DE60133510T2

DE60133510T2 - Automatisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Überwachung von exogenem Hämoglobin in Vollblut, Blutplasma und Blutserum

Info

Publication number: DE60133510T2
Application number: DE60133510T
Authority: DE
Inventors: Michael J. So. Nyack Malin; Phyllis Stamford Shapiro
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2021-06-06
Also published as: EP1162461B1; EP1162461A3; DE60133510D1; EP1162461B8; ES2305014T3; JP2002040029A; ATE391917T1; JP4694720B2; US20020012904A1; EP1162461A2; US6623972B2

Description

Diese Anmeldung beansprucht Nutzen der US-Patentanmeldung Nr. 60/210,625, eingereicht am 9. Juni 2000.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neue Verfahren zum Detektieren, Quantifizieren und Überwachen extrazellulären oder exogen hinzugegebenen Hämoglobins, einschließlich Hämoglobinersatzmitteln, in einer Blutprobe, insbesondere in einer Vollblutprobe und auch in Plasma- und Serumproben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin das Verwenden von automatischen Hämatologie-Analysatoren zum Ermitteln und Quantifizieren der Konzentration extrazellulären und exogenen Hämoglobins, einschließlich zellfreier Hämoglobinersatzmittel, in einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe; diese Erfindung ist insbesondere vorteilhaft für die medizinische Nutzung bei einer Verletzung oder einer Operation eines Patienten sowie zum Überwachen von Hämoglobin-Leveln während der Rehabilitation.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Seit langem hat man Vollblutersatzmittel als Alternativen zu Vollblut für den Einsatz in der Medizin, insbesondere nach Verletzungen und/oder Operationen, wenn Transfusionen erforderlich sind, gesucht. Motiviert durch die Notwendigkeit, große Blutmengen an das Militär auf Schlachtfeldern zu liefern, aber beschränkt durch die Ressourcen zur Gewährleistung der Sicherheit des Blutvorrats angesichts möglicher Kontaminierung durch menschliche Krankheitserreger und Viren, besonders Hepatitisviren und HIV, haben Blutbanken in den frühen 1980er Jahren ihre Vollblutlieferungsprogramme aufgegeben.
Allerdings ist die Suche nach Blutersatzmitteln, z. B. nach synthetischen Blutersatzmitteln, die frei von Kontaminanten sind und bei der Behandlung von Patienten verwendet werden können, weiter fortgesetzt worden.
Zurzeit gibt es ein wiedererwachtes Interesse, Blutersatzmittel herzustellen und/oder zu isolieren. Allerdings hat die Branche – wegen der Komplexität von Blut und der verschiedenen Komponenten, aus denen Vollblut besteht, und wegen der strengen staatlichen Vorschriften bezüglich des Testens und Verwendens solcher synthetischen Produkte – ihre Forschungsbemühungen auf das Entwickeln von Produkten konzentriert, die vorübergehend Sauerstoff liefern, und nicht auf das Entwickeln einer Vielfalt unterschiedlicher Produkte, die andere Funktionen haben, die transfusioniertes Blut bietet.
Aus menschlichem oder tierischem Blut isoliertes Hämoglobin (HGB, hemoglobin) und ein synthetisch hergestellter Sauerstoffträger wie etwa Perfluorcarbon, sind zwei Arten von Hämoglobinersatzmitteln, die zurzeit klinischen Tests unterzogen werden. Andere Ersatzmittel für rote Blutzellen, d. h. sauerstofftragende Hämoglobinersatzmittel, sind ebenfalls entwickelt und für die Verwendung bei Patienten charakterisiert worden. (Siehe beispielsweise Red Blood Cell Substitutes, 1998, Herausgeber: A. S. Rudolph, R. Rabinovici und G. Z. Feuerstein, Dekker, New York, New York.) Solche sauerstofftragenden Hämoglobinersatzmittel könnten in Verbindung mit standardmäßigen medizinischen Therapien wie etwa der Transfusion von Blut oder Blutprodukten verwendet werden. Als spezielles, aber nicht einschränkendes Beispiel hat die Enzon, Inc. (Piscataway, New Jersey) ein polyethylenglycol-modifiziertes (PE-modifiziertes) Rinderhämoglobin, abgekürzt PEG-HGB, entwickelt. PEG-HGB wird durch in einem Prozess hergestellt, in dem Faserbündel aus PEG mit den Oberflächen von HGB-Molekülen vernetzt werden, wie es beispielsweise in den Nho et al. erteilten US-Patenten 5,386,014 und 5,234,903 beschrieben ist. Zu anderen speziellen, aber nicht einschränkenden Beispielen zählen Hemopure^® und Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA).
Die HGB-Ersatzmittel der ersten Generation waren generell für kurzzeitige Behandlungen von Blut-/Sauerstoff-Verlusten während Operationen oder nach Verletzungen gedacht. Ein Nachteil von HGB-Ersatzmitteln ist die diesen Produkten eigene kurze Halbwertszeit im Kreislauf. Beispielsweise haben HGB-Ersatzmittel, die Blut hinzugegeben werden, eine Halbwertszeit im Kreislauf von bis zu 36 Stunden, verglichen mit einer Halbwertszeit von bis zu 30 Tagen von transfusioniertem Blut im Kreislauf. Allerdings ist diese relativ kurze Halbwertszeit bei der Verwendung solcher Blutersatzmittel typischerweise kein ernstes Problem, weil diese Produkte vorwiegend dem Ziel kurzdauernder Behandlung dienen sollen.
Beim Entscheiden, ob ein Patient, der eine niedrige Bluthämoglobinkonzentration hat, eine Bluttransfusion bekommen soll oder nicht, liegt der »Entscheidungspegel« zum Transfusionieren zwischen circa 6 und 8 g/dL Hämoglobin im Vollblut und hängt ab von etlichen speziellen Faktoren wie etwa Blutvolumen-Status, Lungen-, Herz- und Zerebralgefäß-Status, Chronizität oder Schwere von Anämie, Patientensymptome bezüglich Blutverlust, erwarteter Blutverlust bei einem bestimmten Eingriff, Risiko von Nachblutungen nach Operation, Hochrisiko-Patienten (d. h. ältere Personen) und Thrombozytopenie.
Im Allgemeinen wird das Messen von Hämoglobin in Vollblutproben mithilfe im Handel erhältlicher automatischer Hämatologie-Analysatoren durchgeführt. Bis heute können die im Handel erhältlichen Blutanalysatoren – mit Ausnahme bestimmter Hämatologie-Analysatoren wie etwa der von der Bayer Corporation (z. B. das Hämatologie-Analysatorsystem ADVIA 120^®) – nur das Gesamt-Hämoglobin messen, was nicht nur exogen hinzugegebenes Hämoglobin einschließt, sondern auch Zell-Hämoglobin, das aus den roten Blutzellen einer Blutprobe stammt. Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit, das exogene Hämoglobin in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe auf zuverlässige, reproduzierbare und automatische Weise zu ermitteln und zu messen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bekanntmachen eines Verfahrens zum getrennten und präzisen Detektieren, Quantifizieren und Überwachen unterschiedlicher Arten von Hämoglobin im Rahmen einer Analyse einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe, vorzugsweise einer Vollblutprobe, nämlich (i) aus roten Blutzellen stammendes Hämoglobin (hier Zell-Hämoglobin genannt); (ii) extrazelluläres Hämoglobin oder ein Hämoglobin-Produkt oder -ersatzmittel, insbesondere ein zellfreies Hämoglobin-Derivat, z. B. PEG-HGB oder eine synthetische Form von Hämoglobin, z. B. Hemopure^® (Biopure, Cambridge, MA); Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA), das ein Patient, der hinzugegebenes HGB benötigt, per Transfusion bekommen hat oder das einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe hinzugegeben worden ist (d. h. exogenes Hämoglobin); und (iii) Gesamt-Hämoglobin (d. h. die Kombination von Zell-Hämoglobin und exogenem Hämoglobin).
