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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Anthraquinon und seine Derivate, im besonderen – obwohl
nicht ausschließlich – einschließlich seiner
Anwendungen im Bereich von Fluoreszenserfassungstechnologien.
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Es gibt eine Anzahl von DNA-Bindungsfluorchromen,
die verfügbar
sind und den UV-Bereich und den sichtbaren Bereich des Spektrums
abdecken. In jüngerer
Zeit sind sehr helle DNA-einschiebende Cyanin-Fluorchrome, basierend
auf modifizierten Dimeren von Thiazolorange, kommerziell verfügbar geworden. Diese
Cyaninfarben teilen nicht die zelldurchdringenden Eigenschaften
von anderen DNA-spezifischen UV-aktivierten Fluorchromen. Darüber hinaus
besitzen die üblicherweise
eingesetzten DNA-interaktiven Fluorchrome fluoreszente Zeichnungen,
die diejenigen anderer Fluorochromen überlappen, die aktiviert sind
in dem Spektralbereich sichtbaren Lichts, welche zum Einsatz kommen
als molekulare Marken zur Untersuchung von Aspekten von zellbiologischen
oder biologischen Strukturen. Beispiele gegenwärtig bekannter Cyaninfarben werden
beschrieben in der
US 5410030 und
US 5436134 .
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Die vorliegende Erfindung versucht
zellpermanente DNA-aktive Mittel zu entwickeln, die Fluoreszenzzeichnungen
bereitstellen, welche sich in den Infrarotbereich des Spektrums
hineinerstrecken. Solch ein Mittel könnte beispielsweise optimal
erregt werden durch Rotlinien emittierende La ser/Multifluorchromanwendungen,
sowohl für
fixierte Proben als auch lebende Zellen.
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Dementsprechend wird gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt,
die die folgende Formel (I) besitzt:
wobei jeweils X
1 und
X
2 unabhängig
NH-A-NR
1R
2 sind
und wobei A eine C
2
-8-Alkylengruppe
ist und R
1 und R
2 unabhängig ausgewählt sind
von Wasserstoff, C
1-4-Alkyl, C
2-4-Hydroxyalkyl
und C
2-4-Aminoalkyl, oder R
1 und R
2 zusammen eine C
2-6-Alkylengruppe
bilden, die mit dem Stickstoffatom, an welchem R
1 und
R
2 anhängen, einen
heterozyklischen Ring bildet, und wobei die Zusammensetzung (I)
wahlweise in der Form eines Säuresalzes
vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure.
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Der Begriff "Alkylen" wird hier eingesetzt mit der Bedeutung
einer Alkylkette.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
besitzt der Ring, wenn R1 und R2 einen
heterozyklischen Ring bilden, 3 bis 7 Atome hierin. Vorzugsweise
sind sowohl X1 als auch X2 beide
NH(CH2)2NR1R2. Im besonderen
wird bevorzugt, dass sowohl R1 als auch
R2-C1-4-Alkylgruppen
sind, vorzugsweise Methylgruppen.
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Gemäß einem zweiten Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die
die folgende Formel besitzt (II)
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Gemäß einer Ausführungsform
kann die Zusammensetzung (II) die Form ihres N-Oxidderivates aufweisen.
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Die Zusammensetzung der allgemeinen
Formel (I) und deren N-Oxidderivate
und im besonderen die spezielle Zusammensetzung (II) können beispielsweise
eingesetzt werden als DNA-Farbstoff und können eine rein synthetische
Zusammensetzung sein, die lösbar
ist in biologisch verträglichen
Lösungsmitteln
einschließlich
Wasser. Die Zusammensetzung (II) besitzt eine hohe Infinität hinsichtlich
DNA (die DNA-Bindungskonstante liegt bei etwa 107 M–1)
und besitzt die Fähigkeit,
rasch in lebende Zellen einzudringen.
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Das Absorbtionsspektrum für die Zusammensetzung
(II) zeigt Exmax in der Nähe von 647
nm und erzeugt ein Fluoreszenzspektrum, welches sich erstreckt von
665 nm bis über
780 nm Wellenlängen
hinaus (Emmax liegt bei etwa 677.5 nm).
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, zur Herstellung
einer Zusammensetzung mit der folgenden Formel (I)
wobei sowohl X
1 als
auch X
2 unabhängig NH-A-NR
1R
2 sind und wobei A eine C
2-8-Alkylengruppe
ist und R
1 und R
2 unabhängig ausgewählt sind
von Wasserstoff, C
1-4-Alkyl, C
2-4-Hydroxyalkyl
und C
2-4-Aminoalkyl, oder R
1 und R
2 zusammen eine C
2-
6-Alkylengruppe bilden, mit welchem das Stickstoffatom,
an welchem R
1 und R
2 anhängen, einen
heterozyklischen Ring bildet und wobei die Zusammensetzung (I) wahlweise
in der Form eines Säuresalzes
vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure und
wobei das Verfahren den Schritt der Reaktion einer Zusammensetzung
der folgenden Formel (III) umfaßt
mit NH
2-A-NR
1R
2, wobei A, R
1 und R
2 wie oben
definiert sind.
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Das Verfahren umfasst vorzugsweise
darüber
hinaus den Schritt der Behandlung der sich ergebenden Verbindung
mit einer Säure,
vorzugsweise konzentrierter Schwefelsäure. Zusätzlich kann gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
das Verfahren darüber
hinaus die anschließende
Behandlung mit Natriumchlorat und/oder Natriumhydrogensulfid umfassen.
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Modellieren hat demonstriert, dass
die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung stabile, eingeschobene Komplexe mit DNA bilden können. Somit
wird gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein fluoreszierender
Komplex bereitgestellt, mit einer Nukleinsäure und einer Verbindung der
folgenden Formel (I):
wobei sowohl X
1 als
auch X
2 unabhängig NH-A-NR
1R
2 sind und wobei A eine C
2-8-Alkylengruppe
ist und R
1 und R
2 unabhängig ausgewählt sind
von Wasserstoff, C
1-4-Alkyl, C
2-4-Hydroxyalkyl
und C
2-4-Aminoalkyl, oder R
1 und R
2 zusammen eine C
2-6-Alkylengruppe
bilden, mit welcher das Stickstoffatom, an welchem R
1 und
R
2 hängen, einen
heterozyklischen Ring oder ein N-Oxidderivat hiervon bildet,
und
wobei die Verbindung (I) oder ihr N-Oxidderivat wahlweise in der
Form eines Säuresalzes
vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure.
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Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA. Es
wurde herausgefunden, dass die DNA in einer lebenden Zelle anwesend
sein kann. Die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
fixierte menschliche Chromosomen markieren. Wenn das DNA: Verbindungsmolverhältnis ansteigt,
liegt ein bathochromischer Wechsel in der Verbindung vor plus DNA-Lösungsspektrum.
Bei hohen DNA: Verbindungsverhältnissen,
die innerhalb lebender Zellen erreichbar sind, trägt der Spektralwechsel
bei zu einer bereits signifikanten Trennung des Verbindungs-DNA-Emissionsspektrums
von demjenigen eines Beispiels einer rot fluoreszierenden Verbindung
Cy 5.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Analysieren
einer Zelle oder eines biologischen Materials, welches eine oder
mehrere Nukleinsäuren
enthält,
mit den folgenden Schritten:
- a) Herstellen
einer biologisch kompatiblen Lösung,
welche eine Verbindung der Formel (1) enthält: wobei jeweils X1 als
auch X2 unabhängig NH-A-NR1R2 sind und wobei A eine C2-8-Alkylengruppe
ist und R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind
von Wasserstoff, C1-4-Alkyl, C2-4-Hydroxyalkyl
und C2-4-Aminoalkyl, oder R1 und
R2 zusammen eine C2
-6-Alkylengruppe bilden, mit welcher das
Stickstoff atom an welchem R1 und R2 anhaften, einen heterozyklischen Ring bildet,
oder
ein N-Oxidderivat hiervon und wobei die Verbindung (I) oder ihr
N-Oxidderivat wahlweise
in der Form eines Säuresalzes
vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure,
- b) Behandeln der Zelle oder des biologischen Materials mit der
biologisch kompatiblen Lösung,
- c) Erregen der Verbindung (I) in der behandelten Zelle oder
dem biologischen Material mit einer Lichtquelle und
- d) Erfassen des emittierten Fluoreszenzsignals.
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Die Verbindung der Formel (I) kann
in ihrem freien Zustand vorliegen oder komplex mit einem anderen Molekül/Molekülen, beispielsw.
entweder über
eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung.
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Die Lichtquelle stellt bevorzugt
(eine) Wellenlänge
(n) bereit in dem Spektralbereich der Wellenlänge (n) der maximalen Absorption
der Verbindung (I).
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Es wurde herausgefunden, daß die Fluoreszenzzeichnung
der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
sich in den Infrarotbereich des Spektrums hinein erstreckt. Die
Zusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann in der Zelle oder dem biologischen Material anwesend
sein in Kombination mit einer oder mehreren Fluorchromen oder Licht
emittierenden Verbindungen. Die anderen Fluorchorome können Licht emittieren
in den UV-Bereich oder den sichtbaren Bereich des Spektrums. Somit
eignen sich die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für eine Multiparameteranalyse
mit anderen Fluorchromen mit Spektren, die sich überlappen mit denjenigen, die üblicherweise
eingesetzt werden in dem sichtbaren Bereich der DNA-Proben.
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Die eine oder mehrere andere Verbindungen)
können
zum Einsatz kommen, um beispielsweise Annexin V zu erfassen, und
werden vorzugsweise in Kombination eingesetzt mit dem N-Oxidderivat
der Verbindung (I). Eine Strömungscytometrische
Analyse, beispielsweise mit dem Instrument im Duallasermodus, kann
zum Einsatz kommen. Die Erfindung kann dementsprechend einen Weg
bereitstellen zum Unterscheiden intakter lebender Zellen von denjenigen,
die den verschiedenen Stufen des Zelltodes unterliegen.
