DE3220231A1

DE3220231A1 - Verfahren zur stabilisierung der blutplaettchen bei der bestimmung mehrfacher blutplaettchenparameter in vergleichskontroll- und eichzusammensetzungen sowie verduennungsmittel dafuer

Info

Publication number: DE3220231A1
Application number: DE19823220231
Authority: DE
Inventors: James H. Ft. Lauderdale Fla. Carter; Harold R. Miami Fla. Crews; Ted Miami Fla. Sena
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1981-05-29
Filing date: 1982-05-28
Publication date: 1982-12-23
Also published as: FR2506944A1; ES512660A0; ES8307099A1; JPS57203956A; GB2099282A; GB2099282B; CA1187807A; FR2506944B3; US4389490A

Description

Patentanwälte ' .'."*. .: ;"":«; I .·

Dipl.-ing. E. Eder *'-- -- *

DIpL-Ing, K. Schieschke

8000 München 40, Elisabethstr. 34

Die Einführung neuer verbesserter elektronischer Zählgeräte hat das Bedürfnis nach einer Verbesserung bei der Qualitätskontrolle von Produkten deutlich! gemacht, insbesondere bei menschlichen Blutplättchenvergleichskontrollen zur Zählung biologischer Zellbestandteile für klinisch-diagnostische Zwecke. Ein derartiges System ist das Coulter Counter Model S-Plus Hämatologiesystem, das die Volumenverteilung menschlicher Blutplättchen in Gesamtblutproben zählt und überprüft. Geräte ähnlicher Art werden von anderen Herstellern zu diesem Zweck verkauft.

Frühe Untersuchungen der Volumenverteilungsanalyse haben Änderungen in der Größenverteilung der Blutplättchen unterschiedlicher menschlicher blutplättchenreicher Plasmalb Zubereitungen gezeigt. Abweichungen in der Art der Blutplättchenverteilungskurven verdeutlichen Zählunterschiede. Diese Feststellungen haben Fragen in bezug auf-deren Bedeutung bei der klinischen Anwendung aufgeworfen.

Die mittlere Zellvolumenverteilungs-Analyse hat in jüngerer Zeit an .Bedeutung gewonnen als geeignete Messung für die klinische Anwendung. Die menschliche Blutplättchenverteilungsbrei.te kann nunmehr aufgrund spezifischer gemessener Parameter berechnet werden. Jeder dieser gemessenen Parameter i.st als eine Verbesserung der Überprüfung der logarithmischen Normalverteilung menschlicher Blutplättchen anzusehen.

Die Daten der elektronischen Eichung sind der Bedienungsperson derartiger Geräte genau beschrieben. Es sind jedoch "^ Vergleichskontrollen erforderlich, um gute Qualitätskontr:o 11 ν erfahren sicherzustellen und die funktionellen Eigenschaften im. Hinblick auf die Zählweise und die Volumenverteilungsanalyse zu überwachen.

Es ist außerordentlich wichtig, diese hämatologischen Systeme ausreichend zu überwachen. Jede menschliche Blutplättchenvergleichskontrolle muß sämtlichen Kriterien entsprechen, die bei den menschlichen Patienten-Proben gemessen werden.

Die Vergleichskontrolle muß sich der normalen frischen Gesamtblutprobe möglichst weit annähern. Sie muß auch geeignet eingestellten Grenzwerten in bezug auf die Zählweise, genau ausgeglichenen öffnungen, den Strom, den Verstärkungseinstellungen und der Empfindlichkeit des Systems hinsichtlich sämtlicher funktioneller Gesichtspunkte entsprechen.

