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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren der Plättchen-Analyse
und von deren quantitativer Bestimmung mit automatisierten Hämatologie-Systemen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hoch-Gewinnungsverfahren, das sowohl für normale
als auch abnorme Blutproben anwendbar ist, um unter anderen Parametern
die Plättchenzahl,
das Plättchenvolumen,
die Konzentration oder Dichte der Plättchenkomponenten und die Trockenmasse
der Plättchen
mit einem höheren
Genauigkeits- und Präzisionsgrad
im Vergleich mit anderen Verfahren zu bestimmen.
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Hintergrund der Erfindung
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Obwohl
halb- und vollautomatisierte Analysiersysteme nun routinemäßig zur
Bestimmung der Blutplättchenzahlen
angewandt werden, ist es im Stand der Technik anerkannt, dass die
geläufigen
automatisierten Plättchenbestimmungs-
und -messverfahren noch durch Probleme der Ungenauigkeit sowie des
Fehlens der Präzision
und Reproduzierbarkeit beeinträchtigt
sind. Dies ist besonders auffällig
bei der Analyse abnormer Blutproben, wie denjenigen, die von Personen
oder Patienten erhalten werden, die an vielerlei Blutdyskrasien und
thrombotischen Störungen,
wie an Thrombozytopenie (einem Absinken der Anzahl der Blutplättchen),
an Thrombozytosie und dergl. leiden. Mehrere Gründe für die Schwierigkeiten und Herausforderungen
bei der Steuerung der Genauigkeit von Plättchen-Zählungen können 1) dem großen dynamischen
Bereich der Plättchenzahl
und -größe bei den
Patienten, 2) der kleinen Größe der Plättchen,
3) der Gegenwart von mit der Plättchengröße interferierenden
Partikeln in den Analysenproben und 4) dem Verhalten der Partikel
bei einer in vitro-Alterung zugeschrieben werden.
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Die
Analyse und quantitative Bestimmung von Plättchen kann besonders schwierig
im Fall von Personen mit Thrombozytopenie sein, die verringerte
oder niedrige Anzahlen der Plättchen
in ihren Blutproben aufweisen. Dieser Zustand resultiert häufig aus
Behandlungen und Therapien, die gewöhnlich für Krebs-Patienten angewandt
werden, die abgesenkte thrombotische Tendenzen aufweisen. Außerdem erleiden
Personen, die an bestimmten immunologischen Krankheiten, insbesondere
an Autoimmunkrankheiten, wie idiopathischem thrombozytopenischen
Purpur (ITP), leiden, oft einen Schaden und eine Zerstörung der
Plättchen,
was zu abgesunkenen Plättchenzahlen
führt.
Ferner weisen Personen, die an aplastischer(n) Anämie(n) leiden,
ebenfalls verrin gerte Zahlen der Blutplättchen auf. Beispielsweise
betragen in Proben von Personen mit Thrombozytopenie die Plättchenzahlen
oft weniger als 50.000/Tl, verglichen mit Plättchenzahlen im Normalbereich,
die in der Größenordnung
von ca. 150.000 bis 400.000/Tl liegen (J. C. Dacie und S. M. Lewis,
1989, Practical Haematology, 6. Ausgabe, Churchill Livingstome,
London).
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Tatsächlich wird
die genaue Zählung
der Plättchen
sogar noch wichtiger mit dem Erscheinen breit verfügbarer Plättchenersatztherapien
für Patienten
mit Thrombozytopenie. Außerdem
macht die Entwicklung und Anwendung einer Vielzahlausgeklügelterer
Studien der Plättchen-Funktion,
z. B. von Aktivierungs- und/oder Klebekraftbestimmungen der Plättchen,
genaue und präzise
Plättchen-Zählungen
als integralen Bestandteil von Labor-Hämatologie-Tests
erforderlich. Auch macht es die Qualitätssicherung von Plättchen-Packungen, die
für eine
Transfusion zubereitet sind, erforderlich, dass genaue Plättchen-Zählverfahren
vor Ort verfügbar sind
(R. K. Wertz und J. A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Path. 68 (1):
195–201).
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Im
Stand der Technik werden genauere, präzisere und empfindlichere Verfahren
zum Nachweis, zur Unterscheidung, quantitativen Bestimmung und zur
Charakterisierung der Plättchen-Parameter
sowohl für
normale als auch für
abnorme Blutproben benötigt.
Außerdem
kann mit genauen und präzisen
Plättchen-Analysenverfahren,
die an Vollblutproben durchgeführt
werden, die anfängliche
Zubereitung von Plättchen-reichem Plasma
mittels Differenzialzentrifugations-Sedimentationstechniken, die
bei einigen Verfahren erforderlich sind, umgangen werden. Derartige
Vollblut-Plättchen-Analysenverfahren
können
zur Diagnose unvermuteter Plättchenabnormitäten sowie
zur Aufzeichnung und Verfolgung von Plättchen-Zählungen und -Parametern normaler
Einzelpersonen und von Patienten beim Einsetzen einer Störung oder
während
des Behandlungsverlaufes oder dem Fortschreiten einer Krankheit
zweckdienlich sein. Außerdem
werden Verfahren zur Anwendung an automatisierten Systemen im Stand
der Technik benötigt,
die eine Signalauflösung
und die Unterscheidung der Plättchen,
insbesondere in Fällen
niedriger Plättchenzahlen,
zu verbessern vermögen.
Die vorliegend beschriebene Erfindung zeigt und ergibt derartige
Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik.
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Zwei
voll-automatisierte Plättchen-Zähl- und
-Größenmessverfahren
sind derzeit bekannt und werden im Stand der Technik angewandt.
Das eine ist das Öffnung-Impedanzverfahren.
Vollblut-Plättchen
in wässriger Suspen sion
werden nachgewiesen, während
und wobei sie durch eine enge Öffnung
zwischen zwei Elektroden gehen, wodurch die elektrische Impedanz
(der elektrische Scheinwiderstand) in der Öffnung relativ zu derjenigen
des Suspendiermediums in grobem Verhältnis zum Plättchenvolumen
erhöht
wird. Somit ergeben die Plättchen-Pulse
die Plättchenzahl
und das Plättchenvolumen.
Die Plättchen
werden von roten Blutzellen im Öffnung-Impedanzverfahren
auf der Grundlage ihrer Größe unterschieden,
da Plättchen
als Gruppe kleiner als rote Blutzellen als Gruppe sind. In einigen
Anwendungsfällen
dieses Verfahrens werden Plättchen-Zähl- und Größenbestimmungen
durch mathematische Analyse der Plättchengrößen-Verteilungen verfeinert.
Diese Verteilungen werden log-normalen Kurven angepasst, und die
Parameter der angepassten Kurven ergeben die Plättchenzahl und -größe. Obwohl
es die Absicht dieser Vorgehensweise ist, Partikel-Müll und kleine
rote Blutzellen auszuschließen,
deren Vorliegen die log-normale Plättchenvolumen-Verteilung verzerrt,
werden solche kontaminierenden Partikel und Zellen nicht immer ausgeschlossen.
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Ein
zweites halb-automatisiertes Verfahren ist das Laserlicht-Streuverfahren. In
diesem Verfahren werden Vollblut-Plättchen in wässriger Suspension nachgewiesen,
während
und wobei sie einen Laserstrahl schneiden, wodurch das einfallende
Licht unter charakteristischen Winkeln in Wege gestreut wird, in
denen optische Detektoren vorliegen. Die Plättchen-Signalpulse ergeben eine Volumeninformation
sowie Zählwerte, da
das Plättchenvolumen
als proportional zur Streuintensität erachtet wird. Beispiele
automatisierter Fließ-Zytometriegeräte, die
entworfen worden sind und angewandt werden, um solche Lichtstreuungsverfahren
durchzuführen,
sind die H·-System-Geräte (die
im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H·-Systeme, z.
B. H·1,
H·2,
H·3 und
dergl., erhältlich
sind und von der hier auftretenden Anmelderin verkauft werden) und das
ORTHO ELT-8 (Ortho Diagnostics).
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Im
ORTHO ELT-8-System werden die Plättchen
von den roten Blutzellen ganz einfach durch die Unterschiede bei
der Streuintensität über einem
Einzelkegelwinkel unterschieden. In den TECHNICON H·-Systemen
werden die Plättchen
auch bezüglich
ihrer Größe auf der
Grundlage der Streuintensität über einem
Einzelkegelwinkel erfasst und gemessen; allerdings werden sie von
den roten Blutzellen auf der Grundlage der charakteristischen Streuintensitäten in einem
Paar geeignet gewählter
Detektoren unterschieden. Obwohl die Plättchen-Streuungsintensitätsverteilung
log-normal ist, verfeinert das zweite Laserlicht-Streuverfahren
die Zähl-
oder Größenwerte
nicht durch Anpassung der mit log-normalen Kurven erhaltenen Daten.
Partikel-Müll ist
in diesem Verfahren aus Signalen zusammengesetzt, deren Streuintensitäten unter
einen ausgewählten Schwellenwert
fallen.
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Wie
oben erwähnt,
unterscheidet das Öffnung-Impedanzverfahren
Plättchen
von roten Blutzellen und Partikel-Müll auf der Grundlage der Plättchengröße sowie
auf der Grundlage der log-normalen Verteilung der Plättchengrößen. In
Fällen,
in denen Plättchen
und weitere Partikel eine sich überlappende
Größe aufweisen, verschwimmen
diese Unterscheidungen und das beste, was mit diesem Verfahren bewerkstelligt
werden kann, ist es, dieses Versagen zu erkennen. Außerdem unterscheidet
das Licht-Streuverfahren Plättchen
von roten Blutzellen, bezogen auf zweidimensionale Grenzen, die
sich kreuzen können,
wenn rote Blutzellen klein werden oder sich fragmentieren, wodurch
die Unterscheidung zwischen den disparaten Zellpopulationen ebenfalls verschwimmt.
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Ein
drittes halb-automatisiertes Verfahren zur Unterscheidung von Plättchen beinhaltet
eine Kombination der Laserlichtstreuung und -fluoreszenz zur Unterscheidung
der Plättchen
von roten Blutzellen und Partikelmüll. Vollblut-Plättchen in
wässriger
Suspension werden mit Plättchen-spezifischen Antikörpern, wie
mit CD42A, markiert. Die Antikörper
werden ihrerseits an Fluorophore, wie an Fluoreszeinisothiocyanat
(FITC) gebunden. Die markierten Plättchen streuen einfallendes
Licht und fluoreszieren, während
und wobei sie durch ein Fluoreszenz-Fließzytometer, wie ein Becton
Dickinson FACScan (Becton Dickinson), gehen. Die Plättchen und
Partikel in Plättchengröße werden
von den roten Blutzellen auf der Grundlage zweidimensionaler Streuungsmuster
(Vorwärtsstreuung
und Seitenstreuung) unterschieden. Diese "versperrten" Zellen werden ferner auf der Grundlage
der Fluoreszenzintensität
klassifiziert, wobei nur die Plättchen
eine signifikante Fluoreszenz zeigen und ergeben (W. Groner et al.,
1994, Blood, Nr. 10 Supplement, 687a; R. Dickerhof und A. von Ruecker, 1995,
Clin. Lab. Hematol., 17: 163–172).
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Obwohl
die letzten beiden oben beschriebenen Verfahren eine Unterscheidung
der Plättchen
von weiteren Blutzell-Typen und von Müll ermöglichen, ergeben sie keine
absoluten Plättchenzahlen.
Ferner wird mit ihnen die Plättchengröße nicht
bestimmt, da es keinen einfachen Weg gibt, die Verfahren und die
Systeme zur Durchführung
der Verfahren für
diesen Zweck zu zeichen. Außerdem
ist die Markierungstechnik Labor-intensiv und relativ teuer.
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Zusätzlich zur
Unterscheidung und quantitativen Bestimmung von Plättchen in
Blutproben werden einfache, preiswerte, genaue und reproduzierbare Verfahren
zur Bestimmung der Plättchen-Aktivierung
(oder des Aktivierungszustands) im Stand der Technik benötigt. Der
Aktivierungszustand von Plättchen
ist ein wichtiger Parameter der Plättchen-Funktion, wie dies im
folgenden beschrieben wird.
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Die
Aktivierung von Plättchen
ist eine fundamentale Funktionseigenschaft der Plättchen,
da aktivierte Plättchen
eine integrale Rolle bei Hämostasis
und Thrombose spielen. Bei einer Gefäßverletzung werden subendotheliale
Oberflächen
an der Verletzungsstelle dargelegt, was dazu führt, dass aktivierte Plättchen an
der subendothelialen Oberfläche
kleben. Darauf folgen eine Plättchenkernefreisetzung,
Plättchenaggregation
und eine Thrombusbildung. Thromben sind aus Fibrin, Plättchenaggregaten
und roten Blutzellen zusammengesetzt.
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Aktivierte
Plättchen
unterscheiden sich von restlichen Plättchen dadurch, dass die ersteren
Oberflächenglycoproteine
exprimieren, die mit dem Klebevorgang zusammenhängen. Auch setzen aktivierte
Plättchen
kernige Komponenten frei und unterliegen solchen Vorgängen, wie
der Scheibe-zu-Kugel-Formänderung und
der Aggregation. Eine Quellung ist ebenfalls mit der Formänderung
verbunden.
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Thrombose
ist Teil der Normalreaktion auf eine Gefäßverletzung. Jedoch tritt auch
eine gesteigerte thrombotische Aktivität auf, mit negativen Auswirkungen
auf Krankheitsbedingungen, wie peripherale Gefäßkrankheiten (D. V. Devine
et al., 1993, Arteriosclerosis and Thrombosis, 13: 857–62), Herzischämie (D.
McTavish et al., 1990, Drugs, 40: 238; G. DiMinno et al., 1985,
J. Clin. Invest., 75: 328), Diabetes mellitus (D. Toschoepe et al.,
1991, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 17: 433–438) und
Angina (R. C. Becker et al., 1994, Coronary Artery Dis., 5: 339).
Es ist auch bekannt, dass Blutbank-Plättchen in Konzentraten während der
Aufbewahrung und Lagerung aktiviert werden und als Ergebnis etwas
ihrer Potenz verlieren (H. M. Rinder und E. L. Snyder, 1992, Blood
Cells, 18: 445). Außerdem
ist es bei Hämodialyse
und chirurgischen Maßnahmen,
die eine extrakorporeale Zirkulation von Blut beinhalten, bekannt,
dass eine Aktivierung der Plättchen
verursacht wird (z. B. J. C. Reverter et al., 1994, J. Lab. Clin.
Med., 124: 79; Y. T. Wachtfogel et al., 1993, J. Thoracic and Cardiovascular
Surg., 106: 1–10;
R. E. Scharf et al., 1992, Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:
1975–1487). Demzufolge
ergibt die Befähigung
zur Identifizierung und Verfolgung des Aktivierungszustandes von
Plättchen ex
vivo eine vorteilhafte und nützliche
Rastertechnik, die durch die vorliegende Erfindung geleistet und
erstellt wird.
