DE69911011T2

DE69911011T2 - Anthrachinonverbindungen und ihre derivate

Info

Publication number: DE69911011T2
Application number: DE69911011T
Authority: DE
Inventors: James Paul Cowbridge SMITH; Laurence Hylton Anstey PATTERSON
Original assignee: Biostatus Ltd
Current assignee: Biostatus Ltd
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2019-06-16
Also published as: JP2002531587A; CA2340670A1; EP1086178A1; DK1086178T3; US7605280B2; EP1086178B1; US7060427B2; PT1086178E; WO1999065992A1; ATE248897T1; US6468753B1; CA2340670C; JP4629871B2; AU4380499A; ES2207232T3; US20030008316A1; AU771378B2; US20060148777A1; DE69911011D1; GB9813062D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Anthraquinon und seine Derivate, im besonderen – obwohl nicht ausschließlich – einschließlich seiner Anwendungen im Bereich von Fluoreszenserfassungstechnologien.
Es gibt eine Anzahl von DNA-Bindungsfluorchromen, die verfügbar sind und den UV-Bereich und den sichtbaren Bereich des Spektrums abdecken. In jüngerer Zeit sind sehr helle DNA-einschiebende Cyanin-Fluorchrome, basierend auf modifizierten Dimeren von Thiazolorange, kommerziell verfügbar geworden. Diese Cyaninfarben teilen nicht die zelldurchdringenden Eigenschaften von anderen DNA-spezifischen UV-aktivierten Fluorchromen. Darüber hinaus besitzen die üblicherweise eingesetzten DNA-interaktiven Fluorchrome fluoreszente Zeichnungen, die diejenigen anderer Fluorochromen überlappen, die aktiviert sind in dem Spektralbereich sichtbaren Lichts, welche zum Einsatz kommen als molekulare Marken zur Untersuchung von Aspekten von zellbiologischen oder biologischen Strukturen. Beispiele gegenwärtig bekannter Cyaninfarben werden beschrieben in der US 5410030 und US 5436134 .
Die vorliegende Erfindung versucht zellpermanente DNA-aktive Mittel zu entwickeln, die Fluoreszenzzeichnungen bereitstellen, welche sich in den Infrarotbereich des Spektrums hineinerstrecken. Solch ein Mittel könnte beispielsweise optimal erregt werden durch Rotlinien emittierende La ser/Multifluorchromanwendungen, sowohl für fixierte Proben als auch lebende Zellen.
Dementsprechend wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, die die folgende Formel (I) besitzt:
wobei jeweils X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² sind und wobei A eine C₂ _-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind von Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² zusammen eine C_2-6-Alkylengruppe bilden, die mit dem Stickstoffatom, an welchem R¹ und R² anhängen, einen heterozyklischen Ring bildet, und wobei die Zusammensetzung (I) wahlweise in der Form eines Säuresalzes vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure.
Der Begriff "Alkylen" wird hier eingesetzt mit der Bedeutung einer Alkylkette.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besitzt der Ring, wenn R¹ und R² einen heterozyklischen Ring bilden, 3 bis 7 Atome hierin. Vorzugsweise sind sowohl X₁ als auch X₂ beide NH(CH₂)₂NR¹R². Im besonderen wird bevorzugt, dass sowohl R¹ als auch R^2-C_1-4-Alkylgruppen sind, vorzugsweise Methylgruppen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die die folgende Formel besitzt (II)
Gemäß einer Ausführungsform kann die Zusammensetzung (II) die Form ihres N-Oxidderivates aufweisen.
Die Zusammensetzung der allgemeinen Formel (I) und deren N-Oxidderivate und im besonderen die spezielle Zusammensetzung (II) können beispielsweise eingesetzt werden als DNA-Farbstoff und können eine rein synthetische Zusammensetzung sein, die lösbar ist in biologisch verträglichen Lösungsmitteln einschließlich Wasser. Die Zusammensetzung (II) besitzt eine hohe Infinität hinsichtlich DNA (die DNA-Bindungskonstante liegt bei etwa 10⁷ M^–1) und besitzt die Fähigkeit, rasch in lebende Zellen einzudringen.
Das Absorbtionsspektrum für die Zusammensetzung (II) zeigt Ex_max in der Nähe von 647 nm und erzeugt ein Fluoreszenzspektrum, welches sich erstreckt von 665 nm bis über 780 nm Wellenlängen hinaus (Em_max liegt bei etwa 677.5 nm).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, zur Herstellung einer Zusammensetzung mit der folgenden Formel (I)
wobei sowohl X₁ als auch X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² sind und wobei A eine C_2-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind von Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² zusammen eine C_2- ₆-Alkylengruppe bilden, mit welchem das Stickstoffatom, an welchem R¹ und R² anhängen, einen heterozyklischen Ring bildet und wobei die Zusammensetzung (I) wahlweise in der Form eines Säuresalzes vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure und wobei das Verfahren den Schritt der Reaktion einer Zusammensetzung der folgenden Formel (III) umfaßt
mit NH₂-A-NR¹R², wobei A, R¹ und R² wie oben definiert sind.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise darüber hinaus den Schritt der Behandlung der sich ergebenden Verbindung mit einer Säure, vorzugsweise konzentrierter Schwefelsäure. Zusätzlich kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren darüber hinaus die anschließende Behandlung mit Natriumchlorat und/oder Natriumhydrogensulfid umfassen.
Modellieren hat demonstriert, dass die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung stabile, eingeschobene Komplexe mit DNA bilden können. Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein fluoreszierender Komplex bereitgestellt, mit einer Nukleinsäure und einer Verbindung der folgenden Formel (I):
wobei sowohl X₁ als auch X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² sind und wobei A eine C_2-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind von Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² zusammen eine C_2-6-Alkylengruppe bilden, mit welcher das Stickstoffatom, an welchem R¹ und R² hängen, einen heterozyklischen Ring oder ein N-Oxidderivat hiervon bildet,
und wobei die Verbindung (I) oder ihr N-Oxidderivat wahlweise in der Form eines Säuresalzes vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure.
Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA. Es wurde herausgefunden, dass die DNA in einer lebenden Zelle anwesend sein kann. Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können fixierte menschliche Chromosomen markieren. Wenn das DNA: Verbindungsmolverhältnis ansteigt, liegt ein bathochromischer Wechsel in der Verbindung vor plus DNA-Lösungsspektrum. Bei hohen DNA: Verbindungsverhältnissen, die innerhalb lebender Zellen erreichbar sind, trägt der Spektralwechsel bei zu einer bereits signifikanten Trennung des Verbindungs-DNA-Emissionsspektrums von demjenigen eines Beispiels einer rot fluoreszierenden Verbindung Cy 5.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Analysieren einer Zelle oder eines biologischen Materials, welches eine oder mehrere Nukleinsäuren enthält, mit den folgenden Schritten:

a) Herstellen einer biologisch kompatiblen Lösung, welche eine Verbindung der Formel (1) enthält:
wobei jeweils X₁ als auch X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² sind und wobei A eine C_2-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind von Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² zusammen eine C₂ _-6-Alkylengruppe bilden, mit welcher das Stickstoff atom an welchem R¹ und R² anhaften, einen heterozyklischen Ring bildet, oder ein N-Oxidderivat hiervon und wobei die Verbindung (I) oder ihr N-Oxidderivat wahlweise in der Form eines Säuresalzes vorliegt, abgeleitet von einer organischen oder anorganischen Säure,
b) Behandeln der Zelle oder des biologischen Materials mit der biologisch kompatiblen Lösung,
c) Erregen der Verbindung (I) in der behandelten Zelle oder dem biologischen Material mit einer Lichtquelle und
d) Erfassen des emittierten Fluoreszenzsignals.

Die Verbindung der Formel (I) kann in ihrem freien Zustand vorliegen oder komplex mit einem anderen Molekül/Molekülen, beispielsw. entweder über eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung.
Die Lichtquelle stellt bevorzugt (eine) Wellenlänge (n) bereit in dem Spektralbereich der Wellenlänge (n) der maximalen Absorption der Verbindung (I).
Es wurde herausgefunden, daß die Fluoreszenzzeichnung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sich in den Infrarotbereich des Spektrums hinein erstreckt. Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in der Zelle oder dem biologischen Material anwesend sein in Kombination mit einer oder mehreren Fluorchromen oder Licht emittierenden Verbindungen. Die anderen Fluorchorome können Licht emittieren in den UV-Bereich oder den sichtbaren Bereich des Spektrums. Somit eignen sich die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für eine Multiparameteranalyse mit anderen Fluorchromen mit Spektren, die sich überlappen mit denjenigen, die üblicherweise eingesetzt werden in dem sichtbaren Bereich der DNA-Proben.
Die eine oder mehrere andere Verbindungen) können zum Einsatz kommen, um beispielsweise Annexin V zu erfassen, und werden vorzugsweise in Kombination eingesetzt mit dem N-Oxidderivat der Verbindung (I). Eine Strömungscytometrische Analyse, beispielsweise mit dem Instrument im Duallasermodus, kann zum Einsatz kommen. Die Erfindung kann dementsprechend einen Weg bereitstellen zum Unterscheiden intakter lebender Zellen von denjenigen, die den verschiedenen Stufen des Zelltodes unterliegen.
Somit stellen die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung weit eindringende rot/infrarot fluoreszierende DNA-Farben bereit, die geeignet sind für die Zellular-DNA-Analyse, wobei intakte Zellen erforderlich sein können, beispielsw. bei der Erfassung von Molekülen entweder an der Zellober fläche (z. B. ein Rezeptormolekül oder einem Marker für eine Differenzierung) oder innerhalb von Zellen (z. B. cytosolische Enzyme) durch Verfahren, die die Aufrechterhaltung der Membranintegrität erfordern, um eine Zerstörung oder einen Verlust solcher Moleküle zu verhindern.
