DE3783838T2

DE3783838T2 - Reagenz und verfahren zum klassifizieren von leukozyten durch durchfluss-zytometrie.

Info

Publication number: DE3783838T2
Application number: DE19873783838
Authority: DE
Inventors: Tomoyuki Kuroda; Takashi Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-09-08
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2007-09-09
Also published as: DE3783838D1; EP0259833A3; CA1309327C; EP0259833A2; EP0259833B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens und ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in der Praxis von klinischen Versuchen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagens und ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten mit einem Fließzytometer mittels optischer Messungen von fluorochromgefärbten Blutzellen.
Leukozyten in dem peripheren Blut von normalen Lebewesen kann in fünf Typen klassifiziert werden, die aus Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen bestehen. Verschiedene Leukozyt-Typen haben unterschiedliche Wirkungen, und das Zählen der Leukozyten in dem Blut in Abhängigkeit ihres Typs liefert wertvolle Informationen für diagnostische Zwecke. Zum Beispiel ist ein Anstieg in der Zahl der Neutrophile mit Krankheiten, wie Entzündungen, myokardialer Infarkt und Leukämie, verbunden, und eine Abnahme in ihrer Zahl ist verbunden mit viralen Krankheiten, hypoplastischer Anämie, Agranulozytosis und so weiter. Auf der anderen Seite wurde ein Anstieg in der Zahl der Eosinophile bei Krankheiten wie Parasitosis, Hodgkin'sche Krankheit und Allergien, gefunden. Eine gesteigerte Zahl an Monocyten tritt entweder während der Konvaleszenzzeit bei Patienten, die an Infektionskrankheiten leiden, oder bei Krankheiten, wie monozytische Leukämie, auf.
Die Klassifizierung und das Zählen der Leukozyten wird üblicherweise über verschiedene Zählmethoden durchgeführt, unter die auch das visuelle Zählverfahren oder einfach ausgedrückt, das manuelle Verfahren, fällt. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe auf eine Glasplatte verteilt, und die Blutkörperchen in dem Abstrich werden fixiert und für die Untersuchung mittels Mikroskop eingefärbt. Der Typ der individuellen Leukozyten wird gemäß der morphologischen Eigenschaften (zum Beispiel Größe, Morphologie von Kern und Zytoplasma, Vorhandensein oder Abwesenheit von Granulen) oder über das Maß der Farbstoffaufnahme identifiziert, klassifiziert und gezählt. In üblichen Laboratorien werden üblicherweise 100 bis 200 Leukozyten für jede Probe gezählt, und der Prozentsatz der insgesamt gezählten Leukozytenmenge, der von dem jeweiligen Typ an Korpuskel eingenommen wird, wird als Meßwert aufgezeichnet.
Die einzelnen Zählverfahren haben mehrere Nachteile. Zuerst muß die mikroskopische Beobachtung über mühsame Verfahren zur Herstellung einer Probe vorbereitet werden, die Schritte, wie das Abstreichen einer Blutprobe auf einer Glasplatte, Fixieren der Korpuskeln und Einfärben dieser, umfassen. Zweitens wird dem Techniker große Mühen bereitet, geringe Unterschiede zwischen Korpuskeln durch mikroskopische Klassifizierung und Zählung zu identifizieren. Drittens ist es auch für einen erfahrenen Techniker schwierig, konsistente Zählungen durch das manuelle Verfahren zu erreichen, da neben der kleinen Zahl an gezählten Leukozyten die abgestrichene Probe oft eine ungleichmäßige Verteilung der Blutkorpuskeln aufweist.
Verschiedene Verfahren wurden vorgeschlagen, um diese Nachteile des manuellen Verfahrens der Leukozytklassifizierung durch Automatisieren zu eliminieren, und solch automatisierte Techniken können ganz grob in zwei Arten aufgeteilt werden. Das erste Verfahren besteht darin, die Bilder der Korpuskeln mit einer Videokamera oder einer anderen geeigneten Bildaufnahmevorrichtung aufzuzeichnen und die Leukozyten mittels eines auf einem Computer aufgezeichneten Bildes zu klassifizieren. Das Verfahrensprinzip dieser Methode ist ähnlich dem der üblichen visuellen Zählmethode, jedoch ist diese Methode, primär bedingt durch das Vorhandensein vieler Korpuskeln, die sich einer Klassifizierung durch Verarbeitung mittels eines Computers entziehen, nicht eine ideale Alternative zu dem manuellen Verfahren. Weiterhin ist dieses Verfahren nicht wirtschaftlich durchführbar, da es eine hochqualitative Ausrüstung erfordert, die groß und teuer ist.
Die andere Annäherung an eine automatische Klassifizierung und Zählung der Leukozyten basiert auf einem Fließsystem. Bei diesem Verfahren läßt man eine Blutprobe mit in einem Verdünnungsmittel suspendierten Korpuskeln in solch einer Weise fließen, daß die Korpuskeln einzeln eine enge Nachweisfläche passieren, und die Leukozytenklassifizierung wird durch Analyse des durch den Detektor erzeugten Signals bewerkstelligt. Dieses zweite Verfahren der Leukozytenzählung, das ein Fließsystem verwendet, kann weiter in zwei Kategorien unterteilt werden.
Gemäß dem Verfahren der ersten Kategorie wird ein Elektrolyt, bei dem alle roten Zellen, die vorlagen, mit einem Lysiermittel zerstört wurden, so daß nur Leukozyten suspendiert werden, durch eine Öffnung geführt, und die Änderung der elektrischen Impedanz, die an der Öffnung auftritt, wenn diese von jedem Korpuskel passiert wird, wird erfaßt, wobei die Größe des erfaßten Signals als Grundlage für die Klassifizierung der Leukozyten verwendet wird.
Das Verfahren der zweiten Kategorie ist durch die Verwendung eines Fließzytometers gekennzeichnet, das eine Lichtquelle, eine Fließzelle, die es ermöglicht, daß die Blutzellen in einer Probe einzeln durch einen engen Kanal fließen, eine fotometrische Einheit, die Licht, ausgehend von jeder Blutzelle, nachweist, und einen Analysator zur Analyse der nachgewiesenen Signale umfaßt. Bei diesem Verfahren werden die Korpuskeln in der Probe, die eingefärbt sind, unter Licht beleuchtet, und die von den beleuchteten Korpuskeln ausgestrahlte Fluoreszenz wird erfaßt, gegebenenfalls zusammen mit Streulicht, wobei die Leukozytenklassifizierung in Abhängigkeit von der Intensität der nachgewiesenen Signale durchgeführt wird.
Techniken, die in die Kategorie dieser fließzytometrischen Methode fallen, werden zum Beispiel in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 853/1984 und in L.A. Kamentsky, Blutzellen, 6, 121-140 (1980) beschrieben. Gemäß diesen Techniken wird eine Blutprobe mit 10 Volumenteilen an Acridin-Orange-Lösung eingefärbt, eine Minute lang inkubiert und unter einer Lichtquelle, wie zum Beispiel einem Argonionlaser, bestrahlt. Die grüne Fluoreszenz und die rote Fluoreszenz, die von den einzelnen Korpuskeln ausgestrahlt wird; wird gemessen, und die Klassifizierung und das Zählen der Leukozyten werden anschließend auf der Grundlage eines zweidimensionalen Plots der Fluoreszenzmessungen durchgeführt.
Andere Beispiele der Techniken, die als fließzytometrische Lösung klassifiziert sind, werden in der ungeprüften, veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr.
20820/1975; in H.M. Shapiro et al., J. Histochem. Cytochem., 24 (1), 396-411 (1976) und idem, ibid, 25, (8), 976-989 (1977) gezeigt. Gemäß diesen Verfahren wird eine Blutprobe mit vier Volumenteilen an Farbstofflösung I gefärbt, drei Minuten lang inkubiert, anschließend mit 20% Formaldehyd in einem Volumenanteil, der gleich dem des Blutes ist, vermengt, 5 Minuten lang fixiert und mit einer verdünnenden Farbstofflösung II verdünnt, um eine Konzentration zu erhalten, die 15 bis 20mal so niedrig wie der ursprüngliche Wert ist. Die so hergestellte Probe wird dann der Messung mit einem Fließzytometer unterzogen.