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Die
Aktivierung von Plättchen
ist mit Fluoreszenz-Fließzytometrie
untersucht worden (z. B. S. J. Shattil et al., 1987, Blood, 70:
307; C. S. Abrams et al., 1990, Blood, 75: 128; L. Corash, 1990,
Blood Cells, 16: 97–108).
Mit Fluoreszenz-Technologie werden Plättchen mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern, die
spezifisch zu Glycoproteinen sind, die exprimiert werden, oder Konformationsänderungen
eingehen, auf der Plättchenoberfläche als
Ergebnis der Plättchenaktivierung
markiert. Die Anzahl Fluoreszenz-positiver Vorfälle, die an einem Fließ-Zytometer
gezählt
werden, stellt die Anzahl aktivierter Plättchen dar; die Fluoreszenzintensität pro Vorfall
stellt die Anzahl markierter Stellen pro Zelloberfläche dar.
Obwohl diese Technik spezifisch und empfindlich ist, ist sie auch
in gewisser weise von Nachteil, sie ist nämlich teuer, die Zubereitung
der Proben ist zeitaufwendig, und die Datenanalyse ist nicht automatisiert.
Ferner ist kein Standardverfahren zur Festlegung Fluoreszenz-positiver
Schwellenwerte erstellt worden, teilweise wegen der Beliebigkeitsnatur
der Schwellenwertposition und teilweise wegen Unterschieden beim
experimentellen Entwurf.
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Plättchenaktivierung
ist auch durch Dichte-Gradientanalyse untersucht worden (B. van
Oost et al., 1983, Blood, 62: 433–38). Die Dichte von Plättchen sinkt,
bei deren Aktivierung, erstens wegen Quellung und zweitens wegen
der Freisetzung von α-
und Dicht-Kernen ab (S. Holme et al., 1981, J. Lab. Clin. Med.,
97: 610–22;
S. Holme et al., 1988, J. Lab. Clin. Med., 112: 223–231), die
dichter als das Plättchenzytoplasma
sind. Als Folge davon weisen aktivierte Plättchenproben höhere Prozentsätze an Plättchen mit
niedriger Dichte in Dichte-Gradienttrennungen auf, als dies bei
nicht-aktivierten
Proben der Fall ist. Die Dichte-Gradienttrenntechnik ist zeitaufwendig
und bedarf fachmännischer
Technologen. Ferner wird ein Zell-Zählgerät benötigt, um
die Anzahl von Plättchen
in jeder der Dichte-Gradientfraktionen
zu ermitteln.
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Demnach
ergibt die vorliegende Erfindung, mit der eine neue, preiswerte
und empfindliche Absorptions-Lichtstreuverfahrenstechnik zur Bestimmung
der Plättchenaktivierung
angeboten wird, einen Fortschritt und einen Vorteil gegenüber dem
Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung zur Bestimmung der
Plättchenaktivierung
ist automatisiert und somit wirkungsvoll und zeitsparend bei klinischer
Anwendung.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein empfindliches, genaues und präzises Verfahren
zur quantitativen Bestimmung und Analyse von Plättchen in Vollblutproben bereit
und eignet sich ganz besonders zur Analyse von Blut proben von Einzelpersonen,
die abnorme Blutbedingungen aufweisen, die die Zahlen und/oder die
Unterscheidung von Blutplättchen
gegenläufig
beeinflussen. Die Erfindung ergibt auch ein schnelles, einfaches und
preiswertes Verfahren, System und Gerät zur Plättchenunterscheidung und -analyse.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren
zur Plättchenanalyse
unter Anwendung automatisierter Hämatologie-Systeme zum Sammeln
von Plättchendaten,
einschließlich
der Zahl, Größe, Komponentenkonzentration
und der Trockenmasse der Plättchen,
anzugeben und zur Verfügung
zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Hochgewinnungs- oder Hochvergrößerungsverfahren
und die entsprechende Vorrichtung zur Plättchenzählungsgenauigkeit anzugeben
und bereitzustellen, welche mehr Plättchen-Analysendaten anbieten
und die Ergebnisse preiswerter und leichter liefern als Verfahren,
bei denen Fluoreszenzintensität,
Streuungsintensität
und Öffnungsimpedanz
zur Unterscheidung der Nicht-Plättchen
von den Plättchen
in einer Blutprobe angewandt werden.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zählung, Signalauflösung und
Unterscheidung von Plättchen
anzugeben, welches empfindlich und genau für Blutproben mit Plättchenzahlen von
ca. 1.000 bis weniger als ca. 50.000 Plättchen pro Mikroliter ist.
Insbesondere ergibt die Erfindung eine verbesserte Plättchenzählgenauigkeit
für thrombozytopenische
Proben.
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Noch
eine Aufgabe der Erfindung ist es, Zytogrammresultate zu liefern,
die gut entlinierte und detaillierte Darstellungen der Verteilung
des Partikeltyps in der Region mit der Größenordnung der Plättchen ergeben.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel bereitzustellen,
um derzeitige automatisierte Hämatologie-Analysiergeräte durch
die Zufügung
von mindestens zwei Kanälen
zu modifizieren und zu verbessern, um das verbesserte Verfahren
der Plättchenzählung und
-analyse durchzuführen.
Durch die Modifikation oder Verbesserung werden ein Niederstreuwinkel/Hoch-Gewinn-Vergrößerungskanal
und ein Hochstreuwinkel/Hoch-Gewinn-Vergrößerungskanal derzeitigen Systemen
plus Mie-Streu-Theorie-basierter Signalanalyse zugefügt, um das
Leistungsvermögen
des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung zu bewerkstelligen.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Identifizierung und quantitative
Bestimmung mikrozytischer roter Zellen und roter Blutzellfragmente
zu ermöglichen.
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Noch
eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Bestimmung des Ausmaßes der
Plättchenaktivierung durch
Messung der Plättchenkomponenten-Konzen tration
(MPC) anzugeben. Gemäß der Erfindung
werden MPC-Werte mit dem Plättchenaktivierungszustand
korreliert.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Bestimmung der Plättchen-Trockenmasse
anzugeben, die eine Vorhersage der Plättchenaktivierbarkeit darstellt.
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Schließlich ist
es eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Bestimmung der Plättchenkomponenten-Konzentration
anzugeben, die die Messung des in vitro-Blutprobenalters ermöglicht.
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Weitere
Gegenstände
und Vorteile der Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung,
die nun folgt, erkennbar.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
beigefügten
Zeichnungen der Figuren sind angegeben, um die Erfindung noch weiter
zu beschreiben und zu ihrem Verständnis durch Klarstellung ihrer
verschiedenen Gesichtspunkte bzw. Ausführungsformen beizutragen. Die
unten beschriebenen Streu/Streu-Zytogramme wurden erhalten, als
die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung zur
Bestimmung und Analyse von Plättchen
mit einem elektro-optischen Nachweissystem eines automatisierten
Hämatologie-Analysiergeräts gemäß der Erfindung
angewandt wurden. In den am Ende angegebenen Figuren gilt: RBC =
rote Blutzellzahl in 106/Tl; PLT = Plättchenzahl
in 103/Tl; MPV = mittleres Plättchenvolumen
in Femtoliter (fL); MP + C ist gleichwertig mit MPC = mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration in
g/dL; und MP + M ist gleichwertig mit MPM = mittlere Plättchen-Trockenmasse
in Picogramm (pg).
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1 stellt
eine Auftragung des Plättchenvolumens
(V) gegen den Brechungsindex (n) (d. h. V/n) auf einem Streu/Streu-Zytogramm
dar. Jede im Zytogramm gezeigte Linie stellt einen besonderen Partikel-Typ dar,
wie bestimmt in der Analyse und wie identifiziert in der Beschreibung
von 3.
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2A, 2B und 2C zeigen
Streu/Streu-Zytogramme von n-Pentan-, n-Hexan- bzw. n-Heptan-Öltröpfchen.
Jede im Zytogramm gezeigte Linie stellt einen besonderen Partikel-Typ
dar, wie bestimmt in der Analyse und wie identifiziert in der Beschreibung
von 3.
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3 zeigt
die Orte verschiedener Partikel, d. h. von roten Blutzellen, großen Plättchen,
roten Blutzellgeistern, Plättchen,
roten Blutzellfragmenten und Ursprungsmüll in einem Partikel-Typ-Auftragungs-Streu/Streu-Zytogramm. Diese
Beschreibung gilt auch für
die in 4, 5, 6, 8 und 13 dargestellten
Zytogramme.
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4 stellt
ein repräsentatives
Zytogramm und Histogramme dar, die eine Normalproben-Ergebnisausgabe
unter Anwendung des Plättchenbestimmungsverfahren
und -systems der Erfindung zeigen.
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5A stellt
ein repräsentatives
Zytogramm aus der Analyse von Plättchen
in K3EDTA-antikoagulierten Blutproben dar,
die in roter Blutzell-Verdünnung (z.
B. in TECHNICON RBC Diluent) suspendiert sind. 5B stellt
ein repräsentatives
Zytogramm aus der Analyse von Plättchen
in K3EDTA-antikoaguierten Blutproben dar, die
in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert sind.
Es sollte klar sein, dass die Proben bei Raumtemperatur analysiert
wurden, auch wenn sie nicht bei Raumtemperatur gelagert und aufbewahrt
worden sind.
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6A stellt
ein repräsentatives
Zytogramm aus der Analyse von ACD-antikoagulierten Blutproben dar, die
in roter Blutzell-Verdünnung
(z. B. in TECHNICON RBC Diluent) suspendiert sind. 6B stellt
ein repräsentatives
Zyptogramm aus der Anylse von ACD-antikoagulierten Blutproben dar,
die in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert sind.
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7A ist
ein repräsentatives
Diagramm, worin die mittlere Plättchen-Trockenmasse
(MPM) gegen die Zeit für
Normalblut-Spenderproben aufgetragen ist. MPM wurde für 24 h alte
Normalproben gegen 1 h alte Normalproben bestimmt, die bei Raumtemperatur
aufbewahrt worden waren. 7B zeigt
ein repräsentatives Diagramm,
worin die mittlere Plättchen-Trockenmasse
gegen die Zeit für
abnorme Blutspenderproben aufgetragen ist. MPM wurde für 28 h alte
abnorme Proben gegen 9 h alte abnorme Proben bestimmt, die bei Raumtemperatur
aufbewahrt worden waren.
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8A, 8B und 8C stellen
Plättchenvolumen
(MPV)-Histogramme für
eine abnorme Probe dar, die mit verschiedenen automatisierten Verfahren,
d. h. mit dem PLT1-System der Erfindung (8A), dem TECHNICON
H·Ô2-System
(8B) und mit dem Coulter STKS-System (8C),
erstellt wurden.
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In 9A bis 9D ist
das mittlere Plättchenvolumen
(MPV) gegen abnorme Plättchen
(PCT)-Zählbestimmungen
(PLT-Zahl < 20.000/Tl)
aufgetragen; die entweder mit dem TECHNICON H·Ô2-System oder dem Coulter-STKS-System
erhalten wurden. 9A zeigt die Ergebnisse, erhalten
aus dem TECHNICON H.Ô2-System
mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 9A gilt:
r = 0,59; Syx = 0,88 (gemäß Definition
von r und Syx); Steigung = 0,14; und Abschnitt = 4,5. 9B zeigt
die Ergebnisse, erhalten aus dem TECHNICON H·Ô2-System mit 28 h alten abnormen Blutproben.
In 9B gilt: r = 0,72; Syx = 0,54; Steigung = 0,13;
und Abschnitt = 3,29. 9C zeigt die Ergebnisse, erhalten
aus dem Coulter STKS-System mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 9C gilt:
r = 0,13; Syx = 0,95; Steigung = 0,02; und Abschnitt = 8,06. 9D zeigt
die Ergebnisse, erhalten aus dem Couter STKS-System mit 28 h alten
abnormen Blutproben. In 9D gilt:
r = 0,66; Syx = 1,09; Steigung = 0,18; und Abschnitt = 6,31.
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In 10A und 10B ist
das mittlere Plättchenvolumen
(MPV) gegen die Plättchen
(PCT)-Zählbestimmung
für abnorme
thrombozytopenische Blutproben (PLT-Zahl < 20.000/Tl) aufgetragen, die mit dem
neuen PLT1-System und -Verfahren der Erfindung erhalten wurden. 10A zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System
mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 10A gilt:
r = 0,32; Syx = 0,89; Steigung = –0,06; und Abschnitt = 10,02. 10B zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System
mit 28 h alten abnormen Blutproben. In 10B gilt:
r = 0,32; Syx = 1; Steigung = –0,07;
und Abschnitt = 11,79.
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In 11A, 11B und 11C ist das mittlere Plättchenvolumen (MPV) gegen die
Plättchen (PCT)-Zählbestimmungen
aufgetragen, die an Normalblutproben durchgeführt und mit unterschiedlichen
automatisierten Verfahren erhalten wurden, nämlich mit dem TECHNICON H·2-System,
dem Coulter STKS-System und mit dem neuen PLT1-System der Erfindung. 11A zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem TECHNICON
H·2-System
mit 1 h alten Normalblutproben; 11B zeigt
die Ergebnisse, erhalten aus dem Coulter STKS-System mit 1 h alten
Normalblutproben; und 11C zeigt
die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System der Erfindung mit 1
h alten Normalblutproben.
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12A und 12B zeigen
die Genauigkeitsdaten der mittleren Plättchen-Trockenmasse (MPM) und
der mittleren Plättchenkomponenten-Konzentrationen (MPC)
für abnorme
Blutproben mit dem PLT1-Verfahren und -System. In 12A sind die MPM-Genauigkeitsdaten für 24 h alte
abnorme Proben gegen 4 h alte abnorme Proben aufgetragen, welche
bei Raumtemperatur aufbewahrt worden waren und analysiert wurden.
In 12A gilt: r = 0,75; Syx = 0,13; Steigung = 0,74;
Abschnitt = 0,49; der 4 h-Mittelwert beträgt 2,04; und der 28 h-Mittelwert
beträgt
1,99. In 12B sind die MPC-Genauigkeitsdaten
für 28
h alte abnorme Proben gegen 4 h alte abnorme Proben bei Raumtemperatur
aufgetragen. In 12B gilt: r = 0,35; Syx = 1,3; Steigung
= 0,3; Abschnitt = 12; der 4 h-Mittelwert beträgt 22,1; und der 28 h-Mittelwert
beträgt
18,7.
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In 13A, 13B und 13C sind die Plättchenvolumen (MPV)-Histogramme
dargestellt, die den Ergebnissen entsprechen, die in Tabelle 8 für die abnorme
thrombozytopenische Probe #70 angegeben sind. 13A stellt die Histogramm-Ergebnisse dar, erhalten
mit dem PLT1-Analysenverfahren der Er findung; 13B stellt die Histogramm-Ergebnisse dar, erhalten
mit dem TECHNICON H·2-Analysensystem;
und 13C stellt die Histogramm-Ergebnisse
dar, erhalten mit dem Analysenverfahren des Coulter STKS-Systems.