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Somit stellen die Zusammensetzungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung weit eindringende rot/infrarot fluoreszierende DNA-Farben
bereit, die geeignet sind für
die Zellular-DNA-Analyse, wobei intakte Zellen erforderlich sein
können,
beispielsw. bei der Erfassung von Molekülen entweder an der Zellober fläche (z.
B. ein Rezeptormolekül
oder einem Marker für
eine Differenzierung) oder innerhalb von Zellen (z. B. cytosolische Enzyme)
durch Verfahren, die die Aufrechterhaltung der Membranintegrität erfordern,
um eine Zerstörung
oder einen Verlust solcher Moleküle
zu verhindern.
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Wie zuvor erwähnt, können bei diesem Verfahren die
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
Nukleinsäuren
färben
bzw. markieren in fixierten menschlichen Chromosomen, fixierten
Zellen und fixierten biologischen Materialien sowie bei Verfahren,
die die Permeabilität
der lebenden Zellmembranen modifizieren.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in einer biologischen
Probe bereitgestellt. Die Zusammensetzung (I) kann entweder in ihrem
freien Zustand vorliegen oder komplex mit anderen Molekülen entweder
durch kovalente oder nicht kovalente Bindung in der biologischen
Probe. Die Verbindung (I) kann als N-Oxidderivat hiervon vorliegen.
Die biologische Probe ist vorzugsweise ein rasches und/oder große Kapazität aufweisendes
Handhabungsverfahren. Der Einsatz der Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung, wie angegeben durch die Verbindung (I), als Diskriminierungs- oder
Orientierungsparameter für
Zellkerne hat sich als geeignet erwiesen sowohl für die Strömungscytometrie als
auch confocale Lasermikroskopie.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in der Cytometrie
bereitgestellt. Die Verbindung (I) ist optional als ein N-Oxidderivat
hiervon anwesend. Das Cytometrieverfahren kann beispielsweise einstrahlige
oder mehrstrahlige Strömungscytometrie
sein.
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Beispielsweise wurde die einstrahlige
(488 nm) Strömungscytometrie
eingesetzt, um die Eignung der Verbindung (I)-nuclear-DNA-Fluoreszenz
(vorzugsweise Verbindung (II)-nuklear-DNA-Fluoreszenz) als Unterscheidungsparameter
für menschliches
Blut und Lymphzellen zu demonstrieren in Verbindung mit Fluorchrom gekennzeichneten
Antikörpern
für die
Erfassung von Oberflächenantigenen
und Subpopulationerkennung. Von der Verbindung (I)-Fluoreszenz hat
sich gezeigt, daß sie
den zellularen DNA-Gehalt reflektiert, wie indiziert durch die Zellzyklus-DNA-Verteilungsprofile
zum exponentiellen Profilieren von Zellpopulationen, die eine stabile
oder asynchrone Verteilung von Zellen zeigen in Bezug auf das Zellzyklusalter,
oder für
gestörte
Zellpopulationen, bei welchen beispielsweise Drogenwirkung eine
Verzögerung
oder ein Arretieren der Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt des
Zellzyklus erzeugt hat. Gemäß einer
Ausführungsform
zeigt die Dualstrahlströmungscytometrie
(488 nm/633 nm) die selektive Erregung der Verbindung (I), vorzugsweise
der Verbindung (II), und die Fluoreszenz in intakten Zellen. Darüber hinaus
wurde bei einer Ausführungsform
der Einsatz der Verbindung (I), vorzugsweise der Verbindung (II),
bei Dreistrahlströmungscytometrie
(Multilinien UV/488 nm/633 nm) in Anwendungen demonstriert, welche
verzögerte
Signaldiskriminierung involvierten, wobei die Strahltrennung die
Diskriminierung des Erregerstrahls gestattet assoziiert mit einem
Fluoreszenz-Emissionssignal durch Bezugnahme auf die Verzögerung der
Signalankunft bei einem Detektor.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in der Mikroskopie
bereitgestellt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat anwesend
sein.
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Vorzugsweise handelt es sich bei
der Mikroskopie um confocale Lasermikroskopie (CLSM). Beispielsweise
zeigt die CLSM, die entweder 647 nm oder 568 nm Wellenlängenerregung
der intrazellularen Verbindung (I) einsetzt, vorzugsweise der intrazellularen
Verbindung (II), Fluoreszenz, welche sich speziell in der Kern freisetzenden
nuklearen Architektur innerhalb lebender oder fixierter menschlicher
Zellen befindet.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) als ein Nuklearfärbemittel
bereitgestellt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat vorliegen.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) als Abbildemittel
eingesetzt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat vorliegen.
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Gemäß einer Ausführungsform
kann die Verbindung (I) als Abbildemittel bei einer Multiphotonerregungsabbildung
zum Einsatz kommen.
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Duale Wellenlängenabbildung unter Verwendung
der Verbindung (I) zur Freisetzung nuklearer Form kann eingesetzt
werden, um die Heterogenität
bei der Esterase-abhängigen
Fluoresceinbelastung der gesamten Zellen und bei der Bewertung der
mitochondrischen Funktion durch Rhodamin 123 kennzeichnen, zu demonstrieren.
Bei derartigen Abbildungsanwendungen zeigt die Verbindung (I) keine
Evidenz von Fotobleichen und war dauerhaft.
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Somit können die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung betrachtet werden als ein Fluorchrom zur Anwendung als
ein Mittel für
den Einsatz bei der Kalibrierung, Standardisierung und Konfigurierung von
auf Fluoreszenz basierenden Systemen. Die bevorzugte Verbindung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Verbindung (II)-tief rot fluoreszierendes Bisalkylaminoanthraquinon
(DRAQ5).
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Es wurde gefunden, daß die hohe
Penetration von Rotlinienlaserstrahlen in Gewebe hinein und die dauerhaften
Eigenschaften der Komponenten gemäß der vorliegenden Erfindung
eine Kombination bereitstellen, die eine dreidimensionale Orientierung
und Lokalisierung der Kerne innerhalb lebender Gewebe gestatten. Außerdem machen
es die preisgünstige
Verfügbarkeit
von HeNe-Lasern
oder anderen Rotlicht emittierenden Einrichtungen mit verstärkter Leistung
den Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung möglich,
Anwendung zu finden in Erfassungssystemen, bei welchen Fluoreszenzsignatur
als Unterscheidungsparameter zum Einsatz kommen kann.
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Während
die Erfindung oben beschrieben wurde, erstreckt sie sich auch auf
jegliche erfinderische Kombination der Merkmale, die oben oder in
der nachfolgenden Beschreibung zur Ausführung kommen.
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Die Erfindung wird nun beispielhaft
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen und Beispiele beschrieben. Hierbei zeigen:
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1a–c Spektralcharakteristika von DRAQ5,
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2a–f Spektralcharakteristika von DRAQ5 assoziierter
DNA-Fluoreszenz
erfaßt
durch CLSM,
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2g die
Multiphotonabbildung von DRAQ5 gefärbten Zellkernen,
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2h–k einen Vergleich der sichtbaren Zellen,
gefärbt
mit DRAQ5 oder seinem N-Oxidderivat (DRAQ5N),
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3a–d die differenzierte Erregung von Fluorescein
und DRAQ5 in le benden A375 Zellen analysiert durch CLSM,
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4a–c die differenzierte Erregung von Rhodamin
123 und DRAQ5 in lebenden A375 Zellen analysiert durch confocale
Laserscan mikroskopie,
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5 fließcytometrische
Analysen von DRAQ5 Akkumulation für eine Aussetzungsdauer von
einer Stunde in lebenden HL60 Zellen,
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6a–d Dualstrahlfließcytometrieanalysen
zur Erfassung von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz in Fluorescein
gekennzeichneten lebenden HL60 Zellen,
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7a–d Einstrahlfließcytometrieanalyse
von DRAQ5 Fluoreszenz über
Antikörperfluoreszenz
für kultivierte
und blutabgeleitete menschliche Zellen,
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8 einstrahlfließcytometrische
Quantifizierung der Fluoreszenzin tensität von kultivierten und blutabgeleiteten
Zellen, die DRAQ5 aus gesetzt waren,
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9 dualfließcytometrische
Analyse des Zellzyklus speziellen Ausdruckes von Zyklin B1.
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10a–f dreifachstrahlfließcytometrische
Analysen von DRAQ5 gefärbten
fixierten und RNaseA ausgelaugten asynchronen SUD4 Lymphzellen,
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11a–c fließcytometrische Analyse des
zellularen DNA-Gehaltes von intakten SUD4 Lymphzellen unter Einsatz
von 488 nm, 633 nm oder Mehrlinien-UV-Erregung,
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12a–d Beispiele von zellularer Akkumulation
unter Einsatz einer menschlichen B-Zellen Lymphzelllinie unter Einsatz
von Kombinationen von Reagenzbehandlungen und
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13a–d Beispiele unter Wiedergabe der gleichen
Kombination der Reagenzien für
VP-16 behandelte Kulturen.
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Beispiel
1
Synthese von DRAQ5
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Verfahren:
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1,5-Dichloranthroquinon (15 g, 54
mmol) wurden gelöst
in N,N-Dimethylethylendiamin
(47, 68, 540 mmole) und 18 Stunden lang im Rückfluß geführt. Die Reaktion wurde überwacht
durch TLC (9 : 1 CH2Cl2/MeOH).
Die Mischung wurde abgekühlt
auf Zimmertemperatur und verdünnt
mit Wasser, um die titulierte Verbindung auszufällen. Die gefilterten Feststoffe
wurden rekristallisiert von Methanol, um (A) (15,89, 89%) einen kristallinen
Feststoff zu erhalten. Rf (9 : 1 CH2Cl2/MeOH) : 0,60.
1H
NMR (CDDl3): δ 9,8 (t, 2H), 7,6 (m, 4H), 6,9
(m, 2H) 3,4 (q, 4H), 2,7 (t, 4H), 2,4 (5, 12H). Massenspektrum, m/z
381 (m+ + 1).
