DE3781070T2

DE3781070T2 - Durchfluss-zytometrieverfahren zum klassifizieren von leukozyten.

Info

Publication number: DE3781070T2
Application number: DE8787113113T
Authority: DE
Inventors: Tomoyuki Kuroda; Takashi Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-09-08
Publication date: 1993-02-04
Anticipated expiration: 2007-09-09
Also published as: JPS6370166A; US4933293A; EP0259834A3; EP0259834B1; DE3781070D1; JPH06100596B2; EP0259834A2; CA1309326C

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klassifizieren von Leukozyten in der Praxis der klinischen Untersuchung und insbesondere ein Verfahren zum Klassifzieren von Leukozyten mit einem Flufßzytometer mit Hilfe von optischen Messungen bei Blutzellen, die mit Fluorochrom gefärbt sind.
Leukozyten in dem periphären Blut von normalen Subjekten können so klassifiziert werden, daß sie 5 Arten umfassen, die aus Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen bestehen. Verschiedene Leukozytenarten haben unterschiedliche Funktionen und das Zählen von Leukozyten in dem Blut entsprechend ihrer Art verschafft wertvolle Informationen für diagnostische Zwecke. Beispielsweise ist eine Zunahme der Anzahl von Neutrophilen mit solchen Krankheiten wie Entzündungen, Myocardinfarkt und Leukämie verbunden und eine Abnahme deren Zahl ist mit Viruserkrankungen, hypoplastischer Anämie, Agranulozytosis, etc. verbunden. Auf der anderen Seite wird eine Erhöhung der Anzahl von Eosinophilen bei solchen Krankheiten wie Parasitose, Hodgkin's Erkrankungen und Allergose gefunden. Eine erhöhte Anzahl von Monozyten tritt entweder während der Konvaleszenzperiode von Patienten auf, die an Infektkrankheiten leiden oder bei solchen Erkrankungen wie monozytischer Leukämie auf.
Die Klassifizierung und das Zählen von Leukozyten wurden ganz allgemein durch das Differentialzählverfahren durchgeführt, das ebenso als das visuelle Zählverfahren oder einfach als das manuelle Verfahren bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe auf den Glasträger aufgebracht, und die Blutkörperchen in dem Abstrich werden fixiert und für die Untersuchung durch Mikroskop gefärbt. Der Techniker identifiziert die Art der individuellen Leukozyten entsprechend ihrer morphologischen Merkmale (beispiele ihrer Größe, der Morphologie ihrer Kerne und Cytoplasmen, und dem Vorhandensein und der Abwesenheit von Körnern) oder entsprechend dem Grad der Farbstoffaufnahme und führt die Klassifzierung und Zählung davon durch. Bei üblichn Laboratorien werden 100 bis 200 Leukozyten üblicherweise für jede Probe gezählt, und der Prozentsatz der gesamten gezählten Leukozyten, die durch jede Art von Korpusceln besetzt werden, wird als ein gemessener Wert aufgezeichnet.
Das Differentialzählverfahren weist verschiedene Nachteile auf. Zunächst muss eine mikroskopische Beobachtung durch mühselige Vorgehensweisen für die Herstellung einer Probe durchgeführt werden, die solche Schritte umfassen wie Aufstreichen einer Blutprobe auf einen Glasträger, Fixieren der Körperchen und Färben von diesen. Zweitens ist es eine große Last für den Techniker, feine Unterschiede zwischen den Körperchen durch mikroskopische Klassifizierung und Zählung zu identifizieren. Drittens ist es selbst für einen erfahrenen Techniker schwierig, gleichbleibende Zählungen durch das manuelle Verfahren zu erhalten, da neben der kleinen Zahl von gezählten Leukozyten die aufgestrichene Probe häufig eine ungleichmäßige Verteilung der Blutkörperchen aufweist.
Verschiedene Verfahren wurden zur Eliminierung dieser Nachteile des manuellen Verfahrens zur Leukozytenklassifizierung vorgeschlagen, indem eine Automatisierung erreicht wird und derartige automatische Techniken können grob in zwei Typen unterteilt werden. Das erste Verfahren besteht aus dem Aufzeichnen der Bilder der Körperchen mit einer Videokamera oder einiger anderer geeigneter Bildaufzeichnungsgeräte und dem Klassifizieren der Leukozyten mit Hilfe einer Bildverarbeitung auf einem Computer. Das Vorgehensprinzip dieses Verfahens ist ähnlich zu dem des üblichen visuellen Zählverfahrens, aber hauptsächlich auf Grund des Vorhandenseins von vielen Körperchen, die der Klassifizierung durch Verarbeiten mit einem Computer widerstehen, stellt dieses Verfahren noch nicht eine ideale Alternative für das manuelle Verfahren dar. Weiterhin ist dieses Verfahren ökonomisch nicht realisierbar, da es eine anspruchsvolle Ausrüstung erfordert, die groß und teuer ist.
Die andere Annäherung an die automatische Klassifizierung und Zählung von Leukozyten basiert auf einem Flußsystem. Bei diesem Verfahren kann eine Blutprobe, deren Körperchen in einem Verdünnungsmittel suspendiert sind, auf solche Weise fließen, daß die Körperchen individuell (einzeln) durch eine verengte Nachweisfläche geleitet werden und die Leukozytenklassifizierung wird durch Analysieren des Signals durchgeführt, das durch den Detektor erzeugt wird. Dieses zweite Verfahren für die Zählung der Leukozyten, das ein Fließsystem anwendet, wird weiterhin in zwei Kategorien unterteilt.