Gegenwärtig befinden sich mehrere Vergleichskontr'oll-Zubereitungen auf dem Markt. Sie weisen jedoch keine langanhaltende Stabilität in bezug auf das Zählen, das mittlere Zellvolumen und die Größenverteilung auf. Auch führen Veränderungen und Verschiebungen bei dem Verfahren zu falschen Zählungen.. Die gemeinsame Ursache von Zählunterschieden ist die Aggregation. Durch die Aggregation entstehen Doubletten, die bei dem weißen Blutkörperchenverfahren gezählt werden, was zu unzuverlässigen Qualitätskontrollmessungen führt. Eine weitere Diskrepanz erfolgt bei der Zählung aufgrund des schlechten Verhaltens der Stabilität mit der Zeit bis zu dem erwarteten Verfallsdatum.

Versuche menschliche Blutplättchen zu stabilisieren, haben sich als außerordentlich schwierig herausgestellt. Ein großes Problem stellt die Zersetzung der Blutplättchenmembran dar. Wenn sich Blutplättchenmembranen zersetzen, so entstehen ' Bruchstücke -/ ^{die z}" falschen Zählungen führen. Neue Verfahren durch eine verbesserte Computertechnologie zur Kurvenanpassung der Ausgangsdaten sind mit diesen Problemen behaftet.

In der US-PS 4 160 644 wird ein Verfahren zur Herstellung einer Vergleichskontrollzusammensetzung beschrieben, die bezüglich der Zählung und der Bewegung stabil ist, bei 3^ der eine geringe Menge festen Polyäthylenglycols entweder zu der Blutplättchensuspension, die mit Glutaraldehyd fixiert ist, oder z.u dem Verdünnungsmittel zu dieser aldehydbehandelten Blutplättchensuspension zugegeben wird,

-τι um eine Stabilisierung in bezug auf die Zeit und auch während der Bewegung zu erreichen. Das bevorzugte feste Polyäthylenglycol weist ein Molekulargewicht von etwa 6000 auf. Es wird darauf hingewiesen, daß das flüssige PoIyS,thylenglycole mit niedrigem Molekulargewicht sich zu diesem Zweck als unwirksam herausgestellt haben, obgleich die Wirkung auf die Oberflächenspannung ähnlich war.. Es wird ferner in dieser Patentschrift darauf hingewiesen, daß "eine Untersuchung der Größe der mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelten Blutplättchen in einem Coulter ZBI, einem Gerät, das zur Größenanalyse von Teilchen, wie Blutplättchen und weißen Blutzellen., verwendet wird, zeigte, daß dort eine große Herabsetzung der Größe der Blutplättchen erfolgte. Wenn die Blutplättchen jedoch unter dem Mikroskop mit einem Okularmikrometer untersucht wurden, konnte keine Änderung der Blutplättchen festgestellt werden. Das Prinzip des Coulter'Counter ist das, daß es Änderungen der Konduktivität mißt; die oberflächenaktiven Mittel ändern die Konduktiv!tat und lassen damit die Blutplättchen gegenüber dem Gerät kleiner erscheinen". Es hat sich herausgestellt, daß diese Feststellungen nicht zutreffen. Die Änderung des tatsächlichen Volumens (aufgrund des Schrumpfens) kann mit Hilfe eines Mikroskops nicht festgestellt werden, das auf den Durchmesser abgestellt ist, da bei einem Teilchen von Blutp lättchengröße eine geringe Änderung des Durchmessers zu einer großen Änderung des Volumens führt. Es wird davon ausgegangen, daß die tatsächliche Wirkung von· oberflächenaktiven Mitteln zu einer Änderung der Form führt, beispielsweise einem übergang von einer Scheiben- in eine Kugelform., wodurch sich das scheinbare Volumen um einen Faktor 1.:4 ändert.

Nach der US-PS 4 1.98 206 wird die aldehydbehandelte Suspension mit einer Lösung von

1) einer Aminosäure, nämlich Glycin oder Alanin,

2) Glycol, Glycerzin oder Methanol,

3) Puffersalzen,

und

4) einem festen Polyäthylenglycol (Molekulargewicht 4000 bis 20000)

gewaschen, um Blutplättchen zu erhalten, die keine Aggregate bilden und die ihre Größe wenigstens 6 Monate beibehalten.