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Das Anthracen-9,10-dionderivat (A)
(6 g, 15,8 mmole) wurde gelöst
in 65 g konzentrierter H2SO4 und abgekühlt auf
10°C. Wasserfreies
Natriumchlorat (6,5 g, 61,6 mmole) wurde in Teilen über 1,5
Stunden zugesetzt und die Mischung dann 3 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Die blaue Lösung
wurde langsam einer kalten Natriumwasserstoffsulfidlösung (1%,
1000 ml) zugegeben. Die Mischung wurde neutralisiert auf einen pH-Wert
7 mit 5 M NaOH. Die titulierte Verbindung (B) wurde aus der wässrigen
Phase extrahiert mit CH2Cl2 und
unter Vakuum konzentriert. Die Säulenchromatographie
(SiO2, 9 : 1 CH2Cl2/MeOH) ergab (B) (1,2 g, 20%).
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Beispiel 2
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Synthese von DRAQ5N [1,5-Bis-((2-dimethylamin-N-oxid)ethyl)amino)-4,8-dihydroxyanthracen-9,10-dion]
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Die titulierte Verbindung wurde hergestellt
aus Beispiel 1 (DRAQ5) wie folgt. DRAQ5 (0,1 g, 24 mmol) wurden
Meta-chlorperoxibenzolsäure
(80% Reinheit, 0,186 g, 0,96 mmol) beigegeben in trockenem Dichlormethan
und bei minus 20°C über Nacht
stehen gelassen. Das Rohprodukt wurde einer Silicasäulenchromatographie
unterworfen unter Einsatz von 9 : 1: 0,1 Dichlormethan : -Methanol : Ammoniak
(0,88 spezifisches Gewicht) als eluierendem Lösungsmittel. Die titulierte
Verbindung wurde als ein blaues Pulver isoliert. Schmelzpunkt 221°C.
1H NMR (CD3OD) d (delta) 7,39 (d, 2H), 7,2
(d, 2H), 4,0 (t, 4H, 3,65 (t, 4H), 3,30 (S, 12H) 13C NMR (CD3OD) :
d (delta) 189, 156,6, 147, 130, 122,5, 116, 69,5, 59,5, 38,5. Massenspektrum
m/z 445 (M+ +1).
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Beispiel 3
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Spektralanalyse von DRAQ5
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Absorptionsspektren wurden erhalten
durch den Einsatz eines Perkin-Elmer Lambda 16 UV Spektrometers
und eines 10 μM
Lösungsmittels
gelöst
in Dichlormethan und gemessen in einer 1 cm Weglängen Quarz-silikakuvette. Fluoreszenzspektren
für eine
0,8 ml Lösung
von 20 μM
DRAQ5 in einer 1 cm Weglängen Semimikroquarz-silikakuvette
wurden bestimmt durch Erregung bei einer Wellenlänge von 647 nm oder der Überwachung
der Emission bei 670 nm Wellenlänge.
Fluoreszenzmessungen wurden durchgeführt auf einem Perkin Eimer
LS50 Spektrofluormeter, wobei die Spaltbreiten bei 10 nm eingestellt
waren. Das Spektrofluormeter war mit einer rotempfindlichen Fotomultiplizierröhre ausgerüstet (PMT;
Typ R928, Hamamatsu Photonics KK, Japan). Daten wurden akkumuliert
für 4 Abtastungen
bei jedem Zustand und exportiert in ein Kalkulationstabellenprogramm,
um die Werte zu korrigieren hinsichtlich der Puffersteuerung und
zur Bestimmung der Emissionsmaxima. DNA-DRAQ5 Fluoreszenz wurde
gemessen durch die Beigabe von konzentrierten Calfthymus DNA-Lösungen zur
Kuvette unter Mischen. Sowohl das Mittel als auch DNA wurden hergestellt
in einem DNA-Bindungspuffer
(0,05 M Natriumphosphat, pH 6,2, 0,05 M NaCl, 0,0001 M EDTA; 3).
Die gezeigten Spektren wurden korrigiert hinsichtlich des Pufferhintergrundes
und nicht hinsichtlich der spektralen Sensitivität des PMT. Rhodamin 123 Spektren
wurden erzeugt in einem DNA bindenden Puffer unter Einsatz entweder einer
488/5 nm Erregung oder Überwachungsemission
bei 530/5 nm. Die zuvor veröffentlichte
Erregung und die Emissionsspektren wurden erhalten aus ursprünglichen
Quellenakten und normalisiert für
Spitzenintensität.
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Spektralcharakteristika
und Zwischenwirkung von DRAQ5 mit DNA
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Die 1a–c zeigen Spektralcharakteristika
von DRAQ5. 1a: Sichtbares
Absorbanzspektrum für DRAQ5
(10 μM in
Dichlormethan).
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1b:
Vergleich von Erregungsspektren für spezifizierte Emissionswellenlängen für: FITC
(o, 620 nm Emission), Rhodamin 123 (∇ , 0,5 μg/ml, 530 nm Emission), Texas
Red (Δ;
660 nm Emission), Cy 5,18 (⧠, 715 nm Emission), DRAQ5 (• , 670 nm
Emission).
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1c:
Vergleichsemissionsspektren für
spezifizierte Erregungswellenlängen
für FITC
(O, 425 nm Erregung), Rhodamin 123 (∇ ,0,5 μg/ml, 488 nm Erregung), Texas
Red (Δ;
500 nm Emission), Cy 5,18 (⧠, 570 nm Emission), 20 μM DRAQ5 (•, 647 nm
Emission) und 20 μM
DRAQ5 plus 1280 μM
DNA (∎, 647 nm Emission).
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1a zeigt
das sichtbare Absorbanzspektrum für DRAQ5 im Phosphatpufter bei
pH 7,4. Das Spektrum ergab Maxima bei 622 und 676 nm zusätzlich zu
den Maxima (Daten nicht gezeigt) bei 240 nm und 314 nm. Der Extinktionskoeffizient
bei 676 nm Wellenlänge
wurde bestimmt zu 20949 cm–1mol–1.
Die Fluoreszenzcharakteristika von DRAQ5 wurden studiert, um eine
Interpretation der fluormetrischen Daten zu gestatten, erzeugt durch
Fließcytometrie
und Confocalabbildung. Ein Erregungsspektrum wurde erzeugt für den 460–660 nm
Bereich für
Emission bei 680 nm Wellenlänge
und verglichen mit einem optimierten für Rhodamin 123 und denjenigen
für andere
Fluorchrome. 1b zeigt,
daß die
DRAQ5 Erregung in dem 630–650
nm Bereich im wesentlichen ähnlich
ist dem Erregungsspektrum von Cyaninfarbe Cy 5,18 (Exλmax 649
nm), aber verschieden von derjenigen des Texas Red (Exλmax 596
nm), Rhodamin 123 (Exλmax 511 nm) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC;
Exλmax 490
nm). In allen Fällen,
die in 1 wiedergeben
sind, wurden die Spektren normalisiert auf die Intensitätswerte
bei entweder Exλmax oder
Emλmax.
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Das Emissionsspektrum von DRAQ5 allein
(1c) zeigte, daß sich bei
einer 647 nm Erregung eine signifikante Emission ergab, die sich
erstreckte von 665 nm bis über
780 nm Wellenlänge
hinaus mit einem Emλmax von 677,5 nm. Das
Emissionsspektrum ist signifikant zu Rot gewechselt, verglichen
mit demjenigen von Cy 5,18. DRAQ5 scheint eine Resterrregbarkeit
zu zeigen bei viel geringeren Wellenlängen, obwohl die Fluoreszenzintensität für die Wellenlänge von
514 nm Erregung reduziert war von DRAQ5, verglichen mit den Werten
für die
Erregung bei 647 nm unter Beibehaltung der Charakteristika des Erregungsspektrums
(Daten nicht gezeigt).
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Ein molekulares Modellieren läßt vermuten,
daß DRAQ5
in der Lage ist, sich durch Einschub an DNA zu binden, wobei die
Seitenketten einander gegenüberliegender
Seiten des aromatischen Ringaufbaus jeweils das Potential besitzen,
das Molekül
an DNA zu stabilisieren.
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Fluormetrische Experimente zeigen
an, daß DNA
die DRAQ5 Fluoreszenz beeinflusst in einer komplexen Weise mit ansteigenden
DNA : DRAQ5 Verhältnissen
assoziiert mit einem Rotwechsel von Emλmax bis 697
nm bei einem molaren DNA : DRAQ5 Verhältnis von 64. Dieser Wechsel
auf die DNA-Zwischenwirkung ist in 1c gezeigt.
Bei hohen DNA : DRAQ5 Verhältnissen,
die äquivalent
zu denjenigen sind, auf die man bei lebender Zellfärbung trifft,
scheint ein Verlust des DRAQ5 Signals aufgrund des Farb-Farb-Löscheffekts
minimal zu sein. Die Rotverschiebung von Emλmax und
des beachtlich niedrigen Infrarot/Infrarotsignals bei Wellenlängen über 730
nm hinaus unterscheidet diese Probe von Cy 5,18 trotz ähnlicher
Erregungscharakteristika.
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Beispiel 4
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Abbildungs- und Mikroskopieanwendungen
von DRAQ5 als eine neue Tiefrot/Infrarot fluoreszierende DNA-bindende
Untersuchung
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Bevorzugte Aspekte der Erfindung
beziehen sich auf die Entwicklung einer zelldurchdringenden DNA-interaktiven
Farbe, die in der Lage ist, als diskriminierende oder orientierende
Markierung für
zellulare DNA zu wirken mit einer fluoreszierenden Kennzeichnung,
die sich in die infrarote Region des Spektrums hinein erstreckt.
Die Erfindung gestattet eine multilaser, multifluorchrome und multiphotone
Erregung mikroskopischer Verfahren, die eingesetzt werden kann sowohl
bei fixierten Proben als auch lebenden Zellen. Hier werden die Spektralcharakteristika
von DRAQ5 beschrieben und die potentiellen Anwendungen dieser DNA-Untersuchung
demonstriert für
Multiparameter-Analyse von lebenden und fixierten Zellen unter Einsatz
confocaler Laserabtastungsmikroskopie.