Bei einem Verfahren der ersten Kategorie kann ein Elektrolyt, worin alle roten Zellen, die vorhanden waren, mit einem Lysiermittel zerstört worden sind, so daß nur Leukozyten suspendiert sind und durch eine Öffnung fließen, und die Änderung der elektrischen Impedanz, die an der Öffnung auftritt, wenn jedes Körperchen dadurch geht,
wird nachgewiesen, wobei die Größe des ermittelten Signals als eine Basis für die Klassifizierung von Leukozyten verwendet wird.
Ein Verfahren der zweiten Kategorie ist gekennzeichnet durch die Verwendung eines Flußzytometers, der eine Lichtquelle, eine Flußzelle, die ermöglicht, daß die Blutzellen in einer Probe einzeln durch einen verengten Kanal fließen, eine photometrische Einheit, die das Licht ermittelt, das aus jeder Blutzelle austritt, und einen Analysator zum Analysieren der ermittelten Signale enthält. Bei diesem Verfahren werden die Körperchen in der Probe, die gefärbt sind, unter Licht erleuchtet und die von den bestrahlten Körperchen emittierte Fluoreszenz wird ermittelt, wahlweise zusammen mit gestreutem Licht, wobei die Leukozytenklassifizierung entsprechend der Intensität der ermittelten Signale durchgeführt wird.
Techniken, die in die Kategorie dieses flußzytometrischen Verfahrens fallen, sind beispielsweise in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 853/1984 und L.A. Kamentsky, Blood Cells, 6, 121 - 140 (1980) beschrieben. Entsprechend diesen Techniken wird eine Blutprobe mit 10 Volumen einer Acridinorange-Lösung gefärbt, eine Minute lang inkubiert und unter einer Lichtquelle, wie einem Argonionenlaser bestrahlt. Die grüne Fluoreszenz und die rote Fluoreszenz, die aus den einzelnen Körperchen emittiert werden, werden gemessen, und die Klassifizierung sowie die Zählung von Leukozyten werden anschließend durchgeführt, basierend auf einer zweidimensionalen Auftragung der Fluoreszenzmessungen.
Andere Beispiele von Techniken, die so eingestuft werden, daß sie zu der flußzytometrischen Annäherung gehören, sind in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 20820/1975, H.M. Shapiro et al., J. Histochem. Cytochem., 24, (1), 396-411, (1976); und ibid, 25 (8), 976-989 (1977) gezeigt. Entsprechend diesen Verfahren wird eine Blutprobe mit vier Volumen einer Farbstofflösung I gefärbt, 3 Minuten lang inkubiert, weiterhin mit 20% Formaldehyd in einem Volumen vermischt, das gleich zu dem Blut ist, 5 Minuten lang fixiert und mit einer verdünnenden Farbstofflösung II verdünnt, unter Erhalt einer Konzentration, die 15 bis 20mal so gering ist wie der Anfangswert. Die so präparierte Probe wird einer Messung mit einem Flußzytometer unterworfen.
Der Flußzytometer, der bei diesem Verfahren angewandt wird, verwendet entweder drei Quecksilberlampen, von denen jede eine andere Wellenlänge an Licht erzeugt, oder drei Laser, um so die drei Fluoreszenzfärbungen in den Farbstofflösungen anzuregen. Die Parameter, die gemessen werden, sind drei Arten von Fluoreszenz, vorwärts gestreutes Licht, 90º gestreutes Licht und absorbiertes Licht. Basierend auf diesen sechs Parametern werden zweidimensionale Auftragungen in vier Stufen durchgeführt und analysiert, um die Leukozytenklassifizierung und Zählung durchzuführen.
Bei der ersten Version des Verfahrens, das ein Flußsystem für die Leukozytenklassifizierung und Zählung anwendet, ist das Zerbrechen von Erythrozyten eine Voraussetzung, aber in Abhängigkeit von einer Blutprobe ist es unmöglich, eine vollständige Lysis von Erythrozyten durchzuführen, und die Genauigkeit der Messungen kann in einem solchen Fall verschlechtert werden.
Die Beispiele der flußzytrometrischen Annäherung, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 853/1984 und in Blood Cells, 6, 121-140 (1980) beschrieben sind, sind durch die Durchführung von Messungen, bevor die Farbstoffabsorption durch die Zellen ein Gleichgewicht erreicht, oder zu der Zeit, wenn der Unterschied zwischen den Intensitäten der Fluoreszenz von individuellen Leukozyten ein Maximum während des Färbeverfahrens erreicht, gekennzeichnet. Jedoch ist die Zeit, die zum Erreichen eines geeigneten Niveaus der Fluoreszenzintensität in einer Probe, deren Leukozytenzählung entweder bei einem von beiden Extremen ist, erforderlich ist, von der Zeit für eine normale Probe unterschiedlich, und eine geeignete Färbezeit muß für jede Probe ausgewählt werden. Ein weiteres Problem besteht darin, daß dieses Verfahren nur auf den unterschiedlichen Intensitäten der Fluoreszenzen für die Leukozytenklassifizierung beruht und nicht notwendigerweise eine genaue Trennung zwischen unterschiedlichen Leukozytenarten wie Lymphozyten und Monozyten sicherstellt.
Die anderen Beispiele der zytometrischen Annäherung, die in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 20820/1975, J. Histochem. Cytochem., 24 (1) 396-411 (1976) und supra, 25 (8) 976-989 (1977) beschrieben sind, weisen den Nachteil auf, daß sie viele Schritte für die Durchführung beinhalten, eine verlängerte Färbezeit beanspruchen und die Verwendung von Reagentien in einem komplexen System erfordern. Weiterhin erfordert die Durchführung dieser Verfahren eine sehr gut entwickelte und teure Anlage, die drei Lichtquellen umfaßt und die in der Lage ist, 6 Parameter zu messen. Zusätzlich ist die Analyse einer solchen großen Anzahl von Parametern zwangsläufig kompliziert und erfordert einen Analysator mit einer großen Kapazität.