Eine wässrige Lösung von Glutaraldehyd und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, das ein Gemisch aus Äthoxylaten isomerer linearer Alkohole ist,, wird in der US-PS 3 912 450 und in der US-PS 3 968 248 beschrieben. In diesen Patentschriften wird jedoch die Verwendung eiaer derartigen Zusammensetzung für hämatologische Zwecke nicht erwähnt, sondern lediglich zur Sterilisation.

Eine große Gruppe von Analyten sind von anderen Forschern eingesetzt worden, um die Festigkeit von Zellmembranen durch Fixierung zu erhöhen. Beispiele für diese Fixiermittel sind Formaldehyd, Glutaraldehyd, Brenztraubensäure und ähnliche Verbindungen. Durch die Verwendung dieser Bestandteile kann die Größenverteilung und das Volumen menschlicher Blutplättchen geändert werden. Die Aggregation der Blutplättchen ist ein stets vorhandenes Problem, neben einer langandauernden Stabilität der fixierten Blutplättchen,, wodurch die Ersetzbarkeit dieser Verbindungen bei verbesserten Qualitätskontrollmessungen begrenzt wird.

Die. Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung menschlicher Blutplättchen, das dazu beiträgt, die vorstehend erwähnten Unterschiede zu beseitigen, so daß sichergestellt ist, daß der Bericht über die Ergebnisse der Patienten zu dem klinischen Diagnostiker, korrekte Ergebnisse enthält , was zu einer verbesserten Medizin und Verbesserungen in der medizinischen Industrie führt.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Verfahren zur Stabili-

sierung menschlicher oder tierischer Blutplättchen zur Bestimmung mehrfacher Blutplättchenparameter in Ver— gleichskontrollen unter Verwendung elektronischer Geräte. Eine Blutplättchensuspension wird stabilisiert, indem ihr eine geeignete Menge Glutaraldehyd und ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel zugegeben wird, das ein Gemisch aus Äthoxylaten bestimmter isomerer linearer Alkohole ist. Die stabilisierten Blutplättchen können bei sich ausschließlich auf die Blutplättchen erstreckenden Kontrollen sowie bei menschlichen Gesamtblutvergleichskontrollen verwendet werden, wobei ein gutes Qualitätskontrollverfahren sichergestellt wird und funktioneile Eigenschaften in bezug auf Zählverfahren und die Volumenverteilungsanalyse überwacht werden.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung von Blutplättchen zur Bestimmung mehrfacher Blutplättchenparameter bei Vergleichskontrollen und Eichungen mit einem elektronischen Teilchenzählgerät.

Bei dem Verfahren wird eine Zusammensetzung eingesetzt, die eine Kombination von Glutaraldehyd und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel enthält, das ein Gemisch aus A'thoxylaten isomerer linearer Alkohole mit der Formel

CH₃-(CH₂)_n-CH₃

0-(CH₇-CH₉-O)-H

ist, in der die Polyoxyäthylenkette zufallsverteilt an die lineare aliphatische Kette gebunden und η = 9 bis 13 und χ = 9 bis 1.3 ist, wobei die Zusammensetzung auf einen vorgegebenen pH und eine vorgegebene Osmolalität eingestellt wird. Das vorstehend beschriebene nichtionische oberflächenaktive Mittel wird unter dem Namen Tergitol 1.5-S-1.2 verkauft. Der lineare hydrophobe Alkylteil des oberflächenaktiven Mittels ist ein Gemisch aus linearen

C₁₁ bis C₁₅ Ketten. Der hydrophile Teil ist eine Polyoxyäthylenkette mit 9 bis 1.3 Oxy ä t hy 1 en gruppen/ die zufallsverteilt an die lineare aliphatische Kette durch eine Ätherbrücke gebunden sind., wie in der oben angegebenen Formel dargestellt.