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14A bis 14D zeigen
einen Vergleich zwischen dem neuen Licht-Streuungsverfahren gemäß der Erfindung
und einem Fluoreszenz-Verfahren zur Ermittlung der Plättchenaktivierung. 14A bis D legen dar,
dass das neue Licht-Streuungsverfahren (14C und 14D) der Erfindung und das Fluoreszenzverfahren
(14A und 14B)
die Thrombindosis-bezogene Plättchenaktivierung
in ähnlicher
Weise für
sowohl mit Natriumzitrat als auch mit EDTA-behandelte Blutproben
darstellen. Die Dosis-Reaktion-Kurven für das Verfahren der Erfindung
sind in Standard-Format, wobei MPC ansteigt (14C),
und in einem „Oberseite-nach-unten"-Format dargestellt,
wobei MPC absinkt (14D). Sowohl die Oberseite-nach-unten-
als auch die Standard-Format-Kurven
stellen identische Ergebnisse dar, die erstere Orientation ermöglicht aber
einen direkteren visuellen Vergleich der Ergebnisse zwischen den
zwei Verfahren (d. h., 14B direkt
verglichen mit 14D).
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein empfindliches und genaues Verfahren
zur quantitativen Bestimmung und Charakterisierung von Plättchen zur
Anwendung an automatisierten Hämatologie-Analysiersystemen
bereit. Die Erfindung stellt ferner eine Vorrichtung zur Durchführung der
beschriebenen quantitativen Bestimmungs- und Charakterisierungsverfahren
von Plättchen
bereit.
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Wie
hierin verwendet, werden die Plättchen
häufig
mit „PLT" abgekürzt. Weitere
hierin häufig
verwendete Abkürzungen
sind die folgenden: RBC ist rote Blutzelle; MPM ist mittlere Plättchen-Trockenmasse;
MPV ist mittleres Plättchenvolumen;
MPC ist mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration;
TCP ist thrombozytopenisch oder Thrombozytopenie; und TCPS ist die
Bezeichnung für
eine abnorme Blutprobe, erhalten von einem Patient mit Thrombozytopenie;
MCV ist das mittlere Zellvolumen; MCHC ist die mittlere Zell-Hämoglobin-Konzentration;
und HCT ist der Hämatokrit-Wert.
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Häufige Typen
automatisierter Hämatologie-Analysiersysteme,
mit der Eignung zur Anwendung in der Erfindung sind beispielsweise
die H·2-Systeme,
die im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H·1, H·2, H·3 und
dgl. erhältlich
sind und von der hier auftretenden Anmelderin verkauft werden. In
solchen Systemen erfolgt der Nachweis der Plättchen (oder Partikel) elektrooptisch
durch Messung der Lichtstreuung und elektrisch durch Messung der
elektrischen Impedanz (des Scheinwiderstandes). Für die Fachleute
wer den die Betriebsprinzipien der automatisierten TECHNICON H·
TM-Analysiersysteme hierin bezüglich roter
Blutzellen und der Plättchenanalyse
dargelegt, um die Änderungen
klar und deutlich zu beschreiben, die an solchen Systemen zur Erstellung
der Erfindung durchgeführt
wurden. In diesen Systemen werden rote Blutzellen und Plättchen gemeinsam
in einem einzelnen optischen Messkanal analysiert, der eine Helium-Neon-Laserlichtquelle,
eine Fließzelle
und zwei optische Detektoren einschließt. Als Teil seines normalen
Betriebsablaufes suspendiert das automatisierte System 2 Mikroliter
(2 Tl) Vollblut in 1,25 mL TECHNICON H·-Systeme-RBC-Verdünnung, einer
Reagens-Lösung, die
rote Blutzellen isovolumetrisch zu Kugeln so bildet, dass sie mit
der Mie-Streu-Theorie sauber analysiert werden können, wie dies hierin noch
deutlicher erklärt
wird. Reagenzien und Verdünnungsmittel
für die
Kugelbildung roter Blutzellen, welche sich zur Anwendung im Plättchen-Analysenverfahren
und -system der Erfindung eignen, sind in
US 5,284,771, 5,360,739 und
5,911,891 von S. S. Fan
et al., in
US 5,350,695 und
5,938,003 von G. Colella
et al. und in
US 9,575,490 und
9,412,004 von Kim und Ornstein
beschrieben.
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Ein
Strom von ca. 10 Tl dieser Suspension wird dann in einer Reagensflüssigkeit
von übereinstimmendem
Brechungsindex, d. h. im TECHNICON H·-Systeme-RBC/Basophil-Oberflächenmittel-Schaft,
als Schaft umhüllt.
Der RBC/Basophil-Schaft ist ein "passives" Reagens, das mit
Blutzellen nicht direkt wechselwirkt, aber stattdessen den Strom
in der Fließzelle
umgibt und zentriert. Es ergibt auch eine Prozession von Einzelpartikeln
zur Analyse. Beispielsweise umfasst die RBC/Basophil-Oberflächenmittel-Schaft-Reagenszusammensetzung
ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, 7,7 g/L, Natriumphosphat,
dibasisch, 2,9 g/L, Natriumphosphat, monobasisch, 0,3 g/L, das polyethoxylierte
nicht-ionische, nicht-hämolytische
oberflächenaktive
Mittel Pluronic P-105, 1,0 g/L, ein anti-oxidierendes Reagens, wie
3,3-Thiodipropionsäure, 0,10
g/L, und ein anti-mikrobielles Reagens, wie Proclin 150, 0,40 g/L,
bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 und einer Osmolalität von ca. 285
bis 305 mOsmol/kg.
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Die
roten Blutzellen und Plättchen
in der Suspension streuen ein wenig das einfallende Laserlicht, während und
wobei der mit dem Schaft umhüllte
Strom von Zellen durch die Fließzelle
fließt.
Die zwei Detektoren erfassen das gestreute Licht bei besonderen
winkeligen Zwischenräumen
relativ zur Einfallsachse. Die Detektorsignale werden so vergrößert, dass,
für Normalproben,
die durchschnittlichen Signale, die von roten Blutzellen erzeugt
werden, in der Mitte des Signalamplitudenbereichs zu liegen kommen, der
mit roten Blutzellen zusammenhängt.
Gemäß der Erfindung
wird die Lichtstreuungsintensität über zwei
Kegelwinkelintervallen in zwei optischen Kanälen bei und mit gesteigerten
ersten und zweiten optischen Kanalsignalgewinnen gemessen, um zwei
Streuungsintensitätsmessungen
zu erzeugen, die hinreichen, um die Plättchen von den Nicht-Plättchen in
der Probe optisch aufzulösen.
Der erste optische Kanalsignalwert stammt aus einem Zugewinn des
Hochwinkel-Detektors, und der zweite optische Kanalsignalwert stammt
aus einem Zugewinn des Niederwinkel-Detektors, woraus im Ergebnis
eine neue Hochgewinnungsversion der Nieder- und Hochwinkel-Ausgabewerte
entsteht. Auch gibt gemäß der Erfindung
das System die Signale aufgrund einer Gradstreuung von annähernd 5
bis 20 Grad, bevorzugter von 7 bis 15 Grad und am meisten bevorzugt
von 5 bis 15 Grad, entlang der X-Achse eines Streu/Streu-Zytogramms wieder.
Auch gibt das System Signale aufgrund einer Gradstreuung von annähernd 1
bis 7 Grad, bevorzugt von 1 bis 5 Grad und am meisten bevorzugt
von 2 bis 3 Grad, entlang der Y-Achse des Streu/Streu-Zytogramms
wieder. Diese Signale werden zur Ermittlung und Bestimmung roter
Blutzell-Parameter
wie des Volumens und der Hämoglobin-Konzentration
herangezogen, wie dies hierin noch weiter beschrieben wird.
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Rote
Blutzellen sind im Normalfall bikonkave Scheiben, deren Streueigenschaften
empfindlich gegen Orientation sind, während und wobei sie durch die
Fließzelle
des oben beschriebenen optischen Systems fließen. Zur Beseitigung der Auswirkungen
einer Partikel-Orientation auf die Signalintensität werden
die roten Blutzellen wie in der TECHNICON H·
TM-System-RBC-Verdünnung (z.
B.
US 9,575,490 und
9,912,004 von Kim und Ornstein)
zu Kugeln gebildet. Ferner sagt die Mie-Streu-Theorie, mit der winkelförmige Streuungsintensitätsprofile
für gekugelte
Partikel (wie gekugelte rote Zellen) erstellt werden, voraus, dass
die Streuungsintensität
gegenüber
dem Brechungsindex sowie dem Zellvolumen empfindlich ist. Somit
weisen zwei Partikel mit gleichem Volumen, aber mit unterschiedlichen
Brechungsindizes unterschiedliche Streuungsprofile auf. Da der Brechungsindex
roter Blutzellen linear von der zellulären Hämoglobin-Konzentration abhängt (R.
Barer und S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science,
95: 399–423),
welche von Zelle-zu-Zelle
schwankt, ist es bei den Messungen der Streuungsintensität über einem
einzelnen Kegelwinkelintervall nicht wahrscheinlich, dass das Zellvolumen
sogar für
gekugelte rote Blutzellen einzig und allein bestimmt wird. Daher
ist es zur einzigartigen Bestimmung des Volumens einer roten Blutzelle
notwendig, ihre Streuungsintensität über zumindest zwei getrennten
Ke gelwinkelintervallen zu messen. Die zelluläre Hämoglobin-Konzentration wird
als ein Nebenprodukt der Zwei-Winkel-Messung ermittelt und bestimmt.
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Algorithmen
unter Anwendung der Mie-Theorie ergeben die Winkel-Streuungsmuster,
die mit Partikeln von gegebenem Volumen und Brechungsindex zusammenhängen. Über den
Bereich von Interesse der Größen und
Konzentrationen roter Blutzellen (d. h. von ca. 30 bis 180 fL bzw.
von 19 bis 49 g/dL) ist ermittelt worden, dass eine Eins-zu-Eins-Korrespondenz
besteht zwischen 1) dem Paar von Streuungsintensitäten bei
2 bis 3 Grad und 5 bis 15 Grad und 2) dem Volumen und der Konzentration
roter Blutzellen (
US 4,735,504 von Tycko).
Für die
TECHNICON H·
TM-Systeme ist der Satz von Korrespondenzen
in der Form einer zweidimensionalen Matrix tabelliert. Die Indizes
der Matrix sind aus den X- und Y-Kanalsignalwerten zusammengesetzt, und
die Eingangswerte der Matrix sind die zusammenhängenden Volumina und Konzentrationen.
Eine elektromagnetische Streuungstheorie für kugelförmige Partikel (d. h. die Mie-Theorie)
ist im Detail, z. B., von M. Kerker, 1969, in The Scattering of
Light, Academic Press, beschrieben worden.
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Vor
der automatischen Anwendung der Mie-Tabelle zählt das System als Blutzellen
alle Partikel, die einen vorbestimmten Signal-Schwellenwert überschreiten.
Es bringt dann die beiden oben genannten Kegelwinkel-Messungen zur Anwendung,
um sie entweder als rote Blutzellen oder als Plättchen zu bezeichnen. Die zwei
Partikel-Typen besetzen bestimmte Regionen des Volumen/Brechungsindex-Raums,
wobei rote Blutzellen viel größer sind
und deutlich höhere
Brechungsindizes aufweisen. Allerdings ergeben die Signalgewinne, die
geläufig
in diesen Systemen zur Anwendung gelangen, eine nur schwache Unterscheidung
der Plättchen von
den Nicht-Plättchen,
wie von roten Blutzellgeistern, roten Zellfragmenten und von zellulärem Müll. Außerdem werden
mit den geläufigen Öffnung-Impedanzverfahren,
das auf Größenunterschieden
zur Unterscheidung der Plättchen
von weiteren Partikeln beruht, Plättchen nicht von roten Zellfragmenten
oder Müll
unterschieden, die. Volumina ähnlich
dem Volumen der Plättchen
aufweisen.
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Dagegen
beruhen derzeitige elektro-optische Geräte auf Einzelwinkel-Intervall-Messungen
zur Unterscheidung des Plättchenvolumens.
In den geläufigen
H·Ô-Systemen
wird das Plättchenvolumen
als proportional zur 5 bis 15 Grad Streuungsintensität angesehen.
Tatsächlich
sinkt, wie dies hierin beschrieben wird, diese Intensität mit dem
in vitro-Probenalter wegen Quellung der Plättchen ab (siehe Beispiel 1).
Als Ergebnis, fällt
das ermittelte mittlere Plättchenvolumen
in dem Maße,
wie das wahre mittlere Plättchenvolumen
ansteigt. Auch kann das Einzel-Winkel-Verfahren unterschiedliche Volumina
für Plättchen ermitteln
und angeben, die tatsächlich
die gleichen Volumina, aber unterschiedliche Dichte-Werte (d. h.
Brechungsindizes) aufweisen. Ferner geben sowohl elektro-optische
als auch Öffnung-Impedanz-Geräte oft MPV-Werte
für thrombozytopenische
Proben zu niedrig an, weil Nieder-Signal-Müll in typischer Weise einen
signifikanten Bruchteil des Gesamtpartikelzählwertes in diesen abnormen
Proben ausmacht.
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Als
Teil der Anstrengungen der hier auftretenden Erfinder zur Erstellung
empfindlicherer, genauerer und präziserer Plättchen-Analysen zur Durchführung an
automatisierten Analysiersystemen, wie z. B. an den TECHNICON H·-Analysiersystemen,
wurde eine Teststation unter Anwendung des TECHNICON H·1, wie
hierin beschrieben, zum Sammeln von Plättchen-Daten unter Anwendung
des durch die Erfindung beschriebenen Verfahrens und Systems angepasst
und konfiguriert, das eine gesteigerte Vergrößerung sowohl der X- als auch der Y-Optikkanal-Signale
(vergrößerte Signalgewinne)
für die
roten Blutzellen umfasst und ergibt.
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Das
neuartig konfigurierte automatisierte System zur Durchführung der
Analysen der Erfindung zur Unterscheidung von Plättchen wird hierin als das
PLT1-System und -Verfahren der Erfindung bezeichnet. Für die genaue
Plättchen-Analyse
wurde die Mie-Streutheorie angewandt, um die entsprechenden erhöhten Vergrößerungsfaktoren,
wie sie hierin beschrieben sind, herauszufinden und zu ermitteln.
Zuerst wurden die Volumen- und Brechungsindexbereiche zur Mie-Analyse
ausgewählt.
Der ausgewählte
Volumenbereich betrug ca. 1 bis 60 fL (fL = Femoliter 10–15 Liter)
und vorzugsweise 1 bis 30 fL. Dieser Bereich wurde ausgewählt, um
Plättchengrößen für alle normalen
und die meisten abnormen Proben abzudecken (J. M. Paulus, 1975, Blood,
46 (3): 321–336).