Das bei diesem Verfahren eingesetzte Fließzytometer verwendet entweder drei Quecksilberlampen, die jeweils eine spezielle Lichtwellenlänge erzeugen, oder drei Laser, um die drei Fluoreszenzfarben in der Farbstofflösung anzuregen. Die gemessenen Parameter sind drei Arten an Fluoreszenz, geradliniges Streulicht, 90% Streulicht und absorbiertes Licht. Basierend auf diesen 6 Parametern werden zweidimensionale Plots in vier Stufen konstruiert und analysiert, um die Leukozyten zu klassifizieren und zu zählen.
Bei der ersten Version des Verfahrens, das ein Fließsystem für die Leukozytenklassifizierung und -zählung verwendet, ist das Aufbrechen der Erythrocyten eine Vorbedingung, die jedoch von der Blutprobe abhängt, und es ist unmöglich, eine komplette Lysis der Erythrocyten zu bewirken, und die Genauigkeit der Messungen kann in einem solchen Fall beeinträchtigt sein.
Die Beispiele der fließzytometrischen Lösung, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 853/1984 und in Blutzellen, 6, 121-140 (1980) beschrieben sind, sind gekennzeichnet durch Messungen, bevor die Farbstoffabsorption durch die Zellen ein Gleichgewicht erreicht, oder durch Messungen zu dem Zeitpunkt, in dem der Unterschied zwischen den Intensitäten der Fluoreszenz von den einzelnen Leukozyten ein Maximum während des Färbeprozesses erreicht. Jedoch ist die erforderliche Zeit für das Erreichen eines geeigneten Niveaus der Fluoreszenzintensität in einer Probe, deren Leukozytenzahl extrem ist, unterschiedlich zu der Zeit für eine normale Probe, und es muß eine geeignete Färbezeit für jede Probe ausgewählt werden. Als weiteres Problem verläßt sich dieses Verfahren nur auf die unterschiedlichen Intensitäten der Fluoreszenzen für die Leukozytklassifizierung und sichert sich nicht notwendigerweise durch eine genaue Trennung zwischen den unterschiedlichen Leukozytarten, wie Lymphozyten und Monozyten, ab.
Die anderen Beispiele der cytometrischen Lösung, die in der ungeprüften, veröffentlichten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 20820/1975, in J. Histochem. Cytochem., 24 (1), 396-411 (1976) und supra, 25 (8) 976-989 (1977) beschrieben sind, haben den Nachteil, daß sie viele Operationsschritte umfassen, eine sehr lange Färbezeit erfordern und die Verwendung von Reagentien in einem komplexen System erfordern. Weiterhin erfordert die Handhabung dieser-Verfahren eine qualitativ sehr hochwertige und teure Apparatur, die drei Lichtquellen beinhaltet, und die in der Lage ist, sechs Parameter zu messen. Darüber hinaus ist die Analyse einer solch großen Zahl von Parametern notwendigerweise kompliziert und erfordert einen Analysator mit großer Kapazität.
Erythrocyten in der Blutprobe emittieren nur eine Fluoreszenz mit sehr niedriger Intensität, so daß, wenn nur die Intensität der Fluoreszenz zu messen ist, die Erythrocyten nicht das Zählen der Leukozyten stören, selbst wenn ein Zusammentreffen von Erythrocyten und Leukocyten erfolgt (d. h., wenn Erythrocyten und Leukocyten gleichzeitig den Nachweisteil passieren.). Jedoch, wenn man das Streulicht messen will, dann werden Erythrocyten, die Streulicht mit einer Intensität erzeugen, die vergleichbar zu der des Streulichtes ist, das von Leukozyten emittiert wird, das Zählen der Leukozyten stören. In diesem Fall kann man gleichzeitig die Fluoreszenz und das Streulicht messen und als Leukozyten nur die Korpuskeln betrachten, die Fluoreszenz mit einer Intensität, die über einem bestimmten Niveau liegt, emittieren. Wenn jedoch Leukozyten und Erythrocyten zusammentreffen, dann wird das Streulicht von den Erythrocyten von dem Streulicht von den Leukozyten überlagert, so daß es schwierig ist, eine genaue Messung des Streulichtes von den Leukozyten zu verwirklichen.
Die oben genannten, mit der Störung durch Erythrocyten verbundene Probleme können gelöst werden, wenn sie aus der Blutprobe durch eine geeignete Technik, wie Lysieren, eliminiert werden, jedoch wurde diese Idee bislang noch nicht in die Praxis umgesetzt, da ein Eliminierungsverfahren für Erythrocyten, wie Lysieren, das mit den Bedingungen des Färbens zusammenpaßt, fehlt. Im Stand der Technik des Klassifizierens von Leukozyten in fünf Arten durch Anfärben mit Fluorochromen ist kein Verfahren bekannt, bei dem Erythrocyten lysiert werden. Weiterhin ist auch keine Technik verfügbar, gemäß der erfolgreich nur Erythrocyten innerhalb einer Minute lysiert werden, und das rechtwinkliges Streulicht (morphologische Information aus Leukozyten) nicht nachteilig beeinflußt.
Blutproben für das Zählen der Leukozyten, die frei von Erythrocyten sind, werden üblicherweise gemäß den folgenden Verfahren hergestellt:
i) Zerstören der Erythrocyten
a) Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel;
b) Behandlung mit einem Ammoniumsalz (z. B. NH&sub4;Cl);
c) Hypertonische Behandlung (bei einem physiologischen pH-Wert)
ii) Trennung
d) Zentrifugieren
e) Sedimentieren
f) Andere Verfahren.
Die Verfahren a) bis e) werden im folgenden kurz beschrieben.
a) Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel:
Dieses Verfahren inhibiert das nachfolgende Färben und verursacht zusätzlich zu der Zerstörung der Erythrocyten morphologische Veränderungen bei den Leukozyten, wie zum Beispiel einen Verlust an Kernen, ein Anquellen und Schrumpfen, wodurch es schwierig wird, eine dreiteilige Differenzierung der Leukozyten mittels der Signale von Streulicht zu erreichen.
Weiterhin werden die mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelten Leukozyten in der Probe mit der Zeit morphologische Veränderungen erfahren.
b) Behandlung mit einem Ammoniumsalz.
Dieses Verfahren inhibiert das nachfolgende Anfärben. Darüber hinaus besitzt das Ammoniumsalz keine große Fähigkeit, Erythrocyten zu zerstören, und es ist schwierig, eine dicke Proben die einer 20-fachen Verdünnung des gesamten Blutes entspricht, über dieses Verfahren herzustellen. Weiterhin erfordert es 3 bis 5 Minuten, um eine vollständige Zerstörung der Erythrocyten über das Verfahren b) zu erreichen.
c) Hypotonische Behandlung
Dieses Verfahren läßt die Leukozyten intakt, während die Erythrocyten zerstört werden, indem man von der Tatsache Gebrauch macht, daß Leukozyten in hypotonischen Lösungen resistenter als Erythrocyten sind. Jedoch wird bei einem physiologischen pH-Wert und unter Bedingungen, die eine vollständige Zerstörung der Eryhtrocyten bewirken, ein Teil der Leukozyten zerstört.
d) Zentrifugieren
e) Sedimentieren
Beide Verfahren haben die Nachteile eines mühsamen und langwierigen Vorgehens und die hohe Gefahr eines Verlusts an Leukozyten und von Fluktationen bei der Zählung und Bestimmung der Leukozyten.
Die vorliegende Erfindung wurde geschaffen, um die oben genannten Probleme der Techniken des Standes der Technik bei der Klassifizierung und dem Zählen von Leukozyten zu lösen, und sie schafft ein Reagens und ein Verfahren, die eine genaue Klassifizierung und Zählung der Leukozyten mittels einfacher Vorgehensweisen ermöglichen.
Gemäß einem Aspekt schafft die vorliegende Erfindung ein Reagenzsystem zur Anwendung bei der Klassifizierung von Leukozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, in Lymphozyten, Monocyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile mittels eines Fließzytometers durch Messung der von Fluorochrom gefärbten Zellen emittierten Fluoreszenz und des Streulichtes, das
(a) eine erste Flüssigkeit, umfassend ein Fluorochrom zur selektiven Färbung von Eosinophilen, ein Fluorochrom zur selektiven Färbung von Basophilen und einen Puffer und mit einem pH-Wert zwischen 2,0 und 5,0 und einer Osmolarität im Bereich von 0 bis 100 mOsm/kg, und
(b) eine zweite Flüssigkeit, umfassend einen Puffer zur Neutralisierung der Säure in dem Puffer der ersten Flüssigkeit und zur Einstellung des pH-Wertes der erhaltenen Farbstofflösung auf einen zum Färben geeigneten pH-Wert und ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Anpassung der Osmolarität der Farbstofflösung auf einen Wert, bei dem die Leukozyten in ihrer Form unverändert bleiben, beinhaltet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fluorochrom für das selektive Färben der Eosinophile Neutral-Rot. Weiterhin ist das bevorzugte Fluorochrom für das selektive Färben der Basophile entweder Astrazon Orange G oder Auramin O.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Reagenzsystem in der ersten Flüssigkeit (a) ein Fluorochrom für das selektive Färben der Monocyten. Dieses Fluorochrom kann aus der Reihe