Tergitol 15-S-12, das von Union Carbide hergestellt wird, weist folgende Eigenschaften auf:

Molekulargewicht 728

Trübungspunkt (1 % wässrige Lösung) 9O⁰C Fließpunkt 1.7 ^PC

Löslichkeit in Wasser bei 25⁰C 100% Scheinbares spezifisches Gewicht 20/20°C 1,023 Dichte 8,49 lb/gal bei 30⁰C

Viskosität 48 ck bei 40⁰C Flammpunkt 46O⁰F (ASTM Methode D 92)

Die vorstehend beschriebene Zusammensetzung wird als Fixier- und Stabilisiermittel in der Mehrfachanalyse von Ganzblutvergleichskontrollen sowie von lediglich Blutplättchen betreffenden Kontrollen und Eichungen eingesetzt, um mehrfache Blutplättchenparameter mit elektronischen Teilchenzählgeräten zu bestimmen.

Ohne die Theorie der Wirkung einschränken zu wollen, wird als Mechanismus der stabilisierenden Wirkung angenommen, daß sich native Blutplättchen im zirkulierendem Plasma im Gleichgewicht mit freiem und proteingebundenem Kalzium, bestimmten Proteingerinnungsfaktoren und anderen Antikörpern, die im menschlichen Plasma festgestellt worden sind, befinden. Es wird allgemein angenommen, daß die Gewinnung von Gesamtblut mit herkömmlichen Antikoagulanzien hauptsächlich die bevorzugte Chelatbildung von aktivem Kalzium umfaßt, wodurch der auf die Blutplättchen gerichtete Gerinnungsmechanisraus. inhibiert wird. Dies kann durch die Initiierung der Gerinnung nach der Zugabe von zusätzlichem Kalzium zum. Plasma demonstriert werden.

Die Gerinnungsfaktoren und die Koagulationsproteine werden anscheinend nicht beeinträchtigt.

Nach der Zugabe der Stabilisierungslösung, die Glutaraldehyd und ein oberflächenaktives'Mittel enthält, zu einem blutplättchenreichen Plasma, beginnt das oberflächenaktive Mittel sofort große Proteine, Lipide und Zellmembranoberflächen zu binden, wodurch sie zu polaren und weniger polaren Bereichen modifiziert werden. Bei den fast neutralen Bedingungen der proteingebundenen Lösung des oberflächenaktiven Mittels, tritt eine geringe oder keine elektrische Polarisation auf, die in den Proteinxnolekülen induziert wird, abgesehen von deren nativem zwitterionischen Charakter bei pH 7,2. Auch bei. diesem pH liegt Glutaraldehyd hauptsachlich in dimerer Form mit sehr geringen Mengen an aktiven Monomeren im Gleichgewicht vor. Wenn keine elektrophilen Zentren induziert sind, wird die Geschwindigkeit des Angriffs und der Reaktion von aktivem Aldehyd auf die Zeil- und Plasmaproteine erheblich herabgesetzt.

Vernetzungsreaktionen unter Verwendung der zweiten Aldehydgruppe sind noch ungünstiger. Diese Art der Reaktion wird im. allgemeinen als Fixierung bezeichnet, wobei durch sie die aktiven Wasserstoffbindungsstellen in dem Proteinmolekül ständig abgedeckt werden, wodurch Konformationsänderungen, die durch thermisches Aufbrechen von Plasmatind Zellproteinen auftreten, verhindert werden.

Der Schlüssel zu diesem gesamten Prozeß liegt in den relativen Konzentrationen und der Natur des speziellen verwendeten oberflächenaktiven Mittels, im Glutaraldehyd, in den Blutplattchen— und Plasmaproteinen sowie in den angewendeten kontrollierten pH-Bedingungen. Die Zugabe von mehr oder stärkeren oberflächenaktiven Mitteln führt zu beträchtlichen Formänderungen. Die Anwendung niedriger pH-Werte oder von mehr Glutaraldehyd führt zu einer beträchtlichen Vernetzung und einer sich daraus ergebenden Veränderung, wodurch die Stabilitätszählung beeinträchtigt wird. Der Umstand, daß dieses Verfahren nicht die