Der ausgewählte
Brechungsindexbereich betrug ca. 1,340 bis 1,400, vorzugsweise 1,350
bis 1,400. Die Untergrenze bezieht sich auf die Beobachtung, dass
Plättchen
höhere
Brechungsindizes als ihre Plasmamedien aufweisen (andernfalls würden sie
unsichtbar sein) und der Brechungsindex von Plasma in typischer
Weise größer als
ca. 1,345, gemäß Bestimmung
mit Refraktometrie, ist. Die Obergrenze bezieht sich auf die Beobachtung,
dass die meisten Plättchen
weniger dicht (und somit niedrigere Brechungsindizes aufweisen)
als rote Blutzellen sind, deren Brechungsindizes nur selten unter
1,390 fallen (zelluläre
Hämoglobin-Konzentration
von 23 g/dL). Die Grenze wurde vorzugsweise auf ca. 1,400 erweitert,
um dem kleinen Bruchteil von Plättchen
Rechnung zu tragen, die so dicht wie einige rote Blutzellen sind.
Bezogen auf diese Volumen- und Brechungsindexbereiche und auf die
Mie-Theorie, wurden die Standard H·TM-System-X-Kanal-Signale
um das ca. 8- bis
15-Fache und vorzugsweise um das ca. 12-Fache, und die Y-Signale
um das ca. 20- bis 35-Fache und vorzugsweise um das ca. 30-Fache
gemäß der Erfindung
erhöht
oder vergrößert.
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Bei
diesen Signalgewinnsteigerungen waren die Lichtstreuungsintensitäten bei
z. B. 2 bis 3 Grad und bei z. B. 5 bis 15 Grad angemessen und angepasst,
um Plättchen
gegenüber
interferierenden Substanzen, wie Zellmüll, roten Blutzellfragmenten
und roten Blutzellgeistern, optisch aufzulösen. Auch wurden rote Blutzellen im
Verfahren bestimmt unterschieden, weil ihre Signale in Sättigungskanälen X =
99, Y = 99 auftraten. Daher ergeben die kombinierten Streuungsmessungen,
die für
die Erfindung beschrieben sind, genauere Plättchen-Zählwerte, als dies bei derzeit
geläufigen
automatisierten Verfahren der Fall ist, insbesondere für thrombozytopenische
Proben, bei denen die Fraktion von Interferenzen typischerweise
ansteigt. Ferner erlauben die Streu/Streu-Zytogramme, die gemäß der Erfindung
erstellt werden, eine visuelle Bewertung der Zahl, der Durchschnittsgröße und des
Durchschnittsbrechungsindex der in einer Probe enthaltenen Plättchen.
Die Zytogramme ergeben auch eine visuelle Bewertung der Zahlen und
Typen anderer in Plättchengröße vorliegender
Partikel, die in der Probe vorhanden sein können.
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Ferner
werden, in einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, mit den Zwei-Winkel-Streuungsmessungen, die die Erfindung
einzigartig machen, Plättchen,
in denen ihre Kerne freigesetzt sind (d. h. aktivierte Plättchen),
von denjenigen unterschieden, worin dies nicht der Fall ist, da
Plättchen
in der aktivierten Form niedrigere Brechungsindizes als diejenigen
in der unaktivierten Form aufweisen. Derzeit geläufige automatisierte Geräte treffen
diese Unterscheidung nicht.
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Darüber hinaus
wird es durch die hohe Verstärkung
ermöglicht,
dass das System der Erfindung zur Bestimmung von Plättchen die
Mie-Theorie-Analyse
an den Plättchen
zur Durchführung
bringt, wodurch die Information über
das Plättchenvolumen
und den Brechungsindex vielmehr auf der Grundlage einer Theorie
als auf empirischer Beobachtung erbracht wird. Im PTL1-Teststation-System
waren die gemäß der Erfindung
gemessenen fünf
Parameter der rote Blutzell-Zählwert
(RBC-Zahl, 106/Tl), der Plättchen-Zählwert (PLT-Zahl, 103/Tl),
das mittlere Plättchenvolumen
(MPV, fL), die mittlere Plättchen-Trockenmasse
(MPM, pg) und die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration oder
-Dichte (MPC, g/dL).
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Es
sollte klar sein, dass vor dem neu erfundenen Verfahren zur Plättchen-Bestimmung
und seiner Testung im automatisierten Testsystem, wie dies hierin
beschrieben ist, die analytischen, gemessenen Parameter von MPM
und MPC vorher in automatisierten Plättchen-Analysen- und -Messverfahren
und -Systemen, die im Stand der Technik bekannt waren und angewandt
wurden, nicht verfügbar
waren. Somit wird durch das Verfahren und System der Erfindung eine
genaue und vollständige
Plättchen-Analyse
einer Probe bereitgestellt, einschließlich von Plättchen-Zahl,
mittlerem Plättchenvolumen,
mittlerer Plättchen-Trockenmasse
und mittlerer Plättchenkomponenten-Konzentration. Außerdem wird
durch die Erfindung auch der Zählwert
der roten Blutzellen der Probe bei gleichzeitiger Erstellung der
kompletten Plättchen-Analyse
bereitgestellt, wie dies noch weiter im folgenden beschrieben wird.
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Das
Hochvergrößerungsverfahren
der Erfindung wurde mit anderen Verfahren bezüglich der Genauigkeit der Plättchen-Zählung und
-Größenmessung,
der Empfindlichkeit und der qualitativen und quantitativen Reproduzierbarkeit
verglichen. Die anderen Vergleichsverfahren schlossen Streuungsintensität, z. B.
das TECHNICON H·2-System,
Bayer Corporation, Tarrytown, NY), Öffnung-Impedanz (z. B. das
Coulter STKS-Modellsystem, Coulter Electronics, Dade, Fla.), Phasenkontrast-Mikroskopie
und histologische Blutverschmierung-Schätzwerte ein.
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Das Hoch-Vergrößerungssystem
von PLT1
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung wird mit dem Verfahren und System der Erfindung zur Unterscheidung
und quantitativen Bestimmung von Plättchen ein neu ermitteltes
Hoch-Vergrößerungsverfahren
angewandt. Die Messungen, die in einzigartiger Weise für die vorliegende
Erfindung entwickelt wurden, wurden an einem modifizierten TECHNICON
H·1-System
durchgeführt,
das das PLT1-Modell- oder -Paradigmensystem/verfahren genannt wurde,
und zwar wegen der Befähigung
zur Durchführung
einer einzigartigen Messung und quantitativen Bestimmung von Parametern
an Plättchen
und wegen deren Unterschied zu derzeitigen automatisierten Systemen
und Vorrichtungen des Standes der Technik. Bei der Analyse roter
Blutzellen wurden das X-Kanalsignal
des PLT1-Systems auf das ca. 12-Fache des Nominalwertes und das
Y-Kanalsignal auf das ca. 30-Fache vergrößert.
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Somit
wurde, wie hier oben und gemäß der Erfindung
beschrieben, eine Mie-Streu-Theorie-Tabelle für Kugeln von ca. 1 bis 30 fL
und für
Brechungsindizes von ca. 1,350 bis 1,400 erstellt. Die Tabelle weist
das gleiche Format wie das zur Analyse roter Blutzellen angewandte
auf. Die Volumen/Brechungsindex (V/n)-Auftragung, die der Tabelle
entspricht, ist in 1 dargestellt. Die X- und Y-Kanalgewinne
wurden mit Tröpfchen- Suspensionen von
n-Pentan (n = 1,3577), von n-Hexan (n = 1,3776) und von n-Heptan
(n = 1,3884) standardisiert. 50 mL jedes Kohlenwasserstoffs wurden
mit 1 mL RBC/Baso-Schaft-Reagens 10 s lang Vortex-gerührt und
eine Probe mittels Direkt-Zytometrie analysiert, d. h., die Probe
wurde vor ihrem Durchgang durch die Fließzelle nicht weiter verdünnt. Die
Volumen/Brechungsindex-Auftragung, unter Einschluss Tabellen-abgeleiteter
Kurven von konstantem Brechungsindex für jeden der drei Kohlenwasserstoffe,
wurde auf dem Anzeigeschirm zusammen mit den tatsächlichen
Kurven wiedergegeben, die durch die Tröpfchen gebildet waren. Die
Signalgewinne wurden angepasst und die Proben, nötigenfalls, erneut analysiert,
bis die tatsächliche
Kurve für
jeden Kohlenwasserstoff über
ihre zugehörige
Tabellen-abgeleitete Kurve zu liegen kam. Beispiele der Muster,
die erstellt wurden, sind in 2 dargestellt.
Somit werden, gemäß der Erfindung,
Plättchen
in spezifischer Weise gegenüber
Nicht-Plättchen
durch ihr Vorliegen innerhalb der Volumen/Brechnungsindex-Auftragung
und noch weiter auf der Basis der charakteristischen Gauss-Verteilung
der Plättchenbrechungsindizes optisch
aufgelöst.
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Die
RBC-Zählung,
die mit dem PLT1-Verfahren durchführbar ist, wurde wie auf H·-Systemen
mit einem TECHNICON-Kalibrator gemäß den Anweisungen des Herstellers
geeicht. Der RBC-Zähleichfaktor,
der Verdünnung
in Rechnung stellt, wurde ebenfalls auf den Plättchen-Zählwert angewandt (z. B. wie
auf H·-Systemen),
da die Plättchen
und die roten Blutzellen in einer Probe identischen Verdünnungsfaktoren
unterliegen. Allerdings wurde, gemäß der Erfindung und im Gegensatz
zu automatisierten Vergleichsverfahren, kein unabhängiger Plättchen-Zähleichfaktor
im PLT1-System und -Verfahren angewandt. Daher würden Differenzen im Plättchen-Zählwert zwischen
PLT1 und anderen Technologien nicht durch künstliche Eichfaktoren für Vergleichszwecke
verdunkelt.
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Das
PLT1-System ist entworfen, um eine Vollblutprobe durch Anwendung
der Hydraulik, Pneumatik, Chemie, Reaktionszeit und Zählzeit eines
RBC/PLT-Kanals zu
verarbeiten und zu analysieren. Auch werden die Plättchen-Kanalsignale vom
gleichen Paar optischer Detektoren erfasst, die im RBC/PLT-Kanal
zur Anwendung gelangen; allerdings sind die gesteigerten Signalzugewinne,
die zur oben beschriebenen Messung und Bestimmung von Plättchen erfasst
werden, einzigartig beim PLT1-System und kein Teil der Systeme und
Verfahren, die gegenwärtig
im Stand der Technik angewandt werden. Die erfassten Signale werden
für das
System analysiert, wie dies im folgenden beschrieben und beispielhaft
angegeben wird: Signale stellen Nicht-Plättchen (d. h. RBCs oder "Andere") dar, falls 1) sie
außerhalb
der V/n-Auftragung liegen (diese stellen "Andere" dar); 2) sie die Detektoren sättigen (X
= 99, Y = 99) (diese stellen RBCs dar); oder 3) sie in Kanälen X < 80, Y = 99 liegen
(diese stellen "Andere" dar). Signale oberhalb
und links von der Auftragung nahe dem Ursprungspunkt stellen zellulären Müll dar.
Größere Signale,
einschließlich
derer in Kanälen
X < 80, Y = 99,
stellen rote Zellgeister dar. Sättigungssignale
kommen von RBCs und sehr großen
Plättchen.
Signale unterhalb und rechts von der Auftragung kommen ebenfalls
von RBC-Fragmenten (siehe 3).
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Die
verbleibenden Signale auf der Auftragung werden wie folgt analysiert:
Zuerst berechnet das System den mittleren Brechungsindex und die
Standardabweichung (SD) der Signale in Kanälen X = 18 und mehr, unter
Anwendung der Mie-Umrechnungstabelle. Das System schließt Signale
auf der V/n-Auftragung unterhalb Kanal X = 18 aus diesem Teil der
Analyse wegen möglicher
Kontamination durch Müll
aus. Danach wird jedes Partikel-Signal mit einem Brechungsindexwert
von ca. +2 bis –1,8
SD des Mittelwertes als Plättchen
bezeichnet. Der Rest der Partikel-Signale wird als „Andere" bezeichnet. Dies
ergibt Zählwerte
für drei
Typen von Partikeln, nämlich
für PLTs
(P), RBCs (R) und für "Andere" (0). Die Anzahl
der vom System nachgewiesenen Partikel, die Vsig genannt
wird, ist größer als
die Anzahl analysierter Partikel. Daher stellen P, R und 0 vielmehr die
Relativzahl eines jeden Partikel-Typs als den tatsächlichen
Roh-Zählwert
jeden Typs dar. Zum Erhalt der Roh-Zählwerte führt das System die folgenden
Umrechnungen durch:
Nr = (R/(R + P
+ O)) × Vsig; Np = (R/(R +
P + O)) × Vsig;
No = (O/(R
+ P + O)) × Vsig; worin gilt: Nr =
Roh-Zählwert
roter Blutzellen, Np = Roh-Plättchen-Zählwert;
No = Roh-"Ander"-Zählwert;
und Vsig = Gesamtzahl der nachgewiesenen
Partikel. Die Roh-Zählwerte
werden dann bezüglich
einer "Koinzidenz", d. h. des gleichzeitigen
Auftretens von zwei oder mehr Partikeln im Detektor-Kanal, korrigiert,
wobei der Detektor diese als einen Einzelpartikel zählt. Bei
den "Anderen" wird angenommen, dass
sie sich wie PLTs bezüglich
der Koinzidenz verhalten, und sie werden daher mit ihnen in den
Koinzidenz-Korrektur-Berechnungen gruppiert. Die Häufigkeit
von Koinzidenz wird durch Poisson-Statistiken genau vorhergesagt,
wie dies von den Fachleuten anerkannt ist. Die korrigierten Roh-RBC-,
-PLT- und -"Ander"-Zählwerte
werden mit RBCc, PLTc und Andere c bezeichnet. Schließlich wird
der RBC-Eichfaktor auf RBCc, PLTc und Andere c angewandt, um die
folgenden Werte zu ergeben: RBC (106/Tl);
PLT (103/T1); und Andere (103/Tl).
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Es
ist ersichtlich, dass die dynamischen Bereiche des Volumens und
Brechungsindex des verbesserten automatischen PLT1-Verfahrens und
-Systems effektiv erweitert werden können, um das gelegentliche Auftreten
großer
und dichter PLTs in den Sättigungskanälen X =
99, Y = 99 zu handhaben. PLT1 identifiziert diese als rote Blutzellen.
Dies kann bewerkstelligt werden, indem die geläufige H·-System-Mie-Umrechnungstabelle
nach unten auf V < 8
fL und n < 1,400
erstreckt wird. Die RBC/PLT-Kanal-Vergrößerung, die im PLT1-System
zur Anwendung gelangt, ergibt eine angemessene optische Auflösung großer Plättchen-Signale für die Anwendung
erweiterter Tabellen, um genaue V- und n-Werte zu ergeben.
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Das
PLT1-System der Erfindung berechnet das mittlere Plättchenvolumen
(MPV, fL) und den mittleren Brechungsindex, bezogen auf die Mie-Tabellen.