Diese Erfindung wurde vollendet, um die oben erwähnten Probleme des Standes der Technik für die Leukozytenklassifizierung und Zählung zu lösen, und gibt ein Verfahren an, das eine genaue Klassifzierung und Zählung von Leukozyten durch einfache Vorgehensweisen ermöglicht.
Das Verfahren dieser Erfindung, das das oben genannte Ziel lösen kann, umfaßt die folgenden Schritte:
(a) Herstellen einer Probe für die Messung durch Zugabe einer frischen Probe von nicht koaguliertem Blut zu einer Farbstofflösung und Stehenlassen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist, wobei die Farbstofflösung aus einem Puffer zum Aufrechterhalten eines pH in dem Bereich von 3,5 bis 10,0, einem anorganischen Salz zum Aufrechterhalten der Osmolarität der Farbstofflösung bei der halben bis zu der zweifachen physiologischen Osmolarität, so daß die Leukozyten in dem Blut nicht exzessiv deformieren, und ein Fluorochrom zum unterschiedlichen Färben der Leukozyten entsprechend ihren zytochemischen Eigenschaften besteht;
(b) Fließenlassen der hergestellten Probe für die Messung durch ein Flußzytometer, Differenzieren der Leukozyten von allen anderen Körperchen durch die Intensität der Fluoreszenz und Messen des Signals des in einem rechten Winkel (rechtwinklig) gestreuten Lichtes und zumindest eines Fluoreszenzsignals, das von den Leukozyten emittiert wird; und
(c) Identifizieren der Art eines jeden der Leukozyten, basierend auf den von diesen emittierten Signalen, Zählen der Anzahl der ermittelten Leukozyten entsprechend ihrer Art und Berechnen der Anteile der individuellen Leukozytentypen.
Von den von den Leukozyten emittierten Signalen reflektiert das rechtwinklig streuende Lichtsignal die strukturelle Information einer individuellen Zelle. Je größer der Kern einer weißen Blutzelle und je mehr Körnchen darin vorhanden sind, umso größer wird die Lichtreflektion in der Zelle auftreten, um ein intensiveres rechtwinklig gestreutes Licht zu produzieren. Ein Lymphozyt enthält sehr wenige oder keine Körnchen, so daß das gestreute Licht, das von den Lymphozyten erzeugt wird, das schwächste von allen Leukozyten ist. Auf der anderen Seite enthält ein Neutrophil viele Körnchen und weist einen großen Kern auf, so daß es das intensive gestreute Licht erzeugt. Die Intensität des gestreuten Lichtes, das Eosinophile erzeugen, ist im wesentlichen gleich zu der des gestreuten Lichtes, das Neutrophile erzeugen. Aus diesen Gründen sind die relativen Intensitäten des rechtwinklig gestreuten Lichtes, das von verschiedenen Typen von Leukozyten emittiert wird, aufgetragen, wie es in Fig. 2 gezeigt ist.
Auf der anderen Seite reflektiert das Fluoreszenzsignal die zytochemischen Charakteristika von Leukozyten und in Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen den Färbungen und den einzelnen Leukozytenarten werden Signale mit verschiedenen Intensitäten von den Leukozyten erzeugt.
Durch Kombination des rechtwinklig gestreuten Lichtsignals mit zumindest einem Fluoreszenzsignal, in Abhängigkeit von dem spezifischen Farbstoff, der verwendet wird, können daher Leukozyten mit einer sehr hohen Auflösung klassifiziert werden.
Aus dem vorhergenannten ist verständlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil aufweist, daß keine umständlichen Vorgänge, einschließlich einer komplizierten Vorbehandlung erforderlich sind und daß die Leukozyten in Blut alleine mit einem Flußzytometer klassifiziert und gezählt werden können, nachdem ein einfaches einstufiges Färbeverfahren durchgeführt worden ist.
Fi.g 1 ist ein schematisches Diagramm der Optik eines Flußzytometers, das bei der Durchführung des erf indungsgemäßen Verfahrens angewandt werden kann;
Fig. 2 ist eine Aufzeichnung, die die relativen Intenstitäten von rechtwinklig gestreutem Licht von 5 unterschiedlichen Arten von Leukozyten zeigt;
Fig. 3(a) bis 3(g) sind zweidimensionale Auftragungen von zwei Signalen, die für die Leukozytenklassifizierung ausgewählt sind; und
Fig. 4 bis 13 sind zweidimensionale Auftragungen, die die Ergebnisse der Leukozytenklassifizierung zeigen, wobei zwei ausgewählte Signale verwendet werden.
Ein spezifisches Beispiel der Optik eines Flußzytometers, das erfindungsgemäß verwendet wird, wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben. Die in Fig. 1 gezeigten optischen Anwendungen werden bei einem Flußzytometer verwendet, der zum Messen von rechtwinklig gestreutem Licht, roter Fluoreszenz und grüner Fluoreszenz bestimmt ist. Die Optik, die allgemein durch 10 angezeigt ist, verwendet einen Argonionenlaser 12 als eine Lichtquelle und dieser arbeitet bei einer Wellenlänge von 488 nm, wobei ein Ausstoß von 10 mW erzeugt wird. Das Licht, das von dem Laser 12 emittiert wird, wird durch eine zylindrische Linse 16 konvertiert und bestrahlt eine Blutgruppe, die durch eine Flußzelle 14 fließt.