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Zellkultur
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Die menschliche Melanomzellenlinie
A375 wurde gezüchtet
als asynchrone Kulturen in einem Eagles Minimalessentiellmedium,
unterstützt
durch 10%iges foetales Kaltserum, 1 mM Glutamin und Antibiotika
und inkubiert bei 37° C
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 in Luft. Für Darstellungsexperimente wurden
Zellen gezüchtet
in einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Quelle als Monoschicht auf autoklavierten
Glaseckgläsern
in 6 Quellplatten 48 Stunden vor der Behandlung. Anhaftende lebensfähige Zellen
wurden in frischer PBS für
die Mikroskopie angeordnet. Wo angezeigt, wurden die anhaftenden
Zellen fixiert mit 70% Methanol bei –20°C 10 Minuten vor der Rehydrierung
und gefärbt
mit Ethidiumbromid bei 5 μg/ml
10 Minuten lang in der Anwesenheit von 5 mg/ml RNase A.
-
Drogenherstellung
und -behandlung
-
DRAQ5 wurde synthetisiert unter Einsatz
der beschriebenen Prinzipien und gelagert bei +4°C als wässrige Vorratslösung von
10 mM. DRAQ5-Lösungen wurden
hergestellt in phosphatgepufferter Saline (PBS) und direkt den Kulturen
beigegeben. Fluoresceindiacetat (FDA; Koch Light Laboratories) wurde
hergestellt als Vorratslösung
von 12 mM in Azeton und gelagert bei –20°C. Die Zellen wurden behandelt
mit 0,2 μM FDA
10 Minuten lang bei 37°C
entweder allein oder nach dem 50-minütigen Aussetzen von DRAQ5.
In einer ähnlichen
Weise wurden DRAQ5-behandelte Zellen gekennzeichnet mit Rhodamin
123 (Laserqualität;
Kodak) bei 2 μg/ml
Kulturmedium 10 Minuten lang vor der Analyse.
-
Confocale Laserabtastmikroskopie
(CLSM) von intakten Zellen
-
Das eingesetzte System war ein Leica
TCS 4D Skanner (LaserTechnik GmbH, Deutschland), gekoppelt an ein
Leitz DM R Mikroskop und betrieben mit einem Ominchromargon/Kryptonlaser.
Der Laser stellte Emissionslinien zur Verfügung bei 488, 568 und 647 Nanometer
mit variabler Leistung. Abdeckglaskulturen wurden kurz in PBS gewaschen
in umgekehrten Positionen, auf Glasplättchen aufgebracht, wobei die
Abdeckgläser
an den Kanten abgestützt
wurden durch Aufpipettieren von Erdölgallert, um zu verhindern,
daß die
Zellen zusammengedrückt
wurden. Die Glasplättchen
wurden unmittelbar untersucht unter Einsatz von ×100 oder ×40 Ölimmersionsobjektivlinsen mit
Mittelbereichsblenden- und
Photomultiplikationsverstärkungseinstellungen.
Die Erregungs-/Emissionswellenlängen
für DRAQ5,
Fluorescein und Rhodamin 123 waren 647 nm/> 665 nm, 488 nm/> 515 nm bzw. 488 nm/> 590 nm. Die Verstärkungseinstellungen wurden
derart justiert, daß die am
stärksten
fluoreszierende drogenbehandelte Probe Pixelintensitäten ergab
gerade unterhalb der Sättigung. Der
Schwarzpegel/Verstellung wurde justiert zur Erzeugung eines effektiven
Nullhintergrundes (< 4
für den
Pixelwert) nach 16× Liniengeräuschfiltration
der Darstellungen für
unbehandelte Kontrollen. Unter Einsatz dieser Näherung zeigten die unbehandelten
Kontrollen minimale Autofluoreszenz und ergaben keine erkennbare Darstellung,
so daß keine
Notwendigkeit bestand, einer Hintergrundkorrektur vorzubeugen. Die
gesammelten Darstellungen wurden für die Analyse konvertiert und
vermischt unter Einsatz von IP Laborspektrum-Darstellungsanalysen-Software
(Signal Analytics Corp., Vienna, VA, USA).
-
CLSM-Analyse von DRAQ5-Fluoreszenz
in lebensfähigen
Zellen
-
Um einigen Einblick in die Abhängigkeit
von DRAQ5-Fluoreszenz auf die Erregungswellenlänge und die Spektraltrennung
ihres Fluoreszenzsignals auf eine andere DNA-Probe zu erhalten,
wurden Zellen verglichen, gefärbt
entweder mit DRAQ5 oder Ethidiumbromid. Der Empfindlichkeitsbereich
von CLSM entweder bei 488 nm oder 568 nm Erregung wurde optimiert
in bezug auf die Fluoreszenz von Ethanol-fixierten Zellen gefärbt mit
Ethidiumbromid (2d–f), während
die Abbildung bei 647 nm Erregung optimiert wurde an DRAQ5-behandelten
lebensfähigen
Zellen (2c). 2a–f zeigt,
daß bei
Fluorchromkonzentrationen, geeignet für die Darstellung von Kernen
und bei entsprechender Emissionsfiltration 488 nm und 647 nm Erregungsbedingungen
eingesetzt werden können
zur exklusiven Darstellung sowohl von Ethidiumbromid- als auch DRAQ5-Färbung. DRAQ5
könnte
auch eingesetzt werden zur Darstellung fixierter Zellen unter Beibehaltung
eines großen
Teils der beobachtbaren Nukleararchitektur in intakten, lebensfähigen Zellen
(Daten nicht gezeigt). Fluoreszenzaktivierung wurde auch beobachtet
unter Einsatz einer Multiphotoerregung von fixierten Zellen, gefärbt mit DRAQ5
(menschlichen B-Zelllymphzellen; Ethanol-fixiert; 20 μM DRAQ5;
YLF modusverriegelter Lasererregung bei 15 mW unter Einsatz eines
modifizierten MRC600 Konfokalabbildungssystem; Exλ =
1047 nm; Emλ =
Langrot; 2g).
-
Unter Einsatz von CLSM mit einer
Erregung bei 647 nm (2c)
ergab sich eine klare Demonstration von kernpositionierter Fluoreszenz,
ganz im Unterschied zu anderen Anthraquinon- und Anthracycline-basierenden
Mitteln gefiltert, wodurch sowohl nukleare als auch cytoplasmische
Signale erzeugt wurden. 2c zeigt,
daß DRAQ5-behandelte
lebensfähige
Zellen eine klare Definition nuklearer Architektur zeigten sowie
die Definition von Kanten nukleolarer und nuklearer Membranregionen.
-
Dementsprechend zeigen die 2a–f Spektralcharakteristika
von DRAQ5-assoziierter DNA-Fluoreszenz, erfaßt durch CLSM : Felder a–c, Erregung
bei 488, 568 bzw. 647 nm Wellenlänge
für lebensfähige menschliche
A375 Melanomzellen. Die Felder d–f zeigen die Erregung bei
488, 568 bzw. 647 nm Wellenlänge für Ethanol-fixierte
Zellen gefärbt
mit Ethidiumbromid. Die Abbildungen sind 100 × 100 μm.
-
Multiphotonabbildung von
DRAQ5
-
Das Prinzip der 2-Photon-erregten
Fluoreszenzmikroskopie wurde zuerst demonstriert von Webb und Mitarbeitern
(Science, 248, 73–76
(1990); US-Patent
5 034 613). Im wesentlichen involviert dies das Einfangen von zwei
Photonen durch ein erregbares Molekül, indem man Erregungsbedingungen
erzeugt, die solche Ereignisse favorisieren. Das Erregungsspektrum
für ein
vorgegebenes Fluorchrom für
Multiphotonereignisse unterscheidet sich von dem entsprechenden
Einphotonerregungsspektrum, obwohl die Emissionsspektren unabhängig von
der Erregungsart sind. Die Schlüsselkomponente
des Erregungssystems, wie es für
die Abbildung eingesetzt wird, ist ein abstimmbarer oder an einen
bestimmten Wellenlängenmodus
angeschlossener Laser mit ultrakurzen Impulsen bei einer hohen Wiederholungsgeschwindigkeit.
Das Multiphotonmikroskop umfaßt typischerweise
einen abstimmbaren Ti-Sapphire-Laser, welcher emittiert innerhalb
eines Wellenlängenbereiches
von 700–950
nm bei einer Impulsbreite von etwa 100 Femto-Sekunden und einer
Wiederholungsgeschwindigkeit von 80 MHz. Laser mit fixierter Wellenlänge können ebenfalls
eingesetzt werden, wie etwa ein YLF-modusgebundener Laser, der eine
Multiphotonerregung bei 1047 nm zur Verfügung stellt. Die Spitzenintensität derartiger
Laser ist so hoch, daß die
Farberregung eintreten kann durch Absorption von zwei oder mehr Photonen
in rascher Aufeinanderfolge. Es ist wichtig, daß die Multiphotonerregung die
Notwendigkeit kurzer Erregungswellenlängen (z. B. UV-Bereich) beseitigt.
Da darüber
hinaus die Fluoreszenzerregung lokalisiert ist auf den Bereich des
Brennpunktes, kann das Multiphotonsystem optisch ein abgetastetes
Objekt mit begrenztem Bleichen aufteilen. Multi-(Dual)-Photonerregung
von DRAQ5 wurde erzielt unter Einsatz des YLF-modusgebundenen Lasers,
und ein Beispiel einer gesammelten Abbildung, die nuklear lokalisierte
Fluoreszenz zeigt in fixierten Zellen, ist in 2g dargestellt. Es wurde auch eine Multiphotonerregung
von DRAQ5 in den Kernen von fixierten Zellen beobachtet unter Einsatz
eines Ti-Sapphire-Lasers (gepumpt mit 5 W) emittierend bei 740 nm
Wellenlänge
(konsistent mit der Fähigkeit,
DRAQ5-behandelte
Zellkerne UV zu erregen, entsprechend der Darstellung in 11). Es wird erwartet, daß das Erregungsspektrum
für DRAQ5,
welches konsistent ist mit den Ergebnissen für andere Fluorchrome, sich
unterscheidet von demjenigen, welches bestimmt wird durch die Einphotonspektroskopie.