Das System leitet auch die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration
(MPC, g/dL) und die mittlere Plättchen-Trockenmasse
(MPM, pg) aus den Mittelwerten des Brechungsindex und des Volumens
ab, wie im folgenden dargelegt:
MPC (g/dL) = (mittlerer Brechungsindex – 1,333)/(0,0018/(g/dL)),
worin 1,333 = Brechungsindex von Wasser und 0,0018/(g/dL) = durchschnittlicher
Brechungsindex (RI)-Beitrag. Wie von den Fachleuten anerkannt und unten
weiter diskutiert, wird der RI-Beitragswert als Konstante in dieser
Gleichung behandelt, um ihn als Variable von Zelle-zu-Zelle zu eliminieren:
MPM(pg)
= MPC(g/dL) × MPV(fL/100.
(Merke, dass g/dL = 100 × pg/fL)
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Der
durchschnittliche Brechungsindex-Beitragswert ist, bezogen auf die
Tatsache, dass die Hauptbestandteile von Plättchen-Trockenmasse Protein
(57%), Lipid (19%) und Kohlenhydrat (8,5%) sind (Wintrobe's Clinical Hematology,
9. Ausgabe, 1993, Seite 515). Die Brechungsindex-Beiträge dieser
Komponenten betragen 0,00187/(g/dL), 0,0017/(g/dL) bzw. 0,00143/(g/dL)
(S. H. Armstrong et al., 1997, J. A. C. S., 69: 1797–1753; R.
Barer und S. Joseph, 1954, Quarterly Jorunal of Microscopical Science,
95: 399–423).
Mit den Relativkonzentrationen dieser Komponenten zur Zuordnung
eines durchschnittlichen Brechungsindex-Beitrags zu den Plättchen ergibt
sich ein Wert von 0,0018/(g/dL). Von den geringeren Bestandteilen
weisen einige höhere
Brechungsindex-Beiträge
und einige niedrigere Beiträge
auf. Der mittlere Beitrag dieser Komponenten wird nicht als signifikant
erwartet, um den zugeordneten Wert zu verändern. Anzumerken ist, dass 0,0018/(g/dL)
auch der Wert ist, der Protoplasma von der Literatur im Stand der
Technik zugeordnet wird (R. Barer und S. Josph, 1954, Quarterly
Journal of Microscopical Science, 95: 399–423). Außerdem gibt zur Angabe von
RBC- und PLT-Zählwerten, von
MPV, MPC und von MPM das System der Erfindung Frequenz-Histogramme
des Plättchenvolumens,
der Plättchenkomponenten-Konzentration
und der Plättchen-Trockenmasse
wieder (4).
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Das
PLT1-System und -Verfahren kann die gleichen chemischen Reagenzien
wie im RBC/PLT-Kanal-Verfahren anwenden, worin das geläufige TECHNICON
H·-System
zur Anwendung gelangt; das verwendete Kugelbildungsreagens beeinflusst
oder wirkt auf die Plättchen
nicht gegenläufig.
Darüber
hinaus ist eine zusätzliche
Kugelbildung für
Plättchen
nicht erforderlich, die in K3EDTA-Antikoaguliermittel
gesammelt und gemäß der Erfindung
analysiert worden sind. Beispielsweise ist in 5A ein
PLT1-Streu/Streu-Zytogramm dargestellt, das mit dem PLT1-System
und -Verfahren der Erfindung für
Plättchen
erzeugt wurde, die in K3EDTA antikoaguliert
und dann in RBC-Verdünnungslösung resuspendiert
worden sind. Wie im Stand der Technik berichtet, bildet K3EDTA Plättchen
zu Kugeln, wenn auch unvollkommen (S. Home und S. Murphy, 1980,
J. Lab. Clin. Med., 96: 980–493;
G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487–511). In 5B ist
ein PLT1-Streu/Streu-Zytogramm für
eine zweite Anteilsmenge der gleichen Probe dargestellt, die in
isotonischer, mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert wurde.
Wie durch Vergleich von 5A mit 5B ersichtlich,
weisen die zwei Zytogramme aus dem Verfahren und System der Erfindung
das gleiche Aussehen auf. Darüber
hinaus sind die berichteten Parameterwerte ebenfalls gleich, innerhalb
der Geräte-Fehlergrenzen.
Diese Ergebnisse belegen, dass ein Kugelbildungsreagens für rote Blutzellen
für das
Verfahren der Erfindung nicht erforderlich ist, um genaue RBC-Zählwerte
und Plättchen-Parameter-Ergebnisse
anzugeben.
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Außerdem zeigen 6A und 6B ein
korrespondierendes Paar von PLT1-erstellten Streu/Streu-Zytogrammen
zur Bewertung von Plättchen
vom gleichen Spender, mit der Ausnahme, dass eine im Handel verfügbare Säure/Zitrat/Dextrose
(acid/citrate/dextrose = (ACD))-Lösung als das Anti-Koaguliermittel verwendet
wurde. Im Gegensatz zur Wirkung von K3EDTA
ist es von ACD bekannt, dass es aus Plättchen keine Kugeln bildet
(S. Home und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 980–993; G.
V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 987–511; G. V. R. Born et al.,
1978, J. Physiol., 280: 193–212;
M. Frojmovic und R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16: 1071–1089).
Wiederum weisen die Zytogramme das gleiche Aussehen auf, obwohl
in ACD suspendierte Proben Zytogramme ergeben, die diffuser erscheinen
als diejenigen, die für
in K3EDTA suspendierte Proben erstellt wurden.
Dieser diffuse Charakter kommt von der beliebigen Orientation der
nicht-kugelförmigen Plättchen innerhalb
der Fließzelle
und beeinflusst die Empfindlichkeit und Genauigkeit der mit dem System
und Verfahren der Erfindung erhaltenen Ergebnisse nicht gegenläufig. Diese
Ergebnisse belegen, dass die Verdünnung für die roten Blutzellen Plättchen nicht
zu Kugeln bildet; tatsächlich
ist eine Kugelbildung der Plättchen
für die
Genauigkeit der Ergebnisse in der Erfindung nicht erforderlich.
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Wie
hierin beschrieben, wird durch die vorliegende Erfindung das erste
Mal dargelegt, dass sich gekugelte Plättchen, wie rote Blutzellen, "effektiv" als homogene Kugeln
unter den gewählten
Messbedingungen verhalten, sogar wenn Plättchen nicht perfekt zu Kugeln
gebildet werden und Kerne verschiedener Typen, Anzahlen und Brechungsindizes
enthalten. Vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung ging man
bei dem hier zur Rede stehenden Analysenverfahren davon aus, dass
es nur für
in die Kugelform überführte, homogene Partikel
wirkungsvoll angewandt werden kann (siehe z. B.
US 9,735,504 von D. H. Tycko).
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Anwendung der Mie-Streu-Theorie auf Zwei-Winkel-Streuungsmessungen
zur Plättchenanalyse,
wobei die gleichen oder ähnlichen
Winkelintervalle angewandt werden, die sich zur Analyse roter Blutzellen
eignen. Vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung waren sich
die Fachleute bewusst, dass das ausgewählte Paar von Kegel-Winkelbereichen,
das zur Analyse roter Blutzellen angewandt wird, spezifisch für diesen
Zell-Typ war, da, sogar für
rote Blutzellen, nicht alle Winkelpaare genaue Analysen ergaben
(siehe
US 4,735,504 von
Tycko). Ferner erwies sich die Analyse von Tycko nur als wirkungsvoll
für in
die Kugelform überführte rote
Blutzellen, die in typischer Weise um das ca. 10-Fache größer als
Plättchen
sind (d. h., MCV = 85 fL für
rote Blutzellen gegenüber
MC = 8,5 fL für
Plättchen); daher
ergeben rote Blutzellen viel größere Signale
für die
Analyse. Auch waren sich, bis zum Zeitpunkt der hier beschriebenen
Erfindung, die Fachleute bewusst, dass 2 Winkelintervalle nur für die Analyse
homogener und perfekt in die Kugelform überführter Partikel ausreichten,
und es wurde angenommen, dass unvollkommen in die Kugelform überführte Partikel
mindestens drei Winkelintervalle zur Analyse benötigten. Durch die vorliegende
Erfindung wird zum ersten Mal dargelegt, dass die oben beschriebenen
Parameter (d. h. das Paar aus Winkelkegeln und 2 Winkelintervallen),
welches vorher nur zur Analyse roter Blutzellen angewandt wurde, ebenfalls
wirkungsvoll für
genaue und empfindliche Bestimmungen und Messungen von nur unvollkommen
zu Kugeln gebildeten und nicht- homogenen
Partikeln, wie von Plättchen,
sind, die Normalvolumenbereiche von ca. 2 bis 20 fL aufweisen.
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Derzeitige
automatisierte Verfahren (wie die der TECHNICON H·-Systeme
und die in
US 4,735,504 von
Tycko beschriebenen) sind nur für
die Analyse roter Blutzellen, wie zur Bestimmung des Volumens und der
zellulären
Hämoglobin-Konzentration
der roten Blutzellen, entworfen. Im Gegensatz dazu, wird durch das PLT1-Verfahren
der Erfindung in vorteilhafter Weise die gleichzeitige Analyse von
Plättchen
und roten Blutzellen ermöglicht,
wie dies hierin beschrieben und mit Beispielen belegt ist. Ganz
allgemein wird durch das PLT1-Verfahren zum ersten Mal dargelegt,
dass ein automatisiertes System, z. B. das H·-System, zu gleichzeitigen
Bestimmungen und Analysen von Plättchen
und von roten Blutzellen in einem üblichen optischen System konfiguiert
werden kann, und zwar gemäß der neuen
Methodologie der Erfindung, ohne die Genauigkeit und Präzision von
einer der Bestimmungen zu opfern. Die separaten Mie-Theorie-Analysen
von Plättchen
und roten Blutzellen können
an Signalen durchgeführt
werden, die gemäß der Erfindung
von einem Einzelpaar optischer Detektoren gesammelt werden, weil
die Plättchen
in einer Vollblutprobe unter den Signalvergrößerungsbedingungen und mit
Mie-Theorie-Tabellen
analysiert werden können,
die für
den Plättchen-Zelltyp
im PLT1-System und
-Verfahren besonders geeignet sind, während die roten Blutzellen
in der Vollblutprobe unter Vergrößerungsbedingungen
und mit Mie-Streu-Tabellen
analysiert werden, die für
rote Blutzellen geeignet sind.
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Nur
das PLT1-Verfahren und -System der Erfindung ergibt automatisierte
Messungen der mittleren Plättchen-Trockenmasse
(MPM), sei es auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis
oder als Probendurchschnittswert. Im Prinzip, kann die MPM (aber
nicht die Zelle-zu-Zelle-Trockenmesse oder ihre Verteilung) aus
Messungen der mittleren Plättchenkomponenten-Konzentration,
des MPV und des %-Plättchen-Wassers
wie folgt bestimmt werden:
MPM (pg) = mittlere Gesamt-Plättchenmasse
(pg) × (100 – % Wasser)/100,
worin gilt:
Mittlere Gesamt-Plättchenmasse (pg) = mittlere
Plättchendichte
(g/mL pg/fL) × MPV
(fL).
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Allerdings
machen diesen Bestimmungen sowohl Plättchen-Dichtemessungen (D. G. Penington et
al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L. Corash et al., 1977,
Blood, 99 (1): 71–85;
C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519; und
L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) als auch %-Wasser-Messungen
erforderlich (F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. and Clin. Med.,
70: 938–950);
diese Messungen sind langwierig, Zeit-aufwendig und ungeeignet zur Automatisierung
mit hohem Durchsatz.
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Durchschnitts-MPM-Werte,
die mit den PLT1-Systemen und Verfahren bestimmt wurden, können mit indirekten
Schätzwerten
auf der Basis eingeführter
Durchschnittswerte für
die Plättchendichte,
das MPV und das %-Plättchen-Wasser verglichen
werden. Es herrscht ganz allgemein im Stand der Technik Übereinstimmung,
dass für
Plättchen,
die in ACD antikoaguliert und an Stractan-Gradienten getrennt wurden,
die mittlere Plättchendichte
annähernd
1,065 g/mL (D. G. Penington et al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L.
Corash et al., 1977, Blood, 99 (1): 71–85; C. B. Thompson et al.,
1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519;
und L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) und MPV annähernd 6,5
fL betragen (E. A. Trowbrdige et al., 1985, Clin. Phys. Physiol.
Meas., 6 (3): 221–238;
L. Corash et al., 1977, Blood, 49 (1): 71–85; C. B. Thompson et al.,
1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519).
Allerdings beruhrt der aus dem Stand der Technik abgeleitete MPV-Wert
auf Öffnung-Impedanzmessungen,
die mit Vorrichtungen durchgeführt
wurden, die mit kugelförmigen
Polystyrol-Perlen geeicht werden. Daher sind die MPV-Schätzwerte
für die
nicht in die Kugelform überführten ADC-Plättchen routinemäßig niedrig
(N. B. Grover et al., 1969, Biophys. J., 9: 1398; J. Hurley, 1974,
Biophys. J., 10: 74). Alle anderen Dinge sind gleich, Öffnung-Impedanz-Messungen
an K3EDTA-Plättchen (d. h. an in die Kugelform überführten Plättchen)
sind genauer. Diese Typen von Messungen ergeben MPV-Werte von annähernd 8,5
fL für
frische (ca. 1 h alte) Proben (E. A. Trowbridge et al., 1985, Clin.
Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238).
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Es
gibt Widersprüche
bei den Fachleuten, und zwar dahingehend, ob K3EDTA
Plättchen
quillt und außerdem diese in die Kugelform überführt (siehe z. B. S. Holme und
S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480–493; E. A. Trowbrdige et al.,
1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; G. V. R. Born, 1970,
J. Physiol., 209: 487–511;
G. V. R. Born et al., 1978, J. Physiol., 280: 193–212). Es
ist berichtet worden, dass Dichtegradient-Messungen von K3EDTA-Plättchen
eine mittlere Dichte von 1,060 g/mL ergaben (H. H. K. Watson und
C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117–124). Ein Vergleich dieser
Werte mit dem Wert von 1,065 g/mL für ACD-Plättchen legt es nahe, dass K3EDTA die Plättchen um ca. 8% quellen lässt. Auf
dieser Basis gilt, dass das MPV für „ungequollene" Plättchen =
7,8 fL (das in vernünftiger
Weise gut mit veröffentlichten Werten
auf Basis von Thrombokrit-Messungen (S. Krpatkin und A. Charmatz,
1969, J. Clin. Invest., 48: 1073–1082) und mit visueller Mikroskopie übereinstimmt
(M. Frojmovic und R. Panjwani, 1976, Biophys., J., 16: 1071–1089)).
Mit 7,8 bis 8,5 fL als der MPV-Bereich beträgt der mittlere Gesamt-Plättchenmassebereich 8,31
bis 9,05 pg. Schätzwerte
des %-Plättchen-Wassergehalts
liegen im Bereich von 74,6 bis 77% (F. Gorstein et al., 1967, J.