Wie zuvor erwähnt, können bei diesem Verfahren die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren färben bzw. markieren in fixierten menschlichen Chromosomen, fixierten Zellen und fixierten biologischen Materialien sowie bei Verfahren, die die Permeabilität der lebenden Zellmembranen modifizieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in einer biologischen Probe bereitgestellt. Die Zusammensetzung (I) kann entweder in ihrem freien Zustand vorliegen oder komplex mit anderen Molekülen entweder durch kovalente oder nicht kovalente Bindung in der biologischen Probe. Die Verbindung (I) kann als N-Oxidderivat hiervon vorliegen. Die biologische Probe ist vorzugsweise ein rasches und/oder große Kapazität aufweisendes Handhabungsverfahren. Der Einsatz der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie angegeben durch die Verbindung (I), als Diskriminierungs- oder Orientierungsparameter für Zellkerne hat sich als geeignet erwiesen sowohl für die Strömungscytometrie als auch confocale Lasermikroskopie.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in der Cytometrie bereitgestellt. Die Verbindung (I) ist optional als ein N-Oxidderivat hiervon anwesend. Das Cytometrieverfahren kann beispielsweise einstrahlige oder mehrstrahlige Strömungscytometrie sein.
Beispielsweise wurde die einstrahlige (488 nm) Strömungscytometrie eingesetzt, um die Eignung der Verbindung (I)-nuclear-DNA-Fluoreszenz (vorzugsweise Verbindung (II)-nuklear-DNA-Fluoreszenz) als Unterscheidungsparameter für menschliches Blut und Lymphzellen zu demonstrieren in Verbindung mit Fluorchrom gekennzeichneten Antikörpern für die Erfassung von Oberflächenantigenen und Subpopulationerkennung. Von der Verbindung (I)-Fluoreszenz hat sich gezeigt, daß sie den zellularen DNA-Gehalt reflektiert, wie indiziert durch die Zellzyklus-DNA-Verteilungsprofile zum exponentiellen Profilieren von Zellpopulationen, die eine stabile oder asynchrone Verteilung von Zellen zeigen in Bezug auf das Zellzyklusalter, oder für gestörte Zellpopulationen, bei welchen beispielsweise Drogenwirkung eine Verzögerung oder ein Arretieren der Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt des Zellzyklus erzeugt hat. Gemäß einer Ausführungsform zeigt die Dualstrahlströmungscytometrie (488 nm/633 nm) die selektive Erregung der Verbindung (I), vorzugsweise der Verbindung (II), und die Fluoreszenz in intakten Zellen. Darüber hinaus wurde bei einer Ausführungsform der Einsatz der Verbindung (I), vorzugsweise der Verbindung (II), bei Dreistrahlströmungscytometrie (Multilinien UV/488 nm/633 nm) in Anwendungen demonstriert, welche verzögerte Signaldiskriminierung involvierten, wobei die Strahltrennung die Diskriminierung des Erregerstrahls gestattet assoziiert mit einem Fluoreszenz-Emissionssignal durch Bezugnahme auf die Verzögerung der Signalankunft bei einem Detektor.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) in der Mikroskopie bereitgestellt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat anwesend sein.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Mikroskopie um confocale Lasermikroskopie (CLSM). Beispielsweise zeigt die CLSM, die entweder 647 nm oder 568 nm Wellenlängenerregung der intrazellularen Verbindung (I) einsetzt, vorzugsweise der intrazellularen Verbindung (II), Fluoreszenz, welche sich speziell in der Kern freisetzenden nuklearen Architektur innerhalb lebender oder fixierter menschlicher Zellen befindet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) als ein Nuklearfärbemittel bereitgestellt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat vorliegen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Einsatz der Verbindung (I) als Abbildemittel eingesetzt. Die Verbindung (I) kann als ihr N-Oxidderivat vorliegen.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Verbindung (I) als Abbildemittel bei einer Multiphotonerregungsabbildung zum Einsatz kommen.
Duale Wellenlängenabbildung unter Verwendung der Verbindung (I) zur Freisetzung nuklearer Form kann eingesetzt werden, um die Heterogenität bei der Esterase-abhängigen Fluoresceinbelastung der gesamten Zellen und bei der Bewertung der mitochondrischen Funktion durch Rhodamin 123 kennzeichnen, zu demonstrieren. Bei derartigen Abbildungsanwendungen zeigt die Verbindung (I) keine Evidenz von Fotobleichen und war dauerhaft.
Somit können die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung betrachtet werden als ein Fluorchrom zur Anwendung als ein Mittel für den Einsatz bei der Kalibrierung, Standardisierung und Konfigurierung von auf Fluoreszenz basierenden Systemen. Die bevorzugte Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung (II)-tief rot fluoreszierendes Bisalkylaminoanthraquinon (DRAQ5).
Es wurde gefunden, daß die hohe Penetration von Rotlinienlaserstrahlen in Gewebe hinein und die dauerhaften Eigenschaften der Komponenten gemäß der vorliegenden Erfindung eine Kombination bereitstellen, die eine dreidimensionale Orientierung und Lokalisierung der Kerne innerhalb lebender Gewebe gestatten. Außerdem machen es die preisgünstige Verfügbarkeit von HeNe-Lasern oder anderen Rotlicht emittierenden Einrichtungen mit verstärkter Leistung den Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, Anwendung zu finden in Erfassungssystemen, bei welchen Fluoreszenzsignatur als Unterscheidungsparameter zum Einsatz kommen kann.
Während die Erfindung oben beschrieben wurde, erstreckt sie sich auch auf jegliche erfinderische Kombination der Merkmale, die oben oder in der nachfolgenden Beschreibung zur Ausführung kommen.
Die Erfindung wird nun beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen und Beispiele beschrieben. Hierbei zeigen:
1a–c Spektralcharakteristika von DRAQ5,
2a–f Spektralcharakteristika von DRAQ5 assoziierter DNA-Fluoreszenz erfaßt durch CLSM,
2g die Multiphotonabbildung von DRAQ5 gefärbten Zellkernen,
2h–k einen Vergleich der sichtbaren Zellen, gefärbt mit DRAQ5 oder seinem N-Oxidderivat (DRAQ5N),
3a–d die differenzierte Erregung von Fluorescein und DRAQ5 in le benden A375 Zellen analysiert durch CLSM,
4a–c die differenzierte Erregung von Rhodamin 123 und DRAQ5 in lebenden A375 Zellen analysiert durch confocale Laserscan mikroskopie,
5 fließcytometrische Analysen von DRAQ5 Akkumulation für eine Aussetzungsdauer von einer Stunde in lebenden HL60 Zellen,
6a–d Dualstrahlfließcytometrieanalysen zur Erfassung von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz in Fluorescein gekennzeichneten lebenden HL60 Zellen,
7a–d Einstrahlfließcytometrieanalyse von DRAQ5 Fluoreszenz über Antikörperfluoreszenz für kultivierte und blutabgeleitete menschliche Zellen,
8 einstrahlfließcytometrische Quantifizierung der Fluoreszenzin tensität von kultivierten und blutabgeleiteten Zellen, die DRAQ5 aus gesetzt waren,
9 dualfließcytometrische Analyse des Zellzyklus speziellen Ausdruckes von Zyklin B1.
10a–f dreifachstrahlfließcytometrische Analysen von DRAQ5 gefärbten fixierten und RNaseA ausgelaugten asynchronen SUD4 Lymphzellen,
11a–c fließcytometrische Analyse des zellularen DNA-Gehaltes von intakten SUD4 Lymphzellen unter Einsatz von 488 nm, 633 nm oder Mehrlinien-UV-Erregung,
12a–d Beispiele von zellularer Akkumulation unter Einsatz einer menschlichen B-Zellen Lymphzelllinie unter Einsatz von Kombinationen von Reagenzbehandlungen und
13a–d Beispiele unter Wiedergabe der gleichen Kombination der Reagenzien für VP-16 behandelte Kulturen.
Beispiel 1 Synthese von DRAQ5
Verfahren:
1,5-Dichloranthroquinon (15 g, 54 mmol) wurden gelöst in N,N-Dimethylethylendiamin (47, 68, 540 mmole) und 18 Stunden lang im Rückfluß geführt. Die Reaktion wurde überwacht durch TLC (9 : 1 CH₂Cl₂/MeOH). Die Mischung wurde abgekühlt auf Zimmertemperatur und verdünnt mit Wasser, um die titulierte Verbindung auszufällen. Die gefilterten Feststoffe wurden rekristallisiert von Methanol, um (A) (15,89, 89%) einen kristallinen Feststoff zu erhalten. Rf (9 : 1 CH₂Cl₂/MeOH) : 0,60.
¹H NMR (CDDl₃): δ 9,8 (t, 2H), 7,6 (m, 4H), 6,9 (m, 2H) 3,4 (q, 4H), 2,7 (t, 4H), 2,4 (5, 12H). Massenspektrum, m/z 381 (m⁺+ 1).
Das Anthracen-9,10-dionderivat (A) (6 g, 15,8 mmole) wurde gelöst in 65 g konzentrierter H₂SO₄ und abgekühlt auf 10°C. Wasserfreies Natriumchlorat (6,5 g, 61,6 mmole) wurde in Teilen über 1,5 Stunden zugesetzt und die Mischung dann 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die blaue Lösung wurde langsam einer kalten Natriumwasserstoffsulfidlösung (1%, 1000 ml) zugegeben. Die Mischung wurde neutralisiert auf einen pH-Wert 7 mit 5 M NaOH. Die titulierte Verbindung (B) wurde aus der wässrigen Phase extrahiert mit CH₂Cl₂ und unter Vakuum konzentriert. Die Säulenchromatographie (SiO₂, 9 : 1 CH₂Cl₂/MeOH) ergab (B) (1,2 g, 20%).
Beispiel 2
Synthese von DRAQ5N [1,5-Bis-((2-dimethylamin-N-oxid)ethyl)amino)-4,8-dihydroxyanthracen-9,10-dion]
Die titulierte Verbindung wurde hergestellt aus Beispiel 1 (DRAQ5) wie folgt. DRAQ5 (0,1 g, 24 mmol) wurden Meta-chlorperoxibenzolsäure (80% Reinheit, 0,186 g, 0,96 mmol) beigegeben in trockenem Dichlormethan und bei minus 20°C über Nacht stehen gelassen. Das Rohprodukt wurde einer Silicasäulenchromatographie unterworfen unter Einsatz von 9 : 1: 0,1 Dichlormethan : -Methanol : Ammoniak (0,88 spezifisches Gewicht) als eluierendem Lösungsmittel. Die titulierte Verbindung wurde als ein blaues Pulver isoliert. Schmelzpunkt 221°C.
¹H NMR (CD3OD) d (delta) 7,39 (d, 2H), 7,2 (d, 2H), 4,0 (t, 4H, 3,65 (t, 4H), 3,30 (S, 12H) 13C NMR (CD3OD) : d (delta) 189, 156,6, 147, 130, 122,5, 116, 69,5, 59,5, 38,5. Massenspektrum m/z 445 (M+ +1).
