DE2517860B2 - Verfahren zum Bestimmen des Pyrogengehalts in Proben - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen des Pyrogengehalts einer Probe unter Einsatz einer Verdünnungsreihe von Dispersionen eines Limulus-Proteine fallenden Pyrogens.

Aus der Literatur, z. B. »Thrombos. Diath. Haemorrh.«. Band 23, Seiten 170 bis 181 (1970), ist es bekannt, daß Amoebocytenblutkörperchen von Angehörigen der Gattung Limulus, insbesondere Limulus polyphemus, d. h. Königskrabben, beim Inberührunggelangen mit Pyrogenen, z. B. Bakterienendotoxin, Klumpchen bzw. Gerinnsel büden. Diese

ίο Amoebocytenzellen schaffen einen wirksamen Blutgerinnungsmechanismus bei verletzten Königs krabben, wodurch eine weitere Proliferation und ein weiteres Vordringen von Bakterien in andere Körperteile verhindert wird.

Gegenwärtig werden parenteral zu verabreichende Lösungen in vivo auf Pyrogene mit Hilfe von Kaninchen getestet. Ein derartiges Testprogramm ist sehr kostspielig und schwierig durchzuführen.

Es wurde beträchtliche Forschungsarbeit aufgewandt, um Limulus-Amoebocyten - nach dem Auflösen in Wasser und dergleichen zum Aufbrechen der Zellenverbände - als Ersatztestmöglichkeit für Pyrogene in sterilen Produkten verwenden zu können. Eine Zusammenfassung dieser Forschungsarbeiten an Limulus findet sich in »Bulletin of the Parenteral Drug Association«, Band 27, Nr. 3, Seiten 139 bis 148 (Mai/Juni 1973).

In typischer Weise werden Limulus-Amoebocytenzellen durch Einbringen in destilliertes Wasser oder

jo nach sonstigen zum Aufbrechen der Blutkörperchen bekannten Maßnahmen lysiert bi^v. in Lösung gebracht. Anschließend daran wird die erhaltene Lösung filtriert oder zentrifugiert, um Feststoffe, wie ZeIlwandbruchstücke und dergleichen, zu entfernen und

j5 um eine Proteinlösung, die üblicherweise als Limulus-Lysat bezeichnet wird, zu gewinnen.

Diese Prcteinlösung (Limulus-Lysat) wird üblicherweise zum Nachweis von Bakteriendotoxin benutzt, indem sie mit dem zu untersuchenden Material in Berührung gebracht wird. Hierbei wird dann untersucht, ob sie einen bestimmten Mindeststabilitätsanforderungen genügenden Proteinklumpen bildet. Ein typischer Teststabilitätsstandard für den Klumpen besteht in einem Umdrehen des Teströhrchens, in dem sich der Klumpen gebildet hat, um 180° C. Wenn der Klumpen intakt bleibt, ist es ein Zeichen für eine positive Endotoxinreaktion. Wenn der Klumpen aufbricht oder wenn sich überhaupt kein intakter Klumpen bildet, wird dies als negative Endotoxinreaktion angesehen.

Ein Nachteil der Klumpentechnik zur Ermittlung der Anwesenheit von Pyrogenen ist, daß die Ergebnisse in Abhängigkeit von der Art und Weise, in der die Untersuchungsperson das Teströhrchen umdreht, variieren kann. Eine weitere Fehlerquelle ist die subjektive Interpretation der Untersuchungsperson, ob der betreffende Niederschlag ein Klumpen ist oder nicht.

Die geschilderte Klumpenbildung zur Analyse von

(,o Endotoxin hat sich zwar in einigen Fällen als zufriedenstellend erwiesen, es gibt jedoch eine Reihe von sehr wichtigen und kritischen Endotoxinbestimmungen, bei denen eine einfache Klumpenbildung (zur Endotoxinbestimmung) nicht genügend genau und

_b5 empfindlich ist, um eine hinreichend exakte Analyse auf die Anwesenheit eines Endotoxins zu ermöglichen.