Die Eindringungsfähigkeit
von Infrarotlaserstrahlen bietet Anwendungen für Mehrphotonerregung von DRAQ5
beim Abtasten tiefer Einschnitte/Gewebe bei der Kernlokalisierung, Quantifizierung
und Morphologie, so daß eine
genaue 3D-Rekonstruktion von komplexen zellularen Umgebungen ermöglicht wird.
-
Die 2g zeigt
die Multiphotonabbildung von DRAQ5-gefärbten Zellkernen. Menschliche B-Zell-Lymphzellen
wurden mit Ethanol fixiert und gefärbt mit 20 μM DRAQ5. YLF-modusgebundene
Lasererregung bei 15 mW (Ex λ =
1047 nm; Ein λ =
lang rot) wurde eingesetzt und Abbildungen erhalten unter Einsatz eines
60 × N.
A. 1,4 Ölobjektivs,
einem Zoomfaktor von 1,9 und einem durchschnittlichen Kalman von
37 Rahmen.
-
CLSM-Analyse der Fluoreszenz
von DRAQ5 und einem N-Oxid-Derivat (DRAQ5N) in lebensfähigen Zellen
-
Es wurde versucht, den Effekt von Änderungen
der Struktur in einer Verbindung der allgemeinen Form der Verbindung
(I) zu exemplifizieren an Charakteristika der Färbung lebensfähiger Zellen.
Ein N-Oxid-Derivat von DRAQ5 (z. B. DRAQ5N) behält die allgemeine Struktur
(I) aufrecht, hat jedoch Gesamtladung verloren. Diese Änderung
beeinflußt
die Wirksamkeit des Bindungspotentials des Mittels in lebensfähigen Zellen,
während
die Fluoreszenz, die Zelldurchdringungseigenschaften und die nukleare
Lokalisierung beibehalten werden. 2h– k zeigen, daß unter äquivalenten Bedingungen für die Erfassung
der nuklearen Fluoreszenz in lebensfähigen menschlichen Zellen die
DRAQS-integrierte nukleare Fluoreszenzintensität pro Kernabschnitt etwa um
das 10-fache größer war
als der von DRAQ5N-behandelten Zellen abgeleitete Wert. Frühere Veröffentlichungen
(siehe die Referenzen 1–10
unten) beschrieben die Charakteristika von Alkylaminanthraquinon-N-Oxiden
und ihr Potential als bioreduktive Drogen. Somit teilt sich das
N-Oxid von DRAQ5 (d. h. DRAQ5N), welches hier beschrieben wird,
die Eigenschaften dieser Klasse von Mitteln dahingehend, daß es zur
bioreduktiven Konversion zu DRAQ5 in der Lage ist. Es wird vorgeschlagen,
daß die
neuen Fluoreszenzcharakteristika von DRAQ5 ein Markierungsmittel
für zellulare
bioreduktive Aktivität
bereitstellen, und als natürliche
Folgerung den hypoxischen Status durch die DRAQ5N Konversion. Somit
zieht die vorliegende Erfindung den Einsatz von DRAQ5N als Markierungsmittel
für hypoxische
Zellen in Betracht.
-
Dementsprechend zeigen die 2h–k gleichzeitig
das CLSM-Einfangen
der Transmission (Felder h und j) und die entsprechende langwelliges
Rot/kurzes Infrarot-Fluoreszenz- (Felder i bzw. j)-Abbildungen lebensfähiger HL60-Zellen,
die entweder 10 μM
DRAQ5 oder 10 μM
DRAQ5N eine Stunde lang ausgesetzt wurden.
- 1.
Patterson LH: Anthraquinone anticancer compounds with (disubstituted
amino-N-oxide)alkylamino substituent. UK Patent GB2237283, 1989
- 2. Patterson, L. H. Rationale for the use of aliphatic N-oxides
of cytotoxic anthraquinones as prodrug DNA binding agents: a new
class of bioreductive agent. Cancer and Metastasis Revs. 12, 119–134, 1993.
- 3. Patterson, LH, Craven, MR, Fisher, GR and Teesdale-Spittle,
P. Aliphatic amine N-oxides of DNA binding agents as bioreductive
drugs. Oncology Research 6, 533–538,
1994.
- 4. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, McAleer, IA, McAleer, JJA and Patterson,
LH. AQ4N: an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive
potential and positive interaction with radiation in vivo. Brit
J Cancer, 72,76–81.
- 5. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, Mcntyre, IA, McAleer, JJA and Patterson,
LH. AQ4N: an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive
potential and positive interaction with radiation. Brit J Cancer,
72, 76–81,
1995.
- 6. Wilson, WR, Denny, WA, Pullen, SM, Thompson, KM, Li, AE,
Patterson, LH. Tertiary amine N-oxides as bioreductive drugs: DACA
N-oxide, nitracrine N-oxide and AQ4N, Brit J Cancer, 74, S43–47, 1996.
- 7. McKeown, SR, Friery OP, McIntyre, IA, Hejmadi, MV, Patterson
LH. Evidence for a therapeutic gain when AQ4N or tirapazamine is
combined with radiation Brit J Cancer 74, S39–42, 1996
- 8. Hejmadi, MV, McKeown, MV, Friery, OP, McIntyre, IA, Patterson,
LH and Hirst, DG, DNA demage following combination of radiation
with the bioreductive drug AQ4N: possible selective toxicity to
oxic and hypoxic cells. Brit J Cancer, 73, 499–505, 1996.
- 9. Smith, PJ, Blunt, NJ, Desnoyers, R, Giles, Y and Patterson,
LH. DNA topoisomerase II dependent cytotoxicity of allcylaminoanthraquinones
and their N-oxides. Cancer Chemotherap. Pharmacol, 39, 455–461 (1997)
- 10. Smith, PJ, Desnoyers, R, Blunt, N, Giles, Y and Patterson,
LH. Flow cytomeric analysis and confocal imaging of anticancer alkylaminoanthraquinones
and their N-oxides in intact human cells using 647 nm Krypton laser
excitation. Cytometry, 27, 1, 43–53, 1997.
-
CLSM-Abbildung
von Dual-Fluorchrom-Vitalzellfärbung
-
Es wurde versucht, die Spektraltrennung
des DRAQ5-Fluoreszenzsignals von demjenigen anderer, üblicherweise
eingesetzter Fluorchrome zu demonstrieren durch den Einsatz selektiver
Erregung. 3b zeigt die
signifikante Variation der Kapazität der A375-Zellen für intrazellulare
Konversation von FDA durch esterase Zellteilung zur beibehaltenen
Form von Fluorescein. Die Abbildung der gleichen Probe unter Einsatz
selektiver Erregung von DRAQ5 demonstriert klar die nukleare Morphologie
(3c), während die
Transmissionsabbildung ( 3a)
die Gesamtzellform wiedergibt. Dreifachabbildungsanalyse identifiziert
Tochterzellpaare (markiert als x, y und z durch Pfeile in 3d). Dualabbildung erstreckte
sich auf eine vitale Farbe, die in der Lage war, cytomplasmische
Organellen zu definieren. 4a–c zeigt DRAQ5 (Kerne) und Rhodamin 123
(Mitochondrien) als zusammen gekennzeichnete Zellen.
-
Somit zeigen die 3a–d unterschiedliche Erregung von Fluorescein
und DRAQ5 in lebensfähigen A375-Zellen,
analysiert durch CLSM. Die Zellen wurden behandelt mit 10 μM DRAQ5 × 1 Stunde
und anschließend
gekennzeichnet mit FDA bei 1 μM
15 Minuten lang. Die Felder zeigen die gleichen Darstellungsansichten wie
folgt: a Transmissionsabbildung; b 488 nm Erregung von Fluorescein;
c 647 nm Erregung von DRAQ5; d vermischte Darstellungen von a–c kodiertem
Blau, Grün
bzw. Rot. Die Abbildungen sind 250 × 250 μM; Paare von Tochterzellen sind
durch Pfeile angezeigt.
-
4a–c zeigen a–c unter Wiedergabe der unterschiedlichen
Erregung von Rhodamin 123 und DRAQ5 in lebensfähigen A375-Zellen, analysiert durch konfokale Laserabtastmikroskopie.
Zellen wurden behandelt mit 10 μM
DRAQ5 × 1
Stunde und anschließend
gekennzeichnet mit Rhodamin 123 mit 2 μg/ml 5 Minuten lang. a und b zeigen
die gleiche Ansicht mit 488 nm bzw. 647 nm Erregung. Die c repräsentiert
die ge mischten Abbildungen von a (kodiertes
Grün) und b (kodiertes Rot). Die Abbildungen sind
100 × 100 μM.
-
Beispiel 5
-
Fließcytometrieanwendungen von
DRAQ5 als neuartiges Langwelligrot/Infrarot-Fluoreszenz-DNA-Bindungsverfahren
-
Fließcytometrie, wie sie hier zum
Einsatz kommt, ist ein Verfahren zur Messung der Lichtstreuungs- und
Fluoreszenzcharakteristika von Zellen oder Partikeln, die in einem
Fluidstrom durch die Meßvorrichtung hindurchgeführt werden,
in welcher einzelne Zellen die Brennpunktposition(en) eines einzigen
oder mehrerer Laserstrahlen überqueren.
Die zeitliche Verzögerung
beim Durchgang durch die räumlich
getrennten Brennpunktpositionen wird elektronisch überwacht,
wobei das Cytometer vollständig
korrelierte Multiparametermessungen erzeugt für die Mehrstrahlkonfigurationen.
Hier wird der Einsatz von DRAQ5 in Ein-, Zwei- und Dreistrahlsystemen demonstriert
in einer Gruppe von Anwendungen unter Einsatz menschlicher Zellen.
-
Zellkultur
-
HL60 (menschliche promyelocytische
Leukämie-Zell-Linie)
und SUD4 (menschliche B-Zell-Lymphzell-Linie) wurden kultiviert
als Suspensionskulturen in RMPI-Medium mit 10% fötalem Kalbserum, 1 mM Glutamin
und Antibiotika und bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5%igem CO2 in Luft inkubiert. Für die Fließcytometrie-Experimente
wurden asynchrone Wachstumssuspensionskulturen verdünnt auf
2,5–4 × 105 Zellen/ml 2 Stunden vor der Drogenbehandlung.