Beispiel 3
Spektralanalyse von DRAQ5
Absorptionsspektren wurden erhalten durch den Einsatz eines Perkin-Elmer Lambda 16 UV Spektrometers und eines 10 μM Lösungsmittels gelöst in Dichlormethan und gemessen in einer 1 cm Weglängen Quarz-silikakuvette. Fluoreszenzspektren für eine 0,8 ml Lösung von 20 μM DRAQ5 in einer 1 cm Weglängen Semimikroquarz-silikakuvette wurden bestimmt durch Erregung bei einer Wellenlänge von 647 nm oder der Überwachung der Emission bei 670 nm Wellenlänge. Fluoreszenzmessungen wurden durchgeführt auf einem Perkin Eimer LS50 Spektrofluormeter, wobei die Spaltbreiten bei 10 nm eingestellt waren. Das Spektrofluormeter war mit einer rotempfindlichen Fotomultiplizierröhre ausgerüstet (PMT; Typ R928, Hamamatsu Photonics KK, Japan). Daten wurden akkumuliert für 4 Abtastungen bei jedem Zustand und exportiert in ein Kalkulationstabellenprogramm, um die Werte zu korrigieren hinsichtlich der Puffersteuerung und zur Bestimmung der Emissionsmaxima. DNA-DRAQ5 Fluoreszenz wurde gemessen durch die Beigabe von konzentrierten Calfthymus DNA-Lösungen zur Kuvette unter Mischen. Sowohl das Mittel als auch DNA wurden hergestellt in einem DNA-Bindungspuffer (0,05 M Natriumphosphat, pH 6,2, 0,05 M NaCl, 0,0001 M EDTA; 3). Die gezeigten Spektren wurden korrigiert hinsichtlich des Pufferhintergrundes und nicht hinsichtlich der spektralen Sensitivität des PMT. Rhodamin 123 Spektren wurden erzeugt in einem DNA bindenden Puffer unter Einsatz entweder einer 488/5 nm Erregung oder Überwachungsemission bei 530/5 nm. Die zuvor veröffentlichte Erregung und die Emissionsspektren wurden erhalten aus ursprünglichen Quellenakten und normalisiert für Spitzenintensität.
Spektralcharakteristika und Zwischenwirkung von DRAQ5 mit DNA
Die 1a–c zeigen Spektralcharakteristika von DRAQ5. 1a: Sichtbares Absorbanzspektrum für DRAQ5 (10 μM in Dichlormethan).
1b: Vergleich von Erregungsspektren für spezifizierte Emissionswellenlängen für: FITC (o, 620 nm Emission), Rhodamin 123 (∇ , 0,5 μg/ml, 530 nm Emission), Texas Red (Δ; 660 nm Emission), Cy 5,18 (⧠, 715 nm Emission), DRAQ5 (• , 670 nm Emission).
1c: Vergleichsemissionsspektren für spezifizierte Erregungswellenlängen für FITC (O, 425 nm Erregung), Rhodamin 123 (∇ ,0,5 μg/ml, 488 nm Erregung), Texas Red (Δ; 500 nm Emission), Cy 5,18 (⧠, 570 nm Emission), 20 μM DRAQ5 (•, 647 nm Emission) und 20 μM DRAQ5 plus 1280 μM DNA (∎, 647 nm Emission).
1a zeigt das sichtbare Absorbanzspektrum für DRAQ5 im Phosphatpufter bei pH 7,4. Das Spektrum ergab Maxima bei 622 und 676 nm zusätzlich zu den Maxima (Daten nicht gezeigt) bei 240 nm und 314 nm. Der Extinktionskoeffizient bei 676 nm Wellenlänge wurde bestimmt zu 20949 cm^–1mol^–1. Die Fluoreszenzcharakteristika von DRAQ5 wurden studiert, um eine Interpretation der fluormetrischen Daten zu gestatten, erzeugt durch Fließcytometrie und Confocalabbildung. Ein Erregungsspektrum wurde erzeugt für den 460–660 nm Bereich für Emission bei 680 nm Wellenlänge und verglichen mit einem optimierten für Rhodamin 123 und denjenigen für andere Fluorchrome. 1b zeigt, daß die DRAQ5 Erregung in dem 630–650 nm Bereich im wesentlichen ähnlich ist dem Erregungsspektrum von Cyaninfarbe Cy 5,18 (Ex_λmax 649 nm), aber verschieden von derjenigen des Texas Red (Ex_λmax 596 nm), Rhodamin 123 (Ex_λmax 511 nm) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC; Ex_λmax 490 nm). In allen Fällen, die in 1 wiedergeben sind, wurden die Spektren normalisiert auf die Intensitätswerte bei entweder Ex_λmax oder Em_λmax.
Das Emissionsspektrum von DRAQ5 allein (1c) zeigte, daß sich bei einer 647 nm Erregung eine signifikante Emission ergab, die sich erstreckte von 665 nm bis über 780 nm Wellenlänge hinaus mit einem Em_λmax von 677,5 nm. Das Emissionsspektrum ist signifikant zu Rot gewechselt, verglichen mit demjenigen von Cy 5,18. DRAQ5 scheint eine Resterrregbarkeit zu zeigen bei viel geringeren Wellenlängen, obwohl die Fluoreszenzintensität für die Wellenlänge von 514 nm Erregung reduziert war von DRAQ5, verglichen mit den Werten für die Erregung bei 647 nm unter Beibehaltung der Charakteristika des Erregungsspektrums (Daten nicht gezeigt).
Ein molekulares Modellieren läßt vermuten, daß DRAQ5 in der Lage ist, sich durch Einschub an DNA zu binden, wobei die Seitenketten einander gegenüberliegender Seiten des aromatischen Ringaufbaus jeweils das Potential besitzen, das Molekül an DNA zu stabilisieren.
Fluormetrische Experimente zeigen an, daß DNA die DRAQ5 Fluoreszenz beeinflusst in einer komplexen Weise mit ansteigenden DNA : DRAQ5 Verhältnissen assoziiert mit einem Rotwechsel von Em_λmax bis 697 nm bei einem molaren DNA : DRAQ5 Verhältnis von 64. Dieser Wechsel auf die DNA-Zwischenwirkung ist in 1c gezeigt. Bei hohen DNA : DRAQ5 Verhältnissen, die äquivalent zu denjenigen sind, auf die man bei lebender Zellfärbung trifft, scheint ein Verlust des DRAQ5 Signals aufgrund des Farb-Farb-Löscheffekts minimal zu sein. Die Rotverschiebung von Em_λmax und des beachtlich niedrigen Infrarot/Infrarotsignals bei Wellenlängen über 730 nm hinaus unterscheidet diese Probe von Cy 5,18 trotz ähnlicher Erregungscharakteristika.
Beispiel 4
Abbildungs- und Mikroskopieanwendungen von DRAQ5 als eine neue Tiefrot/Infrarot fluoreszierende DNA-bindende Untersuchung
Bevorzugte Aspekte der Erfindung beziehen sich auf die Entwicklung einer zelldurchdringenden DNA-interaktiven Farbe, die in der Lage ist, als diskriminierende oder orientierende Markierung für zellulare DNA zu wirken mit einer fluoreszierenden Kennzeichnung, die sich in die infrarote Region des Spektrums hinein erstreckt. Die Erfindung gestattet eine multilaser, multifluorchrome und multiphotone Erregung mikroskopischer Verfahren, die eingesetzt werden kann sowohl bei fixierten Proben als auch lebenden Zellen. Hier werden die Spektralcharakteristika von DRAQ5 beschrieben und die potentiellen Anwendungen dieser DNA-Untersuchung demonstriert für Multiparameter-Analyse von lebenden und fixierten Zellen unter Einsatz confocaler Laserabtastungsmikroskopie.
Zellkultur
Die menschliche Melanomzellenlinie A375 wurde gezüchtet als asynchrone Kulturen in einem Eagles Minimalessentiellmedium, unterstützt durch 10%iges foetales Kaltserum, 1 mM Glutamin und Antibiotika und inkubiert bei 37° C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft. Für Darstellungsexperimente wurden Zellen gezüchtet in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Quelle als Monoschicht auf autoklavierten Glaseckgläsern in 6 Quellplatten 48 Stunden vor der Behandlung. Anhaftende lebensfähige Zellen wurden in frischer PBS für die Mikroskopie angeordnet. Wo angezeigt, wurden die anhaftenden Zellen fixiert mit 70% Methanol bei –20°C 10 Minuten vor der Rehydrierung und gefärbt mit Ethidiumbromid bei 5 μg/ml 10 Minuten lang in der Anwesenheit von 5 mg/ml RNase A.
Drogenherstellung und -behandlung
DRAQ5 wurde synthetisiert unter Einsatz der beschriebenen Prinzipien und gelagert bei +4°C als wässrige Vorratslösung von 10 mM. DRAQ5-Lösungen wurden hergestellt in phosphatgepufferter Saline (PBS) und direkt den Kulturen beigegeben. Fluoresceindiacetat (FDA; Koch Light Laboratories) wurde hergestellt als Vorratslösung von 12 mM in Azeton und gelagert bei –20°C. Die Zellen wurden behandelt mit 0,2 μM FDA 10 Minuten lang bei 37°C entweder allein oder nach dem 50-minütigen Aussetzen von DRAQ5. In einer ähnlichen Weise wurden DRAQ5-behandelte Zellen gekennzeichnet mit Rhodamin 123 (Laserqualität; Kodak) bei 2 μg/ml Kulturmedium 10 Minuten lang vor der Analyse.