1,1'-Dimethyloxacarbocyanin, 1,1'-Diethyloxacarbocyanin,
1,1'-Di(n-propyl)oxacarbocyanin,
1,1'-Di(n-pentyl)oxacarbocyanin,
1,1'-Di(n-hexyl)oxacarbocyanin, TA-2 und
2-(gamma-(1'-Ethyl-4,5'-benzothiazolyliden)propenyl)-1- ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid ausgewählt werden.
Die verwendeten Farbstoffe haben die folgenden chemischen Strukturformeln:
Neutral Rot (C.I. Nr. 50.040 oder C.I. Basis Rot 5)
Astrazon Orange G (C.I. Nr.48.035 oder C.I. Basis Orange 21)
Auramin o (C.I. Nr. 41.000 oder C.I. Basis Gelb 2)
DiOCn(3) (1,1'-Dialkyloxacarbocyanin); n=1, 2, 3, 5 oder 6
2-(gamma-(1'-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)propenyl)-1- ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid
Wenn das Reagenzsystem der vorliegenden Erfindung verwendet wird, dann sind keine komplizierten Vorbehandlungsverfahren notwendig und es kann eine selektive Klassifizierung und Zählung der Leukozyten mit einem Fließzytometer erhalten werden, indem man einfach ein einstufiges Färbeverfahren mit der Blutprobe durchführt.
Während der Versuche, die auf der Grundlage von "Trial-and-error" durchgeführt wurden und die letztlich zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde gefunden, daß 17 Farbstoffe hervorragen, mit denen die Leukozyten eingefärbt werden konnten, um sie in mindestens 4 verschiedene Typen auf der Grundlage eines zweidimensionalen Plots von zwei Meßparametern, die aus rechtwinkligem Streulicht und mehreren Fluoreszenzemissionen bestanden, mit einem Argonionlaser, der bei 488 nm arbeitet und als einzige Lichtquelle verwendet wird, zu klassifizieren. In der folgenden Tabelle A sind die Namen, die Farbindexnummern und die Fluoreszenzeigenschaften der einzelnen Farbstoffe widergegeben. Farbstoffgruppe Name Farbindex Nr. Fluoreszenzeigensschaften Anregungsmaximum (nm) Emissionsmaximum (nm) I. Xanthenfarbstoffe Pyronin Y Rhodamin 3GO Fluoreszein II. Oxacarbocyanin-Farbstoffe III. Acridinfarbstoffe Acridin Orange Brilliant Phosphin Rhodulin Orange Euchrysin 3RX Flavophosphin R Coriphosphin O IV. Azinfarbstoffe Neutral Rot V. Diphenylmethanfarbstoffe Auramin O VI. Methinfarbstoffe Astrazon Orange G *DiOC1(3): 1,1'-Dimethylaoxacarbocyanin *DiOC2(3): 1,1'-Diethyloxacarbocyanin *DiOC3(3):1,1'-Di-(n-Propyl)-oxacarbocyanin *DiOC5(3): 1,1'-Di-(n-Pentyl)-oxacarbocyanin *DiOC6(3): 1,1'-Di-(n-Hexyl)-oxacarbocyanin
Leukozyten können in fünf oder mehrere Arten klassifiziert werden, wenn Acridinfarbstoffe wie Acridin Orange und Rhodulin Orange verwendet werden.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm der Optik eines Fließzytometers, das für die Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann;
Fig. 2a ist eine Darstellung, die die relativen Intensitäten des rechtwinkligen Streulichts von fünf verschiedenen Arten von Leukozyten zeigt;
Fig. 2b stellt eine Frequenzverteilungskurve hinsichtlich der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichts von Lymphozyten, Monocyten und Neutrophilen dar, die durch das Zusammentreffen von Erythrocyten und Leukocyten beeinflußt ist.
Fig. 2c stellt eine Frequenzverteilungskurve der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichtes von Lymphozyten, Monocyten und Neutrophilen in Abwesenheit eines Zusammentreffens von Erythrocyten und Leukozyten dar;
Fig. 3 bis 11 und 14 sind zweidimensionale Plots von zwei Signalen, wie sie zur Klassifizierung der Leukozyten verwendet werden;
Fig. 12 ist eine Darstellung, die das Anregungs- und Emissionsspektrum der Fluoreszenz von Neutral Rot zeigt;
Fig. 13 ist eine Darstellung, die das Anregungs- und Emissionsspektrum der Fluoreszenz von Astrazon Orange G zeigt;
Fig. 15 ist eine Darstellung, die die Auflösung zwischen Eosinophilen und Neutrophilen und zwischen Basophilen und Neutrophilen als Funktion der Konzentration von Neutral Rot zeigt;
Fig. 16 ist ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten der roten und grünen Fluoreszenz, wie sie in der Klassifizierung der Leukozyten verwendet werden; und
Fig. 17 ist eine Darstellung, die die Auflösung zwischen Eosinophilen und Neutrophilen und zwischen Basophilen und Neutrophilen als Funktion des pH-Wertes der Farblösung zeigt.
Fig. 18 ist eine Darstellung, die den Zusammenhang zwischen den Intensitäten der Fluoreszenz der klassifizierten Leukozyten und den Wellenlängen zeigt.
Die Fig. 3 bis 5 sind zweidimensionale Plots der Intensitäten von rechtwinkligen Streulicht und der Fluoreszenz, wie sie mit einem Fließzytometer von Leukozyten gemessen wurden, die mit einem der 17 in Tabelle A aufgeführten Farbstoffe eingefärbt wurden, so daß sie klar von Erythrocyten und Plättchen unterscheidbar waren. Die Zahlen und Symbole, die in diesen drei Figuren verwendet wurden, besitzen die folgenden Bedeutungen: 1, Lymphocyten; 2, Monocyten; 3, Neutrophile; 4, Eosinophile; 5, Basophile; RIRS, relative Intensität von rechtwinkligem Streulicht; und RIF, relative Intensität der Fluoreszenz.
Das in Fig. 3 gezeigte Trennmuster ist typisch für das Einfärben mit Xanthenfarbstoffen, Oxacarbocyaninfarbstoffen oder Acridinfarbstoffen. Ähnliche Muster werden erhalten, wenn man zweidimensionale Plots der Intensitäten der grünen und roten Fluoreszenz von Leukozyten konstruiert, die mit Acridinfarbstoffen eingefärbt wurden.
Das in Fig. 4 dargestellte Trennmuster ist typisch für das Einfärben mit Neutral Rot.
Das in Fig. 5 gezeigte Trennmuster ist typisch für das Einfärben mit Astrazon Orange G oder Auramin O.
Es wurde auch gefunden, daß es ungefähr 20 Farbstoffe gibt, mit denen Leukozyten zur Klassifizierung von drei Arten eingefärbt werden können, und das Trennmuster, das typisch für das Einfärben mit diesen Farbstoffen ist, ist in Fig. 6 gezeigt.
Wenn einer der Farbstoffe, die ein Trennmuster des Typs, wie er in Fig. 4 gezeigt ist, produziert, mit einer geeigneten Menge von einem der Farbstoffe, die ein Trennmuster derart, wie sie in Fig. 5 gezeigt ist, produzieren, vermengt wird, und wenn die Fluoreszenz von jedem Farbstoffaufgefangen wird, dann wird ein Muster des Typs, wie er in Fig. 7 gezeigt ist, durch Messung der Intensitäten der Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichtes erhalten. Wenn zwei Fluoreszenzemissionen (d. h. grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz), die eine geeignete Wellenlänge für spezifische Farbstoffe aufweisen, verwendet werden, dann können Eosinophile und Basophile von anderen Leukozyt-Typen, wie dies in Fig. 8 gezeigt ist (Eosinophile 4 und Basophile 5), getrennt werden. Die verbleibenden Komponenten der Leukozyten, (d. h. Lymphocyten, Monocyten und Neutrophile) können voneinander mittels der Intensitäten der Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichtes, wie es in Fig. 9 gezeigt ist, getrennt werden.
Wenn ein Farbstoff, der ein Muster des Typs, wie er in Fig. 6 gezeigt ist, produziert, zu Farbstoffen hinzugegeben wird, die das Muster gemäß der Fig. 7 erzeugen, dann wird eine bessere Auflösung von Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen erreicht, wobei ein Muster des Typs, wie es in Fig. 10 gezeigt ist (wobei die entsprechenden Leukozytpopulationen mit 1, 2 und 3 bezeichnet sind), erzeugt wird. Auch in diesem Fall kann eine zweistufige Analyse durchgeführt werden, indem man zunächst grüne und rote Fluoreszenz (Fig. 8) einsetzt, und dann Fluoreszenz und rechtwinkliges Streulicht (Fig. 11) verwendet.