Ein sehr wesentliches Gebiet dieser Art ist die Py-

rogenbe^timmung in parenteral zu verabreichenden Lösungen. Hierbei wäre ein Ersatz des gegenwärtig praktizierten, teuren und aufwendigen und mit lebenden Kaninchen durchgeführten Testprogramms, wie es von den Herstellern parenteral zu verabreichender Lösung durchgeführt wird, von höchstem Interesse, d. h. es besteht ein erheblicher Bedarf an einer möglichst genauen, quantitativen lind empfindlichen invitro-Bestimmung der Anwesenheit von Pyrogenen, z. B. von Bakterienendotoxin.

In Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 261,1972, S. 284—289 wird angeblich bei einer Lipopolysaccharid konzentration (d. h. einer Endotoxinkonzentration) von 10~¹² ug/ml noch eine positive Reaktion auf das Lysat von Limulus-Blutkörperchen festgestellt. Endotoxine bzw. Pyrogene stellen jedoch polydisperse Lösungen dar, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht der Teilchen etwa 24000000 beträgt und die größeren Teilchen durch die Aggregation identischer Untereinheiten eines Molekulargewichts von etwa 1000000 gebildet werden (vgl. Beer et al, The Journal of Clinical Investigation, Vol. 44, S. 492 [1965]). Die obengenannte Empfindlichkeitsangabe ist bereits aufgrund theoretisch-wissenschaftlicher Überlegungen nicht haltbar, da für eine Volumeneinheit von 0,1 ml errechnet wird, daß darin 0,0602 Moleküle enthalten sind, d. h., man kann unter statistischen Gesichtspunkten davon ausgehen, daß in der Volumeneinheit regelmäßig überhaupt kein Endotoxin enthalten ist.

Im Bulletin of the Parenteral Drug Association, Band 27,1973, Heft 3, S. 139-148 wird bereits die Verwendung einer Verdünnungsreihe eines Pyrogens zum Test einer Limulus-Lysat-Lösung beschrieben. Dabei ist die Frage des positiven Bndpunktes von wesentlicher Bedeutung, der nämlich erst vorliegen soll, wenn sich ein fester Klumpen gebildet hat. Ganz offensichtlich handelt es sich hierbei nicht um ein quantitatives Verfahren, da die Ergebnisse des in dieser Literaturstelle beschriebenen Versuchs lediglich aussagen, ob sich ein Proteinklumpen gebildet hat oder nicht. Somit bleibt die Endotoxinkonzentration unbekannt und nicht bestimmt. Nach diesem bekannten Verfahren läßt sich allenfalls eine Endotoxinkonzentration von 0,1 ng/ml unter Anwendung einer Lysat-Lösung feststellen.

J. Lab. CHn. Med., VoI. 75,1970, Nr. 6, S. 903-911 beschreibt ein photometrisches Verfahren, wie die Lichtstreuung, um den Anstieg ausgeschiedenen Limulus-Proteins zu identifizieren, wobei die niedrigste Konzentration an verwendetem Endotoxin lediglich 1 ng/ml beträgt.

In Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, Vol. 19,1968, Nr. 1/2, S. 187-196 wird die quantitative photometrische Bestimmung gefällten Proteins beschrieben, wobei jedoch offensichtlich außergewöhnlich hohe Konzentrationen an Endotoxin vermessen werden, so z. B. Konzentrationen von 5000 ng/ml. Das Endotoxin muß in einem Überschuß eingesetzt werden, um die zwingend zu erhaltende vollständige Gelierung zu erreichen. Schließlich wird in dieser Literaturstclle darauf hingewiesen, daß absolut negative Ergebnisse bei einer Endotoxinkonzentration von 0,04 ng/ml erhalten werden.

Ausgehend von dem oben erläuterten Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, das eingangs beschriebene Verfahren so zu verbessern, daß eine quantiative Erfassung des Pyrogens bzw. Endotoxins in Konzentrationen ermöglicht wird, die deutlich unter den Konzentrationen liegen, die nach dem bekannten Verfahren erfaßbar sind.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man

a) zu der Verdünnungsreihe eine abgemessene Menge gereinigten, durch Pyrogene fällbarer. Proteins der Limulus-Lysatlösung gibt und die Proteinkonzentration in jedem vorgegebenen