Confocale Laserabtastmikroskopie (CLSM) von intakten Zellen
Das eingesetzte System war ein Leica TCS 4D Skanner (LaserTechnik GmbH, Deutschland), gekoppelt an ein Leitz DM R Mikroskop und betrieben mit einem Ominchromargon/Kryptonlaser. Der Laser stellte Emissionslinien zur Verfügung bei 488, 568 und 647 Nanometer mit variabler Leistung. Abdeckglaskulturen wurden kurz in PBS gewaschen in umgekehrten Positionen, auf Glasplättchen aufgebracht, wobei die Abdeckgläser an den Kanten abgestützt wurden durch Aufpipettieren von Erdölgallert, um zu verhindern, daß die Zellen zusammengedrückt wurden. Die Glasplättchen wurden unmittelbar untersucht unter Einsatz von ×100 oder ×40 Ölimmersionsobjektivlinsen mit Mittelbereichsblenden- und Photomultiplikationsverstärkungseinstellungen. Die Erregungs-/Emissionswellenlängen für DRAQ5, Fluorescein und Rhodamin 123 waren 647 nm/> 665 nm, 488 nm/> 515 nm bzw. 488 nm/> 590 nm. Die Verstärkungseinstellungen wurden derart justiert, daß die am stärksten fluoreszierende drogenbehandelte Probe Pixelintensitäten ergab gerade unterhalb der Sättigung. Der Schwarzpegel/Verstellung wurde justiert zur Erzeugung eines effektiven Nullhintergrundes (< 4 für den Pixelwert) nach 16× Liniengeräuschfiltration der Darstellungen für unbehandelte Kontrollen. Unter Einsatz dieser Näherung zeigten die unbehandelten Kontrollen minimale Autofluoreszenz und ergaben keine erkennbare Darstellung, so daß keine Notwendigkeit bestand, einer Hintergrundkorrektur vorzubeugen. Die gesammelten Darstellungen wurden für die Analyse konvertiert und vermischt unter Einsatz von IP Laborspektrum-Darstellungsanalysen-Software (Signal Analytics Corp., Vienna, VA, USA).
CLSM-Analyse von DRAQ5-Fluoreszenz in lebensfähigen Zellen
Um einigen Einblick in die Abhängigkeit von DRAQ5-Fluoreszenz auf die Erregungswellenlänge und die Spektraltrennung ihres Fluoreszenzsignals auf eine andere DNA-Probe zu erhalten, wurden Zellen verglichen, gefärbt entweder mit DRAQ5 oder Ethidiumbromid. Der Empfindlichkeitsbereich von CLSM entweder bei 488 nm oder 568 nm Erregung wurde optimiert in bezug auf die Fluoreszenz von Ethanol-fixierten Zellen gefärbt mit Ethidiumbromid (2d–f), während die Abbildung bei 647 nm Erregung optimiert wurde an DRAQ5-behandelten lebensfähigen Zellen (2c). 2a–f zeigt, daß bei Fluorchromkonzentrationen, geeignet für die Darstellung von Kernen und bei entsprechender Emissionsfiltration 488 nm und 647 nm Erregungsbedingungen eingesetzt werden können zur exklusiven Darstellung sowohl von Ethidiumbromid- als auch DRAQ5-Färbung. DRAQ5 könnte auch eingesetzt werden zur Darstellung fixierter Zellen unter Beibehaltung eines großen Teils der beobachtbaren Nukleararchitektur in intakten, lebensfähigen Zellen (Daten nicht gezeigt). Fluoreszenzaktivierung wurde auch beobachtet unter Einsatz einer Multiphotoerregung von fixierten Zellen, gefärbt mit DRAQ5 (menschlichen B-Zelllymphzellen; Ethanol-fixiert; 20 μM DRAQ5; YLF modusverriegelter Lasererregung bei 15 mW unter Einsatz eines modifizierten MRC600 Konfokalabbildungssystem; Ex_λ = 1047 nm; Em_λ = Langrot; 2g).
Unter Einsatz von CLSM mit einer Erregung bei 647 nm (2c) ergab sich eine klare Demonstration von kernpositionierter Fluoreszenz, ganz im Unterschied zu anderen Anthraquinon- und Anthracycline-basierenden Mitteln gefiltert, wodurch sowohl nukleare als auch cytoplasmische Signale erzeugt wurden. 2c zeigt, daß DRAQ5-behandelte lebensfähige Zellen eine klare Definition nuklearer Architektur zeigten sowie die Definition von Kanten nukleolarer und nuklearer Membranregionen.
Dementsprechend zeigen die 2a–f Spektralcharakteristika von DRAQ5-assoziierter DNA-Fluoreszenz, erfaßt durch CLSM : Felder a–c, Erregung bei 488, 568 bzw. 647 nm Wellenlänge für lebensfähige menschliche A375 Melanomzellen. Die Felder d–f zeigen die Erregung bei 488, 568 bzw. 647 nm Wellenlänge für Ethanol-fixierte Zellen gefärbt mit Ethidiumbromid. Die Abbildungen sind 100 × 100 μm.
Multiphotonabbildung von DRAQ5
Das Prinzip der 2-Photon-erregten Fluoreszenzmikroskopie wurde zuerst demonstriert von Webb und Mitarbeitern (Science, 248, 73–76 (1990); US-Patent 5 034 613). Im wesentlichen involviert dies das Einfangen von zwei Photonen durch ein erregbares Molekül, indem man Erregungsbedingungen erzeugt, die solche Ereignisse favorisieren. Das Erregungsspektrum für ein vorgegebenes Fluorchrom für Multiphotonereignisse unterscheidet sich von dem entsprechenden Einphotonerregungsspektrum, obwohl die Emissionsspektren unabhängig von der Erregungsart sind. Die Schlüsselkomponente des Erregungssystems, wie es für die Abbildung eingesetzt wird, ist ein abstimmbarer oder an einen bestimmten Wellenlängenmodus angeschlossener Laser mit ultrakurzen Impulsen bei einer hohen Wiederholungsgeschwindigkeit. Das Multiphotonmikroskop umfaßt typischerweise einen abstimmbaren Ti-Sapphire-Laser, welcher emittiert innerhalb eines Wellenlängenbereiches von 700–950 nm bei einer Impulsbreite von etwa 100 Femto-Sekunden und einer Wiederholungsgeschwindigkeit von 80 MHz. Laser mit fixierter Wellenlänge können ebenfalls eingesetzt werden, wie etwa ein YLF-modusgebundener Laser, der eine Multiphotonerregung bei 1047 nm zur Verfügung stellt. Die Spitzenintensität derartiger Laser ist so hoch, daß die Farberregung eintreten kann durch Absorption von zwei oder mehr Photonen in rascher Aufeinanderfolge. Es ist wichtig, daß die Multiphotonerregung die Notwendigkeit kurzer Erregungswellenlängen (z. B. UV-Bereich) beseitigt. Da darüber hinaus die Fluoreszenzerregung lokalisiert ist auf den Bereich des Brennpunktes, kann das Multiphotonsystem optisch ein abgetastetes Objekt mit begrenztem Bleichen aufteilen. Multi-(Dual)-Photonerregung von DRAQ5 wurde erzielt unter Einsatz des YLF-modusgebundenen Lasers, und ein Beispiel einer gesammelten Abbildung, die nuklear lokalisierte Fluoreszenz zeigt in fixierten Zellen, ist in 2g dargestellt. Es wurde auch eine Multiphotonerregung von DRAQ5 in den Kernen von fixierten Zellen beobachtet unter Einsatz eines Ti-Sapphire-Lasers (gepumpt mit 5 W) emittierend bei 740 nm Wellenlänge (konsistent mit der Fähigkeit, DRAQ5-behandelte Zellkerne UV zu erregen, entsprechend der Darstellung in 11). Es wird erwartet, daß das Erregungsspektrum für DRAQ5, welches konsistent ist mit den Ergebnissen für andere Fluorchrome, sich unterscheidet von demjenigen, welches bestimmt wird durch die Einphotonspektroskopie. Die Eindringungsfähigkeit von Infrarotlaserstrahlen bietet Anwendungen für Mehrphotonerregung von DRAQ5 beim Abtasten tiefer Einschnitte/Gewebe bei der Kernlokalisierung, Quantifizierung und Morphologie, so daß eine genaue 3D-Rekonstruktion von komplexen zellularen Umgebungen ermöglicht wird.
Die 2g zeigt die Multiphotonabbildung von DRAQ5-gefärbten Zellkernen. Menschliche B-Zell-Lymphzellen wurden mit Ethanol fixiert und gefärbt mit 20 μM DRAQ5. YLF-modusgebundene Lasererregung bei 15 mW (Ex λ = 1047 nm; Ein λ = lang rot) wurde eingesetzt und Abbildungen erhalten unter Einsatz eines 60 × N. A. 1,4 Ölobjektivs, einem Zoomfaktor von 1,9 und einem durchschnittlichen Kalman von 37 Rahmen.
CLSM-Analyse der Fluoreszenz von DRAQ5 und einem N-Oxid-Derivat (DRAQ5N) in lebensfähigen Zellen
Es wurde versucht, den Effekt von Änderungen der Struktur in einer Verbindung der allgemeinen Form der Verbindung (I) zu exemplifizieren an Charakteristika der Färbung lebensfähiger Zellen. Ein N-Oxid-Derivat von DRAQ5 (z. B. DRAQ5N) behält die allgemeine Struktur (I) aufrecht, hat jedoch Gesamtladung verloren. Diese Änderung beeinflußt die Wirksamkeit des Bindungspotentials des Mittels in lebensfähigen Zellen, während die Fluoreszenz, die Zelldurchdringungseigenschaften und die nukleare Lokalisierung beibehalten werden. 2h– k zeigen, daß unter äquivalenten Bedingungen für die Erfassung der nuklearen Fluoreszenz in lebensfähigen menschlichen Zellen die DRAQS-integrierte nukleare Fluoreszenzintensität pro Kernabschnitt etwa um das 10-fache größer war als der von DRAQ5N-behandelten Zellen abgeleitete Wert. Frühere Veröffentlichungen (siehe die Referenzen 1–10 unten) beschrieben die Charakteristika von Alkylaminanthraquinon-N-Oxiden und ihr Potential als bioreduktive Drogen. Somit teilt sich das N-Oxid von DRAQ5 (d. h. DRAQ5N), welches hier beschrieben wird, die Eigenschaften dieser Klasse von Mitteln dahingehend, daß es zur bioreduktiven Konversion zu DRAQ5 in der Lage ist. Es wird vorgeschlagen, daß die neuen Fluoreszenzcharakteristika von DRAQ5 ein Markierungsmittel für zellulare bioreduktive Aktivität bereitstellen, und als natürliche Folgerung den hypoxischen Status durch die DRAQ5N Konversion. Somit zieht die vorliegende Erfindung den Einsatz von DRAQ5N als Markierungsmittel für hypoxische Zellen in Betracht.