Farbstoffcharakterisierung

a. Neutral Rot
Dies ist ein Farbstoff, der selektiv Leukozyten färbt. Er färbt Eosinophile in einem größeren Ausmaß als andere Leukozyten. Ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten von rechtwinkligem Streulicht und roter Fluoreszenz von Leukozyten, die mit Neutral Rot eingefärbt wurden, ist in Fig. 4 gezeigt.
Fig. 12 zeigt die Anregungs- und Emissionsspektren der Fluoreszenz für Neutral Rot. Neutral Rot produziert eine spezifische Fluoreszenz der Eosinophile im Bereich von 580 bis 640 nm (orange bis rot).
Ein zweidimensionaler Plot des Musters, wie es in Mol-%4 gezeigt ist, wird erzeugt, indem man eine Farbstofflösung mit einem pH-Wert von 5 bis 11 und einer Farbstoffkonzentration von 3 bis 300ug/ml verwendet. Selbst wenn die Farbstoffkonzentration weniger als 3ug/ml beträgt, dann wird ein spezifisches Muster der Verteilung der Eosinophile erzeugt, jedoch sind die anderen Leukozyten zu grell, als daß sie genau gemessen werden könnten. Wenn man nur das Signal der Eosinophile erhalten muß, dann sollte die Konzentration mindestens 0,1ug/ml betragen.
b. Astrazon Orange G
Dies ist ebenfalls ein Fluorochromfarbstoff, der selektiv Leukozyten färbt. Er färbt Basophile in einem größeren Ausmaß als andere Leukozyten. Ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichts und der grünen Fluoreszenz von grünen Leukozyten, die mit Astrazon Orange G eingefärbt wurden, ist in Fig. 5 gezeigt.
Fig. 13 zeigt die Anregungs- und Emissionsspektren der Fluoreszenz von Astrazon Orange G. Astrazon Orange G erzeugt eine spezifische Fluoreszenz von Basophilen im gelb-grünen Bereich mit einer zentralen Wellenlänge von ungefähr 540 nm.
Ein zweidimensionaler Plot des Musters, wie es in Mol-%5 gezeigt ist; wird erzeugt, wenn man eine Farbstofflösung mit einem pH-Wert von 5 bis 11 und mit einer Farbstoffkonzentration von 1 bis 300ug/ml verwendet. Ein ähnliches Trennmuster wird mit Auramin O erhalten.
c. Weitere Farbstoffe
Weitere Farbstoffe, die Leukozyten färben, können auch verwendet werden. Sie färben Monozyten in einem größeren Ausmaß als die anderen Leukozyten. Sie sind in der Lage, Leukozyten mindestens in drei Typen hinsichtlich ihres rechtwinkligen Streulichtes und der Fluoreszenz zu unterscheiden, wie dies in Fig. 6 gezeigt ist.
d. Kombination von Neutral Rot und Astrazon Orange G
Neutral Rot erzeugt eine spezifische Fluoreszenz von Eosinophilen, während Astrazon Orange G spezifisch Basophile färbt, wobei ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichts und der gelben bis roten Fluoreszenz erzeugt wird, wie es in Fig. 7 gezeigt wird. Dieser Plot wird erhalten, wenn man eine Farbstofflösung mit einem pH-Wert von 5 bis 11, einer Neutral Rot Konzentration von 0,1 bis 30ug/ml und einer Konzentration von Astrazon Orange G von 1 bis 390ug/ml verwendet.
e. Kombinaton von Neutral Rot, Astrazon Orange G und anderen Farbstoffen
Durch Verwendung geeigneter Kombinationen von Farbstoffen der Gruppen d. und c. können Leukozyten auf solch eine Weise eingefärbt werden, daß eine bessere Auflösung der Monocyten (geringere Kontaminierung durch Lymphocyten und Neutrophile) im Vergleich zu dem Fall, in dem Farbstoffe der Gruppe d. alleine verwendet werden, erhalten werden kann. Ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichtes und der gelben bis roten Fluoreszenz von Leukozyten, die mit Kombinationen von Neutral Rot, Astrazon Orange und anderen geeigneten Farbstoffen eingefärbt wurden, ist in Fig. 10 gezeigt.
Beispielhafte Farbstoffe, die unter die Kategory c. fallen und die verwendet werden können, um ein Trennmuster des Typs, wie es in Fig. 10 gezeigt ist, zu erzeugen, beinhalten Oxacarbocyaninfarbstoffe, wie DiOC&sub1;(3), DiOC&sub2;(3), DiOC&sub3;(3), DiOC&sub5;(3) und DiOC&sub6;(3), TA-2 (ein Styrolfarbstoff, hergestellt von Nippon Kanko-Shikiso Kenkyusho Co., Ltd., Okayama, Japan), und Cyaninfarbstoffe wie 2-(gamma-(1'-ethyl- 4',5'-benzothiazolyliden)-propenyl)-1-ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid.
Wie in Fig. 14 dargestellt, kann man mit Oxacarbocyaninfarbstoffen, die alleine verwendet werden, Leukozyten in vier Typen klassifizieren, wobei Eosinophile (4) in einem geringeren Ausmaß wie Neutrophile (3) eingefärbt werden. Wenn solche Farbstoffe mit Neutral Rot vermengt werden, das eine stärkere Spezifizierung hinsichtlich der Einfärbung von Eosinophilen liefert, dann wird ein Plot des Musters gemäß Fig. 10 erhalten, wobei Eosinophile (4) über Neutrophilen (3) verteilt werden.
Es gibt viele andere Farbstoffe, die zu der Gruppe c. gehören, wobei jedoch aufgrund mehrerer limitierender Faktoren, wie Färbebedingungen, Ausmaß der Farbstoffaufnahme und Wellenlänge der Fluoreszenzemmissionen, die oben speziell genannten und analoge Verbindungen hierzu die einzigen Beispiele sind, die vorteilhaft gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.