Lab. Clin. Med., 70: 938–950;
S. Karpatkin, „Composition
of platelets", In:
Hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178).
Dies ergibt einen MPM-Bereich von 1,91 bis 2,30 pg. Der mit PLT1
erhaltene Mittelwert von 2,02 pg liegt innerhalb dieses Bereichs.
Im Gegensatz dazu, liegt der höchste veröffentlichte
MPM-Wert, nämlich
die 2,8 pg, (S. Karpatkin, „Composition
of Platelets", In:
hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178) weit
außerhalb
dieses Bereichs. Außerdem
ist dieser Wert aus physikalischen Gründen unwahrscheinlich, da er
einem Komponenten-Konzentrationsbereich von 32,9 bis 35,9 g/dL gleichkommt,
der mit dem Bereich der roten Zellkomponenten-Konzentration – 35 bis
38 g/dL – für MCHC =
32 bis 35 g/dL überlappt
(J. W. Harris und R. W. Kellermeyxer, 1972, In The Red Cell, 2.
Ausgabe, Harvard University Press, S. 282). Demzufolge sollten Plättchen durchschnittlicher
Dichte innerhalb der Fraktion mit niedriger Dichte normaler roter
Bluttzellpopulationen vorgefunden werden. Allerdings ist dies nicht
der Fall, wie es durch übliche
Praxis belegt ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind Messungen der Plättchen-Aktivität, wie sie
durch das Verfahren und System der Erfindung angegeben und zur Verfügung gestellt
werden, klinisch nützlich.
Derzeit gelangen laufend Fluoreszenz-Fließzytometrie (G. I. Johnston
et al., 1987, Blood, 69 (5): 1401–1403; J. N. George et al.,
1986, J. Clin. Invest., 78: 340–398),
Plättchen-Dichtemessungen
(D. G. Pennington et al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L.
Corash et al. 1977, Blood, 49 (1): 71–85; A. J. Friedhoff et al.,
1978, Blood, 51 (2): 317–323;
C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519: L.
Corash et al., 1984, Blood, 69 (1): 185–193) und MPV-Bestimmungen (C.
B. Thompson et al., 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 205–213) zur
Voraussage einer Plättchen-Aktivität zur Anwendung.
Wie oben bereits erwähnt,
ist das erste dieser Verfahren, die Fluoreszenz-Fließzytometrie,
umständlich,
Zeit-aufwendig und teuer. Das zweite Verfahren, die Dichtemessung
von Plättchen,
ist ebenfalls indirekt. Das dritte Verfahren, die MPV-Bestimmung, ist indirekt
und wird durch die Sammel- und Aufbewahrungsbedingungen beeinflusst.
Daher ist ein einfaches, schnelles, preiswertes und robustes Verfahren
zur Voraussage einer Plättchen-Aktivität im Stand
der Technik erwünscht.
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Die
potentielle Plättchen-Aktivität steigt
zusammen mit der Anzahl und Messe von α- und Dicht-Kernen an (L. Corash
et al., 1977, Blood, 49 (1): 71–85;
und L. Corash et al., 1984, Blood, 69 (1): 185–193). Da die Plättchen-Trockenmasse
mit dem Gehalt von Kernen korreliert (ibid.) steigt die potentielle
Plättchen-Aktivität mit MPM
an. Daher wird durch eine Ausführungsform
des PLT1-Verfahrens der Erfindung ein einfaches, genaues und preiswertes
Verfahren zur Voraussage einer Plättchen-Aktivität angegeben
und zur Verfügung
gestellt. Ferner ist MPM ein robuster Parameter, da er sich nur
wenig in Proben verändert,
die bis zu ca. 24 h lang vor Durchführung der Analyse, sogar bei
Raumtemperatur, aufbewahrt worden sind. Außerdem verhält sich MPM im Zeitablauf vorhersagbar,
bezogen auf die Korrelationskoeffizienten (siehe Tabelle 1). In
Tabelle 1 sind MPM- und MPC-Bestimmungen
normaler Blutspenderproben gegen die Zeit und Temperatur (8 h gegen
1 h bei Raumtemperatur (RT); 24 h gegen 1 h bei RT; 8 h bei RT gegen
8 h bei 4°C;
und 24 h bei RT gegen 24 h bei 4°C)
dargestellt, welche mit dem PLT1-System und -Verfahren durchgeführt wurden.
In den relevanten Tabellen, die unten angegeben sind, gilt: "r" ist der Korrelationskoeffizient; "Syx" ist der Standardfehler
des Schätzwertes; "Xmittel" ist der Mittelwert
für die
unabhängige
Variable; und "Ymittel" ist der Mittelwert
für die abhängige Variable.
Somit sind sogar noch präzisere
MPM-Werte als für
frische Proben aus gealterten oder gelagerten Proben durch Extrapolation,
bei gegebenem in vitro-Probenalter und gegebener Lagerungstemperatur,
erhältlich.
Beispielsweise würde,
bei einer gegebenen Absinkrate um 4% pro 24 h bei Raumtemperatur und
einer MPM von 2,00 pg bei 24 h, die MPM der frischen Probe 2,08
pg betragen. Es ist beachtenswert, dass das PLT1-System im wesentlichen
die gleichen MPM-Werte für
ACD- und für
K3EDTA-antikoagulierte
Blutproben angibt (Tabelle 2 und 5A und 5B).
Dies ist im Lichte der Tatsache überraschend,
dass Plättchen in
ACD nicht, in K3EDTA aber zu Kugeln gebildet
werden. Daher ist das PLT1-Verfahren der Erfindung vielseitig und
liefert genaue und zuverlässige
MPM-Ergebnisse für
die Analyse von Plättchen,
die in beiden Typen von Antikoagulanzien suspendiert sind.
-
Tabelle
1
Normalspender: mittlere PLT-Trockenmasse (MPM)
Genauigkeitsdaten
-
MPC
steht in linearer Beziehung zum Plättchen-Brechungsindex, der
seinerseits in linearer Beziehung zur Plättchendichte steht. Die Ergebnisse
des unten angegebenen Beispiels 4, worin MPC-Werte, die gemäß den Verfahren
der Erfindung erhalten wurden, mit Fluoreszenz-Fließzytometriedaten
für die
Dosisreaktion von Normalplättchen
auf den Plättchen-Agonist
Thrombin verglichen wurden, belegen, dass die MPC-Werte mit dem
PLT-Aktivierungszustand korrelieren (14A bis 14D). Ganz deutlich, ist das Verfahren der Erfindung
zur Untersuchung der PLT-Aktivierung preiswert, rasch und sehr einfach
anzuwenden. Außerdem
ist die Datenanalyse ganz leicht automatisiert durchzuführen. Darüber hinaus
ist die Information, die durch Anwendung des Verfahrens der Erfindung
erhältlich
ist, im wesentlichen einheitlich von dem einen Gerät zu einem anderen
Gerät,
falls und wenn unterschiedliche Geräte zur Durchführung des
Verfahrens angewandt werden.
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Das
Verfahren eignet sich ganz besonders zur Analyse von Blutproben,
die in Natriumzitrat oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
vorzugsweise in K3EDTA, antikoaguliert worden
sind. Wie die Fachleute wissen, können Lösungen von Natriumzitrat oder
K3EDTA mit einer Blutprobe vermischt oder
Natriumzitrat oder K3EDTA können in
trockener Form (d. h. als Pulver) in der Blutprobe zur Verwendung
als Antikoagulans aufgelöst
werden. Als beispielhafte Richtlinie werden ca. 7 bis 14 mg K3EDTA in Pulverform pro 7 cc-Röhrchen verwendet. Natriumzitrat
wird routinemäßig als
Lösung
mit 2,0 bis 5 g/dL und vorzugsweise mit 3,2 bis 3,8 g/dL pro Röhrchen und
in einem endgültigen
Verhältnis
von 1 Teilen Natriumzitrat und 9 Teilen Vollblut verwendet. Wie
die Fachleute ferner wissen, ist K3EDTA
bei weitem das am üblichsten
verwendete Antikoagulans für
automatisierte Hämatologie-Analysen.
In vorteilhafter Weise stellt diesbezüglich die vorliegende Erfindung
eine wertvolle Alternative zu den vorherigen Verfahren zur Mischung
von Plättchen
und aktivierten Plättchen
unter Verwendung von Antikörpern
dar, bei denen EDTA-enthaltende Lösungen nicht angewandt werden
können, und
zwar wegen der nachteiligen Wirkung solcher Lösungen auf die Unversehrtheit
epitopischer Bindungsstellungen zwischen Antikörpern und auf die Molekularstrukturen,
an die sie gebunden werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung beruht darauf, dass ein Verfahren und automatisiertes System
zur Bewertung der Beziehung zwischen MPM-Werten und Krankheitszuständen und/oder
Krankheitsbehandlungsregimen angegeben und zur Verfügung gestellt
werden (siehe Beispiel 2). Durch die Erfindung wird ein praktikables
Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von z. B. Chemotherapie- oder
Strahlungsbehandlungen auf den Gehalt von Plättchenkernen eines Patienten
durch Messung von MPM angegeben und zur Verfügung gestellt. Derzeit wird
davon ausgegangen, dass Thrombozytopenie, die mit einer peripheralen Zerstörung von
Plättchen
zusammenhängt,
im Ergebnis zu Plättchen
führt,
die größer als
normal sind, während
die gleiche Bedingung wegen verringerter Thrombopoiesis im Ergebnis
zu Plättchen
mit normaler Größe oder
zu kleinen Plättchen
führt (J.
D. Bessman et al., 1982, Am. J. Clin. Pathol., 78: 150–153; R.
B. Nelson und D. Kehl, 1981, Cancer, 48: 954–956). Ferner wird eine erhöhte Plättchengröße mit Herzinfarkt
in Zusammenhang gebracht (A. Eldor et al., 1982, Br. Med. J., 285:
397–900;
H. A. Cameron et al., 1983, Br. Med. J., 287: 449–451; J.
F. Martin et al., 1983, Br. Med. J., 287: 986–488). Im Hinblick auf die
Korrelation zwischen dem MPV und der Plättchen-Trockenmasse (L. Corash
et al., 1977, Blood, 99 (1): 71–85,
und L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) würde man bei einem hohen MPM-Wert
erwarten, dass dieser mit destruktiver Thrombozytopenie zusammenhängt, und
bei einem niedrigen MPM-Wert würde
man erwarten, dass dieser mit verringerter Thrombopoiesis zusammenhängt. Außerdem stellt
eine hohe MPM wahrscheinlich eine Voraussage für ein thrombotisches Potential
dar.
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Tabelle
2
PLT1-System-MPM-Werte (pg), Wirkung antikoagulanter Normalspender:
(1 h-Proben; RT)
-
Die
folgenden Beispiele dienen der Verdeutlichung der Erfindung. Sie
sind zur weiteren Erleichterung des Verständnisses der erfinderischen
Konzepte angegeben und sollen in keiner Weise dahingehend interpretiert
werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
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Dieses
Beispiel beschreibt das Leistungsvermögen des Hochgewinnungs-PLT1-Kanals und des
Plättchen-Analysenverfahrens
der Erfindung gemäß Test an
ca. 75 Normalblutproben (erhalten von Bayer Corporation-Spendern).
Für Bezugsvergleiche
des PLT1-Verfahrens und -Systems der Erfindung mit Systemen und Verfahren
des Standes der Technik wurden Blutplättchenproben mit dem automatisierten
TECHNICON H·2-Analysiergerät, dem Coulter
STKS-Analysiergerät und dem
verbesserten, genaueren PLT1-System analysiert. Zum visuellen Bezug
wurden Glasbilder gefärbter
Blutverschmierungen für
jede Probe ebenfalls zubereitet und hergestellt. Plättchen-Zählwerte,
MPV-Werte und RBC-Zählwerte
wurden unter den oben aufgezählten
Analysenarten verglichen. Daten wurden auch für zwei Parameter, die für eine automatisierte
Me thodologie neu sind, gesammelt und in den Stand der Technik durch
das PLT1-System
und -Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeführt, nämlich für die mittlere Plättchen-Trockenmasse
(MPM) und die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration
(MPC).
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Alle
Proben wurden in evakuierten Behältern
gesammelt, die K3EDTA enthielten. Die Proben
wurden nach 1 h Lagerung bei Raumtemperatur, nach 8 h Lagerung sowohl
bei Raumtemperatur als auch bei 4°C
und nach 24 h Lagerung bei Raumtemperatur und bei 4°C analysiert.
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Zur
Durchführung
der Plättchen-Analysen
mit den TECHNICON H·2-
und den Coulter STKS-Systemen wurden die Systeme gemäß den Anweisungen
der Hersteller standardisiert und geeicht. Alle Proben wurden in
Duplikaten durchgeführt
und analysiert. Außerdem
wurden Proben am PLT1-Testsystem, das, wie hierin oben beschrieben,
standardisiert und geeicht wurde, in Duplikaten durchgeführt und
analysiert.
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Film-Glasbilder
von Blut-Verschmierungen wurden in Duplikaten für alle Proben zubereitet. Wright-Giemsa-Färbung wurde
dann an den Glasbildern mittels des im Handel erhältlichen
Hema-Tek 2000-Slide Stainer (Bayer Corporation) durchgeführt. Die
Glasbilder wurden zur Plättchen-Zählung und
zum relativen Größenbezug
aufbewahrt.
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Die
Ergebnisse der Normalblutanalyse und der PLT-Zähl-Vergleichsgenauigkeitsdaten sind in
Tabelle 3 angegeben; MPV-Vergleichsgenauigkeitsdaten
sind in Tabelle 4 angegeben; RBC-Zählwert-Vergleichsgenauigkeitsdaten sind in
Tabelle 5 angegeben; und MPM- und MPC-Genauigkeitsdaten sind in Tabelle 1
angegeben.
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-
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PLT-Zählwerte:
Die Plättchen-Zählwerte,
erhalten aus dem PLT1-Verfahren
der Erfindung, stimmten gut mit den Zählwerten aus den H·Ô2- und
den STKS-Systemen überein,
die beide weithin anerkannte Plättchen-Zählvorrichtungen aufweisen.
Es sei angemerkt, dass kein Plättchen-Zähl-Eichfaktor in dem
PLT1-Verfahren angewandt wurde, während die Eichfaktoren für H·Ô2 und STKS
0,85 bzw. 1,02 betrugen. Dies legt es nahe, dass die geläufige H·Ô2-System-Technologie
signifikante Anzahlen von Nicht-Plättchen in ihrem Plättchen-Rohzählwert einschließt.
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MPV:
Kein geläufiges
Verfahren zur MPV-Messung wird als Standard im Stand der Technik
erachtet. Daher betreffen Vergleiche unter den Verfahren das qualitative
Verhalten der Plättchen. 4 zeigt
ein typisches Normalproben-Plättchenvolumen-Histogramm
für das
PLT1-Verfahren. Es stellt eine log-normale Verteilung der Plättchenvolumina
dar, in Übereinstimmung
mit veröffentlichten
Ergebnissen (J. M. Paulus, 1975, Blood, 46 (3): 321–336). Typische
Plättchenvolumen-Verteilungen
für die
H·Ô2- und
STKS-Systeme sind ebenfalls log-normal.