Dementsprechend zeigen die 2h–k gleichzeitig das CLSM-Einfangen der Transmission (Felder h und j) und die entsprechende langwelliges Rot/kurzes Infrarot-Fluoreszenz- (Felder i bzw. j)-Abbildungen lebensfähiger HL60-Zellen, die entweder 10 μM DRAQ5 oder 10 μM DRAQ5N eine Stunde lang ausgesetzt wurden.

1. Patterson LH: Anthraquinone anticancer compounds with (disubstituted amino-N-oxide)alkylamino substituent. UK Patent GB2237283, 1989
2. Patterson, L. H. Rationale for the use of aliphatic N-oxides of cytotoxic anthraquinones as prodrug DNA binding agents: a new class of bioreductive agent. Cancer and Metastasis Revs. 12, 119–134, 1993.
3. Patterson, LH, Craven, MR, Fisher, GR and Teesdale-Spittle, P. Aliphatic amine N-oxides of DNA binding agents as bioreductive drugs. Oncology Research 6, 533–538, 1994.
4. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, McAleer, IA, McAleer, JJA and Patterson, LH. AQ4N: an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive potential and positive interaction with radiation in vivo. Brit J Cancer, 72,76–81.
5. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, Mcntyre, IA, McAleer, JJA and Patterson, LH. AQ4N: an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive potential and positive interaction with radiation. Brit J Cancer, 72, 76–81, 1995.
6. Wilson, WR, Denny, WA, Pullen, SM, Thompson, KM, Li, AE, Patterson, LH. Tertiary amine N-oxides as bioreductive drugs: DACA N-oxide, nitracrine N-oxide and AQ4N, Brit J Cancer, 74, S43–47, 1996.
7. McKeown, SR, Friery OP, McIntyre, IA, Hejmadi, MV, Patterson LH. Evidence for a therapeutic gain when AQ4N or tirapazamine is combined with radiation Brit J Cancer 74, S39–42, 1996
8. Hejmadi, MV, McKeown, MV, Friery, OP, McIntyre, IA, Patterson, LH and Hirst, DG, DNA demage following combination of radiation with the bioreductive drug AQ4N: possible selective toxicity to oxic and hypoxic cells. Brit J Cancer, 73, 499–505, 1996.
9. Smith, PJ, Blunt, NJ, Desnoyers, R, Giles, Y and Patterson, LH. DNA topoisomerase II dependent cytotoxicity of allcylaminoanthraquinones and their N-oxides. Cancer Chemotherap. Pharmacol, 39, 455–461 (1997)
10. Smith, PJ, Desnoyers, R, Blunt, N, Giles, Y and Patterson, LH. Flow cytomeric analysis and confocal imaging of anticancer alkylaminoanthraquinones and their N-oxides in intact human cells using 647 nm Krypton laser excitation. Cytometry, 27, 1, 43–53, 1997.

CLSM-Abbildung von Dual-Fluorchrom-Vitalzellfärbung
Es wurde versucht, die Spektraltrennung des DRAQ5-Fluoreszenzsignals von demjenigen anderer, üblicherweise eingesetzter Fluorchrome zu demonstrieren durch den Einsatz selektiver Erregung. 3b zeigt die signifikante Variation der Kapazität der A375-Zellen für intrazellulare Konversation von FDA durch esterase Zellteilung zur beibehaltenen Form von Fluorescein. Die Abbildung der gleichen Probe unter Einsatz selektiver Erregung von DRAQ5 demonstriert klar die nukleare Morphologie (3c), während die Transmissionsabbildung ( 3a) die Gesamtzellform wiedergibt. Dreifachabbildungsanalyse identifiziert Tochterzellpaare (markiert als x, y und z durch Pfeile in 3d). Dualabbildung erstreckte sich auf eine vitale Farbe, die in der Lage war, cytomplasmische Organellen zu definieren. 4a–c zeigt DRAQ5 (Kerne) und Rhodamin 123 (Mitochondrien) als zusammen gekennzeichnete Zellen.
Somit zeigen die 3a–d unterschiedliche Erregung von Fluorescein und DRAQ5 in lebensfähigen A375-Zellen, analysiert durch CLSM. Die Zellen wurden behandelt mit 10 μM DRAQ5 × 1 Stunde und anschließend gekennzeichnet mit FDA bei 1 μM 15 Minuten lang. Die Felder zeigen die gleichen Darstellungsansichten wie folgt: a Transmissionsabbildung; b 488 nm Erregung von Fluorescein; c 647 nm Erregung von DRAQ5; d vermischte Darstellungen von a–c kodiertem Blau, Grün bzw. Rot. Die Abbildungen sind 250 × 250 μM; Paare von Tochterzellen sind durch Pfeile angezeigt.
4a–c zeigen a–c unter Wiedergabe der unterschiedlichen Erregung von Rhodamin 123 und DRAQ5 in lebensfähigen A375-Zellen, analysiert durch konfokale Laserabtastmikroskopie. Zellen wurden behandelt mit 10 μM DRAQ5 × 1 Stunde und anschließend gekennzeichnet mit Rhodamin 123 mit 2 μg/ml 5 Minuten lang. a und b zeigen die gleiche Ansicht mit 488 nm bzw. 647 nm Erregung. Die c repräsentiert die ge mischten Abbildungen von a (kodiertes Grün) und b (kodiertes Rot). Die Abbildungen sind 100 × 100 μM.
Beispiel 5
Fließcytometrieanwendungen von DRAQ5 als neuartiges Langwelligrot/Infrarot-Fluoreszenz-DNA-Bindungsverfahren
Fließcytometrie, wie sie hier zum Einsatz kommt, ist ein Verfahren zur Messung der Lichtstreuungs- und Fluoreszenzcharakteristika von Zellen oder Partikeln, die in einem Fluidstrom durch die Meßvorrichtung hindurchgeführt werden, in welcher einzelne Zellen die Brennpunktposition(en) eines einzigen oder mehrerer Laserstrahlen überqueren. Die zeitliche Verzögerung beim Durchgang durch die räumlich getrennten Brennpunktpositionen wird elektronisch überwacht, wobei das Cytometer vollständig korrelierte Multiparametermessungen erzeugt für die Mehrstrahlkonfigurationen. Hier wird der Einsatz von DRAQ5 in Ein-, Zwei- und Dreistrahlsystemen demonstriert in einer Gruppe von Anwendungen unter Einsatz menschlicher Zellen.
Zellkultur
HL60 (menschliche promyelocytische Leukämie-Zell-Linie) und SUD4 (menschliche B-Zell-Lymphzell-Linie) wurden kultiviert als Suspensionskulturen in RMPI-Medium mit 10% fötalem Kalbserum, 1 mM Glutamin und Antibiotika und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5%igem CO₂ in Luft inkubiert. Für die Fließcytometrie-Experimente wurden asynchrone Wachstumssuspensionskulturen verdünnt auf 2,5–4 × 10⁵ Zellen/ml 2 Stunden vor der Drogenbehandlung. Zellzyklusgestörte Populationen wurden erhalten durch die Behandlung der SUD4-Zellen mmit der Droge Etoposid (VP-16-213) bei 0,25 μM 18 Stunden lang. Die Zellen wurden behandelt mit DRAQ5 und FDA, wie dies oben beschrieben wurde. Die Zellkonzentrationen wurden bestimmt unter Einsatz eines Coulterzählers, und die Zellzyklusverteilung wurde bestimmt unter Einsatz eines Algorithmus von der normalen Verteilung der Fluoreszenzintensitätsprofile für Fluorchrom-gefärbte G1 und G2-Zellen.
Suspensionskulturen wurden analysiert durch Fließcytometrie ohne Waschen. Menschliches Blut wurde erhalten unter Einsatz von Venenpunktur eines gesunden Spenders und Proben manipuliert unter Verwendung von standardhämatologischen Verfahren für die Isolation von mono-nuklearen Blutzellen und Oberflächenantigenerkennung unter Einsatz von Antikörperfeldern (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1
Fußnoten zur Tabelle:
Fließcytometrie
Zellen wurden analysiert unter Einsatz eines von vier Fließcytometern, entsprechend den Erregungserfordernissen.
Cytometer A: Einstrahlhochleistungs- 647 nm-Kryptonlaser-Erregung: Das System war ein handelsüblich gebautes Cytometer und eingebaut in einen Innova 3000 K Kryptonlaser (Coherent Corp. Palo Alto, CA, USA), abgestimmt auf die 647 nm-Linie. Vorwärtslichtstreuung 90° leichte Streuung und Fluoreszenzemission wurden gesammelt für 1 × 10⁴ Zellen unter Einsatz des 90° Lichtstreuungsparamter als Hauptsignal. Das optische System gestattete die Analyse von verschiedenen Fluoreszenz-Emissionswellenlängen einschließlich: > 715 nm (bezeichnet als langwelliges Infrarot) und berichtet hier als > 780 nm Fluoreszenz (Infrarot). Vorwärts- und 90°-Lichtstreuung wurden analysiert für die Identifizierung von Zelltrümmern. Die Laserleistung wurde auf 200 mW eingestellt und lineare Verstärker kamen zum Einsatz für die Fluoreszenz-Signale. Die Analysenoptik umfaßte einen 675 nm kalten dichroitischen Spiegel, die Umgebungslabortemperatur betrug in etwa 12°C und das Behälterreservoir wurde bei 10°C gehalten. Filter wurden bereitgestellt von Melles Griot. Die mittleren, durchschnittlichen und Modus-Parameter wurden berechnet für die Verteilung der Fluoreszenzintensitätswerte, durchgängig für eine gegebene Zellpopulation. Bei allen Experimenten ergaben alle Mittel- und Durchschnittswerte ähnliche Ergebnisse. Die Mittelwerte werden allein angegeben, da dieser Parameter weniger beeinflußt wird durch die Anwesenheit von hochfluoreszierenden Zellen über die Obergrenze hinaus für die Quantifizierung.