Wenn die gefärbten Leukozyten in der Probe durch das Laserlicht bestrahlt werden, erzeugen sie gestreutes Licht und Fluoreszenz. Das rechtwinklig gestreute Licht und die Fluoreszenz werden mit einer Kondensorlinse 18 konvergiert und durch eine Öffnung 20 geleitet, um auf einem dichroitischen Spiegel 22 zu fallen. Der dichroitische Spiegel 22 reflektiert das rechtwinklig gestreute Licht 24 und transmittiert die Fluoreszenz 26. Das rechtwinklig gestreute Licht 24, das von dem dichroitischen Spiegel 22 reflektiert wird, wird in einer Sekundärelektronenverfielfacherröhre 28 bestimmt. Von der Fluoreszenz 26, die durch den dichroitischen Spiegel 22 geht, wird rote Fluoreszenz 32 durch einen dichroitischen Spiegel 30 reflektiert, und die grüne Fluoreszenz 38 wird durch diesen Spiegel transmittiert. Die reflektierte rote Fluoreszenz 32 geht durch einen Farbfilter 34 und wird in einer Sekundärelektrodenvervielfacherröhre 36 erfaßt. Die trasmittierte grüne Fluoreszenz 38 wird durch einen Farbfilter 40 geleitet und in einer Sekundärelektronenverfielfacherröhre 42 nachgewiesen.
Erythrozyten in der Probe für die Messung emittieren nur Fluoreszenz mit sehr geringer Intensität und wenn es nur erforderlich ist, die Intenstität der Fluoreszenz zu messen, beeinflussen die Erythrozyten nicht die Zählung der Leukozyten, selbst wenn ein Zusammentreffen von Erythrozyten und Leukozyten auftritt (d.h. Erythrozyten und Leukozyten gehen gleichzeitig durch den Nachweisbereich durch). Wenn man jedoch das gestreute Licht messen möchte, stören Erythrozyten, die gestreutes Licht erzeugen, das eine Intenstität aufweist, die zu der des gestreuten Lichtes vergleichbar ist, das von Leukozyten emittiert wird, das Zählen der Leukozyten. In diesem Fall kann man Fluoreszenz und gestreutes Licht gleichzeitig messen und als Leukozyten nur die Körperchen ansehen, die Fluoreszenz mit einer Intensität von mehr als einem bestimmten Niveau emittieren. Wenn jedoch das Zusammentreffen von Leukozyten und Erythrozyten auftritt, wird das gestreute Licht von Erythrozyten über das gestreute Licht von Leukozyten gelagert, wodurch eine genaue Messung von gestreutem Licht von den Leukozyten unmöglich gemacht wird. Bei der Optik 10 eines Flußzytometers, der in Fig. 1 gezeigt ist, kann eine Blutprobe durch die Flußzelle 14 fließen, nachdem sie beispielsweise auf das 20fache verdünnt ist, so daß die Möglichkeit des Zusammentreffens von Erythrozyten und Leukozyten vermindert wird und daß die mögliche gegenseitige Beeinflussung durch Erythrozyten auf ein Niveau vermindert wird, das es für praktische Zwecke unberücksichtigt gelassen werden kann.
Um die Reproduzierbarkeit von Daten, die erzeugt werden können, zu verbessern, ist es wünschenswert, nicht weniger als etwa 10000 weiße Blutzellen mit einem Flußzytometer zu zählen.
Die Erfinder haben festgestellt, daß es 17 Fluorochrome von 6 Gruppen gibt, mit denen Leukozyten in zumindest 4 Typen mit Hilfe der Flußzytometrie mit den in Fig. 1 gezeigten optischen Anwendungen klassifiziert werden können. Die Namen, Farbindexnummern und Fluoreszenzcharakteristika dieser Fluorochromfarbstoffe sind unten in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Fluoreszenz Charakteristika Farbstoffgruppe Name Anregungsmaximum (nm) Emissions-Maximum (nm) I. Xanthenfarbstoffe II. Oxacarbocyaninfarbstoffe III. Acridinfarbstoffe IV. Azinfarbstoffe V. Diphenylmethanfarbstoffe VI. Methinfarbstoffe Pyronine Y Rhodamine 3GO Fluorescein Acridine Orange Brilliant Phosphine Rhoduline Orange Euchrysin 3RX Flavophosphine R Coriphosphine O Neutral Red Auramine O Astrazon Orange G *DiOC1(3): 1,1'-Dimethyloxacarbocyanine DiOC2(3): 1,1'-Diethyloxacarbocyanine DiOC3(3): 1,1'-Di-(n-propyl)-oxacarbocyanine DiOC5(3): 1,1'-Di-(n-pentyl)-oxacarbocyanine DiOC6(3): 1,1'-Di-(n-hexyl)-oxacarbocyanine
Die Farbstoffe dieser sechs Gruppen, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, haben die Fähigkeit, die einzelnen Typen von Leukozyten entsprechend ihrer zytochemischen Charaktere differentiell zu färben. Wenn daher die Flußzytometrie durchgeführt wird, wobei einer von diesen Farbstoffen verwendet wird und die Bedingungen der Färbung und Messung und die Parameter für die Messung angemessenerweise ausgewählt werden, kann eine vierteilige Differenzierung von Leukozyten vervollständigt werden, wie es in den Fig. 3a bis 3d gezeigt ist, worin die Bezugsziffern und die Symbole die folgenden Bezeichnungen aufweisen: 1, Lmphozyt; 2, Monozyt; 3, Neutrophil; 4, Eosinophil; 5, Basophil, Seite Sc: Relative Intensität von rechtwinklig gestreutem Licht; Fl: relative Intensität der Fluoreszenz; rote FL: relative Intensität der roten Fluoreszenz; und grüne FL: relative Intensität der grünen Fluoreszenz (die gleichen Zeichen und Symbole, die nachfolgend hier verwendet werden, haben die gleiche Bedeutung).
Die Farbstoffe der ersten und der zweiten Gruppe in Tabelle 1 ermöglichen, daß Leukozyten in vier oder mehr Typen klassifiziert werden können, wie es in Fig. 3a angezeigt ist, wobei die Intensitäten der Fluoreszenz und des rechtwinklig gestreuten Lichtes als Parameter für die Messung ausgewählt werden (vgl. Bsp. 1 und 2, die nachfolgend in dieser Beschreibung beschrieben werden).
Die Farbstoffe der dritten Gruppe ermöglichen, daß Leukozyten in vier oder mehr Typen, wie es in Fig. 3b gezeigt ist, klassifiziert werden können, wobei die Intensitäten der grünen und der roten Fluoreszenz als Parameter für die Messungen ausgewählt sind (vgl. Bsp. 3).