ι ο aliquoten Teil jeder Stufe der Verdünnungsreihe

so wählt, daß bei praktischer Abwesenheit von Pyrogen eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von weniger als 0,2 und bei Gegenwart einer zum Ausfällen praktisch des gesamten fällbaren Proteins ausreichenden Pyrogenmenge eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von über 1 erreicht wird,

b) durch quantitative spektro-photometrische Be-Stimmung die Menge des gefällten Proteins ermittelt, wobei ein abrupter Anstieg in der Menge des gefällten Proteins in einer Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe im Vergleich zur nächsten Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe eine positive Pyrogenempfindlichkeit anzeigt, und

c) die Probe mit unbekanntem Pyrogengehalt analysiert, indem man die Probe mit einer abgemessenen Menge der gereinigten Limulus-Proteinlösung unter den beim Verfahrensschritt a)

jo eingehaltenen Bedingungen versetzt und dann

durch quantitative spektro-photometrische Bestimmung die Menge des gefällten Proteins ermittelt, wobei mindestens diejenige ausgefällte Proteinmenge, die der Proteinmenge in derjenigen Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe, bei der eine abrupte Zunahme der Proteinfällung zu beobachten war, entspricht, ein Anzeichen für eine positive Pyrogennachweisreaktion in der Probe bildet.

Vorzugsweise wird der obengenannten Verdünnungsreihe eine konstante Menge eines gereinigten, fällbaren Proteins der Limulus-Lysatlösung zugesetzt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine solche gereinigte Lösung des fällbaren Proteins vom Limulus-Lysat verwendet, aus der überschüssige Mengen an Fremdprotein, die in Gegenwart von Proteinen nicht ausfallen, entfernt worden sind. Letztere Proteine können die Empfindlichkeit der erfindungsgemäß analytischen Ergebnisse herabsetzen. So ist es zweckmäßig, die Zellwandbruchstücke und andere feste Anteile des Limulus-Lysats sowie mindestens einen Teil der wasserlöslichen, nicht-fällbaren Proteinfraktionen durch Filtrieren, Zentrifugieren u. dgl. zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Reinigen des Limulus-Lysatproteins wird nachfolgend noch erläutert werden. Selbstverständlich können erforderlichenfalls auch andere Reinigungsmaßnahmen angewandt werden. Einfachere und weniger wirksame Reinigungsmaßbo nahmen können in solchen Fällen angewandt werden, in denen weniger genaue Ergebnisse als im folgenden Beispiel in Kauf genommen werden können.

Die obengenannte Verdünnungsreihe von Dispersionen eines Limulus-Proteine fällenden Pyrogens kann aus einer handelsüblichen Standardendotoxinlösung angesetzt werden. In typischer Weise wird eine Verdünnungsreihe mit 20 verschiedenen Bakterienendotoxirikonzentrationen angesetzt. Die erste Lö-

sung mit der höchsten Konzentration enthält hierbei 100 Nanogramm Endotoxin pro ml, jede folgende Lösung enthält die Hälfte der Endotoxinkonzentration der vorhergehenden Lösung, so daß die 20. und letzte Lösung pro ml 0,00019 Nanogramoi Endotoxin pro ml enthält.

Nun wird zu den einzelnen Lösungen der verschiedenen Verdünnungsstufen der Verdünngungsreihe, d. h. zu den verschieden verdünnten Pyrog^ndispersionen, eine abgemessene Menge, vorzugsweise dieselbe Menge pro Teströhrchen, des gereinigten fällbaren Proteins der Limulus-Lysatlösung zugegeben, worauf die Dispersion in der Regel eine gewisse Zeit lang, z. B. 60 min lang, ir typischer Weise bei erhöhter Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von 37° C, stehen gelassen wird. Die Tests können jedoch auch (wirksam) unter Einhaltung anderer Inkubationszeiten und innerhalb eines relativ breiten Temperaturbereichs durchgeführt werden. Vorzugsweise sollten jedoch sämtliche Proben brt/. Teströhrchen gleichmäßig behandelt werden.

Während der Inkubation kann sich in den Teströhrchen . die Endotoxi .i in höherer Konzentration enthalten, ein Klumpen aus gefälltem Protein bilden. Dies stellt eine »Frühanzeige« für eine positive Reaktion dar. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch beträchtlich empfindlicher als das »Klumpenverfahren« und eignet sich zum Nachweis weit geringerer Endotoxinkonzentrationen als letzteres Verfahren.