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Möglichkeit zu schaffen, Hämoglobin oder ein Hämoglobin-Produkt, -derivat oder -ersatzmittel, wie etwa ein zellfreies Hämoglobin-Derivat, das dem Blut eines Patienten oder einer es benötigenden Person hinzugegeben worden ist, während eines Behandlungsverlaufs oder Behandlungsregims zu überwachen. Außerdem kann gemäß der vorliegenden Erfindung Hämoglobin oder ein Hämoglobin-Produkt, -derivativ oder -ersatzmittel wie etwa ein zellfreies Hämoglobin-Derivat als exogenes Hämoglobin im Blut, Plasma oder Serum eines Patienten überwacht, ermittelt oder quantifiziert werden, nachdem der Patient eine Transfusion mit einem solchen Hämoglobin-Produkt oder einer das Produkt enthaltenden Substanz (z. B. eine physiologisch geeignete Lösung oder Zusammensetzung und dergleichen) bekommen hat.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bekanntmachen eines Verfahrens zum Aufgliedern und präzisen Messen des Beitrags eines hinzugegebenen oder exogenen Hämoglobin-Produkts oder Blutersatzmittels, z. B. PEG-HGB, getrennt vom Beitrag des zellularen HGB, das von den roten Blutzellen eines Patienten stammt. Gemäß der vorliegenden Erfindung berechnet das beschriebene automatische, analytische Verfahren die spezifische Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in einer Blutprobe, die mit einem Hämoglobin-Produkt transfusioniert worden ist, oder in einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe, die extrazelluläres Hämoglobin enthält, das detektiert werden soll. Somit ermöglicht die Erfindung das Detektieren und Überwachen einer extrazellulären Hämoglobin-Komponente selbst bei gleichzeitigem Vorhandensein einer Zell-Hämoglobin-Komponente, die von den roten Blutzellen in einer gegebenen Probe stammt. Außerdem ist mithilfe des vorgestellten Verfahrens schon eine so geringe Menge wie ungefähr 0,5 g/dL Hämoglobin in einer Gesamtmenge von ungefähr 6,0 g/dL extrazellulären Hämoglobins detektierbar. Es sind Experimente in dem für Transfusionen relevanten Bereich der HGB-Konzentration durchgeführt worden, d. h. bei einem Entscheidungspunkt von circa 6–7 g/dL Gesamt-HGB im Blut. Darüber hinaus war Hämoglobin in Blutproben nachweisbar und quantifizierbar, die 24 Stunden alt waren und bei Temperaturen von 2 bis 8°C gelagert worden waren.
Weitere mithilfe der vorliegenden Erfindung erreichbare Ziele und Vorteile werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung klar werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren gemäß Anspruch 1, um unterschiedliche Arten von Hämoglobin in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe getrennt und präzise zu detektieren und zu quantifizieren. Es hat sich gezeigt, dass von der Bayer Corporation, dem Bevollmächtigten dieser Patentanmeldung, hergestellte und von ihr im Handel vertriebene automatische Hämatologie-Analysatoren direkt die Konzentration exogenen, d. h. extrazellulären Hämoglobins in einer Probe ermitteln und messen können. Zum Ausführen der Analysen der vorliegenden Erfindung geeignete Messgeräte besitzen zwei Analysekanäle, die die Konzentration von Hämoglobin in einer Blutprobe messen. Insbesondere, und hier als Beispiel erwähnt, haben die Hämatologie-Analysator-Messgeräte der Baureihe Bayer H*^TM und die Hämatologie-Analysator-Messsysteme der Baureihe Bayer ADVIA^® (z. B. ADVIA 120^®) ebenso wie Hämatologie-Analysatoren ähnlicher Konstruktion oder Funktion de Fähigkeit, quantitative Analysen des Hämoglobingehalts von exogenes Hämoglobin enthaltendem Blut, Plasma und Serum durchzuführen.
Andere zurzeit im Handel erhältliche Blutanalysatoren messen lediglich das Gesamt-Hämoglobin (d. h. die Kombination von Zell-HGB und extrazellulärem, exogen hinzugegebenem HGB) in einer Blutprobe. Demgegenüber sind die automatischen Hämatologiemessgeräte zur Nutzung mit der vorliegenden Erfindung, z. B. die oben erwähnten Bayer Hämatologie-Analysatoren, dazu fähig, in einer Vollblutprobe das Zell-HGB (angegeben als »Berechnetes HGB«) und das Gesamt-Hämoglobin (angegeben als »HGB«) separat und unabhängig zu ermitteln. Bis heute können zurzeit erhältliche Hämatologie-Analysatoren nicht gleichzeitig Zell-Hämoglobin und Nicht-Zell-Hämoglobin, d. h. exogen hinzugegebenes Hämoglobin in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe detektieren und somit nicht die getrennten Ergebnisse dieser Messungen angeben.
Außerdem ist mit anderen im Handel erhältlichen Analysatoren das Überwachen der Fortschritte der Patientengesundung bei Patienten nicht möglich, die beispielsweise exogenes Hämoglobin, z. B. PEG-HGB oder ein zellfreies, sauerstofftragendes Hämoglobinersatzmittel wie etwa Hemopure^® oder Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) per Transfusion bekommen haben, weil diese Analysatoren bei einer Vollblutprobe nicht zwischen dem durch das exogen zugeführte HGB-Ersatzmittel beigetragenen Hämoglobin und dem durch die roten Blutzellen beigetragenen Hämoglobin unterscheiden können, insbesondere im Fall eines akuten Blutverlusts oder einer Autolyse.
Im Gegensatz zu den zurzeit verwendeten Blutanalysatoren können die automatischen Analysatoren und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Beitrag eines exogenen HGB-Ersatzmittels als solchen erkennen und ihn getrennt vom Beitrag des von roten Blutzellen stammenden Zell-HGBs einzeln und präzise messen. Wie hier beschrieben wird, berechnen die automatischen Analysatoren eine spezifische Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe, die mit einem Hämoglobin-Produkt transfusioniert worden ist; damit ermöglichen sie das Detektieren und Überwachen exogenen Hämoglobins in Abwesenheit der Zell-Hämoglobin-Komponente, die von den roten Blutzellen einer vorgegebene Probe stammt. Darüber hinaus liefern die hier beschriebenen Analysatoren Werte für das Zell-Hämoglobin und das Gesamt-Hämoglobin in einer Blutprobe, die ein hinzugegebenes Hämoglobin-Produkt enthält.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere deshalb vorteilhaft, weil bereits eine Anzahl von zellfreien Hämoglobin-Derivaten zur Verwendung anstelle von Vollblut, besonders in Verletzungsfällen, entwickelt worden ist. Deshalb bietet die vorliegende Erfindung ein gangbares Verfahren zum Ermitteln, Messen und Überwachen der Pegel solcher Hämoglobin-Produkte in Blut, Plasma oder Serum, wenn diese Produkte einem Blut exogen hinzugegeben und Patienten als Ersatzmittel für Vollblut verabreicht (z. B. per Transfusion) worden sind.
Es ist offensichtlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Analyse von Blutproben – vorzugsweise von Vollblutproben, aber auch von Plasma- und Serumproben – beinhaltet, die von Patienten stammen, die aus einem von vielen medizinischen Gründen zellfreie Ersatzmittel für rote Blutzellen bekommen haben, z. B. in Form ihrem Blut hinzugegebener Hämoglobinersatzmittelprodukte oder sauerstofftragender Blutersatzmittelprodukte. Es ist außerdem offensichtlich, dass es eine Anzahl von zellfreien, hämoglobin-basierten Ersatzmitteln für rote Blutzellen gibt, die man Blut hinzugeben oder die man als Ersatzmittel zum Behandeln von Patienten benutzen kann, die solche Ersatzmittel für rote Blutzellen oder sauerstofftragende Blutersatzmittel bei verschiedenen Therapien und Behandlungsbedingungen wie beispielsweise Transfusion, Wiederherstellung des Blutvolumens, Behandlung akuten Blutverlusts, Operation, Schock (z. B. hämorrhagischer Schock) oder Sauerstoffanreicherung in Tumoren benötigen.
Zu nicht einschränkenden Beispielen zellfreier, hämoglobin-basierter Ersatzmittel für rote Blutzellen oder sauerstofftragender Ersatzmittel, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren in Vollblut-, Plasma- oder Serumproben ermittelt, gemes sen und/oder überwacht werden können, zählen vernetzte, insbesondere chemisch vernetzte Humanhämoglobin-Produkte (z. B. D. J. Nelson, 1998, »HemAssist: Development and Clinical Profile« in: Red Blood Cell Substitutes, 1998, Herausgeber: A. S. Rudolph, R. Rabinovici und G. Z. Feuerstein, Dekker, New York, New York, S. 353–400; J. Adamson et al., 1998, ibd., S. 335–351; und T. M. S. Chang, 1998, ibd, S. 465–473); Produkte mit rekombinantem Hämoglobin, insbesondere rekombinantes Humanhämoglobin (z. B. J. H. Siegel et al., 1998, ibd., S. 119–164 sowie J. W. Freytag und D. Templeton, 1998, ibd., S. 222–325) oder rekombinantes Rinderhämoglobin; gereinigte, vorzugsweise hochgereinigte tierische Hämoglobin-Produkte, z. B. hochgereinigtes Rinderhämoglobin und hochgereinigtes Humanhämoglobin; und sauerstofftragende Produkte auf tierischer Basis, beispielsweise Rinderhämoglobin-basierte Sauerstoffträger-Produkte (HBOC-Produkte, hemoglobin based Oxygen carrier), z. B. Hemopure^® und Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA); (W. R. Light et al., 1998, ibd., S. 421–436; T. Standl et al., 1998, Br. J. Anaesth., 80(2): 189–194; und Palaparthy et al., 2000, Adv. Drug Delivery Reviews, 40: 185–198). Die gereinigten oder hochgereinigten Hämoglobin-Produkte sind zellfrei und können vernetzt oder polymerisiert sein, z. B. Hemopure^® und Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA).