Cytometer B: Dualstrahlniedrigleistungs-633 nm/Hochleistungs-488 nm-Lasererregung: Das System war ein FACS 440-Zellsortierer (Becton Dickinson Inc., Cowley, Großbritannien) mit einem Spektraphysics-Argon-lonenlaser (maximal 500 mW-Ausgang), abgestimmt auf die 480 nm-Linie (100 mW-Ausgang) und einem zweiten Spektraphysics-156-Helium-Neonlaser, emittierend bei 633 nm (emittierend < 5 mW), mit einer temporalen Strahltrennung von etwa 30 μsec. Vorwärtslichtstreuung, 90° Lichtstreuung und Fluoreszenzemission wurden gesammelt für 1 × 10⁴ Zellen unter Einsatz des Vorwärtslichtstreuungs-Parameters als Hauptsignal von dem Primärstrahl 488 nm, während die Seitenstreuung gesammelt wurde durch ein 488/10 nm Bandpaßfilter. Die Analysenoptik umfaßte: i) einen kalt dichroitischen Spiegel (transmittierend > als 675 nm), ii) die Fluoreszenz von Fluorescein, erregt durch den 488 nm-Strahl, er faßt bei PMT, abgeschirmt durch ein 535/15 nm-Bandpaßfilter ohne Signalverzögerung und iii) ein rotempfindlichen PMT mit einer entsprechenden Verzögerung, zusätzlich abgeschirmt durch ein 620 nm Langpaßfilter zur Erfassung des transmittierten Strahles von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz bei Wellenlängen über 675 nm hinaus (kurzwelliges Rot und sich hinein erstreckend in den Infrarot-Bereich des Spektrums).
Vorwärts- und 90° Lichtstreuung wurden analysiert, um jegliche Zelltrümmer auszuschließen. Alle Parameter wurden erhalten bei 256 Kanalauflösung mit Consort 30 Software (Becton Dickinson) und anschließend analysiert mit WinMDI Software (J. Trotter, La Jolla, Ca.). Das System verwendete die gleiche Analyseoptik, wenn es zum Einsatz kam im Einstrahl-488 nm-Modus, jedoch ohne Signalverzögerung für den rot empfindlichen PMT.
Cytometer C: Einstrahlniedrigleistung-Lasererregung 480 nm: Das System war ein FACScan (Becton Dickinson Inc., Cowley, Großbritannien) mit einem Argonionenlaser (maximal 15 mW Ausgang), abgestimmt auf die 488 nm-Linie. Vorwärts-Lichtstreuung, 90°-Lichtstreuung und Fluoreszenzemissionen wurden gesammelt für 1 × 10⁴ Zellen unter Einsatz des Vorwärts-Lichtstreuungs-Parameters als das Hauptsignal. Die Standardanalysenoptik stellte die FL1 (blau)/FL2 (grün)/FL3 (rot) PMT-Parameter bereit mit Impulsanalyse, durchgeführt an den FL3 ausgehenden Signalen.
Cytometer D: Dreistrahlige mittlere Leistung 633 nm/mittlere Leistung 488 nm/mittlere Leistung Mehrlinien-UV-Lasererregung: Das System war ein FACS Vantage Zellsortierer (Becton Dickinson Inc., Cowley, Großbritannien) mit einem kohärenten Enterprise 11-Laser, gleichzeitig emittierend bei Mehrlinien-UV(350–360 nm-Bereich) und 488 nm Wellenlängen, wobei die Strahlen nichtkolinear gemacht wurden unter Einsatz von dichroitischen Separatoren. Eine strahlkombinierende Optik wurde eingesetzt, um den UV-Strahl auszurichten auf denjenigen, der emittiert wurde durch einen Spektra-Physics 127–35-Helium-Neon-Laser (maximal 35 mW Ausgang), emittierend bei 633 nm mit einer temporalen Trennung von etwa 25 μsec. von demjenigen des primären 488 nm-Strahls. Vorwärtslichtstreuung, 90°-Lichtstreuung und Fluoreszenzemissio nen wurden gesammelt für 1 × 10⁴ Zellen unter Einsatz des Vorwärtslichtstreu-Parameters als Hauptsignal von dem Primär-488 nm-Strahl, während Seitenstreuung gesammelt wurde durch ein 488/10 nm Bandpaßfilter. Die Analysenoptik war: i) vom Primärstrahl ausgehende Signale, analysiert bei FL1 (FITC-Filter; Barrierefilter von 530/30 nm) nach der Übertragung bei SP 610 und SP 560 dichroitisch oder bei FL2 (Barrierefilter von 585/42 nm oder 575/26 nm) nach der Übertragung bei SP 610 und Reflektion bei SP 560 dichroitisch, oder bei FL3 (Barrierefilter von LP 715 nm), nach der Reflektion bei SP 610 dichroitisch; ii) verzögerte, vom Strahl ausgehende Signale, analysiert bei FL4 (Barrierefilter von LP 695 nm) oder bei FL5 (Barrierefilter von DF 424/44 nm) nach der Übertragung oder Reflektion bei LP 640, jeweils dichroitisch. Vorwärts- und 90°-Lichtstreuung wurden analysiert, um jegliche Zelltrümmer auszuschließen. Alle Parameter wurden analysiert unter Einsatz von ZellQuest-Software (Becton Dickinson).
Gesamte Zellfluoreszenz, erfaßt durch Fließcytometrie
Obwohl die DRAQ5-Erregung optimal ist bei der 647 nm-Laserwellenlänge, zeigten vorläufige Studien an, daß die Untersuchung suboptimal erregt werden konnte bei niedrigeren Wellenlängen, einschließlich Mehrlinien-UV 488 nm, 514 nm und 633 nm. Es wurde versucht, DRAQ5 zu prüfen als DNA-Untersuchung für den Einsatz bei der Fließcytometrie durch den Vergleich der vier unterschiedlichen Cytometer-Konfigurationen:
Cytometer A: Einstrahlige Hochleistungs-647 nm-Krypton-Laser-Erregung.
Cytometer B: Doppelstrahl-Niedrigleistungs-633 nm/Hochleistungs-488 nm-Laser-Erregung.
Cytometer C: Einstrahlige Niedrigleistungs-488 nm-Laser-Erregung.
Cytometer D: Dreistrahlige Mittelleistungs-633 nm/Mittelleistungs-488 nm/Mittelleistungsmehrlinien-UV-Laser-Erregung.
5 zeigt, daß beim Einsatz eines Niedrigleistungs-HeNe-Laser (Cytometer B) eine vollständige Trennung nicht eintritt für die Autofluoreszenz und DRAQ5-Signalen für lebensfähige HL-60-Zellen behandelt mit niedrigen nicht ge sättigten DRAQ5-Konzentrationen. Darüber hinaus zeigen Studien (Daten nicht wiedergegeben) an, daß eine vollständige Trennung erzielt werden konnte nach einer zweistündigen Inkubation mit 20 μM DRAQ5. Jedoch sogar unter diesen begrenzenden Erregungsbedingungen zeigte das 633 nm abgeleitete DRAQ5-Signal ein klares lineares Dosis-Ansprechen (siehe Eintrag in 5) bis herab auf etwa 2,5 μM, vergleichbar mit der Linearität, die erhalten wurde für die optimale 647 nm-Erregung (unter Einsatz des Cytometers A) und die Erfassung bei Wellenlängen > 780 nm.
6a und b zeigen, daß ein Niedrigleistungs HeNe-Laser (Cytometer B) zum Einsatz kommen kann, um die DRAQ5-assoziierte Fluoreszenz in Fluorescein-beladenen Zellen zu identifizieren, analysiert in einer Dualstrahlkonfiguration. 6c und d zeigen, daß eine Koerregung von DRAQ5 und Fluorescein möglich ist unter Einsatz eines Einzelstrahls von 488 nm-Wellenlänge (Cytometer B). Es gibt eine klare Trennung von Signalen aufgrund der deutlichen, sich nicht überlappenden Spektren trotz des Signals niedriger Intensität, abgeleitet von der suboptimalen Erregung von DRAQ5.
Es wurde versucht, die Einsatzfähigkeit von DRAQ5 in einem einstrahligen Cytometer zu demonstrieren (d. h. FACScan^TM; Cytometer C). 7a–d zeigen typische Ergebnisse bei der Demonstration der Fähigkeit von DRAQ5, nukleierte Zellen in komplexen Populationen zu identifizieren. 7a zeigt die Erfassung der Zellzyklusverteilung über den Zelloberflächenantigenausdruck für intakte Zellen. 7b zeigt die Diskriminierung von Untergruppen entsprechend dem Färbungspotential, während 7c und 7d die Anwendbarkeit von DRAQ5 demonstrieren bei der Erfassung nukleierter Zellen in dem gesamten Blut und dem lysierten Blut. Faktoren, die sich auf die Fähigkeit von DRAQ5 beziehen zur Färbung von Kernen, sind in der Tabelle analysiert. Beim Einsatz lebensfähiger kultivierter asynchroner Zellen (Präparation 1) färbte DRAQ5 rasch Zellen in einer reproduzierbaren Weise und erzeugte Fluoreszenz, deutlich abgehoben von dem Autofluoreszenzhintergrund. Die großen sd-Werte leiten sich von der Zellausbreitung durch den Zellzyklus ab. Der mittlere Wert reflektiert den mittleren zellularen DNA-Gehalt, wie verdeutlicht durch den 1,7-fachen Anstieg von G2-arretierten Populationen. Die Bearbeitung von Zellen für die Oberflächenantigen-Analyse (Präparation 2) beeinflußt die obigen Charakteristika nicht. Die Isolation von intakten mononuklearen Blutzellen (Präparationen 3 und 4) führt zu Proben, die in einem praktischen Zelldichtebereich gefärbt und für die Oberflächenantigen-Analyse bearbeitet werden können. Bei den Präparationen 3 und 4 wurde durchgängig ein verstärktes Färbungspotential von Monocyten gegenüber Lymphocyten beobachtet (1,14–1,4-fach), was anzeigte, daß das Färbungspotential lebensfähiger Zellen zum Einsatz kommen kann als Faktor für Subpopulationsdiskriminierung. Die Ergebnisse für das gesamte Blut zeigen, daß nukleierte Zellen (einschließlich Granulocyten) bis zu einem ähnlichen Grad gefärbt werden können in der Anwesenheit (Präparation 5) von roten Blutzellen (RBCs) oder nach einer RBC-Lyse und milder Fixierung (Präparation 6).
8 faßt die DRAQ5-konzentrationsabhängigen Unterscheide zusammen bei der DRAQ5-Färbung lebender Zellpopulationen, die man erhielt unter Einsatz der Präparationsverfahren 1 und 2 (siehe die Fußnote zur Tabelle). Die Populationen zeigen ähnliche Titrierkurven, wobei die Sättigung eintritt in einer Weise, die den relativen DNA-Gehalt (für einen gegebenen Zelltyp, z. B. SUD4) oder das nukleare Färbungspotential (z. B. Lymphocyten gegenüber Monocyten) bei Konzentrationen von ≥ 10 μM wiedergibt.