Im Anschluß an die Inkubation wird die Menge an gefälltem Protein durch quantitative spektro-photometrische Bestimmung ermittelt. Hierbei wild in der Regel das gefällte Protein abzentriguiert oder abfiltriert, um es von der überstehenden Flüssigkeit zu befreien. Der Zweck dieses Trennvorgangs ist, soviel wie möglich nicht-gefälltes Protein aus der Lösung zu entfernen, um die quantitative Messung der Menge an zurückbleibendem gefälltem Protein zu erleichtern.

Daran einschließend kann das Protein in beliebiger Weise redispergiert und dann quantitativ auf spektro-photometrischem Wege, beispielsweise durch Absorptionsmessung, bestimmt werden.

In der Regel bedient man sich zur quantitativen spektro-photometrischen Bestimmung einer Absorptionsmessung, wobei der Proteingehalt in einem elektromagnetischen Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 Millimikron bestimmt wird. Insbesondere bedient man sich der von Oliver H. Lowry und Mitarbeitern in der Zeitschrift »Journal of Biological Chemistry«, Band 193, Seiten 165 bis 275 (1951) beschriebenen Analysenmaßnahmen.

Jeder aliquote Teil der Testlösung enthält genügend fällbares Protein, um eine Absorption von weniger als 0,2 bei im wesentlichen gegebener Abwesenheit von Endotoxin und eine Absorption von über 1 bei vollständiger Proteinfällung (bei der jeweiligen Meßwellenlänge) zu liefern.

Wenn die gefällten Proteinproben aus den einzelnen Verdünnungsstufen, d. h. aus den verschieden verdünnten Pyrogendispersionen, auf absorptivem Wege spektro-photometrisch analysiert werden, kann man für jede Probe einen speziellen Absorptionswert erhalten, der zu einer speziellen Endotoxinkonzentration jeder bekannten Probe in einer bestimmten Beziehung steht.

Hierauf kann man unter Benutzung desselben geeichten Limulus-Lysatmaterials und Einhaltung derselben Reaktionsbedingungen Materialien unbe kannten Pyrogengshaits analysieren, indem man das betreffende Material mit einer abgemessenen Menge eines vorher nicht gebrauchten Anteils derselben gereinigten Limulus-Proteinlösung versetzt und auf ent-

sprechende spektro-photometrische Weise die Menge an gefälltem Protein bestimmt. Folglich stellt der jeweils abgelesene optische Dichtewert, der dem bei einem speziellen Teströhrchen bekannter und gleichzeitig mit gemessener Endotoxinl-jonzentration abge-

ic lesenen optischen Dichtewert ähnlich ist, ein Maß dafür dar, daß in dem unbekannten Material eine ähnliche Pyrogenkonzentration vorliegt.

Andererseits kann die Abnahme der Lichtabsorption und dergleichen in der überstehenden Lösung

nach Entfernung der gefällten Proteine ermittelt und aus dem ermittelten Wert die Menge der gefällten Proteine bestimmt werden.

Das folgende Beispiel soll das Verfahren gemäß der Erfindung näher erläutern.

Beispiel

Königskrabben (Limulus polyphemus) aus dem Atlantischen Ozean wurden gesammelt und derart in einem Gestell fixiert, daß ihre Unterseite nach oben zeigte. Das Gelenk zwischen den ersten beiden Segmenten der Krabben (Prosthoma und Opisthoma) wurde durch Betupfen mit Alkohol präpariert. Hieraufwurde in das Gelenk eine Blutsammeinadel eingestochen. Die Blutsammelnadel war am Ende eines handelsüblichen Blutbeutels, dessen Blutsammeirohr jedoch lediglich 12,7 cm lang war, befestigt. Der Blutbeutel enthielt 300 ml einer 3 %igen (Gewicht/Volumen in g pro I) Natriumchloridlösung mit 2,87 g an gelöstem Äthylendiamintetraacetat.

Es wurden so viele Königskrabben nacheinander ausgeblutet, bis 300 ml Blut in den ein Fassungsvermögen von 600 ml aufweisenden Blutbeutel gelangt waren. Das 12,7-cm-Blutspenderohr wurde dann nahe seiner Eintrittsöffnung in den Beutel auf dielek trischem Wege heißversiegelt.

Schließlich wurde das Blutsammeirohr nahe dem hitzeversiegelten Abschnitt abgeschnitten, um die Nadel zu entfernen.