Das Verwenden automatischer Hämatologie-Analysatoren bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bietet noch weitere Vorteile, die hier weiter unten beschrieben und anhand der angegebenen Beispiele demonstriert werden. Genauer gesagt und am Beispiel erklärt, ermöglicht eine Analyse unter Verwendung eines automatischen Hämatologie-Analysators gemäß der vorliegenden Erfindung das Detektieren und Messen von extrazellulärem (d. h. nicht aus Zellen stammendem) PEG-HGB (z. B. ≥ 0,2 bis 5,6 g/dL Blut), das antikoagulierten Vollblutproben hinzugegeben ist. Die Nachweiskurve von PEG-HGB ist linear (z. B. ≥ 0,2 bis 5,6 g/dL Blut), wenn es Plasma- oder Vollblutproben hinzugegeben ist. Darüber hinaus ist PEG-HGB in 24 Stunden alten Proben nachweisbar, die bei 2–8°C gelagert worden sind. Außerdem sind die Rinderhämoglobin-Produkte Hemopure^® (Biopure, Cambridge, MA) und Oxyglobin, ebenfalls von Biopure geliefert, Vollblut- und Plasmaproben hinzugegeben worden und gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung präzise als sauerstofftragende Blutersatzmittel detektiert worden (Beispiele 5 und 6.)
Die hinzugegebene HGB-Komponente in einer Blutprobe wird durch Ermitteln der Differenz zwischen dem Gesamt-HGB (berechnet aus der kolorimetrischen Absorbanz im Hämoglobin-Kanal des Hämatologie-Analysators) und dem berechneten Zell-HGB (ermittelt aus dem Rote-Blutzellen-Zytogramm (RBC, red blond cell) im Rote-Blutzellen-Kanal des Hämatologie-Analysators), das mittels der Formel (RBC·MCV·CHCM/1000) berechnet wird, wobei MCV (mean cell volume) das mittlere Zellvolumen und CHCM (cellular hemoglobin concentration mean) die mittlere Konzentration des Zell-Hämoglobins ist, die dieselbe zelluläre Eigenschaft repräsentiert wie die Größe MCHC (mean cellular hemoglobin concentration), in unlysiertem Blut. Der CHCM-Wert wird vom Rote-Blutzellen-Kanal des Hämatologie-Analysators (wie etwa das Hämatologiesystem ADVIA 120^®) geliefert.
Insbesondere wird der CHCM-Wert mittels Lichtstreuungsmessungen gemäß der Mie-Theorie (siehe Tycko et al., 1985, Appl. Optics 24: 1355–1365; und US-Patent Nr. 4,736,504 von Tycko) ermittelt. Im Gegensatz dazu wird der MCHC-Wert durch Dividieren des Gesamt-HGB durch das Produkt (MCV·RBC) ermittelt. Praktisch gesehen ist MCHC bei normalen Blutproben nicht genau so groß wie CHCM, aber diese beiden Werte sind ziemlich gleich groß. Beispielsweise liegt der zu der hinzugegebenen Hämoglobinkomponente gehörende MCHC-Wert vorzugsweise im Bereich von etwa 0–5 g/dL Blut, noch besser zwischen circa 0–2 g/dL Blut des CHCM-Werts. Die Differenz zwischen dem Gesamt-Hämoglobin und dem Zell-Hämoglobin wird »HGB-Delta« (»HGBΔ«) genannt und steht für die Konzentration des exogen hinzugegebenen Hämoglobins (z. B. PEG-HGB) in einer Blutprobe.
Eine Erklärung für die vorerwähnte mangelnde völlige Übereinstimmung der MCHC- und CHCM-Werte ist folgende. Nach einer typischen Mahlzeit beispielsweise ist es nicht ungewöhnlich, dass das Blutplasma eine schwache Lipämie (d. h. eine Suspension kleiner submikroskopischer und mikroskopischer Partikel aus Lipiden, Chylomikronen genannt) ausbildet. Die Anwesenheit der Partikel verursacht eine geringe Lichtstreuung und verringert dadurch in einem Hämoglobinometer die durch eine Hämoglobin-Lösung hindurchtretende Lichtmenge. Infolgedessen scheint die Lösung etwas mehr Hämoglobin zu enthalten, als es wirklich der Fall ist. Die vom Bayer ADVIA 120^® Hämatologie-Analysator vorgenommenen Zelle-für-Zelle-Messungen der Hämoglobin-Konzentration haben diesen Fehler nicht. Der ADVIA 120^® wird so kalibriert, dass eine Probe als »abnormal« gekennzeichnet wird, falls ihr HGBΔ-Wert größer als 1,9 gm/dL ist; d. h., dass ein Grad von Lipämie oberhalb dieses Werts als abnormal betrachtet wird. Außerdem wird ein HGBΔ-Wert auch geliefert, wenn ein Teil der Blutprobe entweder in vivo im Patienten oder in dem Sammelröhrchen hämolysiert ist. Die beiden vom Analysator ADVIA 120^® durchgeführten HGB-Messungen weisen den Arzt oder Kliniker auf das Vorhandensein einer abnormalen Lipämie oder Hämolyse in einer Patientenprobe hin. Vor der vorliegenden Erfindung konnte kein im Handel erhältlicher automatischer Hämatologie-Analysator gleichzeitig das Zell-Hämoglobin (»berechnetes HGB«) und das extrazelluläre HGB (HGBΔ) in einer Vollblutprobe detektieren. Folglich bietet vorliegende Erfindung die Möglichkeit, Blut hinzugegebene Hämoglobinersatzmittel zu überwachen, indem die Menge der hinzugegebenen Hämoglobinersatzmittel unabhängig von demjenigen Hämoglobin ermittelt wird, das von der Rote-Blutzellen-Komponente von Blut stammt. Bei normalen, unlysierten wie auch bei abnormalen Blutproben liefert ein richtig kalibriertes System einen HGB-Delta-Wert von null.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Hämatologie-Analysatoren, z. B. der Bayer ADVIA 120^® und die Geräte der Bayer H*^TM-Systemserie direkt die Konzent ration exogenen extrazellulären Hämoglobins messen, weil diese Messgeräte zwei Analyse- oder Detektorkanäle besitzen, von denen jeder eine andere Art von Hämoglobin-Konzentration in einer Vollblut- oder Plasmaprobe misst.
Bei solchen Messgeräten ist einer der Analyse- oder Detektorkanäle der Hämoglobin-Kanal (HGB-Kanal), der die Konzentration des Gesamt-Hämoglobins in der Probe mittels Hämolyse und Extraktion der Häme aus ihrem biologischen Komplex mit Globin misst, wobei eine Hämeart mit ligiertem Eisen gebildet wird, die in einer oberflächenaktiven Mizelle eingefangen und spektrofotometrisch gemessen wird (siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5,858,794 von M. Malin; M. Malin et al., 1992, Anal. Chim. Acta., 262: 67–77; und M. Malin et al., 1989, Am. J. Clin. Path., 92: 286–294). Der zweite Analyse- oder Detektorkanal in solchen Messgeräten ist der Rote-Blutzellen-Kanal (RBC-Kanal), der die Konzentration der roten Blutzellen, das mittlere Zellvolumen (MCV) und die mittlere Konzentration des Zell-Hämoglobins (MCHC) von circa 10.000 einzelnen Erythrocyten misst, während diese zwei Lichtstreuungs-Detektoren passieren.
Das Vorhandensein und die Konstruktion von Hämatologie-Analysatoren, die sowohl einen HGB-Kanal als auch einen RBC-Kanal besitzen in Verbindung mit zwei Lichtstreuungsdetektoren, die das gestreute Licht Zelle für Zelle detektieren, während eine RBCs enthaltende Blutprobe den optischen RBC-Kanal passiert, ermöglicht es, eine Differenz zwischen dem Zell-Hämoglobin und dem extrazellulären Hämoglobin zu ermitteln und zu berechnen und somit die Leistung des hier beschriebenen Verfahrens zu bieten. Für eine Beschreibung der optischen Mechanismen geeigneter automatischer Analysatoren, die das Verfahren der vorliegenden Erfindung ausführen können, siehe Kim und Ornstein, 1983, Cytometry, 3: 419–427; US-Patent Nr. 4,412,004 für Ornstein und Kim; Tycko et al., 1985, Appl. Optics, 24: 1355–1365; US-Patent Nr. 4,735,504 für Tycko; und Mohandas et al., 1986, Blood, 68: 506–513.
Als spezielles, aber nicht einschränkendes Beispiel kann der Hämatologie-Analysator Bayer ADVIA 120^® die Differenz (»HGB-Delta« oder »HGBΔ«) zwischen den Konzentrationen des Gesamt- und des Zell-HGB wie folgt berechnen (alle HGB-Konzentrationen sind in Gramm pro Deziliter Vollblut, g/dL, angegeben): HGBΔ, g/dL = Gesamt-HGB, g/dLHGB-Kanal – Zell-HGB, g/dLRote-Blutzellen-Kanal
In der vorstehenden Gleichung steht HGBΔ für die Konzentration des extrazellulären HGB in der Blut-, Plasma- oder Serumprobe. Unter üblichen Bedingungen gilt HGB-Delta (HGBΔ) = 0. Folglich wird gemäß der vorliegenden Erfindung das Gesamt-Hämoglobin unter Benutzung des HGB-Kanals des Hämatologie Messgeräts gemessen und überwacht, wogegen der RBC-Kanal lediglich das intrazelluläre, in den roten Blutzellen einer Blutprobe enthaltene HGB (d. h. das Zell-HGB) detektiert. Diese beiden Messwerte werden subtrahiert, um den Wert HGB-Delta zu bekommen, der das extrazelluläre HGB repräsentiert. In einem System, das für die vorliegende Erfindung genutzt werden könnte, ist HGB-Delta als Ableseparameter realisiert worden, um einen Prüfwert der vom HBG-Kanal für bestimmte Arten abnormaler oder pathologischer Blutproben, einschließlich lipämischer und ikterischer Blutproben und Proben mit erhöhter Anzahl weißer Blutzellen, gelieferten HGB-Werte zu bieten. Solche abnormalen oder pathologischen Blutproben einschließlich lipämischer und ikterischer Blutproben und Proben haben eine erhöhte Anzahl weißer Blutzellen. Es hat sich gezeigt, dass solche abnormalen Blutproben fälschlich erhöhte HGB-Werte im HGB-Kanal des H*^TM Systems liefern (siehe, M. Malin et al., 1989, Am. J. Clin. Path., 92: 286–294). Beispielsweise streuen bestimmte Blutproben das Licht und solche Lichtstreuungs-Störungen bewirken, dass ein Teil des Lichts nicht detektiert wird. Diese Lichtstreuungs-Störung verursacht eine scheinbare oder fälschliche Erhöhung der absorbierten Lichtmenge (also des Absorbanzwerts) der Probe. Weil man eine HGB-Konzentration vom Rote-Blutzellen-Kanal eines Hämatologie-Analysators (Tycko et al., 11985, Appl. Optics, 24: 1355–1365), geliefert bekommen kann, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung kürzlich herausgefunden, dass man HGBΔ (auch HGB-Delta genannt) bei dem Analysator als Ableseparameter realisieren kann, wobei der Wert für das Zell-Hämoglobin (geliefert vom Rote-Blutzellen-Kanal des Analysators) von dem Wert für das Gesamt-Hämoglobin (geliefert vom Hämoglobin-Kanal des Analysators) subtrahiert werden kann, um den HGBΔ-Wert zu bekommen (g/dL in Blut).