Integrität der Gerinnungsfaktoren beeinflußt, ist durch erneute Kalziumzugabe und Thrombinzusatz gezeigt worden. Prothrombinzeiten und aktivierte Partialthromoplastinzexten sind unbegrenzt.
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Es ist vorgeschlagen worden, daß, wenn nichtionische oberflächenaktive Mittel benutzt werden, die nichtionischen linearen Alkoho3äthoxylate die Oberflächenspannung herabsetzen und die Benetzbarkeit der Blutplättchen/Flüssigkeit-Grenzschicht derart erhöhen, daß sie eine schnellere Absorptionsrate der Glutaraldehydmoleküle hervorrufen. Dies könnte auch das Ergebnis davon sein, daß an der Blutplättchen/Flüssigkeit—Zwischenschicht eine höhere Konzentration an Glutaraldehydmolekülen eingeschlossen wird, und/oder eine schnellere Penetration innerhalb der Blutplättchenteilchen hervorgerufen wird.

Es ist nun festgestellt worden, daß das Molekulargewicht des betreffenden oberflächenaktiven Mittels eine unmittelbare Wirkung auf die Membraneigenschaften hat. *3eben einer Verringerung des negativen Ladungspotentials der Membran setzt das oberflächenaktive Mittel die gegenseitige Anziehung der Zellen herab, wodurch eine Aggregation oder eine Klumpenbildung verhindert wird. Das Molekulargewicht des bevorzugten flüssigen nichtionischen oberflächenaktiven Mittels Tergitol 1.5-S—1.2 beträgt weniger als etwa 750. Dies steht im Gegensatz, zu den hohen Molekulargewichten von festem Polyäthylenglycol (4000 bis 20000), das nach der. US-PS 4 1.60 644 und der US-PS 4 198 206 als erforder-

^O lieh angesehen wird.

Durch die Erfindung wird, eine langandauernde Stabilität hervorgebracht, die ausreicht, um den wahren Zusammenhang aller Volumenverteilungsfunktionen z.u zeigen, der bei der Überprüfung von normalen, menschlichen Blutplättchen angegeben wird, einschließlich

A. Mittel

B.. Verfahren

C. Mittleres Blutplättchenvolumen

D.. Blutplättchenverteilungsbreite

E. Blutplättchenzählverfahren

F. Signal/üntergrund-Verhältnis

Dadurch wird sichergestellt, daß das Gerät richtig überprüft wird im Hinblick auf alle Funktionen, die erforderlieh sind, um menschliche Blutplättchen ausreichend zu überprüfen, so daß sichergestellt ist, daß korrekte Ergebnisse dem klinischen Diagnostiker übermittelt werden. Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sie in Gegenwart von Harnstoff und Natriumchlorid zur Anwendung kommt, einer Kombination, die gleichfalls stabilisierende Wirkung hat.. Die Gegenwart beider Kombinationen von Materialien gewährt eine doppelte Sicherheit, da sämtliche Parameter des Blutplättchenkontrollreagenz für einen beliebig langen .Zeitraum stabil bleiben.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der erste Schritt darin, daß mit niedriger Ge-"^: schwindigkeit frisches Blut zentrifugiert wird, das in einem herkömmlichen Antikoagulanz gesammelt worden ist, um ein blutplättchenreiches Plasma zu erhalten. Innerhalb • von 2 Stunden nach der Blutentnahme werden 50 ml einer wässrigen Lösung mit einem Harnstoffgehalt von 2,0 molar dem blutplättchenreichen Medium zugesetzt. Innerhalb von 5 Tagen nach der Blutentnahme werden 50 bis 100 ml der folgenden fixiermittelstabiJLisierenden Zusammensetzung jeder Probe des harnstoffhaltigen blutplättchenreichen Mediums zugesetzt;

Fixiermittelstabilisierende Zusammensetzung

NaH₂PO₄-H₂O 0,196 g

Na₂HPO₄.7H₂O 1,960 g

NaN₃ 0,098 g

NaCl 7,9 g

Glutaraldehyd, 49 % 8,4 g

Tergitol 1.5-S-12 0,5 g

Wasser q.s. X L

Der pH 1st mit Phosphaten auf 7,3 bis 7,4 und die Osmolalität auf 290 mOs/kg mit NaCl eingestellt.