Zwei der in der geschilderten Weise vorbereiteten

Beutel wurden ausgewählt, erforderlichenfalls mit Gewichten austariert und schließlich 7 min in einer handelsüblichen Zentrifuge mit einer Schwerkraft von 1000 (etwa 1800 Upm) rotieren gelassen, damit sich die Amoebocytenzellen aus dem Limulus-Blut abset zen konnten. In den Fällen, in denen das Blut offen sichtlich gut sedimentiert, reicht es in der Regel aus, 7 min lang lediglich eine Schwerkraft von 600 (etwa 1500 Upm) einzuhalten.

Im Anschluß an das Abzentrifugieren der Zellen

wurde jeder Blutbeutel auf eine 10° geneigte Ebene gelegt, wobei der versiegelte Stutzen des Blutsammelrohrs nach unten zeigte. Nun wurde das Sammelrohr durch Aufschneiden wieder geöffnet. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig abdekantiert, um die abgesetzten Zellen im Beutel zurückzuhalten. Nach dem Dekantieren wurde das Sammelrohr erneut in der geschilderten Weise hitzeversiegelt.

Nun wurde einer der beiden sterilen Einlasse (Medikationsöffnungen) der Blutbeutel mit einer lnjek- tionsnadel durchstochen, wobei auf jeden Gewichtsteil an in dem Beutel enthaltenen Zellen zu deren Auflösung 6 Gewichtsteile destillierten, pyrogenfreien Wassers in den Beutel eingespritzt wurden. Das

Zellengewicht konnte in üblicher bekannter Weise durch Subtrahieren des Standardtrockengewichts des Blutbeutels vom tatsächlichen Gewicht des speziellen Beutels und der darin enthaltenen Zellen ermittelt werden.

Das destillierte Wasser wurde in dem Blutbeutel bewegt und dann 24 h bei einer Temperatur von 4° C stehen gelassen. Dann wurde der Beutel 7 min lang mit einer Schwerkraft von 1000 zentrifugiert.

Hierauf wurde der flüssige Inhalt jeden Beutels durch ein handelsübliches 170-Mikron-Filter filtriert, um die Flüssigkeit von den abgesetzten Feststoffen zu trennen. Dann wurde die Lösung bis zum Festwerden gefroren.

Die gefrorene Limulus-Lysatlösung wurde hierauf sorgfältig aufgetaut, wobei darauf geachtet wurde, daß die Lösung kalt blieb, d. h. bei einer Temperatur unterhalb 20° C blieb. Nach dem Auftauen wurde die Limulus-Lysatlösung durch ein weiteres handelsübliches 170-Mikron-Filter in eine Sammelflasche vorfiltriert.

Der auf dem Filter verbliebene Filterrückstand bestand aus einem nicht-verwertbaren Material, das während des Gefrierens ausgefallen war. Hierauf wurde das Filtrat in typischer Weise erneut durch ein handelsübliches Vorfilter einer nominalen Porengröße von 1,5 Mikron und dann durch ein Membranfilter einer angegebenen absoluten Porengröße von 1,2 Mikron und einer nominalen Porengröße von weniger als 1,2 Mikron filtriert. Die nominale Porengröße ist definiert als derjenige Porendurchmesser, bei dem mindestens 98% sämtlicher Teilchen der genannten Teilchengröße entfernt werden.

Vor Gebrauch wurden sämtliche Filter mit 1 1 sterilem, pyrogenfreiem Wasser gespült. Die letzte Filtrationsstufe wurde derart durchgeführt, daß die Lysatlösung unter einem Stickstoffgasdruck von etwa 0,907 kp/cnr nach oben durch den Filter gedrückt wurde. Andererseits konnte zur Erleichterung des Filtriervorgangs im Sammelgefäß ein Vakuum angelegt werden.

Nach dem letzten Filtriervorgang wurde die Lösung in aliquote Teile von 2,0 ml geteilt, die dann in 6 ml fassende Phiolen oder Teströhrchen gefüllt wurden. Die Phiolen oder Teströhrchen waren vorher gründlich mit sterilem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen und 4 h bei einer Temperatur von 245° C entkeimt worden. Hierauf wurden die Teströhrchen in üblicher Weise versiegelt, worauf der Röhrcheninhalt in einer handelsüblichen Lyophilisierungsvorrichtung so weit gefriergetrocknet wurde, bis in den Röhrchen ein trockenes Pulver erhalten wurde.