Zellzyklusgestörte
Populationen wurden erhalten durch die Behandlung der SUD4-Zellen
mmit der Droge Etoposid (VP-16-213) bei 0,25 μM 18 Stunden lang. Die Zellen
wurden behandelt mit DRAQ5 und FDA, wie dies oben beschrieben wurde.
Die Zellkonzentrationen wurden bestimmt unter Einsatz eines Coulterzählers, und
die Zellzyklusverteilung wurde bestimmt unter Einsatz eines Algorithmus von
der normalen Verteilung der Fluoreszenzintensitätsprofile für Fluorchrom-gefärbte G1
und G2-Zellen.
-
Suspensionskulturen wurden analysiert
durch Fließcytometrie
ohne Waschen. Menschliches Blut wurde erhalten unter Einsatz von
Venenpunktur eines gesunden Spenders und Proben manipuliert unter
Verwendung von standardhämatologischen
Verfahren für
die Isolation von mono-nuklearen Blutzellen und Oberflächenantigenerkennung
unter Einsatz von Antikörperfeldern
(siehe Tabelle 1).
-
-
Fußnoten zur Tabelle:
-
Fließcytometrie
-
Zellen wurden analysiert unter Einsatz
eines von vier Fließcytometern,
entsprechend den Erregungserfordernissen.
-
Cytometer A: Einstrahlhochleistungs-
647 nm-Kryptonlaser-Erregung: Das System war ein handelsüblich gebautes
Cytometer und eingebaut in einen Innova 3000 K Kryptonlaser (Coherent
Corp. Palo Alto, CA, USA), abgestimmt auf die 647 nm-Linie. Vorwärtslichtstreuung
90° leichte
Streuung und Fluoreszenzemission wurden gesammelt für 1 × 104 Zellen unter Einsatz des 90° Lichtstreuungsparamter
als Hauptsignal. Das optische System gestattete die Analyse von
verschiedenen Fluoreszenz-Emissionswellenlängen einschließlich: > 715 nm (bezeichnet
als langwelliges Infrarot) und berichtet hier als > 780 nm Fluoreszenz
(Infrarot). Vorwärts-
und 90°-Lichtstreuung
wurden analysiert für
die Identifizierung von Zelltrümmern.
Die Laserleistung wurde auf 200 mW eingestellt und lineare Verstärker kamen
zum Einsatz für
die Fluoreszenz-Signale.
Die Analysenoptik umfaßte
einen 675 nm kalten dichroitischen Spiegel, die Umgebungslabortemperatur
betrug in etwa 12°C
und das Behälterreservoir
wurde bei 10°C
gehalten. Filter wurden bereitgestellt von Melles Griot. Die mittleren,
durchschnittlichen und Modus-Parameter wurden berechnet für die Verteilung
der Fluoreszenzintensitätswerte,
durchgängig
für eine
gegebene Zellpopulation. Bei allen Experimenten ergaben alle Mittel-
und Durchschnittswerte ähnliche
Ergebnisse. Die Mittelwerte werden allein angegeben, da dieser Parameter
weniger beeinflußt
wird durch die Anwesenheit von hochfluoreszierenden Zellen über die
Obergrenze hinaus für die
Quantifizierung.
-
Cytometer B: Dualstrahlniedrigleistungs-633
nm/Hochleistungs-488 nm-Lasererregung: Das System war ein FACS 440-Zellsortierer
(Becton Dickinson Inc., Cowley, Großbritannien) mit einem Spektraphysics-Argon-lonenlaser
(maximal 500 mW-Ausgang), abgestimmt auf die 480 nm-Linie (100 mW-Ausgang)
und einem zweiten Spektraphysics-156-Helium-Neonlaser, emittierend
bei 633 nm (emittierend < 5
mW), mit einer temporalen Strahltrennung von etwa 30 μsec. Vorwärtslichtstreuung,
90° Lichtstreuung
und Fluoreszenzemission wurden gesammelt für 1 × 104 Zellen
unter Einsatz des Vorwärtslichtstreuungs-Parameters als Hauptsignal von
dem Primärstrahl
488 nm, während
die Seitenstreuung gesammelt wurde durch ein 488/10 nm Bandpaßfilter.
Die Analysenoptik umfaßte:
i) einen kalt dichroitischen Spiegel (transmittierend > als 675 nm), ii) die
Fluoreszenz von Fluorescein, erregt durch den 488 nm-Strahl, er faßt bei PMT,
abgeschirmt durch ein 535/15 nm-Bandpaßfilter ohne Signalverzögerung und
iii) ein rotempfindlichen PMT mit einer entsprechenden Verzögerung,
zusätzlich
abgeschirmt durch ein 620 nm Langpaßfilter zur Erfassung des transmittierten
Strahles von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz bei Wellenlängen über 675
nm hinaus (kurzwelliges Rot und sich hinein erstreckend in den Infrarot-Bereich
des Spektrums).
-
Vorwärts- und 90° Lichtstreuung wurden analysiert,
um jegliche Zelltrümmer
auszuschließen.
Alle Parameter wurden erhalten bei 256 Kanalauflösung mit Consort 30 Software
(Becton Dickinson) und anschließend
analysiert mit WinMDI Software (J. Trotter, La Jolla, Ca.). Das
System verwendete die gleiche Analyseoptik, wenn es zum Einsatz
kam im Einstrahl-488 nm-Modus, jedoch ohne Signalverzögerung für den rot
empfindlichen PMT.
-
Cytometer C: Einstrahlniedrigleistung-Lasererregung
480 nm: Das System war ein FACScan (Becton Dickinson Inc., Cowley,
Großbritannien)
mit einem Argonionenlaser (maximal 15 mW Ausgang), abgestimmt auf
die 488 nm-Linie. Vorwärts-Lichtstreuung,
90°-Lichtstreuung
und Fluoreszenzemissionen wurden gesammelt für 1 × 104 Zellen
unter Einsatz des Vorwärts-Lichtstreuungs-Parameters als das
Hauptsignal. Die Standardanalysenoptik stellte die FL1 (blau)/FL2
(grün)/FL3
(rot) PMT-Parameter bereit mit Impulsanalyse, durchgeführt an den
FL3 ausgehenden Signalen.
-
Cytometer D: Dreistrahlige mittlere
Leistung 633 nm/mittlere Leistung 488 nm/mittlere Leistung Mehrlinien-UV-Lasererregung:
Das System war ein FACS Vantage Zellsortierer (Becton Dickinson
Inc., Cowley, Großbritannien)
mit einem kohärenten
Enterprise 11-Laser, gleichzeitig emittierend bei Mehrlinien-UV(350–360 nm-Bereich)
und 488 nm Wellenlängen,
wobei die Strahlen nichtkolinear gemacht wurden unter Einsatz von
dichroitischen Separatoren. Eine strahlkombinierende Optik wurde
eingesetzt, um den UV-Strahl auszurichten auf denjenigen, der emittiert
wurde durch einen Spektra-Physics 127–35-Helium-Neon-Laser (maximal 35 mW Ausgang),
emittierend bei 633 nm mit einer temporalen Trennung von etwa 25 μsec. von
demjenigen des primären
488 nm-Strahls. Vorwärtslichtstreuung,
90°-Lichtstreuung
und Fluoreszenzemissio nen wurden gesammelt für 1 × 104 Zellen
unter Einsatz des Vorwärtslichtstreu-Parameters als Hauptsignal
von dem Primär-488
nm-Strahl, während
Seitenstreuung gesammelt wurde durch ein 488/10 nm Bandpaßfilter.
Die Analysenoptik war: i) vom Primärstrahl ausgehende Signale,
analysiert bei FL1 (FITC-Filter;
Barrierefilter von 530/30 nm) nach der Übertragung bei SP 610 und SP
560 dichroitisch oder bei FL2 (Barrierefilter von 585/42 nm oder
575/26 nm) nach der Übertragung
bei SP 610 und Reflektion bei SP 560 dichroitisch, oder bei FL3
(Barrierefilter von LP 715 nm), nach der Reflektion bei SP 610 dichroitisch;
ii) verzögerte,
vom Strahl ausgehende Signale, analysiert bei FL4 (Barrierefilter
von LP 695 nm) oder bei FL5 (Barrierefilter von DF 424/44 nm) nach
der Übertragung
oder Reflektion bei LP 640, jeweils dichroitisch. Vorwärts- und
90°-Lichtstreuung
wurden analysiert, um jegliche Zelltrümmer auszuschließen. Alle
Parameter wurden analysiert unter Einsatz von ZellQuest-Software
(Becton Dickinson).
-
Gesamte Zellfluoreszenz,
erfaßt
durch Fließcytometrie
-
Obwohl die DRAQ5-Erregung optimal
ist bei der 647 nm-Laserwellenlänge, zeigten
vorläufige
Studien an, daß die
Untersuchung suboptimal erregt werden konnte bei niedrigeren Wellenlängen, einschließlich Mehrlinien-UV 488 nm, 514 nm
und 633 nm. Es wurde versucht, DRAQ5 zu prüfen als DNA-Untersuchung für den Einsatz bei der Fließcytometrie
durch den Vergleich der vier unterschiedlichen Cytometer-Konfigurationen:
Cytometer
A: Einstrahlige Hochleistungs-647 nm-Krypton-Laser-Erregung.
Cytometer
B: Doppelstrahl-Niedrigleistungs-633 nm/Hochleistungs-488 nm-Laser-Erregung.
Cytometer
C: Einstrahlige Niedrigleistungs-488 nm-Laser-Erregung.
Cytometer
D: Dreistrahlige Mittelleistungs-633 nm/Mittelleistungs-488 nm/Mittelleistungsmehrlinien-UV-Laser-Erregung.
-
5 zeigt,
daß beim
Einsatz eines Niedrigleistungs-HeNe-Laser (Cytometer B) eine vollständige Trennung
nicht eintritt für
die Autofluoreszenz und DRAQ5-Signalen für lebensfähige HL-60-Zellen behandelt mit
niedrigen nicht ge sättigten
DRAQ5-Konzentrationen. Darüber
hinaus zeigen Studien (Daten nicht wiedergegeben) an, daß eine vollständige Trennung
erzielt werden konnte nach einer zweistündigen Inkubation mit 20 μM DRAQ5.