Andere Komponenten der Farbstofflösung

a. Puffer
Der Puffer wird verwendet, um den pH-Wert der Farbstofflösung auf einem optimalen Wert zu halten. Es ist wichtig, daß der pH-Wert der Farbstofflösung auf einem optimalen Niveau gehalten wird, da die Adsorptionsmenge des Farbstoffs und die Spezifizität gegenüber cytoplasmischen Proteinen mit dem pH-Wert variiert. Das Blut selbst hat eine Pufferwirkung, durch die der pH-Wert in der Nähe von 7,4 gehalten wird, so daß der Puffer in einer ausreichenden Menge hinzugegeben werden muß, um diese Wirkung auszuschalten und um einen gewünschten pH-Wert einzustellen.
Aus diesem Zweck werden Puffer, wie Phosphat, Citrat, Borat, Tris, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, Glycin, Carbonat, Collidin und Taurin in Mengen im Bereich von 5 bis 200ug/ml (ppm) verwendet.
b. Die Osmolarität kompensierende Mittel
Das die Osmolarität kompensierende Mittel wird verwendet, ums zu verhindern, daß Leukozyten Defekte, wie extreme Deformation und Zerstörung, erfahren. Zu diesem Zweck werden Alkalimetallsalze in Mengen von 60 bis 380 mM verwendet, um eine Osmolarität zu schaffen, die im Bereich von 40 bis 250% der physiologischen Osmolarität des menschlichen Blutes (280 mOsm/kg) liegt.
Unter Verwendung des Reagenzsystems der vorliegenden Erfindung müssen die folgenden Vorkehrungen getroffen werden.
(a) Wenn zwei oder mehrere Farbstoffe vermengt werden, dann müssen die Färbebedingungen so eingestellt werden, daß den einzelnen Farbstoffen die beabsichtigten Spezifizierungen ermöglicht werden, da die optimalen Konzentrationen und die pH-Werte für das Erreichen spezifischer Einfärbungen im allgemeinen von Farbstoff zu Farbstoff variieren.
(b) Die Menge jedes der hinzuzufügenden Farbstoffe muß in einer solchen Weise angepaßt werden, daß ein gewünschtes Trennmuster erzeugt wird, da unterschiedliche Farbstoffe unterschiedliche Intensitäten von Fluoreszenz aufweisen (die Fluoreszenzintensität wird im allgemeinen bestimmt, indem man die Menge des leuchtenden Lichtes, Io, mit dem molekularen Extinktionskoeffizienten, epsilon, der Quantenausbeute, phi, der Farbstoffkonzentration, c, und dem Kompensationsfaktor, alpha, der durch die speziell verwendete Optik bestimmt wird, multipliziert)
(c) Die Wellenlänge des zu empfangenden Lichtes muß in solch einer Weise ausgewählt werden, daß ein zweidimensionaler Plot mit der gewünschten Spezifizität erhalten werden kann.
Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten geschaffen, das die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Zerstören der Erythrocyten in einer frischen Probe von anticoaguliertem Blut durch Zugabe dessen zu der oben spezifizierten, ersten Flüssigkeit des Reagenzsystems;
(b) Färben der Leukozyten in der so behandelten Blutprobe durch Zugabe dieser zu der oben spezifizierten zweiten Flüssigkeit des Reagenzsystems;
(c) Fließen lassen der gefärbten Probe durch ein Fließzytometer, Differentieren der Leukozyten von allen anderen Korpuskeln und Nebenbestandteilen mittels der Intensität der Fluoreszenz, und Messen der Signale von ein oder zwei Fluoreszenzen und des rechtwinkligen Streulichtes von Leukozyten; und
(d) Identifizieren der Art jedes der Leukozyten mittels zwei oder drei von diesen emittierten Signalen, Zählen der Zahl der nachgewiesenen Leukozyten gemäß ihrem Typ und Berechnen der Anteile der einzelnen Leukozyttypen.
Neutral Rot und Astrazon Orange G, die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, haben die folgenden chemischen Formel:
Neutral Rot (C.I. Nr. 50.040 oder C.I. Basis Rot 5)
Astrazon Orange G (C.I. Nr. 48.035 oder C.I. Basis Orange 21).
Von den von den Leukozyten gemäß dem oben beschriebenen Verfahren emittierten Signalen reflektiert das rechtwinklige Streulichtsignal die strukturelle Information einer einzelnen weißen Zelle. Je größer der Kern einer weißen Blutzelle ist, und je mehr Granulen in ihr vorliegen, desto höher wird die Lichtreflektion in der Zelle auftreten, und umso intensiver wird das rechtwinklige Streulicht erzeugt. Eine Lymphozyte enthält sehr wenige oder gar keine Granulen, so daß das von der Lymphozyte erzeugte Streulicht das schwächste aller Leukozyten ist. Auf der anderen Seite enthält ein Neutrophil viele Granulen und hat einen großen Kern, so daß es ein sehr intensives Streulicht erzeugt. Monocyten, Eosinophile und Basophile erzeugen Streulicht mit einer Intensität, die zwischen den Intensitäten des Streulichtes von Lymphocyten und Neutrophilen liegt. Aus diesem Grund ergeben sich die relativen Intensitäten des rechtwinkligen Streulichtes der einzelnen Leukozyttypen, wie es in Mol-%2a gezeigt ist.
Das Fluoreszenzsignal reflektiert den cytochemischen Charakter der Leukozyten und hängt von der Wechselwirkung zwischen den Farbstoffen und den einzelnen Leukozyttypen ab, wobei Signale unterschiedlicher Intensität von den Leukozyten erzeuge werden.
Deshalb können Leukozyten in fünf Arten klassifiziert werdend indem man zunächst Eosinophile und Basophile selektiv färbt, so daß die Cluster dieser beiden Typen von Leukozyten von jedem anderen Typ durch die Intensitäten der zwei Fluoreszenzen unterschieden werden können, und indem man anschließend die verbleibenden Leukozyten (d. h. Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile) mittels der Intensität des rechtwinkligen Streulichtes unterscheidet.
Aus der vorgehenden Erläuterung wird klar, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Vorteil besitzt, daß keine mühsamen Verfahrensschritte, einschließlich einer komplizierten Vorbehandlung, erforderlich sind, und daß die Leukozyten in dem Blut alleine klassifiziert und gezählt werden können mittels eines Fließzytometers, nachdem ein einfaches, zweistufiges Färbeverfahren durchgeführt worden ist.
Ein spezielles Beispiel der Optik eines gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Fließzytometers wird im Zusammenhang mit der Fig. 1 beschrieben. Die in Fig. 1 gezeigte Optik wird in einem Fließzytometer verwendet, das zur Messung von rechtwinkligem Streulicht, roter und grüner Fluoreszenz konzipiert ist. Die ganz allgemein mit 10 bezeichnete Optik verwendet einen Argionionlaser 12 als Lichtquelle und sie arbeitet bei einer Wellenlänge von 488 nm und produziert einen Leistung von 10 mW. Das von dem Laser 12 emittierte Licht wird mittels einer zylindrischen Linse 16 konvergiert und bestrahlt eine Blutprobe, die durch eine Fließzelle 14 fließt.
Wenn die gefärbten Leukozyten in der Probe durch das Laserlicht angeregt werden, dann erzeugen sie Streulicht und Fluoreszenz. Das rechtwinklige Streulicht und die Fluoreszenz werden mit einer Kondenserlinse 18 konvergiert und durch eine Öffnung 20 geführt, wo sie auf einen dichroitischen Spiegel 22 treffen.
Der dichroitische Spiegel 22 reflektiert das rechtwinklige Streulicht 24 und läßt die Fluoreszenz 26 durch. Das von dem dichroitischen Spiegel 22 reflektierte rechtwinklige Streulicht 24 wird in einer Photovervielfältigungsröhre 28 nachgewiesen. Von der Fluoreszenz 26, die den dichroitischen Spiegel 22 passiert hat, wird die rote Fluoreszenz 32 von einem dichroitischen Spiegel 30 reflektiert, und die grüne Fluoreszenz 38 wird durch diesen Spiegel hindurchgelassen. Die reflektierte rote Fluoreszenz 32 läuft über einen Farbfilter 34 und wird in einer Fotoverfielfältigungsröhre 36 nachgewiesen. Die durchgelassene grüne Fluoreszenz 38 läuft durch einen Farbfilter 40 und wird in einer Photovervielfältigungsröhre 42 nachgewiesen.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Erythrocyten in einer Blutprobe durch eine saure und hypertonische Behandlung aufgebrochen, so daß die Störung reduziert wird, die bei der Intensitätsverteilung des rechtwinkligen Streulichts auftritt, wenn rote und weiße Blutzellen zusammentreffen.
Wie zuvor erwähnt, werden, wenn eine hypertonische Behandlung in dem physiologischen pH-Wert Bereich durchgeführt wird, nicht nur die Erythrocyten, sondern auch einige Leukocyten zerstört. Auf der anderen Seite werden, wenn eine hypotonische Behandlung in einem sauren pH-Bereich, zum Beispiel bei einem pH-Wert zwischen 2,0 und 5,0, durchgeführt wird, die Leukozyten intakt bleiben und es werden nur die Erythrocyten zerstört. In diesem Fall treten keine morphologischen Änderungen, wie Kernverlust, Quellen und Schrumpfen, bei den Leukozyten auf.
Der Mechanismus, durch den die Erythrocyten selektiv zerstört werden, ist nicht klar, jedoch werden Erythrocyten durch eine hypotonische Behandlung progressiv zerstört, wobei ein Brüchigwerden ihrer Membranen und eine saure Fixierung der Leukozyten wahrscheinlich unter sauren pH-Bedingungen auftreten, mit dem Ergebnis, daß nur Leukozyten, die resistenter als Erythrocyten sind, intakt bleiben.
Als Ergebnis dieser hypertonischen Behandlung unter sauren Bedingungen werden die meisten der Erythrocyten zu "Geistern" und nur ein Teil dieser wird zu "Fragmenten" reduziert. Als Konsequenz davon wird die Intensität des rechtwinkligen Streulichtes von den Erythrocyten auf nicht mehr als die Hälfte bis zu einem Drittel der Intensität des rechtwinkligen Streulichtes von Lymphozyten reduziert, und das Zusammentreffen von roten und weißen Blutzellen kann für praktische Zwecke unberücksichtigt bleiben.
Da nicht alle Erythrocyten zu Fragmenten durch die hypotonische Behandlung unter sauren Bedingungen reduziert werden, ist es schwierig, Erythrocyten von Leukocyten nur auf der Grundlage der Intensität der Streulichtsignale zu unterscheiden. Deshalb ist es, wie schon erwähnt, wünschenswert, die Erythrocyten von den Leukozyten durch die Intensität der Fluoreszenzsignale zu unterscheiden.
Die Wirkungen von Astrazon Orange G und Neutral Rot, die als Fluorochrome gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden im folgenden beschrieben.
Eine Probe von anticoaguliertem Blut wird zunächst mit der ersten Flüssigkeit vermengt, so daß die Erythrocyten in dem Blut zu "Geistern" und "Fragmenten" reduziert werden. Im Anschluß daran wird die zweite Flüssigkeit hinzugegeben, um die Leukozyten und die Plättchen in dem Blut zu färben.