Das hier beschriebene Verfahren des Messens und Ermittelns der Konzentrationen des Zell-HGB im Gegensatz zum extrazellulären oder exogen hinzugegebenen HGB in einer Vollblutprobe sowie der Konzentration des Gesamt-HGB kann auf jedem der im Handel erhältlichen Bayer H*^TM-Systeme oder ADVIA 120^® Hämatologie-Analysatormessgeräte genutzt und durchgeführt werden. Allerdings kann jeder Fachmann klar erkennen, dass andere Hämatologie-Messgeräte, die ein 2-Kanal-System zum Messen der HGB-Konzentration in Blut besitzen, so konstruiert werden können, dass sie das hier beschriebene Verfahren des Ermittelns und Überwachens der HGB-Konzentration durchführen können. Darüber hinaus gilt das hier beschriebene Verfahren auch für eine Reihe oder Kombination von Hämatologie-Analysatoren, die dafür konstruiert und/oder programmiert sind, auf der Basis eines 2-Kanal-Hämoglobin-Analysesystems zu arbeiten.
Folglich bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum direkten Ermitteln und Überwachen der Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in einer Blutprobe, vorzugsweise einer Vollblutprobe, das mit einem automatischen Hämatologie-Analysator durchgeführt wird, der vorzugsweise zwei Analysekanäle zur Hämoglobin-Messung hat. Das Verfahren beinhaltet das Ermitteln der Konzentration des Gesamt-Hämoglobins in einer Blut-Teilprobe in einem Kanal des Analysators, der zum Ermitteln, Detektieren und/oder Messen von Hämoglobin geeignet ist. Mithilfe des hier beschriebenen Verfahrens können Konzentrationen des Gesamt-Hämoglobins von circa 0,5–1 g/dL, oder 1,1 g/dL, bis zu circa 25 g/dL Blut, vorzugsweise von circa 1 g/dL bis circa 25 g/dL, noch besser von circa 2 g/dL bis circa 25 g/dL Blut und am besten von circa 6 g/dL bis circa 22 g/dL Blut in einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe oder Teilprobe davon ermittelt werden. Wie erfahrene Ärzte wissen, liegt ein normaler Hämoglobin-Wert im Bereich von circa 11–18 g/dL Blut. Bei Frauen ist der normale Hämoglobin-Bereich 11–16 g/dL Blut; bei Männern ist der normale Hämoglobin-Bereich circa 13–18 g/dL Blut; und bei Neugeborenen ist der normale Hämoglobin-Bereich circa 16–20 g/dL Blut (Fundamentals of Clinical Chemistry, Herausgeber: N. Tietz, W. B. Saunders Co., 1960, S. 944). Ein anderes Beispiel sind anämische Personen, deren Hämoglobin-Wert typischerweise in einem Bereich von circa 6 bis 12 g/dL Blut liegt.
Darüber hinaus beinhaltet das Verfahren das Ermitteln der Konzentration des Zell-HGB einer Blut-Teilprobe in einem Kanal des Analysators, der zum Ermitteln, Detektieren und/oder Messen roter Blutzellen geeignet ist. Die Mengen von Zell-Hämoglobin, die mithilfe des hier beschriebenen Verfahrens ermittelt und gemessen werden können, umfassen HGB-Konzentrationen von circa 0,5–1 g/dL, oder 1,1 g/dL, bis circa 25 g/dL Blut, vorzugsweise von circa 1 g/dL bis circa 25 g/dL, noch besser von circa 4 g/dL bis circa 24 g/dL Blut und am besten von circa 5 g/dL bis circa 23 g/dL Blut. Der zum Detektieren am besten geeignete Bereich der HGB-Konzentration liegt bei circa 6 g/dL bis circa 18 g/dL Blut. Eine kritische Konzentration des Gesamt-Hämoglobins, die sich mit dem Verfahren dieser Erfindung messen lässt, liegt bei etwa 6 g/dL, noch besser bei 5,6 g/dL; das sind die Hämoglobin-Konzentrationen, die für Transfusionen relevant sind, wo der Entscheidungspunkt dafür, dem Patienten eine Transfusion zu geben bei circa 6–7 g/dL Gesamt-Hämoglobin liegt.
Nachdem die Konzentrationen des Gesamt-Hämoglobins und des Zell-Hämoglobins ermittelt sind, werden diese Werte zum Berechnen der Differenz zwischen den Konzentrationen des Gesamt-Hämoglobins und des Zell-Hämoglobins benutzt, um zu einem Wert für die Konzentration des extrazellulären Hämoglobins der Blutprobe zu gelangen, ein Wert, den der Hämatolo gie-Analysator automatisch errechnet. Gemäß der vorliegenden Erfindung misst der Rote-Blutzellen-Kanal des Hämatologie-Analysators die Hämoglobin-Konzentration im Vollblut wie folgt: [HGB]Blut, Rote-Blutzellen-Kanal/Intrazellulär (g/dL) = [CHCM (g/dL)·RBC-Anzahl(Zellen/mm3)·MCV (Femtoliter/Zelle)/1000]
Der HGB-Kanal misst diese Konzentration von Gesamt-Hämoglobin, d. h.[HGB]Intrazellulär + [HGB]Extrazellulär.
Gemäß dem beschriebenen Verfahren berechnet der automatische Hämatologie-Analysator, z. B. ein automatischer Hämatologie-Analysator ADVIA 120^®, die Differenz zwischen der Konzentration des Gesamt-HGB und der Konzentration des Zell-HGB, um den Wert HGB-Delta zu bekommen, der die Konzentration des extrazellulären oder exogenen HGB repräsentiert.
BEISPIELE
Die nachfolgend angegebenen Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte des Ausführens der vorliegenden Erfindung zu illustrieren und zu veranschaulichen; sie sollen die Erfindung in keiner Hinsicht eingrenzen.
BEISPIEL 1
Stoffe und Verfahren
PEG-HGB (Enzon, Inc., Piscataway, N. J.) wurde eingefroren geliefert und eingefroren in einer Kühleinrichtung gelagert. Der gefrorene Beutel wurde vor dem Verwenden aufgetaut und in fünf 50-ml-Teströhrchen aus Polypropylen umgefüllt. Drei Teströhrchen wurden für spätere Verwendung wieder eingefroren; die anderen beiden Röhrchen wurden im Kühlschrank gelagert. Für jedes Experiment wurde eine geeignete Teilprobe in ein Teströhrchen dekantiert, dann wurde vor der Verwendung abgewartet, bis der Stoff Raumtemperatur angenommen hatte. Die hier beschriebenen Experimente wurden an einem kalibrierten automatischen Hämatologie Messgerät ADVIA 120^® (Bayer Corporation) durchgeführt. Der Hämoglobin-Kanal dieses Mess geräts benutzte ein cyanid-haltiges HGB-Reagens wie etwa das im US-Patent Nr. 5,858,794 für M. Malin beschriebene sowie ein Rote-Blutzellen-Verdünnungsmittel (RBC-Verdünnungsmittel) wie im US-Patent Nr. 5,817,519 für D. Zelmanovic et al. und im US-Seriennummer 08/884,595, eingegangen am 27. Juni 1997 für D. Zelmanovic et al.) beschriebene.
Um das Hämatologie-System ADVIA 120^® zu kalibrieren, wurde der Kalibratorstoff (Kalibrator ADVIA 120^® Setpoint^TM) 10-mal angesaugt und der mittlere HGB-Wert ermittelt. Der Systemkalibratorfaktor wurde dann so eingestellt, dass der mittlere Kalibratorwert mit dem auf dem Schild angegebenen Wert für HGB (g/dL) auf dem Kalibrator korrespondierte. Um die Genauigkeit HGB-Kanals abzuschätzen, wurde eine frisch genommene Vollblutprobe 20-mal angesaugt und dann Mittelwert und Standardabweichung berechnet. Die akzeptable Genauigkeit war eine Standardabweichung von ≤ 0,11 g/dL.
Von gesunden Freiwilligen genommene Blutproben wurden antikoaguliert, vorzugsweise unter Benutzung von K3EDTA (≈ 12,15 mg/Röhrchen).
Die meisten der in den hier gegebenen Beispielen beschriebenen Experimente wurde bei HGB-Konzentrations-Leveln von circa 6 g/dL durchgeführt, da für PEG-HGB (Enzon, Inc.) ein Gehalt von 6 g/dL an Rinderhämoglobin angegeben wird. Der erhaltene HGB-Wert war 5,4 ± 2 g/dL, was gut zu dem nominellen Wert 6 g/dL von Blut passt. Außerdem wurde bei allen Beispielen, bei denen ein Hämatologie-Analysator der Bayer Corporation benutzt wurde, die Hämoglobin-Genauigkeit des Messgeräts vor dem Kalibrieren durch 2-maliges Ansaugen von PEG-HGB vor jedem Experiment geprüft.
BEISPIEL 2
Um hinzugegebenes Hämoglobin in einer Plasmaprobe nachzuweisen, wurde das in Beispiel 2 beschriebene Experiment durchgeführt. Bei diesem Experiment wurden variable Volumen von PEG-Hämoglobin (Enzon, Inc.) einem Plasma hinzugegeben, das mit einem Hämatologie Messgerät Bayer ADVIA 120^® analysiert wur de, um die Variation von exogenem PEG-HGB in Plasma zu beurteilen.