Der Farbstoff der vierten Gruppe ermöglicht, daß Leukozyten in vier oder mehr Typen klassifiziert werden können, wie es in Fig. 3c gezeigt ist, wobei die Intensitäten der roten Fluoreszenz und des rechtwinklig gestreuten Lichtes als Parameter für die Messung ausgewählt werden (vgl. Bsp. 4).
Die Farbstoffe der fünften und der sechsten Gruppe ermöglichen, daß die Leukozyten in 4 oder mehr Typen klassifiziert werden können, wie es in Fig. 3d gezeigt ist, wobei die Intensitäten der Fluoreszenz und des rechtwinklig gestreuten Lichtes als Parameter für die Messung ausgewählt werden (vgl. Bsp. 5 und 6).
Beispielhafte Bedingungen für die Färbung und die Messung und Parameter für die Messung, die mit den einzelnen Farbstoffen, die in Tabelle 1 angegeben sind, verwendet werden können, sind in Tabelle 2 unten zusammengefaßt. Tabelle 2 Farbstofflösungszusammensetzung Parameter für die Klassifizierung Farbstoff Pufferlösung Farbstoffkonzentration (ug/ml) NaCl Konzentration (mM) Färbezeit (min) Wellenlänge d. Flouresznez grün (nm) rot (nm) grüne Fluoreszenz rote Fluoreszenz rechwinklig gestreutes Licht Pyronine Y Rhodamine 3GO Fluorescein Acridine Orange Brilliant Phosphine Rhoduline Orange Euchrysin 3RX Flavophosphine R Coriphosphine O Neutral Red Auramine O Astrazon Orange G Citrat Phosphat Borat
Acridinorange und Rhodulinorange, die in Tabelle 2 angegeben sind, sind jeweils in der Lage, Leukozyten in fünf Typen zu differenzieren. Aber die anderen Farbstoffe in Tabelle 2 müssen miteinander kombiniert werden, um eine fünfteilige Klassifizierung von Leukozyten zu erreichen, beispielsweise wenn der Farbstoff der vierten Gruppe mit dem Farbstoff der sechsten Gruppe kombiniert wird und wenn die Fluoreszenz und das rechtwinklig gestreute Licht als Parameter für die Messung verwendet werden, können Leukozyten in fünf Arten klassifiziert werden, wie es in Fig. 3e gezeigt ist (vgl. Beispiel 7).
Keiner der in Tabelle 3 aufgelisteten Farbstoffe ist in der Lage, die Leukozyten in 4 Typen oder mehr durch eine Lichtquelle zu differenzieren, die eine begrenzte Wellenlänge von 488 nm aufweist, aber die Differenzierung von drei Arten (Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten) ist mit diesen Farbstoffen möglich. 7 von den 21 in Tabelle 3 aufgelisteten Farbstoffen sind spezifisch in Tabelle 4 gezeigt, und wenn die Zytometrie mit diesen Farbstoffen unter den Bedingungen, die in Tabelle 4 angegeben sind, durchgeführt wird, wobei die Fluoreszenz und das rechtwinklig gestreute Licht als Parameter für die Messung ausgewählt werden, können zweidimensionale Aufzeichnungen erhalten werden, die eine sehr gute Auflösung von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten erzeugen, wie es in Fig. 3f gezeigt ist (vgl. Beispiel 8). Tabelle 3 Fluoreszenzcharakteristika Farbstoffe Anregungsmaximum (nm) Emissionsmaximum (nm) Xanthenfarbstoffe Oxazinfarbstoffe Cyaninfarbstoffe Styrylfarbstoffe Acridine Red Rhodamine Rhodamine 19 perchlorate Eosin Y Cyanosine Cresyl Fast Violet Darrow Red Acronol Phloxine FFS [DiICl (3)] 1,1-diethyl-9-methylthiocarbocyanine bromide (9-Me-DiSC2 (3)] 2-[γ - (1'-ethyl-4',5-benzothiazolylidene)-propenyl]-1-ethyl-4,5- benzoxazolium iodine*2 Astrazon Red 6B C.I. Basic Violet 16 2-(DMAS)-1-ethyl-4,5-benzothiazolium iodide*1 2,4-bis(DMAS)-1-ethylpyridinium iodide*1 2,6-bis(DMAS)-1-ethylpyridinium iodide*1 TA-2(Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho Co., Ltd., Okayama, Japan) *1: DMAS bedeutet p-Diemethylaminostyryl; *2: abgekürtzt mit NK-720 in Tabelle 4; *3: DiSCl (3) bedeutet 1,1'-Dimethylthiocarbocyanin, und DiSC2(3) ist 1,1'-Diethylthiocarbocyanin. Tabelle 4 Fluoreszenzcharakteristika Farbstofflösungszusammensetzung Farbstoffe Farbstoffkonzentration (ug/ml) NaCl Konzentration (mM) Färbezeit (min grüne Fluoreszenz rote Fluoreszenz rechwinklig gestreutes Licht Rhodamine S Rhodamine 19 perchlorate Acronol Phloxine FFS 9-Me-DiSC2(3)*3 NK-720*2 Astrazon Red 6B TA-2 *1 : Die erhaltenen Fluoreszenzemissionen waren grüne Fluoreszenz (520-580 nm) und rote Fluoreszenz (≥580 nm) *2 : Bezüglich des nicht abgekürzten Namens von NK-720, vgl. Tabelle 3 *3 : Bezüglich 9-Me-DiSC2(3) , vergleiche Tabelle 3
Wenn eine oder mehrere der 17 in Tabelle 1 aufgeführten Farbstoffe mit einem der in Tabelle 4 aufgelisteten Farbstoffe kombiniert wird und wenn die Fluoreszenz und das rechtwinklig gestreute Licht des Parameter für die Messungen ausgewählt werden, können Leukozyten auf besserem Wege als zwischen Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile unterschieden werden, wie es in Fig. 3g gezeigt ist (vgl. Beispiel 9).
Erfindungsgemäß wird nicht nur die Fluoreszenz, sondern ebenfalls das rechtwinklig gestreute Licht als ein Parameter für die Messung verwendet, und Farbstoffe, die die Fähigkeit aufweisen, Blutzellen auf hochdifferenzierte Weise zu färben, werden entweder alleine oder in Kombination verwendet. Folglich stellt diese Erfindung eine sehr effiziente Differenzierung von Leukozyten einschließlich der Auflösung zwischen Lymphozyten und Monozyten zur Verfügung.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um diese Erfindung weiter zu erläutern, aber sie sollen keineswegs den Umfang dieser Erfindung begrenzen.