Man nimmt an, daß die Farbstoffe in der Farbstofflösung (d. h. der ersten Flüssigkeit) sich mit den cellulären Bestandteilen (insbesondere den Granulen) in den Leukocyten durch ionische Adsorption verbinden. Astrazon Orange G würde sich fest an saure Substanzen, wie Separin und Histamin, in basophilen Granulen binden und als Folge davon verschiebt sich die Wellenlänge der von Astrazon Orange G emittierten Fluoreszenz von 520 bis 540 nm auf 560 bis 580 nm (dieses Phänomen wird im allgemeinen als Metachromasia bezeichnet). Astrazon Orange G bindet sich auch an die Granulen in den anderen Leukocyten (d. h. Eosinophilen, Lymphocyten, Monocyten und Neutrophilen), jedoch tritt anders als im Fall der Bindung zu den Basophilen keine nachweisbare Methachromasia auf. Astrazon Orange G bindet sich schwach an die Oberflächen der Kerne und Zellen und emittiert eine Fluoreszenz im Wellenlängenbereich von 520 bis 540 nm.
Neutral Rot färbt auch prinzipell Kerne und emittiert eine Fluoreszenz von 620 nm. Dieser Farbstoff bindet sich an die eosinophilen Kerne in einem größeren Ausmaß als an die Granulen in anderen Leukozyten, wobei hierbei eine stärkere Fluoreszenzstrahlung im Vergleich zu der anderer Leukozyten emittiert wird.
Ein zweidimensionaler Plot, der aus der Messung mit einem Fließzytometer einer Blutprobe, zu der die erste und die zweite Flüssigkeit hinzugegeben worden war, erzeugt wurde, ist in Fig. 16 gezeigt, wobei Rot-RIF die relative Intensität der roten Fluoreszenz und Grün-RIF die relative Intensität der grünen Fluoreszenz bedeutet. Die in der Fig. 16 verwendeten Zahlen haben die folgenden Bedeutungen: 1, Lymphozyten; 2, Monocyten; 3, Neutrophile; 4, Eosinophile; 5, Basophile; und 6, Nicht-Leukozyten, nämlich Plättchen und erythrocytische "Geister" und "Fragmente" (die gleichen Symbole und Nummern haben im folgenden die gleichen Bedeutungen).
In Fig. 16 werden die Leukozyten klar von den Plättchen und den erothrocytischen "Geistern" und "Fragmenten", die mit 6 bezeichnet sind, unterschieden, da die letzteren eine niedrigere Intensität der grünen Fluoreszenz emittieren. Eosinophile 4 und Basophile 5 sind vollständig von anderen Leukozyten in dem zweidimensionalen Plot der Fig. 16 getrennt. Jedoch können die anderen Leukozyten (d. h. Lymphozyten 1, Monozyten 2 und Neutrophile 3), die keine spezifische Fluoreszenz emittieren, nicht voneinander auf dem zweidimensionalen Plot der Intensitäten von grüner und roter Fluoreszenz getrennt werden, so daß sie, wie in Fig. 2c gezeigt, durch die Intensität des rechtwinkligen Streulichtes klassifiziert werden.
Die Zusammensetzungen, pH-Werte und Osmolaritäten der ersten und zweiten Flüssigkeit, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden im folgenden im Detail beschrieben.
(1) Farbstoffkonzentration
a) Konzentration von Astrazon Orange G
Astrazon Orange G erzeugt die beste Trennung von Basophilen und Neutrophilen, wenn die Endkonzentration 15ug/ml (ppm) bei einem pH-Wert zur Färbung von 9,0 beträgt. Wenn die Endkonzentration an Astrazon Orange G weniger als 15ug/ml (ppm) ist, dann resultiert eine geringere Auflösung aufgrund der Abnahme in der Intensität der grünen Fluoreszenz von den Basophilen. Das gleiche Ergebnis tritt auch auf, wenn die Endkonzentration an Astrazon Orange G mehr als 15 ug/ml (ppm) ist, da in diesem Fall die kombinatorische Wirkung der Abnahme der Intensität der grünen Fluoreszenz der Basophile und der Zunahme in der Intensität der grünen Fluoreszenz der Neutrophile auftritt. Die Konzentration an Astrazon Orange G, die eine optimale Auflösung gewährleistet, variiert mit dem pH-Wert. Die Adsorptionsmenge an Astrazon Orange G nimmt mit fallendem pH-Wert ab.
b. Konzentration von Neutral Rot
Eine gute Auflösung zwischen Eosinophilen und Neutrophilen kann am oberen Ende des Konzentrationsbereichs von Neutral Rot von 1 bis 10ug/ml (ppm) erhalten werden. Eosinophile haben bessere Färbeeigenschaften bei niedrigeren pH-Werten.
c. Wechselwirkung zwischen Astrazon Orange G und Neutral Rot
Neutral Rot färbt auch die Granulen in Basophilen (d. h. die Intensität der Fluoreszenz, die dieser Farbstoff ausstrahlt, ist nicht spezifisch für Basophile), so daß es das selektive Färben der Basophile durch Astrazon Orange G inhibiert. Es ist deshalb notwendig, eine Konzentration von Neutral Rot festzulegen, die eine gute Auflösung zwischen Neutrophilen und Basophilen und Neutrophilen und Eosinophilen gewährleistet.
Fig. 15 zeigt die Auflösungsprofile zwischen Eosinophilen und Neutrophilen und zwischen Basophilen und Neutrophilen als Funktion der Konzentration von Neutral Rot, wobei die Konzentration von Astrazon Orange G auf 15ug/ml (ppm) und der pH-Wert auf 9,0 festgelegt worden sind. In Fig. 15 bedeutet der Ausdruck "Verhältnis der grünen Fluoreszenz von Basophilen/Neutrophilen" das Verhältnis der Intensität der grünen Fluoreszenz von Basophilen zu der von Neutrophilen, und der Ausdruck "Verhältnis der roten Fluoreszenz von Eosinophilen/Neutrophilen" bedeutet das Verhältnis der Intensität der roten Fluoreszenz von Eosinophilen zu der von Neutrohilen (die gleichen Ausdrücke werden im folgenden mit der gleichen Bedeutung verwendet). Je höher die Punkte in der Figur liegen, desto besser kann die Trennung zwischen Neutrophilen und Basophilen oder Eosinophilen erreicht werden.
In Fig. 15 trifft die Trennung zwischen Basophilen und Neutrophilen mit der zwischen Eosinophilen und Neutrophilen zusammen, jedoch liegen in der Praxis üblicherweise weniger Basophile bei den Leukozyten vor als Eosinophile, so dar zur Verbesserung der Auflösung zwischen Basophilen und Neutrophilen es wünschenswert ist, die Konzentration von Neutral Rot auf ein vergleichsweise niedriges Niveau, d. h. 2ug/ml (ppm), zu setzen.
Wenn das Volumenverhältnis der ersten zu der zweiten Flüssigkeit auf 9:1 wie in Beispiel 7, das später beschrieben wird,' festgelegt wird, dann können die Konzentrationen an Astrazon Orange G und Neutral Rot in der ersten Flüssigkeit auf 16,5ug/ml (ppm) bzw. 2,2ug/ml (ppm) festgelegt werden, so daß ihre Endkonzentrationen bei 15ug/ml (ppm) bzw. 2ug/ml (ppm) liegen.
(2) pH-Wert
a. End-pH-Wert als Ergebnis der Mischung der ersten und zweiten Flüssigkeit
Fig. 17 zeigt das Auflösungsprofil zwischen Neutrophilen und Basophilen oder Eosinophilen als Funktion des pH-Wertes, wobei die Konzentrationen an Astrazon Orange G und Neutral Rot auf 15,0ug/ml (ppm) bzw. 3.0ug/ml (ppm) festgelegt worden sind. Offensichtlich nimmt die Auflösung zwischen Eosinophilen und Neutrophilen mit steigendem pH-Wert ab. Auf der anderen Seite steigt die Auflösung zwischen Basophilen und Neutrophilen mit steigendem pH-Wert bis zu 9,0 bis 9,5 und nimmt im Anschluß daran wieder ab.
Mit steigendem pH-Wert steigt auch die Geschwindigkeit, mit der Basophile gefärbt werden (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, bis ein Maximum der Fluoreszenzintensität erreicht ist), jedoch, wenn einmal die maximale Fluoreszenzintensität erreicht ist, dann ist der nachfolgende Abfall der Fluoreszenzintensität sehr rasch. Die Färbungsgeschwindigkeit der Eosinophile variiert nicht in starkem Ausmaß mit dem pH-Wert.
Deshalb ist es, wenn man die Auflösung zwischen Neutrophilen und Eosinophilen bzw. Basophilen und die Abnahme der Intensität der Fluoreszenz der Basophile berücksichtigt, wünschenswert, den End-pH-Wert auf einen Bereich in der Nähe von 8,6 bis 8,7 einzustellen. Bei der vorliegenden Erfindung wird der Endwert des pH-Wertes als Färbungs-pH-Wert bezeichnet.
b. pH-Wert der ersten Flüssigkeit
Der pH-Wert der ersten Flüssigkeit beeinflußt die zerstörende Wirksamkeit hinsichtlich der Erythrocyten. Erythrocyten werden rasch bei pH-Werten von 5,0 und darunter zerstört, und je niedriger der pH-Wert ist, desto schneller ist die Zerstörungsgeschwindigkeit. Bei pH-Werten unterhalb von 2,0 beginnen Proteine, wie Hämoglobin, zu denaturieren, wenn die Zerstörung der Erythrocyten fortschreitet, und die Geschwindigkeit der Proteindenaturierung steigert sich, wenn der pH-Wert fällt. Ein denaturiertes Protein wird zu dem Zeitpunkt, wenn der End-pH-Wert für das Färben erreicht ist, klumpen. In Anbetracht dieser Tatsachen ist es wünschenswert, den pH-Wert der ersten Flüssigkeit auf einen pH von 2,0 bis 5,0 einzustellen.
(3) Puffer.
a) Puffer in der ersten Flüssigkeit
Der Puffer der ersten Flüssigkeit wird verwendet, um den pH-Wert der ersten Flüssigkeit auf einen für das Zerstören der Erythrocyten geeigneten Wert einzustellen, und jeder Puffer, der einen pKa-Wert von 3,5 ± 1,5 besitzt, kann für diesen Zweck verwendet werden. Illustrative Beispiele beinhalten Maleinsäure, Malonsäure, Phthalsäure, Diglycolsäure, Salicylsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Milchsäure. Um die Osmolarität der ersten Flüssigkeit zu reduzieren, wird die Konzentration des Puffers wünschenswerterweise so niedrig wie möglich gehalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung liegt die Konzentration des Puffers in der ersten Flüssigkeit vorzugsweise bei 50 mM und darunter, insbesondere bevorzugt bei 5 bis 30 mM.
b) Puffer in der zweiten Flüssigkeit
Der Puffer in der zweiten Flüssigkeit wird verwendet, um die Säure in der ersten Flüssigkeit zu neutralisieren und um den pH-Wert der erhaltenen Farblösung auf dem färbenden pH-Wert zu halten. Jeder Puffer, der einen pKa-Wert von 8,0 bis 9,5 besitzt, kann zu diesem Zweck eingesetzt werden. Illustrative Beispiele beinhalten Tris, Tricin, Bicin, 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, Taurin, Borsäure und Serin. Diese Puffer werden vorzugsweise bei Konzentrationen von 10 mM in Bezug auf die Endkonzentration eingesetzt, die als Ergebnis des Mischens der ersten und zweiten Flüssigkeit erhalten wird. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung besitzt der Puffer in-der zweiten Flüssigkeit vorteilhafterweise eine Endkonzentration von 30 bis 100 mM.
(4) Osmolarität
a. Osmolarität in der ersten Flüssigkeit
Je niedriger die Osmolarität der ersten Flüssigkeit ist, desto rascher ist die Zerstörung der Erythrocyten. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Osmolarität der ersten Flüssigkeit vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 0 bis 100 mOsm/kg, vorzugsweise in dem Bereich von 0 bis 50 mOsm/kg, eingestellt.
b. Osmolarität der zweiten Flüssigkeit
Die Osmolarität der zweiten Flüssigkeit bestimmt die Endosmolarität, die als Ergebnis des Mischens der ersten und zweiten Flüssigkeit erhalten wird. Die Endosmolarität beeinflußt die Fähigkeit der Leukozyten, ihre Form beizubehalten, und sie liegt vorzugsweise im Bereich von 150 bis 600 mOsm/kg, wobei einem Bereich von 150 bis 300 mOsm/kg insbesondere bevorzugt ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detaillierter in Bezug auf die Beispiele 1 bis 7 beschrieben, die zu illustrativen Zwecken gegeben sind, jedoch nicht die vorliegende Erfindung beschränken sollen.