In einer Reihe von in der geschilderten Weise vorbereiteten Teströhrchen wurde der Röhrcheninhalt durch Zusatz von 5 ml eines gleichen Volumengemischs aus 1 Gew.-% Magnesiumchloridlösung und 0,1 Gew.-% Natriumthioglykolatlösung wieder aufbereitet.

Um das Limulus-Lysat zu eichen, wurde 0,1 ml pyrogenfreien Wassers in eine Reihe leerer Teströhrchen (mit Ausnahme des ersten Röhrchens) gefüllt. In das erste Teströhrchen wurde 0,2 ml handelsübliche Escherichia-coli-Standardendotoxinlösung gefüllt. Die Konzentration des verwendeten Escherichia-coli-Endotoxins betrug 100 Nanogramm Endotoxin pro ml. Hierauf wurde 0,1 ml der Lösung aus dem ersten Teströhrchen in das zweite Teströhrchen überführt, worauf aus dem zweiten Teströhrchen

0,1 ml Lösung in das dritte Teströhrchen überführ wurde.

Dies wurde in der Weise, daß das jeweils folgendi Teströhrchen die Hälfte der Endotoxinkonzentratioi des vorhergehenden Teströhrchens enthielt, so langi fortgesetzt, bis das 20. und letzte Teströhrchen eini Lösung mit 0,00019 Nanogramm Endotoxin pro m enthielt. Die Lösung der 6. bis 16. Verdünnungsstufi der angesetzten Verdünnungsreihe wurden zum ei gentlichen Test verwendet.

Einige der Lösungen in den Teströhrchen wurdei mit 0,1 ml der in der geschilderten Weise zubereitetei filtrierten Lysatlösung versetzt.

Die Verdünnungsreihe wurde dann 60 min bei ei ner Temperatur von 37° C inkubiert. Hieiauf wurdf jedes Teströhrchen umgedreht, wobei die An- ode: Abwesenheit eines intakten Proteinklumpens notier wurde.

Hierauf wurden sämtliche Klumpen aufgespaltet und die Röhrchen 15 min lang mit einer Umdre hungsgeschwindigkeit von 4000 Upm zentrifugiert Dann wurde aus jedem Röhrchen zur Entfernung de: gelösten Proteins die überstehende Flüssigkeit ausge gössen, der abgesetzte Niederschlag durfte im Röhr chen verbleiben.

Nun wurden die Röhrchen zur Lösung des gefällter Proteins mit 0,2 ml einer 0,75n-Natriumhydroxidlösung versetzt.

Dann wurde der Proteingehalt in jedem Teströhrchen bzw. in jeder Phiole in der von Oliver H. Lo wry und Mitarbeitern in der Zeitschrift »Journal of Biological Chemistry«, Band 193, Seiten 265 bis 275 (1951) beschriebenen Methode quantitativ analysiert. Bei dem im folgenden beschriebenen Text wurden folgende Reagentien verwendet:
Reagens A 20 g/l Natriumcarbonat in Ο,ΐη-Natri-

umhydroxidlösung
Reagens B 5 g/l CuSO₄ ■ 5H₂O in 10 g/l Kaliumtar-

tratlösung

Reagens C alkalische Kupferlösung, die durch Vermischen von 49 ml Reagens A mit 1 ml Reagens B zubereitet worden war. Dieses Reagens wurde täglich frisch zubereitet.

Reagens D verdünntes Folin-Reagens, das durch Verdünnung von Folin/Cäocalteu-Phenolreagens auf In mit destilliertem Wasser hergestellt worden war.

Zu jeder Proteinlösung in den verschiedenen Phiolen bzw. Teströhrchen wurde 1 ml Reagens C zugesetzt. Hierauf wurde die jeweilige Mischung gründlich durchgemischt und dann etwa 10 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde rasch 0,1 ml Reagens D zugesetzt und mit dem Röhrcbeninhait in weniger als 10 see gemischt. Dann wurde das Ganze mindestens 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Ein handelsübliches Spektralphotometer wurde derart eingestellt, daß die Absorption auf einer optisehen Dichteskala bei einer Wellenlänge von 500 πιμ abgelesen werden konnte. Das Spektralphotometer war in Anpassung an das geringe Probenvolumen mit einer 0,5-ml-Mikrodurchflußküvette ausgestattet. Die Spektralphotometereinstellung reichte in typischer Weise von 450 bis 1000 Γημ, vorzugsweise von 500 bis 750 πιμ.