Beispiel 1

Färben mit Fluorescein in der Farbstoffgruppe I:

8 Mikroliter von EDTA anti-coaguliertem, frischem Blut wurden zu 2 ml einer Fluoresceinfarbstofflösung zugegeben, die die in Tabelle 2 angegebene Zusammensetzung aufwies (d.h. 10 mM Zitratpufferlösung, pH 4,5; 150 mM NaCl; 100 ug/ml Fluorescein), und die Mischung wurde 8 Minuten lang inkubiert. Die inkubierte Probe konnte durch eine Flußzelle 14 in einem Flußzytometer mit den optischen Anwendungen 10, die in Fig. 1 gezeigt sind, fließen, während sie durch Laserbestrahlung bestrahlt wurde. Ein dichroitischer Spiegel 30 war von der Art, daß rotes Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm und länger reflektiert wurde, und Farbfilter 34 und 40 waren Langwegfilter, die Wellenlängen von nicht weniger als 580 nm bzw. 520 nm transmittierten. Die Probe wurde dazu gebracht, daß sie entsprechend dem Prinzip der laminaren Ströme floß. Das rechtwinklig gestreute Licht und die Fluoreszenzemissionen von 520 bis 600 nm wurden nur im Hinblick auf die weißen Zellen gemessen, die Fluoreszenzintensitäten von mehr als einen bestimmten Niveau aufwiesen. Die Analysenergebnisse sind in Fig. 4 angegeben.

Beispiele 2 bis 6

Unter Verwendung von Farbstoffen der Gruppen II bis IV in Tabelle 1 wurden die Leukozytenmessungen wie bei Beispiel 1 entsprechend den in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen durchgeführt:
Färben mit DiOC5(3) der Gruppe II Fig. 5
Färben mit Brilliantphosphin der Gruppe III Fig. 6
Färben mit Neutralrot der Gruppe IV Fig. 7
Färben mit Auramin O der Gruppe V Fig. 8
Färben mit Astrazon Orange G der Gruppe VI Fig. 9

Beispiel 7

Eine fünfteilige Differenzierung von Leukozyten durch Färben mit der Kombination der Farbstoffe der Gruppen IV und VI in Tabelle 1 (Fig. 10):
Unter Verwendung einer Farbstofflösung, die aus 10ug/ml Astrazon Orange G, 1ug/ml Neutralrot, 75 mM NaCl und einer 10 mM Boratpufferlösung (pH 9,0) bestand, wurde die Leukozytenmessung wie bei Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Färbezeit l Minute betrug und daß die rote Fluoreszenz ( ≥ 560 nm) sowie das rechtwinklig gestreute Licht als Parameter für die Messung verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.

Beispiel 8

Dreiteilige Differenzierung von Leukozyten durch Färben mit Farbstoffen aus Tabelle 4 (Fig. 11):
Unter Verwendung von TA-2 wurde die Leukozytenmessung wie bei Beispiel 1 unter den Bedingungen, die in Tabelle 4 beschrieben sind, durchgeführt.