Jedoch sogar unter diesen begrenzenden Erregungsbedingungen zeigte
das 633 nm abgeleitete DRAQ5-Signal ein klares lineares Dosis-Ansprechen
(siehe Eintrag in 5)
bis herab auf etwa 2,5 μM, vergleichbar
mit der Linearität,
die erhalten wurde für
die optimale 647 nm-Erregung (unter Einsatz des Cytometers A) und
die Erfassung bei Wellenlängen > 780 nm.
-
6a und b zeigen, daß ein Niedrigleistungs HeNe-Laser
(Cytometer B) zum Einsatz kommen kann, um die DRAQ5-assoziierte
Fluoreszenz in Fluorescein-beladenen Zellen zu identifizieren, analysiert
in einer Dualstrahlkonfiguration. 6c und d zeigen, daß eine Koerregung von DRAQ5
und Fluorescein möglich
ist unter Einsatz eines Einzelstrahls von 488 nm-Wellenlänge (Cytometer
B). Es gibt eine klare Trennung von Signalen aufgrund der deutlichen,
sich nicht überlappenden
Spektren trotz des Signals niedriger Intensität, abgeleitet von der suboptimalen
Erregung von DRAQ5.
-
Es wurde versucht, die Einsatzfähigkeit
von DRAQ5 in einem einstrahligen Cytometer zu demonstrieren (d.
h. FACScanTM; Cytometer C). 7a–d zeigen typische Ergebnisse
bei der Demonstration der Fähigkeit
von DRAQ5, nukleierte Zellen in komplexen Populationen zu identifizieren. 7a zeigt die Erfassung der Zellzyklusverteilung über den
Zelloberflächenantigenausdruck
für intakte
Zellen. 7b zeigt die
Diskriminierung von Untergruppen entsprechend dem Färbungspotential,
während 7c und 7d die Anwendbarkeit von DRAQ5 demonstrieren
bei der Erfassung nukleierter Zellen in dem gesamten Blut und dem
lysierten Blut. Faktoren, die sich auf die Fähigkeit von DRAQ5 beziehen
zur Färbung
von Kernen, sind in der Tabelle analysiert. Beim Einsatz lebensfähiger kultivierter
asynchroner Zellen (Präparation
1) färbte
DRAQ5 rasch Zellen in einer reproduzierbaren Weise und erzeugte
Fluoreszenz, deutlich abgehoben von dem Autofluoreszenzhintergrund. Die
großen
sd-Werte leiten sich von der Zellausbreitung durch den Zellzyklus
ab. Der mittlere Wert reflektiert den mittleren zellularen DNA-Gehalt,
wie verdeutlicht durch den 1,7-fachen Anstieg von G2-arretierten
Populationen. Die Bearbeitung von Zellen für die Oberflächenantigen-Analyse (Präparation
2) beeinflußt
die obigen Charakteristika nicht. Die Isolation von intakten mononuklearen
Blutzellen (Präparationen
3 und 4) führt
zu Proben, die in einem praktischen Zelldichtebereich gefärbt und
für die
Oberflächenantigen-Analyse
bearbeitet werden können.
Bei den Präparationen
3 und 4 wurde durchgängig
ein verstärktes
Färbungspotential
von Monocyten gegenüber
Lymphocyten beobachtet (1,14–1,4-fach),
was anzeigte, daß das
Färbungspotential
lebensfähiger
Zellen zum Einsatz kommen kann als Faktor für Subpopulationsdiskriminierung.
Die Ergebnisse für
das gesamte Blut zeigen, daß nukleierte
Zellen (einschließlich
Granulocyten) bis zu einem ähnlichen
Grad gefärbt
werden können
in der Anwesenheit (Präparation
5) von roten Blutzellen (RBCs) oder nach einer RBC-Lyse und milder
Fixierung (Präparation
6).
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8 faßt die DRAQ5-konzentrationsabhängigen Unterscheide
zusammen bei der DRAQ5-Färbung lebender
Zellpopulationen, die man erhielt unter Einsatz der Präparationsverfahren
1 und 2 (siehe die Fußnote zur
Tabelle). Die Populationen zeigen ähnliche Titrierkurven, wobei
die Sättigung
eintritt in einer Weise, die den relativen DNA-Gehalt (für einen
gegebenen Zelltyp, z. B. SUD4) oder das nukleare Färbungspotential
(z. B. Lymphocyten gegenüber
Monocyten) bei Konzentrationen von ≥ 10 μM wiedergibt.
-
9 demonstriert
die Einsetzbarkeit von DRAQ5 für
die Erfassung des zellzyklusspezifischen Ausdrucks eines Intrazellularproteins
in fixierten Zellen, erfaßt
unter Einsatz von fluorchrommarkierten Antikörpern, aktiviert durch 488
nm (FITC) und Mehrlinien-UV-Wellenlängen (Cytometer D). 10a–f zeigen,
daß es
bei einer Dreistrahlkonfiguration (Cytometer D) möglich ist,
DRAQ5-Fluoreszenz zu demonstrieren, aktiviert durch zwei getrennte
Strahlen bei der Diskriminierung auf einem dritten für die Überwachung
relativ seltener Zellzyklusereignisse, wie etwa dem Hochcyclin-B1-Ausdruck
in G2/M von asynchronen Kulturen.
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Somit zeigt
5 Fließcytometrie-Analysen der DRAQ5-Akkumulation für eine einstündige Aussetzungsperiode
in lebensfähigen
HL60-Zellen. Die
Häufigkeitsverteilungshistogramme
sind für
Niedrigleistungs-633 nm-Wellenlängenerregung
unter Einsatz des Cytometers B. Symbole: O,
und ∎ repräsentieren
0,5 bzw. 10 μM
DRAQ5. Eintrag: Linearität
des DRAQ5-Dosis- Ansprechens
unter Einsatz zweier unterschiedlicher Cytometer (nämlich B
und A mit Korrelationskoeffizienten von 0,96 und 0,97 für 633 nm
bzw. 647 nm-Erregungen.
-
6a–d zeigen dualstrahlfließcytometrische
Analysen (Cytometer B) für
die Erfassung von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz in fluoresceinmarkierten
lebensfähigen
HL60-Zellen. Repräsentative
fließcytometrische
Eintragungen mit zwei Merkmalsvariablen von grün (FL2-Höhe; Fluorescein) über tiefrot/langwelliges
Infrarot (FL1-Höhe,
DRAQ5) Gesamtzellenfluoreszenz-Signale. Die Felder a und b zeigen
Dualstrahlerregung von Fluorescein (488 nm) und DRAQ5 (Niedrigleistung
633 nm). Feld: a, FDA (0,2 μM
für 10
Minunten allein); b, Zelle penetriert mit 5 μM DRAQ5 eine Stunde lang vor
der FDA-Behandlung. Felder c und d wiederholen die gleichen Zellbehandlungszustände mit
Ausnahme des Einsatzes einer einstrahligen Erregung bei 488 nm für Fluorescein
und DRAQ5. Die Zahlen geben den Prozentsatz torgesteuerter Ereignisse
innerhalb der Quadrantenbereiche an.
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7a–d zeigen einstrahlige fließcytometrische
Analysen (Cytometer C) von DRAQ5-Fluoreszenz (FL3-Bereich) an über Antikörperfluoreszenz
(FL2-Höhe überwachend
Phycoerythrin-markiertes Anti-CD19 oder FL1-Höhe überwachend FITC-markiertes
Anti-CD45) für
kultivierte und von Blut abgeleiteten menschlichen Zellen. Zellsuspensionen
(2,5 × 105/ml) wurden in phosphatgepufferter Saline
gehalten mit einem Gehalt von 1% Bovinserumalbumin. Mononukleare
Zellsubpopulationen menschlichen Bluts, erhalten unter Einsatz von
Standard-Ficoll-Gradient-Separation,
wurden identifiziert und torgesteuert entsprechend ihren Vorwärts- und
Seitenlichtstreucharakteristika. Doubletten wurden ausgeschlossen
durch Impulsanalyse, torgesteuert auf dem normalen FL3-Bereich über FL3-Breitenparamterwerte.
Feld a: Kultivierte asynchrone SUD4-Lymphzellen. Feld b: Mononukleare
Zellsubpopulationen von Blut, erhalten unter Einsatz von Standard-Ficoll-Gradient-Separation.
Feld c: Gesamtblut (ausgelöst
auf CD45 + Ereignissen). Feld d: Lysiertes gesamtes Blut. Mit einem
Pfeil versehene Subpopulation: G1, S und G2/M repräsentieren
Zellzyklusphasen; L, Lymphocyten; M, Monocyten; G, Granulocyten;
N, Plasmamembrane ohne Kern.
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8 zeigt
eine einstrahlige niedrige cytometrische Quantifizierung (Cytometer
C) der Fluoreszenzintensität
von kultivierten und von Blut abgeleiteten menschlichen Zellen,
die 5 Minuten lang DRAQ5 bei Raumtemperatur ausgesetzt waren. Die
Daten sind mittlere Werte (±SD)
und repräsentieren
Ergebnisse von einem typischen Experiment. Symbole: O, kultivierte
asynchrone SUD4-Lymphzellen; ⧠,
SUD4-Zellen, die 18 Stunden lang 0,25 μM VP-16 ausgesetzt waren zum
Arretieren der Zellen in der S-Phase und G2 des Zellzyklus; Lymphocyten; ∎,
Monocyten.
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9 zeigt
eine dualstrahlfließcytometrsiche
Analyse (Cytometer D des zellzyklusspezifischen Ausdruckes von Cyclin
B1. Fixierte, RNaseAausgelaugte und DRAQ5-gefärbte (FL3; 488 nm-Erregung) SUD4-Zellen
wurden erhalten von einer asynchronen Kultur, die 18 Stunden lang
0,25 μM
VP-16 ausgesetzt waren zum Akkumulieren von Zellen in G2/M. G2/M-Phasen
ausgedrücktes
Cyclin B1-Protein wurde überwacht
durch indirekte Immunoflureszenz unter Einsatz von AMCA-markiertem
zweiten Antikörper
(FL5-Höhe; Multilinien-UV-Erregung) zur Erfassung
der Bindung des Anticyclins B1 (GNS1) monoclonalen Mouse IgG. Felder
a und c zeigen Antikörperkontrollen
(nicht spezifisches IgG plus zweitem Antikörper). Felder b und d zeigen
Ergebnisse für
spezifischen Antikörper
plus zweiten Antikörper.