In der vorstehenden fixiermittelstabilisierenden Zusammensetzung beträgt die Konzentration des Glutaraldehyds etwa 0,t % bis 5 % G/V und die Konzentration des Tergitol 15-S-12 etwa 0,01. % bis. 1. % G/V. Der pH wird auf einem Bereich von 6,8 bis 7,6 mit Phosphat eingestellt, und die Osmolalität auf 280-340 Milliosmol je Kilogramm mit Natriumchlorid.

Das Gemisch wird 2 bis 5 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Plasma und die fixiermittelstabilisierende Zusammensetzung werden dann abgepreßt, um die stabilisierten Blutplättchen zu erhalten.

Für Gesamtblutvergleichskontrollen werden die stabilisierten Blutplättchen in 30 ml 2 M Harnstoff erneut suspendiert, oder in 30 ml eines herkömmlich hergestellten Gesamtblutkontrollsuspensionsmediums, wie Coulter 4C Baker Haem-C oder Dade CH-60.

Für. sich lediglich auf Blutplättchen erstreckende Kontrollen werden die stabilisierten Blutplättchen in 30 ml einer

Lösung erneut suspendiert, die im Verhältnis 1:1 aus einer fixiermittelstabilisierenden Zusammensetzung und einer phosphatgepufferten Salzlösung besteht, die auf pH 7,3 bis 7,4 und 290 mOs/kg eingestellt ist.. 35

Die fixiermittelstablllslerte Zusammensetzung kann auch direkt dem blutplättchenreichen Plasma zugegeben werden, das durch langsames Zentrifugieren von frischen Blut—

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plättchen erhalten worden· ist, um eine Stabilität sämtlicher nützlicher Blutplättchenparameter zu erhalten. Dies steht im. Gegensatz· zn dem Zweischrittverfahren nach der US-PS 41.6Q644, bei der ein festes oberflächenaktives Mittel, das Polyäthylenglycol mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 20000 ist, zuerst der aldehydfixierten Blutplättchensuspension zugesetzt wird, worauf das Verdünnungsmittel zugemischt wird; oder bei. dem zuerst das Polyäthylenglycol dem Verdünnungsmittel zugesetzt wird, worauf die aldehydfixierte Blutplättchensuspension zugegeben wird.

Patentanwälte DipU'r.g. E. Eäer

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Claims

Patentanwälte

Dipl.-!ng. E.Eder

DIpl.-lng. K. Schieschke

8000 München 40, Elisabethsir. 34

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida U.S.A.

Verfahren zur Stabilisierung der Blutplättchen bei der Bestimmung mehrfacher Blutplättchenparameter in Vergleichskontroll- und Eichzusammensetzungen sowie Verdünnungsmittel dafür

Patentansprüche

[1J Verfahren zur Stabilisierung der Blutplättchen hei der Bestimmung mehrfacher Blutplättchenparameter in Vergleichskontrollen und Eichungen mit elektronischen Teilchenzählgeräten, dadurch gekennzeichnet , daß zu" einem blutplättchenreichen Plasma eine Zusammensetzung gegeben wird, die eine geeignete Menge Glutaraldehyd und ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel enthält, das ein Gemisch aus Äthoxylaten isomerer linearer Alkohole mit der Formel

CH₃-(CH₂)_n-CH₃

0-(CH₂-CH₂-O)_x-H

ist, in der die Polyoxyäthylenkette zufallsverteilt an die lineare aliphatische Kette gebunden, η = 9 bis 13 und χ = 9 bis T3 ist, wobei die Zusammensetzung auf einen