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Für Normalproben
zeigten die MPV-Werte, erhalten mit dem PLT1-System der Erfindung
und dem Vergleichs-Coulter STKS-System, bei beiden an, dass das
MPV mit der Lagerungszeit ansteigt, wogegen die mit dem TECHNICON
H·2-System erhaltenen
Werte ein Absinken anzeigten (siehe Tabelle 4). Dieses Muster für H·2 gegenüber STKS
und PLT1 stimmte mit dem Muster überein,
das mit dem TECHNICON H6000-System gegenüber dem Coulter S+-System erhalten
wurde, wie dies von Trowbridge et al. angegeben wird (E. A. Trowbridge
et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–2382).
Wie in dem Papier von Trowbridge et al. berichtet, ist in dem TECHNICON
H6000-System (sowie im TECHNICON H·2-System) das Plättchenvolumen proportional
zur Hochwinkel-Streuungsintensität (5 bis
15 Grad im H6000TM und 5 bis 15 Grad im
H·2-System). Die Mie-Streu-Theorie
zeigt, dass die Streuung in diese Winkel gegenüber dem Brechungsindex empfindlich ist,
wie dies oben in der detaillierten Beschreibung der Erfindung bereits
erläutert
wurde. Da Plättchen
ex vivo altern, quellen sie und werden wegen der Wasser-Aufnahme
weniger brechend (S. Holme und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med.,
96: 480–493).
Diese Quellung verringert deren Hochwinkel-Streuungsintensität, wodurch
verursacht wird, dass die H6000Ô-
und die H·2-Systeme
ein abgesenktes MPV angeben, obwohl das MPV tatsächlich angestiegen ist. Allerdings
ist, gemäß Messungen
mit dem Coulter S+-System und dem Coulter STKS-System und mit weiteren Öffnung-Impedanzvorrichtungen,
das Plättchenvolumen
proportional zur elektrischen Impedanz. Daher gaben diese letzteren
Systeme ein gestiegenes MPV wegen Quellung korrekt an, da die Impedanz
in dem Maße
ansteigt, wie die Zellen quellen. Weil mit dem PLT1-System der Erfindung Nieder-
und Hochwinkel-Streuungssignale in Volumina und Brechungsindizes
mit der Mie-Streu-Theorie
umgerechnet werden, wie hierin oben bereits beschrieben, geben das
PLT1-System und -Verfahren das gestiegene MPV wegen Quellung ebenfalls
korrekt an.
-
RBC-Zählwerte:
RBC-Zählwerte,
die mit dem PLT1-System der Erfindung bestimmt wurden, stimmten gut
mit den RBC-Zählwerten überein,
die mit TECHNICON H·2-System
und dem Coulter STKS-System ermittelt wurden, die beide anerkannte
und akzeptierte RBC-Zählvorrichtungen
aufweisen.
-
MPM: 4 zeigt
ein typisches und repräsentatives
PLT1-Plättchen-Trockenmasse-Histogramm
und zeigt an, dass die Plättchen-Trockenmasse
innerhalb einer Probe log-normal verteilt ist. Dies stimmt mit den Ergebnissen
elektronenmikroskopischer Untersuchungen (G. F. Bahr und E. Zeitler,
1965, Lab. Invest., 14 (6): 217–239)
und mit Schlussfolgerungen auf Basis von Dichtegradient-Messungen überein (L.
Corash und B. Shafer, 1982, Blood, 60 (1): 166–171). Gemäß PLT1-System-Messungen beträgt ein typischer
MPM-Wert für eine
Normalprobe, die 1 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurde, 2,02
pg. Dieser Wert stimmt ausgezeichnet mit den meisten der veröffentlichten
Werte überein,
die 2,5, 2,8, 2,06, 2,1 bzw. 2,06 pg betragen (G. F. Bahr und E.
Zeitler, 1965, Lab. Invest., 14 (6): 217–2393; F. Gorstein et al.,
1967, J. Lab. Clin. Med., 70: 938–950; S. Karpatkin, 1977, „Composition
pf platelets", In:
Hematology, 2. Ausgabe, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178; T.
C. Bithell, 1993, „Platelets
and megakaryocytes",
In: Wintrobe's Clinical
Hematology, 9. Ausgabe, Band 1, Lea und Febiger, Philadelphia, PA.,
S. 511–529;
und E. E. Woodside und W. Kocholaty, 1960, Blood, 16: 1173–1183).
Der MPM-Wert sank nur geringfügig über 29 h,
d. h. um 3,5%, als die Proben bei Raumtemperatur gelagert wurden,
und um 1,5% ab, als die Proben bei 4°C gelagert wurden (Tabelle 1).
-
MPC: 4 zeigt
ein typisches und repräsentatives
PLT1-Plättchenkomponenten-Konzentration-Histogramm,
das normal-verteilt (d. h., es zeigt eine Normal- oder Gauss-Verteilung)
für frische
Proben ist. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Dichtegradient-Messungen überein (H.
H. K. Watson und C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117–124; J.
F. Martin et al., 1983, Br. J. Hematol., 54: 337–352). Der Durchschnitts-MPC-Wert,
der mit dem PLT1-System für
Proben erhalten wurde, die 1 h lang bei Raumtemperatur gelagert
wurden, betrug 25,6 g/dL. Zum Vergleich dieses Wertes mit veröffentlichten
Werten bezüglich
der %-Feststoffe, ist es notwendig, die Dichten der nicht-wässrigen
Komponenten zu ermitteln. Wie beschrieben, beträgt die relative Plättchen-Zusammensetzung
aus Protein/Lipid/Kohlenhydrat 57/19/8,5, und die jeweiligen Dichte-Werte
für diese
Komponenten betragen 1,33 g/mL, 0,93 g/mL bzw. 1,50 g/mL (R. Barrer
und S. Josph, 1954, "General
Cytochemical Methods",
Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399–423); somit
beträgt
die Durchschnittsdichte der Feststoff-Komponenten 1,26 g/mL. Daher
berechnet sich das Volumen, das von 25,6 g Plättchen-Komponenten in einem dL von Plättchen eingenommen
wird, wie folgt: 25,6 g × (1 mL/1,26
g) = 20,3 mL oder 0,203 dL. Das verbleibende Volumen pro dL (d.
h. für
das Wasser) ist: 1,000 dL – 0,203
dL = 0,797 dL. Bei einer Dichte von 1 g/mL beträgt die Masse dieses Wasservolumen
79,7 g. Daher gilt:
% Feststoffe = (25,6/(79,7 + 25,6)) × 100 =
24,3%. Bringt K3EDTA die Plättchen um
8% zur Quellung, wie oben beschrieben, gilt dann:
% Feststoffe
= 25,8%. Dieser Bereich von 24,3 bis 25,8% liegt nahe am Bereich
veröffentlichter
Werte, nämlich von
23 bis 25,4% (F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:
938–950;
S. Karpatkin, "Composition
of Platelets", In:
Hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178).
-
Die
MPC sank deutlich im Laufe von 24 h ab; sie sank um 14% für Proben,
die bei 4°C
gelagert wurden, und um 22% für
Proben ab, die bei Raumtemperatur gelagert wurden (Tabelle 1). Die
Statistiken für
MPC, gemessen bei verschiedenen Zeiten und Temperaturen, sind in
Tabelle 6 angegeben. Die Daten zeigen, dass bei Raumtemperatur die
MPC-Werte für
bei 1, 8 bzw. 24 h analysierte Proben, innerhalb 1,5 SD, nicht miteinander überlappen.
So kann man mit 87%iger Zuverlässigkeit
durch Messung ihrer MPC ermitteln, dass eine Probe 1, 8 oder 24
h alt ist. Somit können
MPC-Werte angewandt werden, um das in vitro-Probenalter zu verfolgen
und aufzuzeigen. Eine Vielzahl hämatologischer
Parameter, wie MCV, MCHC, HCT und MPV, sind gegenüber dem
Probenalter empfindlich. Als Folge davon können falsche Schlüsse bezüglich Bedingungen
und Zuständen
wie von Makrozytosis, Hypochromie, Anämie und des thrombotischen
Potentials von Plättchen
gezogen werden, falls die Auswirkungen des Probenalters ignoriert
und genaue und zuverlässige
Daten aus gealterten Proben nicht erhalten werden. Daher ist zu
erwarten, dass die Verfolgung und Überwachung des Probenalters
mittels der MPC-Werte mit den Plättchen-Analysen-
und -Zählverfahren
und -System der Erfindung von signifikantem klinischen Wert sind.
-
Beispiel 2
-
Dieses
Beispiel beschreibt das Leistungsvermögen des Zugewinn-PLT-Kanals (PLT1) und
des Plättchen-Analysenverfahrens
der Erfindung, wie getestet an ca. 70 abnormen Blutproben (erhalten
vom Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York). Alle
Proben wiesen Plättchen-Zählwerte
unterhalb 100.00/Tl auf und wurden wie in Beispiel 1 analysiert.
Außerdem
wurden Plättchen-Zählwerte
mit Phasen-Kontrast-Mikroskopie ermittelt, da die Gültigkeit
der automatisierten Plättchen-Zählwerte
zum gegenwärtigen
Zeitpunkt für
alle thrombozytopenischen Proben nicht gut etabliert ist (K. Mayer
et al., 1980, Am. J. Clin. Pathol, 79: 135–150; P. J. Cornbleet und S.
Kessinger, 1985, Am. J. Clin. Pathol., 83: 78–80). Die Proben wurden an die
Bayer Corporation ca. 4 h, nachdem sie gesammelt wurden, geliefert,
und sie wurden bei Raumtemperatur bei ihrer Ankunft analysiert.
Die Proben wurden erneut nach 28 h Lagerung bei Raumtemperatur analysiert. Die
Ergebnisse sind unten und in Tabelle 7 und 12 angegeben.
-
PLT-Zählwerte:
Die Plättchen-Zählwerte,
erhalten mit dem PLT1-System und -Verfahren der Erfindung, stimmten
mit den Plättchen-Zählwerten
gut überein,
die mit Phasen-Kontrast-Mikroskopie für 4 h lang bei Raumtemperatur
gelagerte Proben erhalten wurden. Die PLT1-Plättchen-Zählwerte stimmten auch mit den TECHNICON
H·2-System-Zählwerten
und den Coulter STKS-System- Zählwerten überein,
mit beachtenswerten Ausnahmen, von denen eine im nachfolgenden Beispiel
3 weiter beschrieben ist.
-
MPV:
Für abnorme
Proben stimmten die TECHNICON H·-System- und Coulter STKS-System-Ergebnisse
besser miteinander als mit den mit PLT1 erhaltenen Ergebnissen überein,
wenn auch das Gegenteil für Normalproben
zutraf. Der Grund dafür
wird klar, wenn repräsentative
Plättchenvolumen-Histogramme
verglichen werden. 8 zeigt, dass die
mit dem TECHNICON H·2-
und dem Coulter STKS-System erstellten Plättchenvolumen-Histogramme interferierende
Partikel in Niederkanälen
einschlossen. Diese Partikel verzerrten die log-normalen Plättchenvolumen-Verteilungen
und verursachten, dass die Systeme die MPV-Werte zu niedrig angaben.
Im Gegensatz dazu, schloss das PLT1-Verfahren der Erfindung die meisten
dieser Typen interferierender Partikel aus, wie dies durch dessen
log-normale Plättchenvolumen-Verteilung
angezeigt wird. Daher gab PLT1 höhere
MPV-Werte als die anderen Systeme an. Außerdem zeigen 9A bis 9D,
dass, gemäß den H·Ô2- und
Coulter STKS-System-Messungen,
MPV direkt auf den PLT-Zählwert
bezogen ist (bis zu 20.000/Tl), während 10A und 10B zeigen, dass, gemäß PLT1-Messungen, das MPV und
der PLT-Zählwert
in umgekehrter Beziehung zueinander stehen. Darüber hinaus sind, gemäß den Literaturangaben,
das MPV und die PLT-Zählwerte
umgekehrt zueinander bezogen für
Normalproben und für
die meisten thrombozytopenischen Proben (J. D. Bessman et al., 1982,
Am. J. Clin. Path., 78: 150–153;
J. Levin und J. D. Bessman, 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295–307; J.
D. Bessman et al., 1981, Am. J. Clin. Path., 76: 289–293; C.
Giles, 1981, Br. J. Hematol., 48: 31–37). Somit stehen die Literaturberichte
in Übereinstimmung
mit den vom PLT1-System der Erfindung erzeugten Ergebnissen. Auch
mikroskopische Relativ-Größenmessungen
an gefärbten
Blut-Glasbild-Filmen
zeigten, dass die TCP-Proben relativ mehr große Plättchen als die Normalproben enthielten.
Für Normalproben
zeigten alle drei Systeme, dass das MPV und die PLT-Zählwerte
in umgekehrter Beziehung standen (11),
in Übereinstimmung
mit den Ermittlungen, über
die im Stand der Technik berichtet ist.
-
Derzeit
ist das MPV ein weithin ignorierter Parameter in der Plättchen-Analyse,
obwohl es sogar angewandt werden kann, unter verschiedenen hämatologischen
Störungen
zu unterscheiden (J. Zeigler et al., 1978, Blood, 51 (3): 979–486; M.
Kraytman, 1973, Blood, 41 (4): 587–597; J. D. Bessman et al.,
1982, Am. J. Clin. Path, 78: 150–153; J. Levin and J. D. Bessman,
1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295–307; C. Giles, 1981, Br. J.
Hematol., 48: 31–37;
A. Eldor et al., Br. Med. Journal, 1982, 285: 397–400; H.
A. Cameron et al., Br. Med. Jorunal, 1982, 285: 397–400; H.
A. Cameron et al., Br. Med. Journal, 1983, 287: 449–451; J.
F. Martin et al., Br. Med. Journal, 1983, 287: 486–488; G.
A. Threatte, Clin. Lab. Med., 1993, 13 (4): 937–950). Der Grund, warum MPV-Werte
keine Beachtung im Stand der Technik finden, beruht darauf, dass,
vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung, MPV-Werte als unzuverlässig (E.
A. Trowbridge et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; G.
A. Threatte et al., 1984, Am. J. Clin. Path., 81: 769–772) aus
den folgenden möglichen
Gründen
angesehen wurden:
- 1) Signifikante Unterschiede
wegen der Blutproben-Lagerungsbedingungen
werden häufig
für MPV-Werte zwischen
dem herkömmlichen
TECHNICON H·-System
und Öffnung-Impedanzgeräten erhalten
(E. A. Trowbrdige et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3):
221–238;
G. A. Threatte, 1993, Clin. Lab. Med., 13 (4): 937–950; U.
Lippi et al., 1987, Am. J. Clin. Pathol., 87: 391–393);
- 2) weder die herkömmlichen
H·Ô2-Systeme
noch die Öffnung-Impedanzvorrichtungen
geben genaue MPVs für
thrombozytopenische Proben an, wie oben dargelegt; und
- 3) MPV ist empfindlich gegen Sammel- und Lagerungsbedingungen
(C. B. Thompson et al., 1983, Am. J. Clin. Path., 80: 327–332; S.