Antikörper
wurden erhalten von Santa Cruz Biotechnology Inc. Mit Pfeilen versehene
Subpopulationen: G1, S und G2/M repräsentieren Zellzyklusphasen.
Der nicht bezeichnete Pfeil zeigt die erwartete Position von Zellen,
die ein hohes Niveau von Cyclin B1 ausdrücken und sich in G2/M des Zellzyklus
befinden.
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10a–f zeigen Dreistrahlfließcytometrie-(Cytometer
D)-Analysen von DRAQ5-gefärbten
fixierten und RNaseA ausgelaugten asynchronen SUD4-Lymphzellen. DRAQ5-Fluoreszenz
(Impulshöhe)
wurde überwacht
durch FL3 (488 nm-Erregung) und FL4 (633 nm-Erregung). Zellzyklusunabhängiges Cdc2-Protein
und die G2/M-Phase, ausgedrückt
durch Cyclin B1-Protein wurden überwacht
durch indirekte Immunofluoreszenz unter Einsatz von FITC-markiertem
zweitem Antikörper
(FL1-Höhe;
488 nm-Erregung), um die Bindung des Anti-Cdc2 p34 (H-297) polyclonalem
Kaninchen IgG zu erfassen und AMCA-markiertem zweiten Antikörper (FL5-Höhe; Mehrlinien-UV-Erregung),
um die Bindung des Anticyclin B1 (GNS1) monoclonalen Maus IgG zu erfassen.
Antikörper
wurden erhalten von Santa Cruz Biotechnology. Felder: a und b, DNA über Cdc-2
p34; c und d, DNA über
Cyclin B1; e und f, DNA-Histogramme für blaue bzw. rote Erregungswellenlängen. Mit
Pfeilen versehene Subpopulationen: G1, S und G2/M repräsentieren
Zellzyklusphasen; HCyB, Hochcyclin B1 um Zellen auszudrücken, die
sich im G2/M des Zellzyklus befinden.
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Fließcytometrische Analyse von
Mehrlinien-UV-Errequngen von DRAQ5-gefärbten Zellen
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Die Absorbanzspitzen, die bei Wellenlängen < 400 nm festgestellt
werden, lassen vermuten, daß Chromophor-Erregung
in der Nähe
von UV-Wellenlängen möglich sein
sollte (Daten nicht wiedergegeben). Es wurde demonstriert, daß DRAQ5-gefärbte Zellen
von lebenden Zellen erregt werden können in der Nähe des UV-Bereichs
des Spektrums, wie dargestellt wurde, durch den Einsatz von Mehrlinien-UV-Cytometrie
(Cytometer B; 11a–c). Obwohl die UV-Erregung
weniger effizient ist als bei der Wellenlänge von 647 nm (11b) und die Erfassung eine
erhöhte
Photomultiplikator-Signalverstärkung
erfordert, reflektieren die Fluoreszenzintensitäten klar die zellulare DNA-Gehaltverteilung
(11c). Dies demonstriert,
daß bei
Dreistrahlkombinationen DRAQ5 ein DNA-Diskriminierungssignal bereitstellen
kann, abgeleitet von UV- und Sichtbereichserregungs-Wellenlängen.
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11a–c zeigen die 488 nm (Feld
a), 647 nm (Feld b) oder Mehrlinien-UV-(350–360 nm-Bereich; Feld c), Erregung
von DRAQ5 in intakten SUD4-Lymphzellen
für eine
Emission bei > 695
nm-Wellenlängen und
analysiert durch Mehrstrahlfließcytometrie
(Cytometer D). Die dicken Linien reflektieren den zellularen DNA-Gehalt
der DRAQ5-gefärbten
Zellen; schwache Linien repräsentieren
nicht-gefärbte
Kontrollzellen; gestrichelte Linien repräsentieren Bezugs-Allophycocyanin-(APC)
gefärbte
Bezugsmikroperlen, eingesetzt als 647 nm erregbaren Standard.
-
Beispiel 6
-
Unterschiedliche zellulare
Akkumulation von N-Oxidderivat von DRAQ5 (DRAQ5NO) bei der Diskriminierung von
intakten und toten Zellen.
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Die Fähigkeit, intakte lebensfähige Zellen
zu unterscheiden von denen, die den verschiedenen Stufen eines Zelltodes
unterliegen, kann erzielt werden durch die unterschiedliche zellulare
Akkumulation von chemischen Proben, einschließlich bestimmten Fluorchromen.
Ein besonderer Typ des Zelltodes, der als Apoptosis bezeichnet wird,
besitzt unterscheidbare frühe
Stufen, die in intakten Zellen auftreten können. Die Diskriminierung wird
eingesetzt extensiv sowohl in biologischen als auch klinischen Prüfungen.
Beispielsweise können fließcytometrische
Prüfungen
eine Identifizierung gestatten sowie Quantifizierung, Analyse, Präparation
oder Ausschluß von
Zelluntergruppen. Die Probenaufnahme und -Haltung hängt ab von
mehreren Faktoren einschließlich
der Integrität
der Plasmamembran (z. B. Einfluß auf
den Probeneingang) und das intrazelluläre Verhalten der Probe (z.
B. die Probenbindung an nukleare DNA). Die gegenwärtige fluormetrische
Prüfung
bezüglich
des Zelltodes kann die Fähigkeit
zum Einsatz bringen, daß intakte
lebensfähige
Zellen ungefärbt
verbleiben durch den Ausschluß der
Probe (z. B. die fluoreszierende DNA-Farbe Propidiumjodid), während Zellen
mit beeinträchtigten
Membranen einen Zugang der Probe zum nuklearen DNA gestatten. Zellen,
die einer frühen Stufe
des apoptotischen Zelltodes unterliegen, können identifiziert werden dadurch,
daß die
Zelloberfläche
das fluorchrommarkierte Chemikal bindet, Annexin V, während sich
jedoch kein Verlust der Membranintegrität zeigt. Die späteren Stufen
des Zelltodes und der Apoptosis sind, wenn die Plasmamembranen unterbrochen werden,
assoziiert mit hoher Annexin-V-Bindung
und hoher Probidiumjodid-DNA-Färbung.
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Hier wird der Einsatz eines N-Oxid-Derivates
exemplifiziert von DRAQ5 (DRAQ5-NO), welches eine Verstärkung bereitstellt
zur Lebens-Tod-Zelldiskriminierung.
DRAQ5NO ist in der Lage, in intakte lebensfähige Zellen einzudringen und
hierin gehalten zu werden bei niedrigem Niveau, wodurch eine positive
Diskriminierung für
intakte Zellen bereitgestellt wird. In Kombination mit einer sekundären Probe
(z. B. Annexin V) ergibt sich eine verstärkte Diskriminierung beim Fortschreiten
der Zellen durch den Vorgang des Zelltodes oder der Apoptosis. Die
vier Stufen entsprechend dem Färbemuster
sind:
Stufe 1: DRAQ5NO positiv/Annexin V negativ (intakte lebensfähige Zellen)
Stufe
2: DRAQ5NO positiv/Annexin V positiv (frühe Stufe apoptotischer Zellen)
Stufe
3:DRAQ5NO hochpositiv/Annexin V positiv (späte Stufe apoptotischer/toter
Zellen)
Stufe 4: DRAQ5NO negativ/Annexin V positiv (kernfreie
zellulare Trümmer).
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12a–d und 13a–d illustrieren Beispiele unter Einsatz
einer menschlichen B-Zell-Lymphzellenlinie, die in der Lage sind,
das Fortschreiten zu zeigen durch die Apoptosis in Abhängigkeit
von der Antikrebsdroge VP-16 (Etoposid) für ein 18-stündiges Aussetzen von 0,25 μM. Zellen
wurden präpariert
durch Standardverfahren für
Annexin V-FITC-Bindung, gleichzeitig ausgesetzt 50 μM DRAQ5NO
und dann verdünnt
1 : 5 in phosphatgepufferter Saline vor der fließcytometrischen Analyse unter
Einsatz von Cytometer D. Das Instrument wurde eingesetzt in einem
Dual-Laser-Verfahren mit einer Wellenlängen-Erregung bei 488 nm von
FITC (überwacht
durch den Parameter FL1-H) und 633 nm Wellenlängen-Erregung von DRAQ5NO (überwacht durch
den Parameter FL4-H). 12a–d zeigen die Kombinationen von Reagenzbehandlungen
(Anx = Annexin V-FITC; AQ5N = das N-Oxidderivat von DRAQ5) für Kontrollzellen
und 13a–d zeigt die gleiche Kombination der Reaktionsmittel
für VP-16
(z. B. VP) behandelten Kulturen. Die Ergebnisse zeigen das geringe Niveau
der DRAQ5NO-Färbung,
erreicht in Stufe 1-Populationen, und das erhöhte Niveau in Stufe 3-Zellen. Die
Frequenz der Zellen, die Annexin V positiv sind, steigt an durch
die VP-16-Behandlung,
aber umfaßt
drei Populationen (Stufen 2–4),
die unterscheidbar sind unter Einsatz der Quadranten-Analyse, die
in den Aufzeichnungen wiedergegeben ist. Die Verstärkung, die
durch den Einsatz von DRAQ5NO zur Verfügung gestellt wird, bezieht
sich auf zwei Merkmale. Zum ersten gestatten die vorteilhaften Spektraleigenschaften
des DRAQ5-Derivats eine Trennung der Proben-Erregungsereignisse durch den Einsatz
von zwei Lasern und/oder das stark reduzierte Spektralüberlappen
der Probenemissionssignale. Zum zweiten ergibt sich die positive
Diskriminierung von intakten Zellen von kernfreien Zelltrümmern.