Beispiel 1

Konzentration von Neutral Rot und Astrazon Orange G:
Zu einer 10 mM Boratpufferlösung (pH: 9,0), die 75 mM NaCl enthält, wurden Astrazon Orange G und Neutral Rot in den in Tabelle 1 gezeigten Mengen zugegeben, um Farbstofflösungen zuzubereiten. Zwei Milliliter jeder dieser Farbstofflösungen wurde mit 80ul einer frischen Probe von EDTA-antikoaguliertem Blut vermengt, und die Mischung wurde 1 Minute lang inkubiert. Die so vorbereiteten Proben ließ man durch ein Fließzytometer mit dem in Fig. 1 dargestellten Aufbau fließen. Die Ergebnisse der Leukozytklassifizierung auf der Grundlage der Messung der Intensitäten der grünen Fluoreszenz, der roten Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichts sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Konzentration an Astrazon Orange G (ug/ml) Konzentrtion an Neutral Rot (ug/ml) *1) fünfteilige Differentierung durch rote Fluoreszenz *2) nicht klassifizierbar *3) fünfteilige Differentierung gemäß der Eosinophile zunächst von Basophilen über rote Fluoreszenz/grüne Fluoreszenz *7) getrennt wurden *4" vierteilige Differentierung mittel roter Fluoreszenz/rechtwinkligem Streulicht *5) Leukozyten wurden in drei Typen mittels roter Fluoreszenz/grüner Fluoreszenz klassifiziert; unter der Voraussetzung einer *6) Roten Fluoreszenz ≥580 nm; und *7) Grünen Fluoreszenz = 520 bis 580 nm.

Beispiel 2

pH-Wert
Eine Farbstofflösung mit einem pH von 8,0 wurde durch Zugabe von 10ug/ml Astrazon Orange G und 1 ug/ml Neutral Rot zu einer 10 mM Boratpufferlösung' die 75 mM NaCI enthielt, hergestellt. Zwei zusätzliche Farbstofflösungen wurden auf die gleiche Weise wie oben beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß ihre pH Werte auf 9,0 bzw. 10,0 eingestellt wurden. Unter der Verwendung dieser Farbstofflösungen wurde die Fließzytometrie auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Mit der Farbstofflösung mit einem pH Wert von 10,0 konnte die fünfteilige Differentierung der Leukozyten nicht erfolgreich durch Messung der Intensitäten der roten Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichtes erreicht werden. Jedoch konnten die Zielresultate erhalten werden, indem man zunächst Basophile (5) und Eosinophile (4) von den anderen Leukozyten durch die grüne Fluoreszenz und die rote Fluoreszenz differenzierte und dann zwischen den verbleibenden drei Typen an Leukozyten auf der Grundlage der grünen Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichts unterschied. Mit der Farbstofflösung mit einem pH-Wert von 9,0 konnte eine fünfteilige Differenzierung der Leukozyten mittels der roten Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichtes erreicht werden. Mit der Farbstofflösung mit einem pH Wert von 8,0 war eine vierteilige Differenzierung auf der Grundlage der roten Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichts möglich.

Beispiel 3

Konzentration von NaCl:
Vier Farbstofflösungen wurden hergestellt, indem man 50, 75, 150 und 300 mM an NaCl zu einer 10 mM Boratpufferlösung (pH Wert 9,0), die 10ug/ml Astrazon Orange G und 1 ug/ml Neutral Rot enthielt, zugab. Unter Verwendung dieser Farbstofflösungen wurde die Fließzytometrie auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden keine bedeutenden Änderungen in dem Trennmuster innerhalb des untersuchten Bereichs der NaCl Konzentrationen beobachtet, und es konnte eine fünfteilige Differenzierung der Leukozyten erfolgreich mittels einer jeden dieser Farbstofflösungen erreicht werden.

Beispiel 4

Konzentration des Puffers:
Es wurde eine Farbstofflösung hergestellt, indem man 75 mM NaCl, 10ug/ml Astrazon Orange G und 1ug/ml Neutral Rot zu einer Boratpufferlösung (pH, 9,0), wobei der Puffer in einer Menge von 3 mM vorlag, hinzugab. Zwei zusätzliche Farbstofflösungen wurden auf die gleiche Weise wie oben beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Pufferkonzentration auf 10 mM bzw. 30 mM eingestellt wurde. Unter Verwendung dieser Farbstofflösungen wurde die Fließzytometrie in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden keine bedeutenden Veränderungen in den Trennmustern innerhalb des getesteten Bereichs der Pufferkonzentrationen beobachtet, und es konnte die fünfteilige Differenzierung der Leukozyten erfolgreich mit jeder dieser Farbstofflösungen erhalten werden.

Beispiel 5

Wellenlänge der Fluoreszenz:
Die Fließzytometrie wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man eine Farbstofflösung verwendete, die aus einer 10 mM Boratpufferlösung (pH-Wert 9,0), die 75 mM NaCl enthielt, 10ug/ml Astrazon Orange G und 1 ug/ml Neutral Rot zusammengesetzt war. Die Analyse wurde auf der Grundlage der Messung der Intensitäten des rechtwinkligen Streulichts und von sechs Fluoreszenzemissionen, die jeweils in einem Wellenlängenbereich von nicht kürzer als 520 nm, 540 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm und 620 nm lagen und die mit einer Fotoverfielfältigerröhre 36 gemäß der in Fig. 1 gezeigten Optik gesammelt wurden, durchgeführt. Ein Gesamtreflektionsspiegel wurde anstelle eines dichroitischen Spiegels 30, und ein Langspaßfilter als Farbfilter 34 verwendet.
Wenn die Wellenlänge der gesammelten Fluoreszenz anstieg, dann nahm die Auflösung zwischen Basophilen und Lymphozyten ab, wohingegen die Auflösung zwischen Eosinophilen und Neutrophilen anstieg. Die Wirksamkeit der fünfteiligen Differenzierung der Leukozyten war besonders hoch, wenn Fluoreszenzemissionen mit Wellenlängen, nicht kürzer als 560 nm und 580 nm, gesammelt wurden.

Beispiel 6

Wellenlängen der roten und grünen Fluoreszenz
Die Fließzytometrie wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 durchgeführt, wobei die Wellenlängen der gesammelten roten und grünen Fluoreszenz variiert wurden, wie dies in Tabelle 2 gezeigt ist

Tabelle 2

Grüne Fluoreszenz (nm) Rote Fluoreszenz (nm)
a. 540-600 ≥560
b. 540-600 ≥580
c. 540-580 ≥560
d. 540-580 ≥580
e. 500-540 ≥560
Wenn Fluoreszenzemissionen mit den Wellenlängen c. oder e. gesammelt wurden, dann wurden Basophile und Eosinophile selektiv gefärbt, und es war eine gute Auflösung gegenüber anderen Leukocyten möglich.
Die zuvor genannten Beispiele zeigen, daß das Reagenzsystem der vorliegenden Erfindung gute Ergebnisse liefert, wenn sie unter den folgenden Bedingungen eingesetzt wird
Astrazon Orange G: 3-100 ug/ml
Neutral Rot: 0,3-10 ug/ml
pH: 8,0-11,0
Fluoreszenzwellenlänge
Grüne Fluoreszenz: 500-580 nm
Rote Fluoreszenz: ≥ 560 nm

Beispiel 7

Dies ist ein Beispiel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wie es mit der Zusammensetzung des oben beschriebenen Reagenssystems, das auf einen optimalen Bereich eingestellt war, durchgeführt wurde.
Reagentien:
1) Erste Flüssigkeit
Astrazon Orange G 16,5 ug/ml (selektiver Farbstoff für Basophile) (ppm)
Neutral Rot 2,2 ug/ml (selektiver Farbstoff für Eosinophile) (ppm)
Zitronensäure/Natriumhydroxid 10 mM (Puffer)
2) Zweite Flüssigkeit
Taurin/Natriumhydroxid 500 mM (Puffer)
Natriumchlorid (Osmolaritätskompensationsmittel) 300 mM
pH, 9,7-9,8; Osmolarität 2,600 mOsm/kg

Färbeverfahren

18 Volumenteile der ersten Flüssigkeit wurden zu einem Volumenteil an mit dem Dikaliumsalz des Dihydrates von EDTA anticoaguliertem Blut hinzugegeben. Nach dem Rühren wurde die Mischung bei 25ºC 20 Sekunden lang inkubiert. Anschließend wurden 2 Volumenteile der zweiten Flüssigkeit hinzugegeben und nach dem Rühren wurde die Mischung bei 25ºC 40 Sekunden lang inkubiert. Die letztendlich erhaltenen Färbebedingungen beinhalteten einen pH-Wert von 8,7 und eine Osmolarität von 260 mOsm/kg.

Emissionseigenschaften der Fluoreszenz

Die Intensität der Fluoreszenzemission in Abhängigkeit von den Wellenlängeneigenschaften der einzelnen Leukozyttypen, die mit dem oben beschriebenen Reagenzsystem eingefärbt worden waren, ist in Fig. 18 dargestellt.
Auswahl der Filter und der dichroitischen Spiegel:
Auf der Grundlage der Emissionseigenschaften, die in Mol-%18 gezeigt sind, wurden die folgenden Filter und dichroitischen Spiegel als optimale Vorrichtungen ausgewählt.
Dichroitischer Spiegel 22 530 nm (Reflektion von blauem Licht)
Dichroitischer Spiegel 30 600 nm (Reflektion von rotem Licht)
Farbfilter 34 600 nm (Langpaßfilter, der Wellenlängen von nicht kürzer als 600 nm durchläßt)
Farbfilter 40 540 nm (Langpaßfilter, der Wellenlängen von nicht kürzer als 540 nm durchläßt).