Murphy und F. H. Gardner, 1971, J. Clin. Invest., 50: 370–377; B.
S. Full und M. B. Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 120:
296–301;
J. G. White und W. Krivit, 1967, Blood, 30 (5): 625–635).
-
Im
Gegensatz dazu, sind die mit PLT1 gemäß der vorliegenden Erfindung
erhaltenen MPV-Ergebnisse aus den folgenden Gründen gültig:
- 1)
Die qualitative und quantitative Übereinstimmung zwischen Ergebnissen,
die für
unter verschiedenen Bedingungen gelagerten Normalproben mit unabhängigen Verfahren,
nämlich
mit PLT1 und Öffnung-Impedanz,
erhalten werden, legen sowohl die PLT1- als auch die Öffnung-Impedanz-MPV-Messungen
auf eine solidere Grundlage;
- 2) PLT1-MPV-Ergebnisse für
thrombozytopenische Proben stimmen qualitativ mit angegebenen Literatur-Ergebnissen
unter einer Vielfalt von Bedingungen überein; und
- 3) PLT1 überwacht
und zeigt die Auswirkung einer Probenalterung auf das MPV durch
Messung der MPC auf, wie dies hierin oben bereits diskutiert wurde.
-
-
RBC-Zählwerte:
Die PLT1-System-Ergebnisse stimmten gut mit den Ergebnissen überein,
die sowohl aus dem TECHNICON H·2-
als auch dem Coulter STKS-Analysenmodus erhalten wurden.
-
MPM:
Die Plättchen-Trockenmasse
war für
Krankenhaus-Proben log-normal verteilt, und diese Verteilung war
sogar für
Proben erkennbar, die so wenige wie 150 rohe Plättchen-Signale zur Analyse
ergaben (8). Für Krankenhaus-Proben, die 9
h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden, betrug der typische MPM-Wert
2,09 pg, der effektiv gleich dem Wert war, der für 1 h lang bei Raumtemperatur
gelagerte Normalproben erhalten wurde. Somit zeigte, mit dem PLT1-System
der Erfindung, MPM die gleiche Zeitstabilität für sowohl Krankenhaus- als auch
Normalproben.
-
In 7 sind Diagramme dargestellt, in denen
MPM-Werte für
Normalproben unter verschiedenen Zeit- und Temperaturbedingungen
(Y-Achse) gegen MPM für
1 h lang bei Raumtemperatur gelagerte Proben (X-Achse) aufgetragen
sind. Einzelne Cluster von zentrierten MPM-Werten zeigen sich bei
2 pg (den Mittelwerten für
Normalproben). 8 gibt das entsprechende
Diagramm für
den abnormen Probensatz wieder und zeigt das Vorliegen von 2 Clustern
an – einer
ist bei 2,0 pg und einer ist bei 2,3 pg zentriert. Die unterschiedlichen
Cluster betreffen wahrscheinlich Unterschiede bei der potentiellen
thrombotischen Aktivität.
Der höhere MPM-Wert
für die
Krankenhaus-Proben, d. h. die abnormen Proben, zeigt an, dass die
Plättchen
in diesen abnormen Proben mehr potentielle Aktivität als diejenigen
in Normalproben aufweisen. Wie hierin oben beschrieben, ergeben
das Plättchen-Analysenverfahren
der Erfindung und die daraus erhaltenen MPM-Werte ein Mittel zur
Bewertung der Beziehung zwischen hohen MPM-Werten und Krankheitszuständen und/oder
Krankheitsbehandlungsregimen.
-
MPC:
Abnorme Proben, die 4 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden,
wiesen einen typischen MPC-Wert von 22,1 g/dL auf (Tabelle 6), welcher
um 0,7 g/dL unter dem Wert lag, der für Normalproben bestimmt wurde,
die 8 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden. Die mit PLT1 erhaltenen
MPC-Werte zeigten die
gleiche Zeit-Abhängigkeit
für Krankenhaus-Proben
wie für
Normalproben.
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Beispiel 3
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Obwohl
die meisten der in Beispiel 2 beschriebenen abnormen Proben ähnliche
Plättchen-Zählwerte unabhängig vom
angewandten Messverfahren erzeugten, erzeugte eine kleine Anzahl
abnormer Proben Ergebnisse, die sich weitgehend in Abhängigkeit
vom Analysenverfahren unterschieden. Eine derartige Probe von einem
thrombozytopenischen Spender wird im vorliegenden Beispiel beschrieben.
In Tabelle 8 sind die Vergleichs-Plättchen-Zähldaten angegeben (die Proben
wurden in Duplikaten auf den automatisierten Systemen durchgeführt), und
in 13 sind die Histogramme dargestellt,
die von jedem der drei automatisierten Verfahren erzeugt wurden.
Wie gezeigt, erzeugte nur das PLT1-System der Erfindung Plättchen-Zählwerte,
die mit den Phasen-Konstrast-Mikroskopie-Zählwerten für beide Duplikat-Messungen übereinstimmten.
Die TECHNICON H·2-Plättchen-Zählwerte
waren annähernd
doppelt so groß wie
die Phasen-Kontrast-Mikroskopie-Zählwerte. Das Coulter STKS-System
gab den Plättchen-Zählwert in
nur einem der Duplikate korrekt an und war eine Leerprobe im anderen
Duplikat. Auch waren die Coulter STKS- und TECHNICON H·2-Volumen-Histogramme
nicht log-normal, weil sie eine Interferenz durch rote Blutzellfragmente
einschlossen. Daher ergaben diese 2 Systeme MPV-Werte, die niedriger
als der tatsächliche
Wert waren, bezogen auf die mikroskopische Betrachtung der Blut-Verschmierung.
Das vom PLT1-Verfahren und -System erzeugte Volumen-Histogramm war
log-normal, und das angegebene MPV lag innerhalb des Bereichs für thrombozytopenische
Proben und stimmte qualitativ mit der mikroskopischen Beobachtung überein.
Ferner war die mit dem PLT1-System ermittelte Plättchenkomponenten-Konzentration
grob normal verteilt, und die Plättchen-Trockenmasse war
log-normal verteilt, was belegt, dass die Partikel, die als Plättchen in
den abnormen Proben mit der vorliegenden Erfindung gezählt wurden,
die physikalischen Charakteristika von Plättchen ebenso aufwiesen.
-
-
Beispiel 4
-
Dieses
Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um die Dosisreaktion
auf eine in vitro-Plättchen-Aktivierung
durch Thrombin zu messen. Für
diese Versuche wurde eine Blutprobe von einem normalen erwachsenen
menschlichen Spender gezogen, der ein Nicht-Raucher war und nicht
unter einer Aspirin-Therapie stand. Die Proben wurden sowohl in
Natriumzitrat als auch in K3EDTA-Antikoagulanzien
gesammelt. Der Vergleich der Ergebnisse, bezogen auf die Verwendung
von Antikoagulanzien, die K3EDTA umfassen,
mit denjenigen unter Verwendung von Natriumzitrat belegt die Nützlichkeit
von K3EDTA für Plättchen-Aktivierungsstudien,
bei denen die neuen Verfahren der Erfindung angewandt werden.
-
Die
Thrombin-induzierte Plättchen-Aktivierung
wurde mit Fluoreszenz-Fließzytometrie-Nachweis
einer erhöhten
Zelloberflächen-Exprimierung
eines I-Kern-Proteins (GMP-140) mit dem Phycoerythrin-konjugierten
monoklonalen Antikörper
CD62-PE gemessen. Die Exprimierung von GMP-140 steht im Zusammenhang
mit einer I-Kern-Freisetzung. Diese Analyse wird durch den Einschluss
des Tetrapeptids Glycyl-L-Prolyl-L-Arginyl-L-Prolin (GPRP) ermöglicht,
beschrieben von Michelson et al. (A. D. Michelson et al., 1991,
Blood, 77: 770–779).
GPRP inhibiert die Plättchen-Aggregation
und Fibrin-Gerinnung
und ermöglicht
daher eine Zelle-zu-Zelle-Analyse.
-
Proben-Zubereitung
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Vollblut
wurde auf 1 : 10 in ergänztem
PBS verdünnt,
um 0,35% Rinderserumalbumin zu enthalten. Anteilsmengen von verdünntem Vollblut
(300 Tl) wurden 5 min lang in der Gegenwart von 2,5 mM GPRP (End-Konzentration)
inkubiert.
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I-Thormbin
wurde zu den Testproben mit End-Konzentrationen von 0,002 U/mL bis
0,087 U/mL gegeben, wie angezeigt in 14A bis D. PBS wurde zu den Vergleichsproben gegeben.
Die Proben wurden 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann
auf 1 : 1 in 1% Paraformaldehyd (in PBS) verdünnt und 30 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Sättigungskonzentrationen
Plättchen-spezifischer
monoklonaler Antikörper,
die gegen den Oberflächen-Rezeptor
GP1bIX (CD42a, FITC-konkugiert und CD62-PE) gerichtet waren, wurden
zu allen mit Fluoreszenz-Fließzytometrie
analysierten Proben gegeben, und die Proben wurden 15 min lang inkubiert.
Diese Stufe wurde für
Proben weggelassen, die mit dem gemäß der Erfindung durchgeführten Verfahren
analysiert wurden. PBS wurde auf eine End-Verdünnung von 1 : 600 vor einer
Analyse der Proben gegeben.
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Proben-Analyse
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Die
Proben wurden mit einem FACScan-Fließzytometer mit einer FACStation-CellQuest-Erfassungs- und
-Analysensoftware (Becton Dickinson, San Jose, CA) mit einem bei
488 nm betriebenen Argonion-Laser analysiert. Die Fluoreszenz von
FITC und Phycoerythrin wurde mit 525 nm bzw. 575 nm Banden-Durchgangsfiltern
nachgewiesen. Die Plättchen
wurden mit ihrem Vorwärtsstreuungs-(Vorwärts-Scatter(FSC)-gegen-Seitenstreuungs-(side
scatter = SSC)-Profil sowie mit ihrer FITC-Positivität (Grün-Fluoreszenz,
FL1) identifiziert. Aktivierte Plättchen wurden mit ihrer PE-Positivität (Rot-Fluoreszenz, FL2),
d. h. FSC vs. FL2, identifiziert.
-
Nach
der Identifikation der Plättchen
mit Licht-Streuungspforten und FITC-Positivität wurde die Bindung des Aktivierungsmarkers
CD62 durch Analyse von 5.000 Plättchen-Vorfällen für die PE-Fluoreszenz
ermittelt. Eine Hintergrund-Bindung, die mit dem isotypischen Antikörper IgG
gemessen wurde, wurde von jeder Probe subtrahiert. Die Ergebnisse
wurden als mittlere Fluoreszenzintensität (FI, willkürliche Einheiten)
für alle Proben
angegeben. FI ist für
einen Vergleich mit MPC geeigneter als die %-Positivität, da weder
FI noch MPC die Festlegung willkürlicher
Schwellenwerte benötigte.
Außerdem
wurden die Proben mit dem Absorption/Licht-Streuverfahren der Erfindung
innerhalb 2 h nach dem Sammeln analysiert.
-
Das
Verfahren der Erfindung und die Fluoreszenz-Fließzytometrie-Methodologie wurden durch Messung der
Plättchen-Aktivierung
gegen zugefügtes
Thrombin verglichen (14A bis 14D).
Die Ergebnisse zeigen, dass das Licht-Streuverfahren der Erfindung
die Thrombindosis-bezogene Plättchen-Aktivierung für Blutproben
gut darstellt und aufzeigt, die sowohl mit Natriumzitrat (offene
Kreise) als auch mit K3EDTA (offene Quadrate)
antikoaguliert sind. Wie ersichtlich, sinkt mit steigenden Konzentrationen
von Thrombin die MPC ab.
-
Beispiel 5
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Dieses
Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um eine in vitro-Plättchen-Autoaktivierung
in K3EDTA zu messen. Für diese Versuche wurde ein
Blutspecimen von einem normalen erwachsenen menschlichen Spender
hinein in K3EDTA-Antikoagulans gezogen.
Die Proben wurden wie für
Beispiel 4 zubereitet und analysiert, aber ohne die Thrombin-Aktivierung
und mit Paraformaldehyd, das mit den angegebenen Mengen zugegeben
wurde. In Tabelle 9 sind die Ergebnisse des Zeitverlaufs der Plättchen-Autoaktivierung
in der Gegenwart von K3EDTA angegeben:
-
-
Tabelle
9 zeigt, dass Plättchen
in Proben, die in EDTA aufbewahrt wurden, eine Autoaktivierung eingehen,
die über
die Zeit ansteigt. Daher müssen
sowohl Fluoreszenz-, als auch Lichtstreuungs-basierte Messungen
der Plättchen-Aktivierung
dem in vitro-Probenalter Rechnung tragen.
-
Beispiel 6
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Dieses
Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um den Aktivierungszustand
von Plättchen
ex vivo zu messen. Für
diese Versuche wurden Blutspecimen von einem normalen menschlichen
Spender und von drei Diabetiker-Spendern gezogen. Die Proben wurden
hinein in K3EDTA-Antikoagulans gezogen. Die Proben wurden
wie im obigen Beispiel 4 zubereitet, mit der Ausnahme, dass weder
Thrombin noch Paraformaldehyd zugegeben wurden. Die Proben wurden
7 h nach dem Sammeln analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen
sind in Tabelle 10 angegeben:
-
-
Tabelle
10 zeigt an, dass sowohl die MPC- als auch die FI-Messungen zwischen
Blutproben, die eine Plättchen-Aktivierung
ex vivo zeigen (Diabetiker 1 und 2), und denjenigen unterscheiden,
die dies nicht tun (Diabetiker 3). Es ist ersichtlich, dass die
FI höher
und die MPC niedriger als erwartet sind, bezogen auf eine Untersuchung
der 14A bis 14D.
Dies legt es nähe,
dass alle drei der Diabetiker-Proben aktiviert sind, aber dass die
dritte Probe weniger aktiviert als die ersten ist. MPC für eine Normalblutprobe
ist ebenfalls eingeschlossen, um zu zeigen, dass sogar für Normalproben
die MPC, die 7 h nach dem Sammeln in EDTA-Lösung gemessen wurde, niedriger
als für
frische Proben ist. ND besagt, dass dieser Wert nicht bestimmt wurde. Der
Grund für
das Absinken beim MPC-Wert und den Anstieg bei FI ist es, dass in
EDTA aufbewahrte Plättchen
im Zeitverlauf fortschreitend autoaktiviert werden, wie dies im
obigen Beispiel 5 gezeigt ist. Dennoch unterscheiden MPC wie auch
FI zwischen Proben, die eine in vivo-Plättchen-Aktivierung erfahren, und denjenigen,
bei denen dies nicht der Fall ist.