Beispiel 9

Fünfteilige Differenzierung von Leukozyten durch Färben mit den Farbstoffen der Gruppen IV und VI von Tabelle 1 durch Kombinieren mit dem Farbstoff von Tabelle 4:
Unter Verwendung einer Farbstofflösung, die aus 10ug/ml Astrazon Orange G, 1ug/ml Neutralrot, 10ug/ml Ta-2, 75 mM NaCl und einer 10 mM Boratpufferlösung (pH 9.0) bestand, wurde die Leukozytenmessung wie bei Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Färbezeit 1 Minute ausmachte und daß die Parameter für die Messung, die ausgewählt wurden, grüne Fluoreszenz (540 - 600 nm), rote Fluoreszenz ( ≥ 600 nm) und rechtwinklig gestreutes Licht waren.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse der fünfteiligen Differenzierung von Leukozyten, basierend auf den Intensitäten der roten Fluoreszenz und dem rechtwinklig gestreuten Licht. Fig. 13 zeigt die Ergebnisse der Zweistufendifferenzierung, die aus einer Trennung zwischen Basophilen (5 in Fig. 13a) und Eosinophilen (4 in Fig. 13a) bestand, basierend auf roter und grüner Fluoreszenz, gefolgt von der Trennung zwischen Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen (durch 1, 2 bzw. 3 in Fig. 13b angegeben), bezogen auf die grüne Fluoreszenz und dem rechtwinklig gestreuten Licht.
In den Beispielen 1 bis 9 wurde mit allen Messungen begonnen, nachdem die erforderlichen Vorgänge der Färbung oder der Reaktion vollendet worden waren (nämlich nachdem die Färbung oder die Reaktion ein Gleichgewicht erreicht hatte). Daher erfährt die Probe nicht irgendeine zeitabhängige Änderung während den Messungen und ein angemessenes Niveau der Intensität der Färbung oder der Reaktion kann innerhalb einer bestimmten Zeitperiode erreicht werden, egal wie groß oder klein die Anzahl der Leukozyten in der Probe ist. Dies erlaubt beständige Ergebnisse bei der Messung und ein Fluoreszenzsignal mit einer adäquaten Intensität kann erreicht werden, selbst wenn eine Lichtquelle mit einem verhältnismäßig geringen Ausstoß verwendet wird. Bei den oben beschriebenen Beispielen 1 bis 9 wurde ein Argonionenlaser mit 10 mW als eine Lichtquelle bei dem Flußzytometer verwendet.
Jedoch ist die Lichtquelle in dem Flußzytometer, der erfindungsgemäß verwendet wird, nicht auf den oben genannten Argonionenlaser mit einem geringen Ausstoß beschränkt, und irgendeine andere Lichtquelle kann verwendet werden, beispielsweise eine Quecksilberbogenlampe, Xenonbogenlampe, ein He-Cd-Laser, ein He-Ne-Laser und ein Kryptonionenlaser, ebenso wie ein Argonionenlaser mit einem hohen Ausstoß. Wenn diese Lichtquellen verwendet werden, können die Bedingungen der Färbung, der Reaktion und der Messung ausgewählt werden, wie es angemessen ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das zur Klassifizierung und zur Zählung von Leukozyten in Blut verwendet wird, weist die folgenden Vorteile auf.
(1) Eine Probe für die Messung kann durch ein sehr einfaches Verfahren präpariert werden, das nur eine einstufige Färbung beinhaltet, die aus der Zugabe von antikoaguliertem Blut zu einer Farbstofflösung besteht.
(2) Die Probe kann in ungefähr 1 Minute hergestellt werden und sie schafft eine schnelle Zugriffszeit für die Messung.
(3) Da Messungen durchgeführt werden, nachdem die erforderlichen Vorgänge der Färbung vollendet sind, erfährt die Probe nicht irgendeine zeitabhängige Änderung während der Messungen, sondern eine geeignete Intensität der Färbung oder Reaktion kann immer innerhalb einer gewissen Zeitperiode erreicht werden, unabhängig von der Natur der Probe (ob sie normal ist oder eine sehr große oder kleine Anzahl an Leukozyten enthält). Dies eliminiert das Erfordernis, die Färbezeit von Probe zu Probe zu ändern.
(4) Da Messungen durchgeführt werden, nachdem die Färbung vollendet worden ist, um eine hohe Färbeintensität zu schaffen, kann eine Lichtquelle mit geringem Ausstoß verwendet werden. Zusätzlich muß nur eine Lichtquelle verwendet werden und zwei Parameter, die angemessenerweise aus zwei Kanälen aus Fluoreszenz und einem Kanal aus rechtwinklig gestreutem Licht ausgewählt sind, können gemessen werden. Da die Anzahl der Parameter, die gemessen und analysiert werden müssen, gering ist, kann das Reagenssystem dieser Erfindung verwendet werden, um eine Flußzytometrie von Blut mit einer einfachen und kostengünstigen Anlage zu vollenden.
(5) Nicht nur die Fluoreszenz, sondern ebenfalls das rechtwinklig gestreute Licht wird als ein Parameter für die Messung verwendet und Farbstoffe, die die Fähigkeit aufweisen, Blutzellen auf hochdifferenzielle Weise zu färben, werden entweder alleine oder in Kombination verwendet, so daß Leukozyten mit einer sehr hohen Auflösung zwischen individuellen Typen, einschließlich Lymphozyten und Monozyten, differenziert werden können.
(6) Erythrozyten, Blutplättchen und unreife Erythrozyten emittieren Fluoreszenz, die viel schäwcher ist als die Emission von Leukozyten, und daher können sie von den zuletzt genannten deutlich unterschieden werden. Dies eliminiert das Bedürfnis, Erythrozyten vor der Messung zu lysieren.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Blutprobe durchgeführt wird, die auf ein solches Niveau verdünnt ist, daß die Möglichkeit des Zusammentreffens von Erythrozyten und Leukozyten angemessenerweise vermindert wird, kann das mögliche Stören von Erythrozyten bei der Messung von rechtwinklig gestreutem Licht auf ein vernachlässigbares Niveau inhibiert werden.
Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren können genaue und hochreproduzierbare Messungen durch Zählen von nicht weniger als 10000 Leukozyten für jede Probe erreicht werden.

Claims

1. Verfahren zum Klassifizieren von Leukozyten durch Flußzytomtrie, umfassend die folgenden Schritte (a) bis (c):

(a) Herstellen einer Probe für die Messung durch Zugabe einer frischen Probe von nicht koaguliertem Blut zu einer Farbstofflösung und Stehenlassen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist, wobei die Farbstofflösung aus einem Puffer zum Aufrechterhalten eines pH in dem Bereich von 3,5 bis 10,0, einem anorganischen Salz zum Aufrechterhalten der Osmolarität der Farbstofflösung bei der halben bis zu der zweifachen physiologischen Osmolarität, so daß die Leukozyten in dem Blut nicht exzessiv deformieren, und ein Fluorochrom zum unterschiedlichen Färben der Leukozyten entsprechend ihren zytochemischen Eigenschaften besteht;

(b) Fließenlassen der hergestellten Probe für die Messung durch ein Flußzytometer, Differenzieren der Leukozyten von allen anderen Körperchen durch die Intensität der Fluoreszenz und Messen des Signals des in einem rechten Winkel (rechtwinklig) gestreuten Lichtes und zumindest eines Fluoreszenzsignals, das von den Leukozyten emittiert wird; und