Zehn Röhrchen mit Teilproben einer normalen Blutprobe, gesammelt in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, »normales EDTA-Vollblut«), wurden bei 750·g zentrifugiert. Das Plasma wurde entfernt und dann erneut zentrifugiert, um zellfreies Plasma zu bekommen. In jedes von 7 Röhrchen wurden die in Tabelle 1 angegebenen Mengen von Plasma und PEG-HGB hinzugegeben, um in jedem Röhrchen ein Gesamtvolumen von 4,0 ml zu haben. Jedes Röhrchen wurde 4-mal angesaugt, um eine Reihe von Messwerten zu ermitteln. TABELLE 1 Nachweis von exogenem Hämoglobin

Plasma (ml)	PEG-HGB (ml)	Gesamt-HGB* (gemessen)	RBC-HGB (gemessen)	HGB-Delta (gemessen)	HGB-Delta (vorhergesagt)	Differenz: HGBΔ (gemessen) minus HGBΔ (vorhergesagt)
4,0	0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
3,6	0,4	0,5	0,0	0,5	0,6	0,1
		0,00	0,00	0,00
3,2	0,8	1,0	0,0	1,0	1,1	0,1
		0,00	0,00	0,00
2,4	1,6	2,2	0,0	2,2	2,2	0
		0,05	0,00	0,05
1,6	2,4	3,4	0,0	3,4	3,4	0
		0,05	0,00	0,05
0,8	3,2	4,4	0,0	4,5	4,5	0
		0,10	0,00	0,10
0	4,0	5,6	0,0	5,6	5,6	0
		0,00	0,00	0,00

*: Die in Tabelle 1 angegebenen Daten stellen die Mittelwerte aus vier aufeinanderfolgenden Messungen dar.

Aus den vier aufeinanderfolgenden HGB-Werten wurden der Mittelwert und die prozentuale Differenz zwischen dem erwarteten und dem erhaltenen Ergebnis berechnet (siehe Tabelle 1).
Die Ergebnisse dieser Wiederholungsexperimente zeigen, dass exogen hinzugegebenes Hämoglobin, d. h. EG-HGB (Enzon, Inc.) vom Hämoglobin-Kanal und nicht vom RBC-Kanal des automatischen Hämatologie-Analysator-Messgeräts detektiert wurde, wie man an den ausgegebenen Werten (Tabelle 1) sieht. Dies passt zum Vorhandensein von PEG-HGB vollständig in Form extrazellulären Hämoglobins. Außerdem war die Nachweiskurve entsprechend dem Versuchskonzept linear. Alle HGB-Pegel entsprachen der Linearitätsspezifikation von 0,2 g/dL oder 2% der erwarteten Werte.
BEISPIEL 3
In diesem Beispiel wurden Experimente durchgeführt, bei denen eine feste Konzentration von Hämoglobin einer Vollblutmatrix hinzugegeben wurde, in der das Gesamt-Hämoglobin, wie es vom HGB-Kanal des Hämatologie-Analysator gemessen wurde, variierte.
10 Röhrchen mit normalem EDTA-Vollblut wurden bei 750·g zentrifugiert. Das zellfreie Plasma wurde entfernt und die roten Blutzellen wurden gesammelt. Eine Teilprobe roter Blutzellen wurde entnommen und Plasma wurde hinzugegeben, sodass die Konzentration des Gesamt-Hämoglobins 10 g/dL betrug, d. h. circa 6 ml gepackte rote Blutzellen plus 14 ml Plasma).
Das Gesamtvolumen der benötigten 10-g/dL-Teilprobe war 15 ml. In jedes von 6 Röhrchen wurden die 10-g/dL-Teilproben und das zellfreie Plasma in den in Tabelle 2 angegebenen Volumenmengen hinzugegeben, um Hämoglobin-Werte von 6,0, 5,0, 4,0, 3,0, 2,0 und 1,0 g/dL zu erzielen. TABELLE 2

»A«-Proben Vollblut* ml Plasma ml Zell-HGB g/dL

1A 3,0 2,0 6,0

2A 2,5 2,5 5,0

3A 2,0 3,0 4,0

4A 1,5 3,5 3,0

5A 1,0 4,0 2,0

6A 0,5 4,5 1,0

*: Das Vollblut von Tabelle 2 enthielt 10,0 g/dL an HGB.