Das Spektralphotometer wurde mittels einer Blindprobe, bestehend aus einer Lösung von 0,75n-

NaOH und ähnlichen Konzentrationen an den Lösungen C und D, wie sie auch für die tatsächlichen Tests verwendet wurden, auf eine O-Absorptionsablesung eingestellt. Bei dieser Technik ist die Konzentration an zugesetztem Lysat groß genug, um nach beendeter Fällung des Proteins eine Absorptionsablesung von über 1 und (im wesentlichen) in Abwesenheit einer Fällung (und von Endotoxin) eine Absorptionsablesung von unter 0,2 zu gewährleisten.

Nun wurden die Absorptionswerte der in der geschilderten Weise gewonnenen Proben als optische Dichtewerte gemessen und aufgezeichnet. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Konzentration an
zu der Lysatlösung
zugesetztem Endotoxin (Nanogramm
pro ml)

Tabelle

Absorption des
gefällten
Proteins

Berechnete Menge an gefälltem Protein (Mikrogramm pro 0,1 ml Lysat-Lösung)

3,12 (Lösung Nr. 6) 1,031
1,56 (Lösung Nr. 7) 1,110
0,78 (Lösung Nr. 8) 1,386

0,39 (Lösung Nr.
0,195(LösungNr.
0,097 (Lösung Nr.
0,048 (Lösung Nr.
0,024(Lösung Nr.
0,012 (Lösung Nr.
0,006 (Lösung Nr.
0,003 (Lösung Nr.
Vergleichs-Lysatlösung ohne zugesetztes Endotoxin

9) 0,941

10) 0,913

11) 0,958*
0,814
0,682
0,535
0,350
0,378

12)
13)
14)
15)
16)

0,136

425 475

(Absorption ist zu hoch, um eine genaue Proteinberechnung durchführen zu können) 370 350 375 287 210 132

77,5

82,5

37,5

* Dies war die geringste Konzentration an Endotoxin, mit der eine übliche positive Proteinklumpenreaktion erreichbar war.

Aus der Tabelle geht hervor, daß ein scharfer Anstieg in der Menge an ausgefälltem Protein im Bereich zwischen der Lösung Nr. 14 und der Lösung Nr. 11 zu beobachten ist. Wenn man bei dieser Reihe von Lösungen die Menge an in jeder Verdünnungsstufe ausgefallenem Protein mit der nächsten stärker verdünnten Probe dieser Reihe vergleicht, ist ein deutlicher Anstieg in der Menge an ausgefallenem Protein feststellbar. Dies ist ein klarer Hinweis darauf, daß die größeren Gehalte an Endotoxin größere Menge an Protein ausfallen lassen. Weiterhin ist dies ein eindeutiger Hinweis auf das typische Verhalten von gereinigtem Limulus-Protein in Gegenwart von Endotoxin.

Rs zeigt sich folglich, daß der im vorliegenden Beispiel durchgeführte Test für die Anwesenheit von Endotoxin in Konzentrationsgehalten bis herunter zu 0,012 Nanogramm/ml Testlösung empfindlich ist, da das in Lösung Nr. 14 ausgefallene Protein mengenmäßig weit größer ist als das in Lösung Nr. 15 ausgefallene Protein. Die Endotoxinnachweisreaktion wird durch weitere Zunahme an der in den Lösungen Nr. 13,12 und 11 ausgefallenen Proteinmenge bestätigt. Ferner hat es sich gezeigt, daß eine Endotoxinreaktion vermutlich bis zu Konzentrationen von 0,003 Nanogramm/ml (Lösung Nr. 16) erfolgte, da die ausgefallene Proteinmenge selbst bei dieser extrem verdünnten Probe beträchtlich über dem Wert der Vergleichslysatlösung ohne zugesetztes Endotoxin liegt. Wenn folglich eine bekannte Probe unter zu den geschilderten Bedingungen identischen Bedingungen unter Verwendung eines nicht-gebrauchten Anteils derselben Charge an gereinigter Lysatlösung getestet wird, läßt sich die Konzentration an vorhandenem Pyrogen, insbesondere Endotoxin, durch Korrelation mit der Absorptionsablesung für die unbekannte Probe quantitativ analysieren. Wenn man beispielsweise bei einer in der geschilderten Weise behandelten unbekannten Probe eine Absorption von etwa 0,535 abgelesen hat, läßt sich daraus schließen, daß ihre Endotoxinkonzentration in etwa so groß ist wie die Endotoxinkonzentration der Lösung Nr. 14 (der Tabelle). Höhere abgelesene Werte entsprechen den höheren Endotoxingehalten der stärker konzentrierten Lösungen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß

3> sich bei stärker konzentrierten Lösungen (Lösung Nr. 11 und größer) aufgrund der abgelesenen Werte quantitative Fehler einstellen können. Diese Ablesungswerte sind jedoch - grob gesagt - noch genau genug, um als qualitativer Nachweis für die Anwesenheit von Endotoxin dienen zu können.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Werte sind nun mit der üblichen Klumpenbildungsanalyse, bei der die Anwesenheit von Endotoxin durch die Bildung eines bei sorgfältigem Umdrehen des Teströhrchens um 180° in dem Reaktionsröhrchen gebildeten und nicht aufbrechenden Klumpens angezeigt wird, zu vergleichen. Bei letzterer Analysentechnik ist die am stärksten verdünnte Lösung, die eine positive Endotoxinreaktion ergab, die Lösung Nr. 11 mit einer

so Konzentration von 0,097 Nanogramm/ml. Folglich ermöglicht das gemäß dem vorliegenden Beispiel durchgeführte Verfahren der Erfindung eine achtmal empfindlichere Endotoxinbestimmung als die übliche Klurripenendotoxinbestimmung.

Claims (4)

ί Patentansprüche:

1. Verfahren zum Bestimmen des Pyrogengehalts einer Probe unter Einsatz einer Verdünnungsreihe von Dispersionen eines Limulus-Proteine fallenden Pyrogens, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) zu der Verdünnungsseite eine abgemessene Menge gereinigten, durch Pyrogene fällbaren Proteins der Limulus-Lysatlösung gibt und die Proteinkonzentration in jedem vorgegebenen aliquoten Teil jeder Stufe der Verdünnungsreihe so wählt, daß bei praktischer Abwesenheit von Pyrogen eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von weniger als 0,2 und bei Gegenwart einer zum Ausfällen praktisch des gesamten fällbaren Proteins ausreichenden Pyrogenmenge eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von über 1 erreicht wird,

b) durch quantitative spektro-photometrische Bestimmung die Menge des gefällten Proteins ermittelt, wobei ein abrupter Anstieg in der Menge des gefällten Proteins in einer Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe im Vergleich zur nächsten Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe eine positive Pyrogenempfindlichkeit anzeigt, und

c) die Probe mit unbekanntem Pyrogengehalt analysiert, indem man die Probe mit einer abgemessenen Menge der gereinigten Limulus-Proteinlösung unter den beim Verfahrensschritt a) eingehaltenen Bedingungen versetzt und dann durch quantitative spektro-photometrische Bestimmung die Menge des gefällten Proteins ermittelt, wobei mindestens diejenige ausgefällte Proteinmenge, die der Proteinmenge in derjenigen Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe, bei der eine abrupte Zunahme der Proteiniällung zu beobachten war, entspricht, ein Anzeichen für eine positive Pyrogennachweisreaktion in der Probe bildet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung des gefällten Proteins derart durchführt, daß man das gefällte Protein von der überstehenden Flüssigkeit, aus der es ausgefällt worden ist, befreit und anschließend die Menge des vorhandenen gefällten Proteins durch spektro-photometrische Messung der Absorption einer Lösung des gefällten Proteins mit Folin-Reagens bei einer Wellenlänge zwischen 450 und 1000 Millimikron gegen ein Vergleichsprotein quantitativ bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Wellenlänge von Millimikron arbeitet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnungsreihe bis zu einer maximalen Konzentration von 0,39 ng/ml Pyrogen herstellt.