9 demonstriert die Einsetzbarkeit von DRAQ5 für die Erfassung des zellzyklusspezifischen Ausdrucks eines Intrazellularproteins in fixierten Zellen, erfaßt unter Einsatz von fluorchrommarkierten Antikörpern, aktiviert durch 488 nm (FITC) und Mehrlinien-UV-Wellenlängen (Cytometer D). 10a–f zeigen, daß es bei einer Dreistrahlkonfiguration (Cytometer D) möglich ist, DRAQ5-Fluoreszenz zu demonstrieren, aktiviert durch zwei getrennte Strahlen bei der Diskriminierung auf einem dritten für die Überwachung relativ seltener Zellzyklusereignisse, wie etwa dem Hochcyclin-B1-Ausdruck in G2/M von asynchronen Kulturen.
Somit zeigt 5 Fließcytometrie-Analysen der DRAQ5-Akkumulation für eine einstündige Aussetzungsperiode in lebensfähigen HL60-Zellen. Die Häufigkeitsverteilungshistogramme sind für Niedrigleistungs-633 nm-Wellenlängenerregung unter Einsatz des Cytometers B. Symbole: O,
und ∎ repräsentieren 0,5 bzw. 10 μM DRAQ5. Eintrag: Linearität des DRAQ5-Dosis- Ansprechens unter Einsatz zweier unterschiedlicher Cytometer (nämlich B und A mit Korrelationskoeffizienten von 0,96 und 0,97 für 633 nm bzw. 647 nm-Erregungen.
6a–d zeigen dualstrahlfließcytometrische Analysen (Cytometer B) für die Erfassung von DRAQ5 assoziierter Fluoreszenz in fluoresceinmarkierten lebensfähigen HL60-Zellen. Repräsentative fließcytometrische Eintragungen mit zwei Merkmalsvariablen von grün (FL2-Höhe; Fluorescein) über tiefrot/langwelliges Infrarot (FL1-Höhe, DRAQ5) Gesamtzellenfluoreszenz-Signale. Die Felder a und b zeigen Dualstrahlerregung von Fluorescein (488 nm) und DRAQ5 (Niedrigleistung 633 nm). Feld: a, FDA (0,2 μM für 10 Minunten allein); b, Zelle penetriert mit 5 μM DRAQ5 eine Stunde lang vor der FDA-Behandlung. Felder c und d wiederholen die gleichen Zellbehandlungszustände mit Ausnahme des Einsatzes einer einstrahligen Erregung bei 488 nm für Fluorescein und DRAQ5. Die Zahlen geben den Prozentsatz torgesteuerter Ereignisse innerhalb der Quadrantenbereiche an.
7a–d zeigen einstrahlige fließcytometrische Analysen (Cytometer C) von DRAQ5-Fluoreszenz (FL3-Bereich) an über Antikörperfluoreszenz (FL2-Höhe überwachend Phycoerythrin-markiertes Anti-CD19 oder FL1-Höhe überwachend FITC-markiertes Anti-CD45) für kultivierte und von Blut abgeleiteten menschlichen Zellen. Zellsuspensionen (2,5 × 10⁵/ml) wurden in phosphatgepufferter Saline gehalten mit einem Gehalt von 1% Bovinserumalbumin. Mononukleare Zellsubpopulationen menschlichen Bluts, erhalten unter Einsatz von Standard-Ficoll-Gradient-Separation, wurden identifiziert und torgesteuert entsprechend ihren Vorwärts- und Seitenlichtstreucharakteristika. Doubletten wurden ausgeschlossen durch Impulsanalyse, torgesteuert auf dem normalen FL3-Bereich über FL3-Breitenparamterwerte. Feld a: Kultivierte asynchrone SUD4-Lymphzellen. Feld b: Mononukleare Zellsubpopulationen von Blut, erhalten unter Einsatz von Standard-Ficoll-Gradient-Separation. Feld c: Gesamtblut (ausgelöst auf CD45 + Ereignissen). Feld d: Lysiertes gesamtes Blut. Mit einem Pfeil versehene Subpopulation: G1, S und G2/M repräsentieren Zellzyklusphasen; L, Lymphocyten; M, Monocyten; G, Granulocyten; N, Plasmamembrane ohne Kern.
8 zeigt eine einstrahlige niedrige cytometrische Quantifizierung (Cytometer C) der Fluoreszenzintensität von kultivierten und von Blut abgeleiteten menschlichen Zellen, die 5 Minuten lang DRAQ5 bei Raumtemperatur ausgesetzt waren. Die Daten sind mittlere Werte (±SD) und repräsentieren Ergebnisse von einem typischen Experiment. Symbole: O, kultivierte asynchrone SUD4-Lymphzellen; ⧠, SUD4-Zellen, die 18 Stunden lang 0,25 μM VP-16 ausgesetzt waren zum Arretieren der Zellen in der S-Phase und G2 des Zellzyklus; Lymphocyten; ∎, Monocyten.
9 zeigt eine dualstrahlfließcytometrsiche Analyse (Cytometer D des zellzyklusspezifischen Ausdruckes von Cyclin B1. Fixierte, RNaseAausgelaugte und DRAQ5-gefärbte (FL3; 488 nm-Erregung) SUD4-Zellen wurden erhalten von einer asynchronen Kultur, die 18 Stunden lang 0,25 μM VP-16 ausgesetzt waren zum Akkumulieren von Zellen in G2/M. G2/M-Phasen ausgedrücktes Cyclin B1-Protein wurde überwacht durch indirekte Immunoflureszenz unter Einsatz von AMCA-markiertem zweiten Antikörper (FL5-Höhe; Multilinien-UV-Erregung) zur Erfassung der Bindung des Anticyclins B1 (GNS1) monoclonalen Mouse IgG. Felder a und c zeigen Antikörperkontrollen (nicht spezifisches IgG plus zweitem Antikörper). Felder b und d zeigen Ergebnisse für spezifischen Antikörper plus zweiten Antikörper. Antikörper wurden erhalten von Santa Cruz Biotechnology Inc. Mit Pfeilen versehene Subpopulationen: G1, S und G2/M repräsentieren Zellzyklusphasen. Der nicht bezeichnete Pfeil zeigt die erwartete Position von Zellen, die ein hohes Niveau von Cyclin B1 ausdrücken und sich in G2/M des Zellzyklus befinden.
10a–f zeigen Dreistrahlfließcytometrie-(Cytometer D)-Analysen von DRAQ5-gefärbten fixierten und RNaseA ausgelaugten asynchronen SUD4-Lymphzellen. DRAQ5-Fluoreszenz (Impulshöhe) wurde überwacht durch FL3 (488 nm-Erregung) und FL4 (633 nm-Erregung). Zellzyklusunabhängiges Cdc2-Protein und die G2/M-Phase, ausgedrückt durch Cyclin B1-Protein wurden überwacht durch indirekte Immunofluoreszenz unter Einsatz von FITC-markiertem zweitem Antikörper (FL1-Höhe; 488 nm-Erregung), um die Bindung des Anti-Cdc2 p34 (H-297) polyclonalem Kaninchen IgG zu erfassen und AMCA-markiertem zweiten Antikörper (FL5-Höhe; Mehrlinien-UV-Erregung), um die Bindung des Anticyclin B1 (GNS1) monoclonalen Maus IgG zu erfassen. Antikörper wurden erhalten von Santa Cruz Biotechnology. Felder: a und b, DNA über Cdc-2 p34; c und d, DNA über Cyclin B1; e und f, DNA-Histogramme für blaue bzw. rote Erregungswellenlängen. Mit Pfeilen versehene Subpopulationen: G1, S und G2/M repräsentieren Zellzyklusphasen; HCyB, Hochcyclin B1 um Zellen auszudrücken, die sich im G2/M des Zellzyklus befinden.
Fließcytometrische Analyse von Mehrlinien-UV-Errequngen von DRAQ5-gefärbten Zellen
Die Absorbanzspitzen, die bei Wellenlängen < 400 nm festgestellt werden, lassen vermuten, daß Chromophor-Erregung in der Nähe von UV-Wellenlängen möglich sein sollte (Daten nicht wiedergegeben). Es wurde demonstriert, daß DRAQ5-gefärbte Zellen von lebenden Zellen erregt werden können in der Nähe des UV-Bereichs des Spektrums, wie dargestellt wurde, durch den Einsatz von Mehrlinien-UV-Cytometrie (Cytometer B; 11a–c). Obwohl die UV-Erregung weniger effizient ist als bei der Wellenlänge von 647 nm (11b) und die Erfassung eine erhöhte Photomultiplikator-Signalverstärkung erfordert, reflektieren die Fluoreszenzintensitäten klar die zellulare DNA-Gehaltverteilung (11c). Dies demonstriert, daß bei Dreistrahlkombinationen DRAQ5 ein DNA-Diskriminierungssignal bereitstellen kann, abgeleitet von UV- und Sichtbereichserregungs-Wellenlängen.
11a–c zeigen die 488 nm (Feld a), 647 nm (Feld b) oder Mehrlinien-UV-(350–360 nm-Bereich; Feld c), Erregung von DRAQ5 in intakten SUD4-Lymphzellen für eine Emission bei > 695 nm-Wellenlängen und analysiert durch Mehrstrahlfließcytometrie (Cytometer D). Die dicken Linien reflektieren den zellularen DNA-Gehalt der DRAQ5-gefärbten Zellen; schwache Linien repräsentieren nicht-gefärbte Kontrollzellen; gestrichelte Linien repräsentieren Bezugs-Allophycocyanin-(APC) gefärbte Bezugsmikroperlen, eingesetzt als 647 nm erregbaren Standard.
Beispiel 6
Unterschiedliche zellulare Akkumulation von N-Oxidderivat von DRAQ5 (DRAQ5NO) bei der Diskriminierung von intakten und toten Zellen.