(c) Identifizieren der Art aller Leukozyten, basierend auf den davon emittierten multiplen Signalen, Zählen der Anzahl der ermittelten Leukozyten entsprechend ihrer Art und Berechnen der Anteile der individuellen Leukozytentypen.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Klassifizieren von Leukozyten in zumindest vier Typen durch Verwendung von einem der einen der folgenden Farbstoffe in Schritt (a):

Gruppe I: Xanthenfarbstoff Pyronin Y

Rhodamine 3Go

Fluorescein

Gruppe II: Oxacarbocyaninfarbstoff DiOCl(3),

DiOC2(3),

DioC3(3),

DioC5(3),

DioC6(3),

Gruppe III: Acridinfarbstoff Acridin Orange

Brilliantphosphin

Rhodulin Orange

Euchrysin 3RX

Flavophosphin R

Coriphosphine O

Gruppe IV: Azinfarbstoffe Neutralrot

Gruppe V: Diphenylmethanfarbstoffe Auramin O

Gruppe VI: Methinfarbstoffe Astrazon Orange G

3. Verfahren nach Anspruch 1 zum Klassifizieren von Leukozyten in zumindest drei Typen durch Verwendung von einem der folgenden Farbstoffe in Schritt (a):

Gruppe I: Xanthenfarbstoffe Acridinrot;

Rhodamin S;

Rhodamin 6G;

Rhodamin B;

Rhodamin 19 Perchlorat;

Rhodamin 123;

Eosin Y; Cyanosin;

Gruppe VII: Oxazinfarbstoffe Cresyl Fast Violet; Darrow Rot

Gruppe VIII: Cyaninfarbstoffe Acronol Phloxine FFS;

1,1'-Dimethylthiocarbocyanin;

1-1'-Diethylthiocarbocyanin;

1-1'-Diethyl-9- methylthiocarbocyaninbromid;

2-(gamma-(1'-Ethyl- 4',5'-benzotiazolyliden)propenyl)- 1-ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid;

Gruppe IX: Styrylfarbstoffe Astrazon Rot 6B;

C.I. Basic Violet 16;

2-(p-Dimethylaminostyryl)-1-ethyl- 4,5-benzothiazoliumiodid;

2,4-Bis(p-dimethylaminostyryl)-1- ethyl-pyridiniumiodid; 2,6-Bis(pdimethylaminostyryl)-1-ethyl-pyridiniumiodid; TA-2 (Nippon Kankoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd., Okayama, Japan)

4. Verfahren nach Anspruch 1 zum Klassifizieren von Leukozyten in zumindest fünf Typen durch Verwendung von zwei oder mehreren der folgenden Farbstoffe in Kombination in Schritt (a):

Gruppe I: Xanthenfarbstoffe Pyronin Y

Rhodamin 3GO

Fluorescein

Gruppe II: Oxacarbocyaninfarbstoffe DiOCl(3) DiOC2(3)

DiOC3(3) DiOC5(3)

DiOC6(3)

Gruppe III Acridinfarbstoffe Acridinorange

Brilliant

Phosphin

Rhodulin Orange

Euchrysin 3RX

Flavophosphin R

Coriphosphin O

Gruppe IV: Azinfarbstoffe Neutralrot

Gruppe V: Diphenylmethanfarbstoffe Auramin O

Gruppe VI: Methinfarbstoffe Astrazon Orange G

5. Verfahren nach Anspruch 4, zum Klassifizieren von Leukozyten in zumindest fünf Typen durch zusätzliche Verwendung von einem der folgenden Farbstoffe in Schritt (a):

Rhodamin S; Rhodamin 19 Perchlorat; Acronol Phloxine FFS;

2-(gamma-(1'-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)propenyl)-1- ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid;

1,1'-Diethyl-9-methylthiocarbocyaninbromid; Astrazon Rot 6B; und Ta-2 (Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho Co., Ltd., Okayama, Japan).

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als eine Lichtquelle für den Zytometer in Schritt (b) ein Argonionenlaser, ein He-Ne-Laser, ein Kryptonionenlaser, ein He-Cd-Laser, eine Hg-Bogenlampe oder eine Xe Bogenlampe verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere der unten angegebenen Farbstoffe verwendet werden:

Acridin Rot; Rhodamin S; Rhodamin 6G; Rhodamin B; Rhodamin 19 Perchlorat; Rhodamin 123; Eosin Y; Cyanosin; Cresyl Fast Violet; Darrow Rot; Acronol Phloxine FFS (1, 1', 3, 3, 3', 3'-Hexamethylindocarbocyanin); 1,1'-Dimethylthiocarboyyanin;

1,1'-Diethylthiocarbocyanin; 1,1'-Diethyl-9-methylthiocarbocyaninbromid (9-Me-DiSC2(3)); 2-(gamma-(1'-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)propenyl)-1-ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid; Astrazon Rot 6B; C.I. Basic Violet 16; 2-(p-Dimethylaminostyryl)-1-ethyl-4,5-benzothiazoliumiodid; 2-4-Bis(p-dimethylaminostyryl)-1-ethyl- pyridiniumiodid; 2-6-Bis(p-dimethylaminostyryl)-1- ethyl-pyridiniumiodid; TA-2 (Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho Co., Ltd. Okayama, Japan); Pyronine Y; Rhodamine 3GO; Fluorescein; DiOCl(3); DiOC2(3); DiOC3(3); DiOC5(3); DiOC6(3); Acridin Orange; Brilliant Phosphin; Rhodulin Orange; Euchrysin 3RX; Flavophosphin R; Coriphosphin O; Neutral Rot; Auramin O; und Astrazon Orange G.