2 ml der »A«-Proben von Tabelle 2 wurden mit 2 ml PEG-HGB verdünnt. Weil ein gleichgroßes Volumen von PEG-HGB einem gleichgroßen Volumen jeder Teilprobe hinzugegeben wurde (d. h. 6,0 g/dL, 5,0 g/dL, 4,0 g/dL, 3,0 g/dL, 2,0 g/dL und 1,0 g/dL), waren nun das Zell-HGB und das extrazelluläre HGB jeder Teilprobe um 50% verringert. Die Konzentration des PEG-HGB, die vor dem Verdünnen 5,6 g/dL betrug, war somit in jeder Teilprobe auf 2,8 g/dL verringert. Das Gesamt-HGB war gleich der Summe des extrazellulären PEG-HGB und des Zell-HGB. Jedes Röhrchen wurde 5-mal angesaugt, um eine Reihe von Ergebnissen zu erhalten. TABELLE 3

»B«-Proben	ml der »A«-Probe*	PEG-HGB (ml)	Gesamt-HGB (g/dL)**		Berechnetes HGB (d. h. Zell-HGB) (g/dL)		HGB-Delta (d. h. extrazelluläesr HGB) (g/dL)
			vorhergesagt	gemessen	vorhergesagt	gemessen	vorhergesagt	gemessen
1B	2,0	2,0	5,8	5,8	3,0	3,2	2,8	2,6
				±0,09		±0,05		±0,11
2B	2,0	2,0	5,3	5,4	2,5	2,7	2,8	2,7
				±0,05		±0,05		±0,08
3B	2,0	2,0	4,8	4,9	2,0	2,2	2,8	2,7
				±0,08		±0,08		±0,11
4B	2,0	2,0	4,3	4,3	1,5	1,7	2,8	2,8
				±0,08		±0,04		±0,07
5B	2,0	2,0	3,8	3,8	1,0	1,1	2,8	2,8
				±0,04		±0,05		±0,05
6B	2,0	2,0	3,3	3,4	0,5	0,5	2,8	2,9
				±0,0		±0,04		±0,04

* Die »A«-Proben wurden gemäß Tabelle 2 vorbereitet. Das unverdünnte PEG-HGB enthielt 5,6 g/dL messbares Hämoglobin.
** Alle Datenwerte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 gleichartigen Messungen.

Die in Tabelle 3 dieses Beispiels angegebenen Ergebnisse zeigen, dass es – wenn eine feste Konzentration von extrazellulärem PEG-HGB einer Vollblutmatrix hinzugegeben wurde, in der die Konzentration des Zell-HGB variierte – ein akzeptabler Nachweis sowohl des extrazellulären PEG-HGB als auch des Zell-HGB erreicht wurde. Die Ergebnisse von Tabelle 3 zeigen, dass die Menge des PEG-HGB mit dem Messgerät Bayer ADVIA 120^® nachweisbar und messbar war, wenn PEG-HGB zu Vollblutproben mit geringem Zell-HGB-Anteil hinzugegeben wurde. Im Hinblick auf die akzeptable Leistung des hier beschriebenen Verfahrens zum Gewinnen von Zahlenwerten für exogenes HGB wie auch für Zell-HGB in Humanblutproben, denen PEG-HGB hinzugegeben wurde, bietet das Verfahren ähnliche Anwendbarkeit für den Einsatz bei Blut-, Plasma- oder Serumproben von mit einer Transfusion behandelten Patienten, insbesondere bei Vollblutproben, die hinzugegebene zellfreie HGB-Derivate oder sauerstofftragende HGB-Ersatzmittel enthalten, wie oben beschrieben.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel präsentiert Daten, die die Stabilität von exogen hinzugegebenem PEG-HGB in Vollblutproben zeigen. Die Proben wurden durch Hinzugeben variabler Volumen von Vollblut (6,0 g/dL HGB) zu variablen Volumen von PEG-HGB (5,6 g/dL) (Tabelle 4A) hergestellt. Jede Probe wurde 4-mal angesaugt. Die Proben wurde 1 Stunde nach ihrer Herstellung untersucht und 24 Stunden später nach gekühlter Lagerung bei 5°C nochmals (Tabelle 43).
Mit diesen Experimenten wurde demonstriert, dass das Hämoglobinersatzmittel PEG-HGB nach 24 Stunden nachweisbar war, wenn die Blutproben bei 2–8°C gelagert worden waren. Wie in den Tabellen 4A und 43 zu erkennen, gab es praktisch keine Änderung beim Gesamt-HGB, beim berechneten HGB (d. h. Zell-HGB) und beim HGB-Delta (d. h. extrazelluläres HGB) in Blutproben, die 24 Stunden lang bei 2–8°C gelagert worden waren (Tabelle 43), verglichen mit den Werten zum Beginnzeitpunkt des Experiments (Tabelle 4A). Also blieb – unter der Voraussetzung, dass die Anzahl der roten Zellen während der Lagerung konstant bleibt – auch der durch das Vorhandensein von PEG-HGB verursachte HGB-Delta-Wert während der 24-stündigen Lagerung bei 2–8°C konstant.
TABELLEN 4A UND 4B
PEG-HGB IN 24 STUNDEN ALTEN BLUTPROBEN

TABELLE 4A Beginnzeitpunkt des Experiments

Vollblut (ml)	PEG-HGB (ml)	Gesamt-HGB (vorhergesagt)	Gesamt-HGB	Zell-HGB (berechnet)	HGB-Delta (extrazellulär)
0,0	0,0	0,0*	0,0	0,0	0,0
			0,00	0,00	0,00
0,0	4,0	5,6	5,4	0,0	5,4
			0,05	0,0	0,05
0,8	3,2	5,7	5,5	1,2	4,3
			0,13	0,00	0,13
1,6	2,4	5,8	5,7	2,5	3,2
			0,08	0,05	0,13
2,4	1,6	5,8	5,9	3,7	2,2
			0,1	0,00	0,05
3,2	0,8	5,9	6,1	4,9	1,2
			0.06	0,00	0,06
3,6	0,4	6,0	6,2	5,5	0,8
			0	0,06	0,06
4,0	0,0	6,0	6,2	6,0	0,2
			0,05	0,05	0,08

*: Diese Probe bestand aus reinem Plasma.

Gesamt-HGB	Zell-HGB (berechnet)	HGB-Delta (extrazellulär)
0,0	0,0	0,0
0,00	0,00	0,00
5,4	0,0	5,4
0,05	0,0	0,05
5,6	1,2	4,4
0,00	0,00	0,05
5,7	2,5	3,3
0,00	0,05	0,05
5,9	3,7	2,2
0,00	0,05	0,05
6,1	4,9	1,1
0,06	0,05	0,05
6,2	5,5	0,7
0,05	0,05	0,05
6,1	5,9	0,2
0,06	0,05	0,06

* Alle Datenwerte in den Tabellen 4A und 4B sind Mittelwerte ± Standardabweichung von 4 gleichartigen Messungen.

BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt die analytische Messung eines anderen sauerstofftragenden Blutersatzmittels, nämlich des zellfreien, Glutaraldehyd-polymerisierten Hämoglobin-basierten Sauerstoffträgers (HBOC) Hemopure^®, geliefert von der Biopure Corporation (Cambridge, MA), durchgeführt gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Hämatologie-Messgerät ADVIA 120^® (Bayer Corporation). Hemopure^® ist ein Rinderhämoglobin, polymerisiert mit Glutaraldehyd zum Erzeugen von Oligomeren mit einem Molekulargewicht von 500.000. Die Poly merisierung wurde bei diesem Produkt ins Herstellungsverfahren aufgenommen, um die Nierenexkretionsrate zu senken.
Es wurden unter Verwendung des Produkts Hemopure^® Experimente zweier Arten durchgeführt und beschrieben: (1) Hemopure^® wurde zu Humanplasma hinzugegeben, und (2) Hemopure^® wurde zu Humanvollblut hinzugegeben, in beiden Fällen vor einer automatischen Hämatologie-Analyse und einer Ermittlung der Konzentration des exogenen Hämoglobins.
Die Experimente zum Messen von Hemopure^® als eine exogene Hämoglobin-Substanz in einer Blut- oder Plasmaprobe wurden wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben unter Verwendung des automatischen Hämatologie-Analysators ADVIA 120^® durchgeführt. Gemäß dieser Erfindung berechnet der Analysator ADVIA 120^® die Differenz zwischen den Konzentrationen des Gesamt-Hämoglobins und des RBC-Zell-Hämoglobins, um den Wert Hämoglobin-Delta (d. h. exogenes Hämoglobin) zu bekommen.
Nachweis von exogenem HGB (HBOC) des Typs Hemopure^® in zellfreiem Plasma
Das Plasma wurde aus frischem Humanblut durch 25-minütiges Zentrifugieren in einer mit einem horizontalen Becherrotor HB4L ausgerüsteten Zentrifuge des Typs Sorvall R-3R bei 2400 U/min (620·g) gewonnen. Das überstehende Plasma wurde erneut für 10 Minuten bei 620·g zentrifugiert und das Pellet entfernt. Das zellfreie Plasma wurde wie folgt in Glasröhrchen verteilt: 5,00, 4,75, 4,50, 3,00, 2,00, 1,00 und 0,00 ml. In diese Röhrchen wurde das Produkt Hemopure^® wie folgt hinzugegeben: 0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 bzw. 5,00 ml, sodass das Gesamtvolumen 5,00 ml betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und ihre Inhalte wurden durch 10-maliges Umdrehen durchgemischt; 30 bis 60 Minuten später wurden sie mithilfe eines ADVIA 120^® untersucht, und zwar 5-mal pro Röhrchen. Die Konzentrationen von Gesamt-HGB, Zell-HGB und HGB-Delta wurden in eine Tabelle eingetragen.
Tabelle 5 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, wobei die Messwerte die Mittelwerte aus 5 Messungen sind. Für das Produkt Hemopure^® war die Differenz zwischen HGB-Deltavorhergesagt und HGB-Deltagemessen 0,0 oder 0, 1 und lag deshalb innerhalb der HGB-Linearitätsspezifikation des Analy sators ADVIA 120^®, die mit 0,2 g/dL oder 2% relative Differenz angegeben ist. Für alle Pegel war die Konzentration des Zell-HGB null, wie durch die Konzeption des Experiments bedingt. Die Daten illustrieren, dass die Nachweiskurve von exogenem HGB in einer Plasmamatrix über den Bereich von 0,6 bis 13,0 g/dL linear ist.
Nachweis von exogenem HGB (HBOC) des Typs Hemopure^® in Vollblut
Vollblut, erhalten von Freiwilligen und in K3EDTA antikoaguliert, wurde so manipuliert, dass die Konzentration des Gesamt-HGB 13,0 g/dL betrug. Dann wurde das Vollblut wie folgt in Glasröhrchen verteilt: 5,00, 4,75, 4,50, 4,00, 3,00, 2,00, 1,00 und 0,00 ml. In diese Röhrchen wurde das Produkt Hemopure^® wie folgt hinzugegeben: 0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 bzw. 5,00 ml, sodass das Gesamtvolumen 5,00 ml betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und ihre Inhalte wurden durch 10-maliges Umdrehen durchgemischt; 30 bis 60 Minuten später wurden sie mithilfe eines ADVIA 120^® untersucht, und zwar 5-mal pro Röhrchen. Die Konzentrationen von Gesamt-HGB, Zell-HGB und HGB-Delta wurden in eine Tabelle eingetragen.
Bei Verwendung von Vollblut und Hemopure^® sank die Konzentration von Zell-HGB mit steigender Konzentration des extrazellulären HGB. Tabelle 6 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, wobei die Messwerte die Mittelwerte aus 5 Messungen sind. Für das Produkt Hemopure^® war die Differenz zwischen HGB-Deltavorhergesagt und HGB-Deltagemessen generell 0,0 oder 0, 1 und lag innerhalb der HGB-Linearitätsspezifikation des Analysators ADVIA 120^®. Für alle Pegel war die Konzentration des Zell-HGB null, wie durch die Konzeption des Experiments bedingt. Die Daten illustrieren, dass die Nachweiskurve von exogenem HGB in einer Vollblutmatrix über den Bereich von 0,09 bis 13,0 g/dL linear war.
BEISPIEL 5 (sic)
Dieses Beispiel beschreibt die analytische Messung eines anderen zellfreien, sauerstofftragenden Blutersatzmittels, nämlich Oxyglobin (Biopure Corporation, Cambridge, MA), durchgeführt gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Hämatologie-Messgerät ADVIA 120^® (Bayer Corporation). Wie Hemopure^® ist auch Oxyglobin eine zellfreie Lösung von Glutaraldehyd-polymerisiertem Hämoglobin.
Wie in Beispiel 5 wurden unter Verwendung des Produkts Oxyglobin Experimente zweier Arten durchgeführt: (1) Oxyglobin wurde zu Humanplasma hinzugegeben, und (2) Oxyglobin wurde zu Humanvollblut hinzugegeben, in beiden Fällen vor einer automatischen Hämatologie-Analyse.
Die Experimente zum Messen von Oxyglobin als eine exogene Hämoglobin-Substanz in einer Blut- oder Plasmaprobe wurden wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben unter Verwendung des automatischen Hämatologie-Analysators ADVIA 120^® durchgeführt.
Nachweis von Oxyglobin in zellfreiem Plasma
Das Plasma wurde aus frischem Humanblut durch 25-minütiges Zentrifugieren in einer mit einem horizontalen Becherrotor HB4L ausgerüsteten Zentrifuge des Typs Sorvall R-3R bei 2400 U/min (620·g) gewonnen. Das überstehende Plasma wurde erneut für 10 Minuten bei 620·g zentrifugiert und das Pellet entfernt. Das zellfreie Plasma wurde wie folgt in Glasröhrchen verteilt: 5,00, 4,75, 4,50, 3,00, 2,00, 1,00 und 0,00 ml. In diese Röhrchen wurde das Produkt Oxyglobin wie folgt hinzugegeben: 0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 bzw. 5,00 ml, sodass das Gesamtvolumen 5,00 ml betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und ihre Inhalte wurden durch 10-maliges Umdrehen durchgemischt; 30 bis 60 Minuten später wurden sie mithilfe eines Hämatologie-Analysators ADVIA 120^® untersucht, und zwar 5-mal pro Röhrchen. Die Konzentrationen von Gesamt-HGB, Zell-HGB und HGB-Delta wurden in eine Tabelle eingetragen.
Tabelle 7 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, wobei die Messwerte die Mittelwerte aus 5 Messungen sind. Wie bei dem Produkt Hemopure^® beobachtet (Beispiel 5) war auch bei dem Produkt Oxyglobin die Differenz zwischen HGB-Deltavorhergesagt und HGB-Deltagemessen 0,0 oder 0, 1 und lag deshalb innerhalb der HGB-Linearitätsspezifikation des Analysators ADVIA 120^®, die mit 0,2 g/dL oder 2% relative Differenz angegeben ist. Für alle Pegel war die Konzentration des Zell-HGB null, wie durch die Konzeption des Experiments bedingt. Die Daten illustrieren, dass die Nachweiskurve von exogenem HGB in einer Plasmamatrix über den Bereich von 0,6 bis 13,0 g/dL linear ist.
Nachweis von Oxyglobin in Vollblut
Vollblut, erhalten von Freiwilligen und in K3EDTA antikoaguliert, wurde so manipuliert, dass die Konzentration des Gesamt-HGB 13,0 g/dL betrug. Dann wurde das Vollblut wie folgt in Glasröhrchen verteilt: 5,00, 4,75, 4,50, 4,00, 3,00, 2,00, 1,00 und 0,00 ml. In diese Röhrchen wurde das Produkt Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) wie folgt hinzugegeben: 0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 bzw. 5,00 ml, sodass das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen 5,00 ml betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und ihre Inhalte wurden durch 10-maliges Umdrehen durchgemischt; 30 bis 60 Minuten später wurden sie mithilfe eines ADVIA 120^® untersucht, und zwar 5-mal pro Röhrchen. Die Konzentrationen von Gesamt-HGB, Zell-HGB und HGB-Delta wurden in eine Tabelle eingetragen.
Bei Verwendung von Vollblut und dem Produkt Oxyglobin sank die Konzentration von Zell-HGB mit steigender Konzentration des extrazellulären HGB. Tabelle 8 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, wobei die Messwerte die Mittelwerte aus 5 Messungen sind. Ähnlich wie bei dem Produkt Hemopure^® beobachtet, war auch bei dem Produkt Oxyglobin die Differenz zwischen HGB-Deltavorhergesagt und HGB-Deltagemessen generell 0,0 oder 0, 1 und lag deshalb innerhalb der HGB-Linearitätsspezifikation des Analysators ADVIA 120^®. Für alle Pegel war die Konzentration des Zell-HGB null, wie durch die Konzeption des Experiments bedingt. Die Daten illustrieren, dass die Nachweiskurve von exogenem HGB in einer Vollblutmatrix über den Bereich von 0,09 bis 13,0 g/dL linear ist.
Die in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Experimente zeigen, dass die sauerstofftragenden Blutersatzmittel Hemopure^® und Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) quantitativ in direkter Weise durch einen automatischen Hämatologie-Analysator wie etwa den Hämatologie-Analysator ADVIA 120^® (Bayer Corporation) detektiert werden konnten. Der Analysator ADVIA 120^® konnte die Hemopure^®- und Oxyglobin-Stoffe in Plasma und in Vollblut direkt und quantitativ detektieren, und zwar in einem Bereich von 0,6 bis 13,0 g/dL. Der ADVIA 120^® hat diese Hämoglobin-Ersatzmittel als extrazelluläres Hämoglobin gemeldet.
Wie hier beschrieben und entsprechend der Arbeitsweise des automatischen Hämatologie-Analysators gemäß der vorliegenden Erfindung, misst der Hämoglobin-Kanal kolorimetrisch die Konzentration des Gesamt-HGB in der Probe mittels Wechselwirkung des in der Probe enthaltenen HGB mit Cyanidionen in Anwesenheit oberflächenaktiver Mizellen (siehe M. J. Malin et al., 1992, J. Anal. Chim. Acta., 262: 67–77, und M. J. Malin et al., 1989, J. Amer. Clin. Path., 92: 286–294.) Deshalb ist das Gesamt-HGB eine Kombination aus Zell-HGB und extrazellulärem HGB. Im Gegensatz dazu erkennt der RBC-Kanal typischerweise nur das in einer Probe enthaltene Zell-HGB. Das automatische System berechnet die Konzentration des extrazellulären HGB durch Bilden der Differenz zwischen den Pegeln des Gesamt- und des Zell-HGB. Beide Stoffe wurden in einem Experiment mit Matrizen von Plasma und Vollblut innerhalb der Linearitätsspezifikation nachgewiesen.
BEISPIEL 7
Absorptionsspektren in Wasser haben bestätigt, das die Stoffe Hemopure^® und Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) Hämoglobin-Derivate sind, deren Häme-Gruppen fähig zur Sauerstoffanreicherung sind. Genauer gesagt, wurden Hemopure^®, Oxyglobin und Vollblut 251-fach in destilliertem Milli-Q-Wasser verdünnt, durchgemischt und mit einem Spektralphotometer Cary 3 von 750 bis 450 nm gegen distilliertes Wasser gescannt. Die Spektren von Vollblut und von den beiden Blutersatzmitteln zeigten Maxima bei 541 nm bzw. 577 nm und Minima bei 508 nm bzw. 560 nm. Diese Merkmale sich beim Vergleich mit Vollblut charakteristisch für die von Oxyhämoglobin (van Kampen und Ziljstra, 1965, Adv. Clin. Chem., 8: 141). Weil die Produkte Hemopure^® und Oxyglobin in mit Sauerstoff angereichertem Wasser ein Spektrum von Oxyhämoglobin zeigen, befindet sich das Häme-Eisen in der Oxidationsstufe 2, wie es in Vollblut-Hämoglobin der Fall ist.
BEISPIEL 8
Beide Produkte, das Hemopure^® und das Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) verhielten sich wie Hämoglobin in Vollblut, wenn sie 251-fach mit einem cyanid-haltigen Hämoglobin-Reagens verdünnt und mit dem Hämatologie-Analysator ADVIA 120^® analysiert wurden. Konkret wurden 20 μl Hemopure^® und Oxyglobin beide mit 5,0 ml cyanid-haltigem Hämoglobin-Reagens verdünnt, wie es beim Analysator ADVIA 120^® verwendet wird. Die Proben wurden durchgemischt, dann mit einem Spektralphotometer Cary 3 von 750 nm bis 450 nm gescannt und verglichen, und zwar mit einem Reagens in Küvetten mit 1 cm Weglänge. A750 wurde auf null gesetzt. Zu Kontrollzwecken wurde eine Teilprobe von frischem Humanblut wie oben für die Testprodukte beschrieben behandelt. Tabelle 9 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse in Form der spektralen Maxima und Minima der Hämoglobin-basierten Sauerstoffträger und von Vollblut in dem cyanid-haltigen Hämoglobin-Reagens. TABELLE 9