• · β

vorbestimmten pH- und. Osmolalitätsbereich eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels weniger als 750 beträgt.
3.. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0,01. bis 1. % G/V vorliegt.
4. Verfahren nach Anspruch 1., 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,1. % bis. 5 % G/V vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche X bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung auf einem pH im Bereich von 6,8 bis 7,6 und eine Osmolalität von 280 bis 34 0 mOs/kg eingestellt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1;, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine Glutaraldehydkonzentration von 4,1; g/l, und. eine Konzentration des oberflächenaktiven Mittels von 0,5 g/l aufweist und auf einen pH yon 7,3 bis 7,4 und eine Osmolalität von 290 mOs/kg eingestellt wird..

7. Fixiermittelstabilisierende Zusammensetzung als Zusatz zu einem blutplättchenreichen Plasma mit einem Harnstoffgehalt von 2,0 molar zur Stabilisierung der Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Materialien in geeigneten Konzentrationen vorhanden sind:

A. Eine wässrige Natriumchloridlösung, ein monobasisches Phosphatsalz, und ein dibasisches Phosphatsalz, eingestellt auf einen bestimmten pH und eine bestimmte Osmolalität;

B. ein bakteriostatisches Mittel, das Natriumazid enthält;

C. ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das

ein Gemisch aus Äthoxylaten isomerer linearer Alkohole mit der Formel

CH₃-(CH₂)_n-CH₃

0-(CH₉-CH₉-O)-H

ist, in der die Polyoxyäthylenkette zufallsverteilt an die lineare aliphatische Kette gebunden und η = 9 bis 1;3 und χ = 9 bis 13 ist; und

D. Glutaraldehyd.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das nicfr

i;5-a-i;2 ist.

daß das nichtionische oberflächenaktive Mittel Tergitol

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des nichtionischen

oberflächenaktiven Mittels weniger als 750 beträgt, der Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,1 % bis 5 % und das nichtionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0,01; bis 1' % G/V vorliegt sowie die Zusammensetzung auf einen pH von 6,8 bis 7,6 eingestellt ist.

1Q. Verfahren zur Fixierung und Stabilisierung von Blut-·*- plättchen in einer Probe blutplättchenreichen Plasmas

zfur Gesamtblutkontrolle oder nur zur Blutplättchen-30

kontrolle, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

A. Zugabe einer geeigneten Menge einer zweimolaren wässrigen Harnstofflösung zu dem blutplättchenreichen

Plasma, das durch Zentrifugieren von frischem Gesamt-35

blut erhalten worden ist, das mit einem herkömmlichen Koagulanz gesammelt worden ist;

B. Zugabe der fixiermittelstabilisierenden Zusammensetzung nach Anspruch 7 innerhalb von 5 Tagen

a β w · *

und stehen lassen des Gemischs für 2 bis 5 Tage bei Raumtemperatur;

C» Abpressen der fixiermittelstabilisierenden Zusammensetzung und anschließendes Resuspendieren der stabilisierten Blutplättchen in einem Suspensionsmedium., das zur Bestimmung mehrfacher Blutplättchenparameter geeignet ist.

1.1.. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierten Blutplättchen des Schritts (C) in einem Medium resuspendiert werden, das stabilisierte rote Blutzellen enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die fixiermittelstabilisierende Zusammensetzung nach Anspruch 7 zu salzhaltigen gewaschenen menschlichen Blutplättchen gegeben wird.

1.3. Verfahren nach Anspruch 1.0, 11 oder 1.2, dadurch

gekennzeichnet, daß das blutplättchenreiche Plasma aus menschlichem oder tierischem Blut gewonnen wird.

1.4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1.0 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das fixiermittelstabilisierende Medium eine logarithmisch normale Verteilung der Blutplättchen aufrechterhält.

Patentanwalts DJpI.-Ing. Dipl.-Ing. K.^hieschke

8000 München-IZ/rafcabethstr.