Ergebnisse der Analyse

Ein zweidimensionaler Plot der Intensitäten der roten und grünen Fluoreszenzen, wie sie mit einem Fließzytometer unter den oben beschriebenen Bedingungen gemessen wurden, ist in Fig. 16 gezeigt.
Die Population 6 (bestehend aus Plättchen, roten Zell-"Geistern" und -"Fragmenten") wurde erfolgreich von Leukozyten abgetrennt, und es war möglich sowohl ein Eosinophilcluster 4 als auch ein Basophilcluster 5 von allen anderen Leukozyten mit hoher Auflösung abzutrennen. Die verbleibenden Leukozyten wurden auch erfolgreich untereinander mit guter Auflösung aufgetrennt, wie dies in Fig. 2c gezeigt ist, die eine Frequenzverteilungskurve für Lymphozyten 1, Moncyten 2 und Neutrophile 3 darstellt. In Fig. 2c bedeutet RIRS die relative Intensität des rechtwinkligen Streulichtes, und FRE steht für Frequenz.
In den Beispielen 1 bis 7 wurden alle Messungen gestartet, nachdem die notwendigen Schritte für das Färben durchgeführt worden waren (d. h. nach dem das Färben einen Gleichgewichtszustand erreicht hatte). Deshalb erfährt die Probe keine zeitabhängige Veränderung während der Messungen, und es kann ein geeignetes Niveau der Intensität des Färbens oder der Reaktion innerhalb einer bestimmten Zeitdauer erreicht werden, unabhängig davon, wie groß oder klein die Zahl der Leukozyten in der Probe ist. Dies erlaubt konsistente Resultate bei der Messung, und es kann ein Fluoreszenzsignal einer adäquaten Intensität erreicht werden, selbst wenn eine Lichtquelle einer vergleichbaren niedrigen Leistung verwendet wird. Bei den obigen Beispielen 1 bis 7 wurde ein Argonionlaser von 10 mW als Lichtquelle in dem Fließzytometer verwendet.
Die Lichtquelle in dem Fließzytometer, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist jedoch nicht auf den zuvor genannten Argonionlaser mit einer niedrigen Leistung begrenzt, sondern es können andere Lichtquellen verwendet werden, wie z. B. eine Quecksilberbogenlampe, eine Xenonbogenlampe, ein He-Cd-Laser, ein He-Ne-Laser, und ein Kryptonionlaser, sowie auch ein Argonionlaser mit hoher Leistung. Wenn diese Lichtquellen verwendet werden, dann können die Bedingungen des Färbens, der Reaktion und des Messens geeignet ausgewählt werden.
Das Reagenssystem und das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten in Blut mittels Fließzytometrie besitzt die folgenden Vorteile:
(1) Eine Meßprobe kann durch einfache Vorbehandlungen hergestellt werden, die nur aus Zugabe von antikoaguliertem Blut zu einer Farbstofflösung besteht.
(2) Die Probe kann in ungefähr einer Minute hergestellt werden und dies schafft eine rasche Zugangszeit für die Messung.
(3) Da die Messungen durchgeführt werden, nachdem die notwendigen Färbeverfahren beendet wurden, wird die Probe keine zeitabhängige Veränderung während der Messungen erfahren und eine ausreichende Intensität der Färbung oder Reaktion kann immer innerhalb einer bestimmten Zeitdauer erhalten werden, unabhängig von der Natur der Probe (normal oder eine extrem große oder kleine Zahl an Leukozyten enthaltend). Dies eliminiert die Notwendigkeit, die Färbezeit von Probe zu Probe zu ändern.
(4) Da die Messungen durchgeführt werden, nachdem das Färben beendet worden ist, um eine hohe Färbungsintensität zu schaffen, kann eine Lichtquelle mit niedriger Leistung verwendet werden. Zusätzlich muß nur eine Lichtquelle verwendet werden, und es können zwei Parameter, die geeignet aus zwei Fluoreszenzkanälen und einem Kanal von rechtwinkligem Streulicht ausgewählt werden, können gemessen werden. Da die Zahl der zu messenden und zu analysierenden Parameter gering ist, kann das Reagenzsystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Fließzytometrie des Blutes mit einer einfachen und kostengünstigen Apparatur durchzuführen.
(5) Das Reagenzsystem der vorliegenden Erfindung ist sehr gut geeignet, um Blutzellen auf unterschiedliche Weise zu färben und ermöglicht deshalb, Leukozyten mit guter Auflösung zu klassifizieren.
(6) Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bewirkt nicht nur eine Messung der Fluoreszenz, sondern auch des rechtwinkligen Streulichtes, und trägt somit bei zu einer besseren Klassifizierung der Leukozyten, die eine Trennung zwischen Lymphozyten und Monocyten einschließt.
(7) Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Erythrozyten selektiv durch eine isotonische Behandlung unter sauren Bedingungen zerstört. Da das Zusammentreffen von Erythrocyten und Leukozyten durch diese Behandlung verhindert wird, kann eine sehr wirksame Trennung zwischen Lymphocyten, Monocyten und Neutrophilen mittels eines rechtwinkligen Streulichtsignals erreicht werden.
(8) Leukozyten können in fünf Typen mit sehr hoher Auflösung klassifiziert werden, indem man zunächst Eosinopile von den Basophilen auf der Grundlage eines Fluoreszenzsignals abtrennt, und anschließend die verbleibenden Leukozyten (d. h. Lymphozyten, Monocyten und Neutrophile) auf der Grundlage des rechtwinkligen Streulichtes trennt.
(9) Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Trennung der Leukozyten von anderen Korpuskeln, einschließlich- ihrer "Geister" und "Fragmente", auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität erreicht, so daß korrekte Messungen gesichert werden, selbst wenn nicht alle Erythrocyten zu Fragmenten reduziert worden sind.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden genaue und reproduzierbare Messungen durch Zählen von nicht weniger als 10.000 Leukozyten für jede Probe gewährleistet.

Claims

1. Reagenzsystem zur Verwendung bei der Klassifizierung von Leukozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, in Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile mittels eines Fließzytometers durch Messung der emittierten Fluoreszenz und des Streulichtes von fluorochromgefärbten Zellen, beinhaltend:

(a) eine erste Flüssigkeit, die ein Fluorochrom für das selektive Färben von Eosinophilen, ein Fluorochrom für das selektive Färben von Basophilen und einen Puffer umfaßt und einen pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 5,0 und eine Osmolarität im Bereich von 0 bis 100 mOsm/kg aufweist, und

(b) eine zweite Flüssigkeit, die einen Puffer zur Neutralisierung der Säure in dem Puffer der ersten Flüssigkeit und zur Beibehaltung des pH-Werts der erhaltenen Farbstofflösung auf einen färbenden pH-Wert und ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Einstellung der Osmolarität der Farbstofflösung auf einen Wert, bei dem die Leukozyten in ihrer Form unverändert bleiben, umfaßt.

2. Reagenzsystem nach Anspruch 1, wobei das Fluorochrom für das selektive Färben der Eosinophile Neutral Rot (Farbindex-Nr. 50.040) ist.

3. Reagenzsystem nach Anspruch 1, wobei das Fluorochrom für das selektive Färben der Basophile entweder Astrazon Orange G (Farbindex Nr. 48.035) oder Auramin O (Farbindex Nr. 41.000) ist.

4. Reagenzsystem nach Anspruch 1, wobei in der ersten Flüssigkeit (a) ein Fluorochrom für das selektive Färben von Monocyten weiterhin eingeschlossen ist.

5. Reagenzsystem nach Anspruch 4, wobei das Fluorochrom für das selektive Färben der Monocyten aus der Reihe 1,1'-Dimethyloxacarbocyanin, 1,1'-Diethyloxacarbocyanin, 1,1'-Di(n-propyl)oxacarbocyanin, 1,1'-Di(n-pentyl)oxacarbocyanin, 1,1'-Di(n-hexyl)oxacarbocyanin, TA-2 und 2-(gamma-(1'-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)propenyl)-1- ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid ausgewählt ist.

6. Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in Lymphozyten, Monocyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile mittels eines Fließcytometers, das die folgenden Schritte (a) bis (d) umfaßt

(a) Zerstören der Erythrocyten in einer frischen Probe von anticoaguliertem Blut durch Zugabe des Bluts zu der ersten Flüssigkeit des Reagenzsystems gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5;

(b) Färben der Leukozyten in der so behandelten Blutprobe durch Zugabe dieser Probe zu der zweiten Flüssigkeit des Reagenzsystems gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5;

(c) Fließenlassen der gefärbten Probe durch ein Fließzytometer, Differentieren der Leukozyten von allen anderen Korpuskeln und "Geistern" durch die Intensität der Fluoreszenz und Messen der Signale von ein oder zwei Fluoreszenzen und des rechtwinkligen Streulichtes von Leukozyten; und

(d) Identifizieren des Typs jedes der Leukozyten mittels zwei oder drei hiervon emittierten Signalen, Zählen der Zahl der nachgewiesenen Leukozyten gemäß ihrem Typ und Berechnen der Anteile der einzelnen Leukozyttypen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Fluorochrom für das selektive Färben der Eosinophile Neutral Rot ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Fluorochrom für das selektive Färben der Basophile Astrazon Orange G ist.