Probe A550 nm A514 nm A550/A514

Vollblut 0,3239 0,2236 1,45

Hemopure^® 0,3267 0,2331 1,40

Oxyglobin 0,3423 0,2453 1,40
Die Daten zeigen, dass beide HBOC-Produkte von Biopure dem Humanblut hinsichtlich ihrer Reaktion mit dem cyanid-haltigen Hämoglobin-Reagens ähneln. Alle Spektren wiesen ein Maximum bei 550 nm und ein Minimum bei 514 nm auf, und zwar mit ähnlichen Max/Min-Absorbanzverhältnissen. Dieses Experiment demonstriert, dass beide Produkte, Hemopure^® und Oxyglobin, Häme enthalten, da die in dem HGB-Reagens erhaltenen Stoffe mizelliertes Dicyano-Fe+3 Protoporphyrin IX (siehe M. Malin et al., 1992, Anal. Chim. Acta, 262: 67–77) sind.
Die Inhalte aller hier zitierten Patentschriften, Patentanmeldungen, veröffentlichten Artikel, Bücher, Referenzhandbücher und Kurzfassungen gelten hiermit in Gänze per Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen, um den Stand der Technik hinsichtlich der Erfindung genauer zu beschreiben.
Da an dem oben beschriebenen Stoff vielfältige Änderungen möglich sind, ohne den Geltungsbereich und die Idee der vorliegenden Erfindung zu verlassen, ist es die hier erklärte Absicht, dass der gesamte Inhalt der vorstehenden Beschreibung oder der beigefügten Patentansprüche als die Erfindung beschreibend und illustrierend verstanden werden soll. Angesichts der vorstehenden Erläuterungen sind viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neue Verfahren zum Detektieren, Quantifizieren und Überwachen extrazellulären oder exogen hinzugegebenen Hämoglobins, einschließlich Hämoglobinersatzmitteln, in einer Blutprobe, insbesondere in einer Vollblutprobe und auch in Plasma- und Serumproben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin das Verwenden von automatischen Hämatologie-Analysatoren zum Ermitteln und Quantifizieren der Konzentration extrazellulären und exogenen Hämoglobins, einschließlich zellfreier Hämoglobinersatzmittel, in einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe; diese Erfindung ist insbesondere vorteilhaft für die medizinische Nutzung bei einer Verletzung oder einer Operation eines Patienten sowie zum Überwachen von Hämoglobin-Leveln während der Rehabilitation

Claims

Verfahren zum Ermitteln, Quantifizieren und Überwachen von extrazellulärem Hämoglobin in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe, durchgeführt an einem mit mindestens zwei Analysekanälen zur Hämoglobin-Messung ausgestatteten, automatischen Hämatologie-Analysator, wobei das extrazelluläre Hämoglobin in der Probe aufgrund der Anwesenheit eines zellfreien Hämoglobin-Produkts oder eines sauerstofftragenden Hämoglobinersatzmittels im Blut vorhanden ist und aus gereinigtem Hämoglobin, aus rekombinantem Hämoglobin, aus vernetztem Hämoglobin, aus polymerisiertem Hämoglobin oder aus einem Polyethylenglycol gekoppeltes Hämoglobin (PEG-HGB) besteht, wobei dieses Verfahren folgende Schritte enthält: (a) Ermitteln der Konzentration des Gesamt-Hämoglobins in einer Teilprobe in einem Hämoglobin-Analyse-Kanal des Analysators; und (b) Ermitteln der Konzentration des zellulären Hämoglobins in der Teilprobe in einem Rote-Blutzellen-Analyse-Kanal des Analysators; und (c) Errechnen der Differenz zwischen der Konzentration des Gesamt-Hämoglobins, ermittelt im Hämoglobin-Kanal, und der Konzentration des Zell-Hämoglobins, ermittelt im Rote-Blutzellen-Kanal des Analysators, um die Hämoglobin-Konzentration in der Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe zu bekommen, wobei der Hämoglobin-Analyse-Kanal von Schritt (a) die Konzentration des Gesamt-Hämoglobins in der Probe mittels Hämolyse und Extraktion der Häme aus ihrem biologischen Komplex mit Globin durch Bilden einer in einer oberflächenaktiven Mizelle einfangbaren Hämeart mit ligiertem Eisen misst, und zwar anhand der kolorimetrischen Absorbanz im Hämoglobin-Kanal des Analysators, und wobei der Rote-Blutzellen-Analyse-Kanal von Schritt (b) die Konzentration der roten Blutzellen, das Volumen der roten Blutzellen und die Hämoglobin-Konzentration einzelner roter Blutzellen misst, während die Letztgenannten die zwei Lichtstreuungsdetektoren praktisch Zelle für Zelle einzeln passieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Probe aus normalem oder abnormalem Vollblut ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Plasma- oder Serumprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Gesamt-Hämoglobins in Schritt (a) und die Konzentration des Zell-Hämoglobins in Schritt (b) im Bereich von circa 0,5 g/dL bis circa 25 g/dL Blut, Plasma oder Serum liegt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe aus abnormem Vollblut von einer Person stammt, die sich in einem pathologischen Zustand befindet, der ein Blutverlust während einer Operation, ein Blutverlust beim Vorliegen einer Verletzung oder ein hämorrhagischer Schock ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gereinigte Hämoglobin gereinigtes Rinderhämoglobin oder gereinigtes Humanhämoglobin ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das rekombinante Hämoglobin rekombinantes Humanhämoglobin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zell-Hämoglobin von Schritt (b) mittels folgender Formel ermittelt wird: RBC·MCV·CHCM/1000; worin RBC der Wert aus dem Rote-Blutzellen-Zytogramm im Rote-Blutzellen-Kanal des Hämatologie-Analysators ist, worin MCV das mittlere Zellvolumen ist, und worin CHCM die mittlere Konzentration des Zell-Hämoglobins ist, geliefert vom Rote-Blutzellen-Kanal des Hämatologie-Analysators.