Die Fähigkeit, intakte lebensfähige Zellen zu unterscheiden von denen, die den verschiedenen Stufen eines Zelltodes unterliegen, kann erzielt werden durch die unterschiedliche zellulare Akkumulation von chemischen Proben, einschließlich bestimmten Fluorchromen. Ein besonderer Typ des Zelltodes, der als Apoptosis bezeichnet wird, besitzt unterscheidbare frühe Stufen, die in intakten Zellen auftreten können. Die Diskriminierung wird eingesetzt extensiv sowohl in biologischen als auch klinischen Prüfungen. Beispielsweise können fließcytometrische Prüfungen eine Identifizierung gestatten sowie Quantifizierung, Analyse, Präparation oder Ausschluß von Zelluntergruppen. Die Probenaufnahme und -Haltung hängt ab von mehreren Faktoren einschließlich der Integrität der Plasmamembran (z. B. Einfluß auf den Probeneingang) und das intrazelluläre Verhalten der Probe (z. B. die Probenbindung an nukleare DNA). Die gegenwärtige fluormetrische Prüfung bezüglich des Zelltodes kann die Fähigkeit zum Einsatz bringen, daß intakte lebensfähige Zellen ungefärbt verbleiben durch den Ausschluß der Probe (z. B. die fluoreszierende DNA-Farbe Propidiumjodid), während Zellen mit beeinträchtigten Membranen einen Zugang der Probe zum nuklearen DNA gestatten. Zellen, die einer frühen Stufe des apoptotischen Zelltodes unterliegen, können identifiziert werden dadurch, daß die Zelloberfläche das fluorchrommarkierte Chemikal bindet, Annexin V, während sich jedoch kein Verlust der Membranintegrität zeigt. Die späteren Stufen des Zelltodes und der Apoptosis sind, wenn die Plasmamembranen unterbrochen werden, assoziiert mit hoher Annexin-V-Bindung und hoher Probidiumjodid-DNA-Färbung.
Hier wird der Einsatz eines N-Oxid-Derivates exemplifiziert von DRAQ5 (DRAQ5-NO), welches eine Verstärkung bereitstellt zur Lebens-Tod-Zelldiskriminierung. DRAQ5NO ist in der Lage, in intakte lebensfähige Zellen einzudringen und hierin gehalten zu werden bei niedrigem Niveau, wodurch eine positive Diskriminierung für intakte Zellen bereitgestellt wird. In Kombination mit einer sekundären Probe (z. B. Annexin V) ergibt sich eine verstärkte Diskriminierung beim Fortschreiten der Zellen durch den Vorgang des Zelltodes oder der Apoptosis. Die vier Stufen entsprechend dem Färbemuster sind:
Stufe 1: DRAQ5NO positiv/Annexin V negativ (intakte lebensfähige Zellen)
Stufe 2: DRAQ5NO positiv/Annexin V positiv (frühe Stufe apoptotischer Zellen)
Stufe 3:DRAQ5NO hochpositiv/Annexin V positiv (späte Stufe apoptotischer/toter Zellen)
Stufe 4: DRAQ5NO negativ/Annexin V positiv (kernfreie zellulare Trümmer).
12a–d und 13a–d illustrieren Beispiele unter Einsatz einer menschlichen B-Zell-Lymphzellenlinie, die in der Lage sind, das Fortschreiten zu zeigen durch die Apoptosis in Abhängigkeit von der Antikrebsdroge VP-16 (Etoposid) für ein 18-stündiges Aussetzen von 0,25 μM. Zellen wurden präpariert durch Standardverfahren für Annexin V-FITC-Bindung, gleichzeitig ausgesetzt 50 μM DRAQ5NO und dann verdünnt 1 : 5 in phosphatgepufferter Saline vor der fließcytometrischen Analyse unter Einsatz von Cytometer D. Das Instrument wurde eingesetzt in einem Dual-Laser-Verfahren mit einer Wellenlängen-Erregung bei 488 nm von FITC (überwacht durch den Parameter FL1-H) und 633 nm Wellenlängen-Erregung von DRAQ5NO (überwacht durch den Parameter FL4-H). 12a–d zeigen die Kombinationen von Reagenzbehandlungen (Anx = Annexin V-FITC; AQ5N = das N-Oxidderivat von DRAQ5) für Kontrollzellen und 13a–d zeigt die gleiche Kombination der Reaktionsmittel für VP-16 (z. B. VP) behandelten Kulturen. Die Ergebnisse zeigen das geringe Niveau der DRAQ5NO-Färbung, erreicht in Stufe 1-Populationen, und das erhöhte Niveau in Stufe 3-Zellen. Die Frequenz der Zellen, die Annexin V positiv sind, steigt an durch die VP-16-Behandlung, aber umfaßt drei Populationen (Stufen 2–4), die unterscheidbar sind unter Einsatz der Quadranten-Analyse, die in den Aufzeichnungen wiedergegeben ist. Die Verstärkung, die durch den Einsatz von DRAQ5NO zur Verfügung gestellt wird, bezieht sich auf zwei Merkmale. Zum ersten gestatten die vorteilhaften Spektraleigenschaften des DRAQ5-Derivats eine Trennung der Proben-Erregungsereignisse durch den Einsatz von zwei Lasern und/oder das stark reduzierte Spektralüberlappen der Probenemissionssignale. Zum zweiten ergibt sich die positive Diskriminierung von intakten Zellen von kernfreien Zelltrümmern.

Claims

Isolierte Verbindung der folgenden Formel:
wobei jedes X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² ist und wobei A eine C_2-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig aus folgender Gruppe gewählt sind, Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2- ₄-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² bilden zusammen eine C_2- ₆-Alkylengruppe aus, welche mit dem Stickstoffatom, an das R¹ und R² gebunden sind, einen heterozyklischen Ring ausbildet, und wobei die Verbindung (I) optional in Form eines von einer organischen oder anorganischen Säure abgeleiteten Säuresalzes ausgebildet ist.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X₁ und X₂ NH(CH₂)₂NR¹R² sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ und R²C_1-4-Alkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ und R² Methyl sind.
Wässrige Verbindung, die eine Komponente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.
Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der folgenden Formel:
wobei jedes X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² ist und wobei A eine C_2- ₈-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig aus folgender Gruppe gewählt sind, Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2- ₄-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² bilden zusammen eine C_2-6-Alkylengruppe aus, welche mit dem Stickstoffatom, an das R¹ und R² gebunden sind, einen heterozyklischen Ring ausbildet, und wobei die Verbindung (I) optional in Form eines von einer organischen oder anorganischen Säure abgeleiteten Säuresalzes ausgebildet ist, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, eine Verbindung der folgenden Formel:
mit NH₂-A-NR¹R² reagieren zu lassen, wobei A, R¹ und R² wie oben definiert ausgebildet sind, um eine resultierende Verbindung zu erhalten, wobei die resultierende Verbindung optional ferner mit einer Säure behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nachfolgend eine Behandlung mit Natriumchlorat und/oder Natriumhydrogensulfit durchgeführt wird.
Fluoreszierender Komplex mit einer Nukleinsäure und einer Verbindung der folgenden Formel:
wobei jedes X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² ist und wobei A eine C_2- ₈-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig aus folgender Gruppe gewählt sind, Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C_2- ₄-Hydroxyalkyl und C₂ _-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² bilden zusammen eine C_2-6-Alkylengruppe aus, welche mit dem Stickstoffatom, an das R¹ und R² gebunden sind, einen heterozyklischen Ring ausbildet, oder ein N-Oxid-Derivat davon, und wobei die Verbindung (I) oder sein N-Oxid-Derivat optional die Form eines von einer organischen oder anorganischen Säure abgeleiteten Säuresalzes aufweist.
Komplex nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure DNA ist.
Komplex nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA in einer lebenden Zelle vorhanden ist.
Verfahren zum Analysieren einer Zelle oder eines biologischen Materials mit einer oder mehr Nukleinsäuren, mit folgenden Schritten: a) Herstellen einer biologisch kompatiblen Lösung, welche eine Verbindung der folgenden Formel (I) enthält:
wobei jedes X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² ist und wobei A eine C_2-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig aus folgender Gruppe gewählt sind, Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C₂ _-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² bilden zusammen eine C₂ _-6-Alkylengruppe aus, welche mit dem Stickstoffatom, an das R¹ und R² gebunden sind, einen heterozyklischen Ring ausbildet, oder ein N-Oxid-Derivat davon, und wobei die Verbindung (I) oder sein N-Oxid-Derivat optional die Form eines von einer organischen oder anorganischen Säure abgeleiteten Säuresalzes aufweist; b) Behandeln der Zelle oder des biologischen Materials mit der biologisch kompatiblen Lösung; c) Erregen der Verbindung (I) in der behandelten Zelle oder in dem biologischen Material mit einer Lichtquelle; und d) Detektieren des emittierten Fluoreszenzsignals.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle eine oder mehrere Wellenlängen in dem Spektralbereich der Wellenlänge(n) von maximaler Absorption der Verbindung (I) zur Verfügung stellt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung (I) in der Zelle oder dem biologischen Material mit einem oder mehr anderen Fluorochromen oder lichtemittierenden Verbindungen vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorochrome Licht im UV-Spektrum oder sichtbaren Spektrum emittieren.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder mehreren anderen Verbindungen zum Nachweise von Annexin-V-Bindungen verwendet werden.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß dieses ferner den Schritt einer fließcytometrischen Analyse umfaßt.
Verwendung einer Verbindung der folgenden Formel:
wobei jedes X₁ und X₂ unabhängig NH-A-NR¹R² ist und wobei A eine C₂ _-8-Alkylengruppe ist und R¹ und R² unabhängig aus folgender Gruppe gewählt sind, Wasserstoff, C_1-4-Alkyl, C₂ _-4-Hydroxyalkyl und C_2-4-Aminoalkyl, oder R¹ und R² bilden zusammen eine C₂ _-6-Alkylengruppe aus, welche mit dem Stickstoffatom, an das R¹ und R² gebunden sind, einen heterozyklischen Ring ausbildet, oder ein N-Oxid-Derivat davon, und wobei die Verbindung (I) oder sein N-Oxid-Derivat optional die Form eines von einer organischen oder anorganischen Säure abgeleiteten Säuresalzes aufweist, als DNA-Farbstoff.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 17 in einer biologischen Analyse.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 18, wobei die Verbindung als N-Oxid-Derivat vorhanden ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 18 in einer Cytometrie.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 20, wobei die Verbindung als N-Oxid-Derivat vorhanden ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 20 oder 21, wobei die Cytometrie eine Einstrahl- oder Mehrstrahl-Fließcytometrie ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 18 zur Mikroskopie.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 23, wobei die Verbindung als N-Oxid-Derivat vorhanden ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei die Mikroskopie eine konfokale Laserabtastmikroskopie ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 17 als nukleares Färbemittel.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 17 als Abbildemittel.