahren zur Qualitätskontrolle der Leukozyten-Immunophänotypisierung, bei dem man als Qualitätskontrollstandard eine Zusammensetzung aus Vollblut gemäß Anspruch 3 verwendet.
Verfahren zur Qualitätskontrolle von einem aus Zinkprotoporphyrin, Erythrozyten-Folat, Bestimmung der Anzahl der gesamten weißen Blutkörperchen und Lymphozyten-Anzahl-Blutbestimmungsverfahren, umfassend Schritte, bei denen als Standard Material zur Qualitätskontrolle eine stabilisierte Zusammensetzung aus Vollblut gemäß Anspruch 3 verwendet.
Stabilisierte Zusammensetzung aus Vollblut, umfassend eine Leukozyten-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus stabilisiertem Vollblut, Schritte umfassend, bei denen man eine stabilisierte Leukozyten-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zu Leukozyten-depletiertem Vollblut gibt.
Verfahren gemäß Anspruch 41, bei dem das Leukozyten-depletierte Vollblut durch Filtration des Bluts über einen Leukozytenfilter erhalten wurde.
Stabilisator zur Stabilisierung zellulärer Bestandteile, umfassend eine wässrige Lösung einer Schwermetall-Verbindung und ein Para-Formaldehyd.
Stabilisator gemäß Anspruch 43, bei dem das Schwermetall ein Übergangsmetall ist.
Stabilisator gemäß Anspruch 44, bei dem das Übergangsmetall ein Übergangsmetall aus der Gruppe VIa oder Gruppe VIIa ist.
Stabilisator gemäß Anspruch 45, bei dem das Übergangsmetall Chrom ist.
Stabilisator gemäß irgendeinem der Ansprüche 43 bis 46, bei dem die Verbindung ein Salz ist.
Stabilisator gemäß irgendeinem der Ansprüche 43 bis 47, bei dem das Salz ein anorganisches Salz, insbesondere ein Chlorid, ist.
Stabilisator gemäß irgendeinem der Ansprüche 43 bis 48, bei dem die Schwermetall-Verbindung Chromchlorid ist.
Stabilisator gemäß irgendeinem der Ansprüche 43 bis 49, bei dem die Schwermetall-Verbindung in einer Menge von 0,01 bis 0,5% W/V und das Para-Formaldehyd in einer Menge von 0,1% bis 0,5% W/V vorliegt.
Stabilisator gemäß irgendeinem der Ansprüche 43 bis 50, bei dem das Verhältnis zwischen Schwermetall-Verbindung und Para-Formaldehyd von 5 : 1 bis 1 : 50 beträgt.
Stabilisierte Vollblut-Zusammensetzung, die stabilisierte Leukozyten gemäß Anspruch 1 und nicht-behandelte rote Blutkörperchen umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem der erste Stabilisator zu einer Vollblut-Zusammensetzung gegeben wird, von der nur das Plasma entfernt wurde.